研究hiv的遺傳和功能變異性的方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法
2023-12-02 17:26:36 3
專利名稱：研究hiv的遺傳和功能變異性的方法以及用於該方法的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的病毒分析領域。具體地，本發明涉及一種用於研究HIV的遺傳和功能變異性方法及其實施手段。
1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)是一種包被的逆轉錄病毒，該病毒的基因組具體地編碼三種截然不同的酶將病毒RNA轉錄成雙鏈DNA的逆轉錄酶；使病毒DNA整合到靶細胞的基因組中的整合酶；以及病毒體成熟所必需的蛋白酶。病毒的酶，即逆轉錄酶(RT)和蛋白酶(PR)，已經成為抗逆轉錄病毒劑的主要靶點。
當前，有15種抑制逆轉錄酶和蛋白酶的抗逆轉錄病毒分子被用於臨床實踐。這些抑制劑的組合使用導致病毒複製大大降低。然而，由於具有顯著的繼發作用(secondary effect)、依從性差，並且產生對抗逆轉錄病毒劑具有抗性的病毒菌株，這些藥物組合有時變得複雜。
導致治療人免疫缺陷病毒(HIV)失敗的原因之一是出現對抗病毒劑治療具有抗性的突變病毒，這些突變病毒是在不完全抑制病毒的複製時產生的。由藥物產生的壓力的喪失涉及對複製型病毒感染能力(適合度(fitness))具有重要意義的酶和病毒蛋白(RT和PR)出現突變。與「野生型」病毒相比，抗性病毒的感染能力下降。由於這些治療方法在臨床實踐中被組合使用，在臨床上，同時獲得關於兩個主要靶點的遺傳和功能變異性的信息是重要的。目前，還沒有這種工具。在存在或不存在該藥物時，在患者的同一份病毒樣品中，現有的檢測方法不能夠同時對至少兩種感興趣的遺傳靶點探測已知和未知的突變以及感染強度。
不同的已有診斷檢測方法使得可能判斷感染HIV的患者的病毒對抗病毒劑的遺傳變異性(基因型)或者功能變異性(表型和複製能力)(
圖1)-檢測基因型抗性-檢測表型抗性-檢測病毒複製-組合檢測檢測基因型抗性提取來源於胞漿的病毒RNA，然後在基因型抗性檢測中對編碼逆轉錄酶和蛋白酶的區域進行分析。
目前，這些分析方法是基於胺基酸的位置，該位置的前面和後面分別有表示「野生型」胺基酸和突變的字母。例如，對於拉米呋啶(lamivudine)抗性突變M184V來說，M184V表示纈氨酸替代了RT的位置184上的甲硫氨酸。
大多數的已有檢測方法使用對靶基因進行自動測序的技術。這些檢測方法檢測存在於被測序區域中的突變，但是不能夠將它們都解釋清楚(interpret)。實際上，僅有那些已知的突變可作為算法的函數而被解釋，這些函數由國際專家委員會定期修正。在市場上已經存在多種治療組合和超過15種的藥物，這使得算法變得越來越複雜。
其他檢測方法如「線性探針陣列」(LiPA)或者由Affymetrix公司推薦的「基因晶片」都是基於雜交技術，並且使用僅限於鑑定某些突變的特定探針。
由於某些突變具有相加效應，而其他突變將恢復其靈敏度，造成難以估計多種突變的累計效應，因此對基因型檢測結果的解釋是複雜的。
檢測表型抗性對抗性的表型檢測的原理是建立在體外測定患者中的病毒在存在藥物時的生長情況。
在表型檢測中，提取來源於胞漿的病毒RNA，然後採用PCR擴增編碼逆轉錄酶和/或蛋白酶的區域。將擴增子體外重組到缺陷載體中，形成病毒顆粒。將這種病毒顆粒放置在存在濃度逐漸增大的藥物的培養液中。結果用相對於對照病毒的IC50(或者IC90)的「倍數變化」比例來表示，該比例對應於與參照野生型病毒相比、抑制50％(或90％)病毒複製的藥物濃度。抗性水平被定義為靈敏度域值的函數(截斷)。
目前有三種主要的表型檢測方法PhenoSenseTM(Virologic，美國)，AntivirogramTM(Virco，比利時)和PhenoscriptTM(VIRalliance法國)。這些檢測方法給出藥物對其靶點的易感性的信息，但是不能預測崗哨突變(sentry mutation)對病毒抗性發展的影響。
已經可能結合基因型和表型的信息來驗證該技術。然而，在那種情形下，該方法學包括通過連接構建重組載體的步驟(Parkin等人，2004，Antimicrob.Agents Chemother.48437)或者需要多個感染循環來進行基因型分型(WO/0233638)。這兩種方法可能會使患者病毒的代表性特性發生偏離。
另一方面，尚不知曉在除了體內使用的其他用途中，已有的表型分型的檢測方法是否與基因型分型的檢測方法相容。
檢測病毒複製已知通過蛋白酶抑制劑和逆轉錄酶抑制劑誘導的抗性突變可用於改變HIV病毒的複製能力。
體外確定複製能力的檢測方法是基於使用重組質粒，轉染、然後在細胞培養物中擴增。在標準化病毒數量後，用病毒上清液感染新細胞。然後按照所用的方法，在對應於一個或幾個複製周期的一定階段內評價複製能力。突變變體的複製能力用與野生型變體的複製能力相比的常用方式表示。
使用來自患者的同一份樣品，對具有強感染能力的病毒的定性通常與其遺傳和功能變異性不相關。
組合檢測WO/0233638描述了用相同擴增產物進行表型分型和基因型分型的可能性。然而，所用的表型分型方法不是描述單個病毒複製循環。在第一個時段中，在允許細胞中必須產生病毒，這使得可能在第二個時段中再感染指示細胞以測量IC50(WO/9727480)。這些步驟並不代表最初的患者病毒群體，這是因為在無藥物選擇壓力下的多個感染循環存在最初病毒發生進化的風險。
WO2004/003513提供一種基因分型、表型分型以及評價複製能力的方法，該複製能力的評價是以通過連接含有報導基因和所研究的序列的重組載體進行構建為主。這種方法對患者感染過程中的病毒行為的實際情況的代表性也較低。通過連接進行克隆對於獲得重組是有意義的，但是可能對最初的患者病毒群體的選擇產生偏離。
WO/0238792中描述的檢測方法使得可能用相同的重組載體測量該表型的感染能力(複製能力)。具體地，可用編碼部分gag基因的大片段(＞2800bp)以及編碼蛋白酶和逆轉錄酶的pol基因的閱讀區來確定病毒的複製能力。此外，在目前實踐中，該大片段並不能夠獲得足以測量感染能力的擴增成功率和複製率。因此，其後的步驟將無法進行，這限制了該大片段的使用。
由於難以同時達到較好地反映病毒行為的代表性特性(同源重組)和充足水平地擴增和複製包括極度突變的病毒，使得研究HIV病毒的已知方法受到限制。因而，一種使得可能使用同一份樣品研究和較好地解釋病毒數據和患者的治療數據的方法是有利的。
實際上，現在急切需要一種策略，其使得可能使用來自感染HIV患者的單一生物學樣品，測量該病毒的基因型抗性、表型抗性和複製能力。
本發明提供一種新策略，使得可能使用來自感染HIV的患者的單一生物學樣品，來獲得該病毒的基因分型抗性和表型分型抗性以及複製能力的測量值，以便更好了解患者的處境，從而能夠產生更好的治療方向。
因此，本發明提供一種分析可能含有HIV病毒的樣品的方法，包括a)提取可能含有HIV病毒的生物學樣品中的病毒RNA；b)逆轉錄在步驟(a)中獲得的RNA，並用第一對引物擴增以獲得擴增的逆轉錄產物，該產物包含HIV病毒基因組的至少兩種連續基因的全部或者部分；該方法還包括-步驟(c)和/或-順序進行以下步驟(d)、(e)、(f)和(g)c)對步驟(b)中獲得的擴增的逆轉錄產物進行測序，以建立存在於所述樣品中的HIV病毒的基因型，並鑑定存在於擴增的逆轉錄產物中的突變；d)用第二對引物擴增步驟(b)中獲得的逆轉錄產物，所述引物與步驟(b)中的第一對引物互補並且能夠產生擴增產物，所述擴增產物可通過同源重組插入到在對應於步驟(b)中製備的擴增的逆轉錄產物的區域中具有缺陷的逆轉錄病毒載體中；e)將步驟(d)中製備的擴增產物與所述缺陷載體同源重組；f)對由在步驟(d)中重組入載體中的所述逆轉錄產物的至少兩個連續基因的全部或部分所編碼的病毒蛋白進行功能分析；和
g)在存在或者不存在至少一種活性物質時，測量步驟(e)中獲得的重組病毒的複製能力。
本發明的方法的顯著之處在於其提供了測量抗逆轉錄病毒劑治療的影響的可能性，根據如下同時進行判斷-記錄已知突變、組合突變和未知突變的遺傳變異；-記錄在存在或不存在抗逆轉錄病毒劑時的感染能力或者複製能力的功能性變異；這使得可能在來自患者的同一份生物學樣品的基礎上，同時研究抗病毒劑對其最初靶點的遺傳和功能變異性的影響，該靶點例如為所設計的抗病毒劑所針對的病毒的酶，而且該工具還可根據相同的數據平行地給出關於一種或多種感興趣的靶點的遺傳和功能變異性的相應信息。
按照本發明的方法還使得可能極好地反映出患者體內病毒的行為，其還代表對屬於B亞型和非B亞型的HIV-1的一個或多個靶點的遺傳和功能變異性的評價。
根據本發明，將每一參數，基因型、表型、複製能力，分別添加到抗性的信息中，所檢測的病毒與其天然行為最為接近。本發明使得可能用同一份生物學樣品測量三種關鍵的抗性參數基因型、表型和複製能力。這提高了分離病毒群體的效率，使得可能對重構病毒進行標準化和對結果進行定量分析。這三個方面使得可以更好地對這些事件進行臨床解釋和相互說明，使之成為一種可用於臨床的組合工具。
按照本發明的方法更特別地涉及一種用於分析樣品的方法，該樣品傾向於含有屬於B亞型和非B亞型的HIV病毒。因此，RNA是屬於B亞型和非B亞型的HIV病毒的RNA。
為了實施步驟(a)，該方法使用來源於患者的樣品。樣品可以是血液或者血清，其也可以是來自生物學液體或者來自活組織檢查或者來自任何其他組織製備物。生物學樣品還可以來自病毒培養物。在一般情形下，生物學樣品對應於含有一種或多種HIV變體的所有類型的樣品，特別是HIV-1。如上指出，術語HIV-1病毒是屬於B亞型和非B亞型的任何病毒菌株。
為了實施步驟(b)，該方法使用第一對引物，使得可能獲得擴增的逆轉錄產物，在下文也稱為擴增子，其包括可用於研究抗逆轉錄病毒劑的抗性的至少兩種基因的全部或者部分。
因此，步驟(b)使用一對引物，使得可能製備一種具有如下特徵的擴增子-在其每一端具有允許對病毒群體進行擴增的保守區；和-可能存在感興趣的突變。
在步驟(b)的一個方面，使用第一對引物使得可能獲得一種擴增子，其包括編碼蛋白酶和逆轉錄酶的gag基因和pol基因的全部或者部分，所述蛋白酶和逆轉錄酶與病毒的複製能力相關並且能夠賦予病毒對治療的抗性。
因此，在步驟(b)中，獲得一種還具有如下特徵的擴增子-編碼gag並且包括裂解位點的核酸序列的一部分，-編碼蛋白酶的序列的全部，和-至少到密碼子340的編碼逆轉錄酶的序列。
上面定義的擴增子小於約2800bp，優選在約2200和約2700bp之間，最優選在約2300和約2600bp之間。
因此，有利的是，在步驟(b)中所使用的第一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列在5』與包括裂解位點的gag基因的系統發生學上的保守區互補，含有編碼蛋白酶的核酸序列的全部，且在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補。
在一個方面，用於步驟(b)中的一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列
-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子102(基因組上的位置1093)和蛋白質p24的密碼子76(基因組上的位置1415)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子325(位置3520)和密碼子421(基因組上的位置3811)之間。
在另一個方面，用於步驟(b)中的一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質平p17的密碼子126(基因組上的位置1165)和蛋白質p24的密碼子21(基因組上的位置1250)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子335(基因組上的位置3550)和密碼子395(基因組上的位置3751)之間。
步驟(b)中的擴增用大小在約10個和約50個核苷酸之間的一對引物進行，優選在約20個和約30個核苷酸之間。
有利地，步驟(b)中的擴增用一對選自包括以下的組的引物進行-作為正向引物，使用由序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQID NO.5(表1)之一表示的那些序列，-作為反向引物，使用由序列SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQID NO.6(表1)之一表示的那些序列，-這些序列的片段或者類似物。
術語「類似物」被理解為是指具有一個或幾個突變的序列，在進行PCR通常使用的嚴格條件下，這些突變不會造成雜交能力的改變，或者是指位於引物序列的上遊或下遊的1個到10個、1個到5個或者1個到3個核苷酸處的序列。
最具體地，本發明涉及在步驟(b)中使用選自包括以下的組的一對引物-由表1中的序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2構成的一對引物R1，-由表1中的序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4構成的一對引物R2，-由表1中的序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6構成的一對引物R3。
方法中步驟(c)的測序可使用從已知文獻中獲得的數據來鑑別已知突變、未知突變和組合突變。
在步驟(d)中，對在步驟(b)中獲得的被擴增的逆轉錄產物進行擴增，使用使得可能製備具有如下特徵的擴增子的一對引物-在其每一端具有保守區，所述保守區允許與所述逆轉錄病毒載體進行重組，和-可能存在感興趣的突變。
在步驟(d)中，使用與步驟(b)中所用的第一對引物互補的第二對引物對步驟(b)中所獲得的擴增的逆轉錄產物進行擴增，所述擴增的逆轉錄產物包括編碼蛋白酶和逆轉錄酶的gag基因和pol基因的全部或者部分，由此能夠獲得一擴增子，所述擴增子還包括-編碼gag並包括裂解位點的核酸序列的部分，-編碼蛋白酶的序列的全部，和-至少到密碼340的編碼逆轉錄酶的序列。
如上定義的擴增子小於約2800bp，優選在約2200和約2700bp之間，最優選在約2300和約2600bp之間。
因此，有利地，步驟(d)的擴增使用覆蓋一核酸序列的一對引物，所述核酸序列在5』與包括裂解位點的gag基因的系統發生學上的保守區互補，含有編碼蛋白酶的核酸序列的全部，且在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補。
最具體地，用於步驟(d)中的引物對覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子102(基因組上的位置1093)和蛋白質p24的密碼子76(基因組上的位置1415)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子325(基因組上的位置3520)和密碼子421(基因組上的位置3811)之間。
最優選的方式，用於步驟(d)中的引物對覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子126(基因組上的位置1165)和蛋白質p24的密碼子21(基因組上的位置1250)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子335(基因組上的位置3550)和密碼子395(基因組上的位置3751)之間。
步驟(d)中的擴增用大小在約10個和約50個核苷酸之間的一對引物進行，優選在約20個和約30個核苷酸之間。
有利地，步驟(d)中的擴增用一對選自下組的引物進行-作為正向引物，使用由序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9(表4)之一表示的那些序列，-作為反向引物，使用由序列SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10(表4)之一表示的那些序列，-這些序列的片段或者類似物。
就此而論，術語「類似物」被理解為是指具有一個或幾個突變的序列，在進行PCR通常使用的嚴格條件下，這些突變不會造成雜交能力的改變，或者是指位於所述引物序列的上遊或下遊的1個到10個、1個到5個或者1個到3個核苷酸處的序列。
一個方面，本發明涉及在步驟(d)中使用選自下組的一對引物-由表4中的序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8構成的一對引物N1，-由表4中的序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10構成的一對引物N2。
該方法的一個方面的步驟(f)的功能分析包括在存在或者不存在一種或幾種活性物質時用步驟(e)中產生的重組病毒感染HIV靶細胞。作為例子，可能參照在存在或者不存在幾種藥物時感染含有指示基因的HIV靶細胞，而不依賴於逆轉錄病毒載體，該指示基因的表達與病毒感染相關。
在該方法的一個方面，步驟(g)的測量複製能力包括測量指示基因應答於步驟(e)的重組病毒的感染的表達，並與參照病毒比較。作為例子，可以參照整合光密度值的操作，這些光密度值來源於相對基因(relativizing gene)相關的酶促反應，該基因獨立於載體並存在於被感染細胞中。
按照一個方面，在實施了步驟(c)和(f)以及(g)的情形下，該方法包括h)處理與如下相關的數據-可能存在步驟(c)中確定的突變，-步驟(f)中的病毒蛋白功能分析，和-步驟(g)的複製能力，以獲得病毒和/或治療的特徵。
作為這種類型的數據處理的例子，可能參照在步驟(c)中鑑定的突變的解釋算法、在步驟(f)中獲得的抑制50％(IC50)或者90％(IC90)病毒複製的藥物濃度值、在不存在藥物時步驟(g)中的重組病毒的複製能力與參照病毒之間的比較。這些使得可能相互解釋病毒的特徵和治療，如此以提供一種新工具，用於單獨地和共同地進行流行病學跟蹤。
本發明還涉及用於擴增如上定義的HIV的核酸序列的引物及其組合。
本發明的方法使得可能提供一種新檢測方法，該檢測方法能夠使用來自HIV患者的同一份生物學樣品，在存在或者不存在抗逆轉錄病毒劑時，獲得該病毒的基因型、表型的抗性和複製能力的測量值，即反映已知突變、組合突變和未知突變的遺傳變異，以及反映感染強度或者病毒複製能力的功能變異(圖2)。
因此，本發明還涉及一種用於實施上述方法的試劑盒，包括一種或幾種上面定義的引物。這種試劑盒還包括分析按照該方法獲得的三類數據的方法基因型、表型和複製能力等。
通過如下實施例並參考附隨的附圖，可看出本發明的其他優點和特徵，在附圖中圖1是流程圖，以表格形式表示分析基因型、表型和複製能力的主要步驟；圖2是流程圖，顯示按照本發明的方法對基因型、表型和複製能力進行分析的相容性；圖3顯示更高效的病毒群體擴增在WO 0238792中描述的條件下(檢測1)和在本發明實施例1定義的條件下(檢測2)，逆轉錄和擴增來自四位患者(A、B、C、D)的RNA；圖4是圖表，顯示在患者病毒(病毒1)和參照病毒的複製能力的檢測中獲得的曲線OD/P24；
圖5顯示本發明的引物對在HIV基因組上的位置以及HIV-1的gag和pol基因的結構-Gag基因·基質p17·核心p24·核核心(CA)p2、p7、p1、p6-Pol基因·蛋白酶(PR)p10斷裂以及gag和pol成熟·逆轉錄酶(RT)p51逆轉錄·RNAseHp15RNAse H活性·整合酶(Int)p31前病毒DNA整合；以及圖6顯示用不同商業檢測方法擴增的區域，其用於實施例3中描述的基因分型和表型分型。
實施例1蛋白酶和逆轉錄酶的遺傳和功能分析該方法一個方面包括生成一種特別的核酸，該核酸同時與基因分型技術和表型分型技術相容(compatible)。
生成第一種特定的擴增子的操作如下1)提取包含在生物學樣品中的病毒RNA。生物學樣品可來源於來自患者的樣品。其可以是血液或者血清樣品，但是也可以來自生物學液體或者活組織檢查或者任何的組織製備物。生物學樣品還可以來自病毒培養物。一般地，生物學樣品對應於含有一種或幾種HIV-1變體的所有類型的樣品。該實施例中的術語「HIV-1」用於指屬於B亞型和非B亞型的任何病毒菌株。
2)逆轉錄在(1)中獲得的RNA並用下面表1中的特定引物對之一擴增，獲得具有如下特徵的擴增子-在5』端和3』端存在保守區，使得可以擴增病毒群體；
-存在已經被描述的感興趣的突變的任何一種；-存在編碼gag和包括裂解位點的核酸序列的部分；-編碼蛋白酶的序列的全部；-至少到密碼子340的編碼逆轉錄酶的序列。
表1
圖3顯示在四位患者中，該方法比在已有專利中的條件下更好地擴增病毒群體。另一個方面，在一系列26位患者中，該方法使得可以擴增所有的樣品，而在WO 02/38792中描述的方法僅能有效地擴增26個檢測樣品中的16個(4個為陰性，6個太微弱而不能被擴增)。
下面表2和表3分別顯示患者1和2中的兩例血漿樣品，通過上述方法生成的擴增子使得可能按照Trugene和Viroseq技術進行基因分型，以及按照Phenoscript技術進行表型分型。
表2
表3
實施例2分析來自患者的在蛋白酶和逆轉錄酶中有突變的HIV病毒的複製能力在該實施例中，該方法包括如下步驟1)提取包含在生物學樣品中的病毒RNA。
2)如實施例1中所述，逆轉錄(1)中獲得的RNA，並用一對特定引物擴增，使得可能以常規方式擴增一種特別的擴增子，所述擴增子包括至少兩種在抗逆轉錄病毒劑的抗性研究中感興趣的基因。
3)通過一對在下面表4中描述的新引物，使用在步驟(2)中獲得的擴增子，製備一種新的擴增子。該新擴增子的特徵在於-在5』端和3』端存在保守區，使得可以用逆轉錄病毒載體進行重組；-存在所有已經被描述的感興趣的突變；-存在編碼gag和包括裂解位點的核酸序列的部分；-編碼蛋白酶的序列的全部；-至少到密碼子340的編碼逆轉錄酶的序列。
表4
與在WO 02/38792的條件下所述的重組相比，表4中描述的引物使得可以在具有大量突變的患者中進行更好的重組，該重組使用一種新逆轉錄病毒載體進行，該逆轉錄病毒載體缺乏gag基因的一部分、編碼蛋白酶的pol的閱讀區的一部分、以及HIV-1逆轉錄酶的一部分。
在下面的表5和表6中，列舉了在一系列6位患者中鑑定的蛋白酶基因和逆轉錄酶基因中的突變。表7給出使用該方法在兩個獨立檢測中獲得的該6位患者中的複製能力的平均值。在WO 02/38792描述的條件下，在這一系列具有大量突變的患者中，用逆轉錄病毒載體進行重組的效率不足以產生令人滿意的重組病毒水平，並且也不可能進行複製能力的分析。
表5在所研究的6位患者中鑑定的蛋白酶抑制劑(IP)的主要突變列表
表6在所研究的6位患者中鑑定的逆轉錄酶抑制劑(RTI)的主要突變列表
表7
表4中描述的引物使得可能在另一系列的4位患者中產生一定量的重組病毒，該重組病毒比在WO 02/38792的條件下描述的重組病毒更加重要，以及用如抗原p24的劑量標準化指示細胞的感染。下面的表8描述按照該方法(GRF載體)由4位患者的重組病毒產生的p24的量大於WO 02/38792(GPR載體)的量。
表8
表4中的引物還使得可能按照定量方法，在測量一定範圍內的重組病毒的複製能力，與參照病毒比較，該定量方法整合從酶促反應中獲得的光密度值，該酶促反應與獨立於載體並且存在於被感染細胞中的顯示基因(revealing gene)相關(圖4)。
表4中的引物使得可能在兩個對照樣品中較好地重複測量複製能力，在這兩個對照樣品中，一個樣品具有已知能夠降低複製能力的突變。下面的表9顯示兩個在蛋白酶中具有已知突變的對照樣品的複製能力值的可重複性。三個獨立檢測。
表9
實施例3用不同商業檢測方法測定的實施例1和2的擴增子的相容性1)用於基因型分型的主要商業檢測的相容性。
在W.Cavert和H.H.Balfour(Detection of antiretroviral resistance inHIV-1 Clin Lab Med 2003 23915)的文章中描述了四種主要的商業檢測方法。
1.1)TrugeneTM試劑盒(Bayer Visible Genetics Inc.)(WO 02/070731；Grant等人，Accuracy of the Trugene HIV-1 Genotyping kit J ClinMicrobiol 2003 411586)。
Trugene HIV-1基因型分型試劑盒被用於確定B亞型和非B亞型的病毒的基因型。按照已知技術，用來自患者的血漿提取RNA，逆轉錄病毒RNA，並用特異於pol基因的引物進行PCR擴增，該引物使得可能擴增1300bp的核酸序列，對於蛋白酶，該序列包括密碼子1-99，對於逆轉錄酶，該序列包括密碼子1-247。利用CLIPTM反應的原理，使用標記引物(染料引物)的測序技術，將如此獲得的RT-PCR產物用於16個測序反應中的每個反應中。將四對不同引物用於該測序方法中，兩對引物用於蛋白酶的測序，另外兩對引物用於逆轉錄酶的測序。用特定的染料引物(CLIPTM)來起始各個測序反應，然後用對應的標記核苷酸阻斷。然後，在電泳凝膠上分離全部的合成片段，通過自動測序儀進行分析，自動測序儀特異性指出以四種標記的核苷酸的每一種作為末尾的片段。一旦重構了該序列，用比對軟體將其與參照病毒的序列比較。
1.2)ViroSeqTM(Applied Biosystems)(*M等人，J Clin Microbiol.2001.394323)。
按照基於RNA對氧化矽柱的親合性的已知提取方法，用來自患者的血漿提取RNA，逆轉錄RNA，用特異於pol基因的引物進行PCR擴增，使得可能擴增1800bp的核酸序列，對於蛋白酶，該序列包括密碼子1-99，對於逆轉錄酶，該序列包括密碼子1-335。然後按照Big DyeTM終止子技術，用七種不同引物對如此獲得的DNA進行測序，該測序技術使用染料終止子。該序列反應用各種特異的未標記引物起始，然後用各種標記的核苷酸阻斷。然後在電泳凝膠上分離全部合成的片段。然後用自動測序儀(ABI Prism 377 DNA測序儀)記錄螢光染料的顏色，自動測序儀特異性指出以四種標記的核苷酸的每一種作為末尾的片段。一旦重構了該序列，用一種比對軟體將該序列與參照病毒序列比較。
1.3)GeneSeqTM(ViroLogic)(Parkin NT等人，Antimicrob.AgentsChemother.2004.48437)。
該技術使用構建用於PhenoSense表型檢測的抗性載體。用不同組合的螢光探針進行測序以分析載體的核酸序列，對於蛋白酶，該核酸序列包括密碼子1-99，且對於逆轉錄酶，該核酸序列包括密碼子1-305。然後將核酸沉澱在電泳凝膠上，並用自動測序儀分析。將獲得的序列與那些從參照病毒中獲得的序列比較。
1.4)GenoSureTM(Virco)(WO 01/81624)。
按照已知的提取技術，從患者血漿中提取RNA，逆轉錄病毒RNA，並用特異於pol基因的引物進行PCR擴增，使得可能擴增1800bp的核酸序列，對於蛋白酶，該序列包括密碼子1-99，且對於逆轉錄酶，該序列包括密碼子1-415。然後如上所述，按照Big DyeTM終止子技術對如此獲得的DNA進行測序。
2)主要商業表型分型檢測方法的相容性在M.Youle於2003年12月發表在網址www.hivandhepatitis.com上的近期綜述「Clinical Issues in HIV」中描述了主要的抗性檢測方法。
目前有三種檢測方法PhenoscriptTM(Viralliance)；AntivirogramTM(Virco)；PhenoSenseTM(ViroLogic)。
2.1)由Virco，AntivirogramTM開發的檢測方法與該方法不相容，這是由於用患者RNA擴增的2200bp的核酸片段包括蛋白酶密碼子10至密碼子99以及逆轉錄酶的全部密碼子(Hertogs等人，1998.Antimicrob.Agents Chemother)。
2.2)PhenoSenseTM(ViroLogic)(Parkin NT等人，Antimicrob.AgentsChemother.2004.48437；Petropoulos等人，Antimicrob.AgentsChemother.2000.44920)。
用從HIV患者的血漿中提取的病毒RNA實施PhenoSense檢測。用RT-PCR擴增編碼蛋白酶和逆轉錄酶的pol基因的區域，獲得一1500bp的核酸序列，其包含蛋白質gag的裂解位點(p7-p1-p6)、編碼蛋白酶的整個區域和從密碼子1到密碼子313的逆轉錄酶區。然後，通過連接將該序列插入到HIV逆轉錄病毒載體中，該載體含有一個報導基因(螢光素酶)，並且缺乏HIV的包裝蛋白。然後用編碼包裝蛋白MLV的載體(鼠白血病病毒)將該逆轉錄病毒載體共轉染到細胞293T中。在存在或者不存在抗逆轉錄病毒劑時，用生成的病毒感染新細胞。將在存在藥物時感染細胞中的螢光素酶活性與不存在藥物時的螢光素酶活性比較，這樣可計算抑制50％的病毒生成的藥物濃度(IC50)。
下面的表10總結了在上面描述的主要檢測方法中擴增的核酸序列的特徵。
表10
圖6顯示通過不同商業檢測方法擴增的區域，其用於實施例3中所述的基因型分型和表型分型。在圖6中被稱作為「新擴增子」的按照本發明的擴增子與所有這些檢測方法相容。
實施例4確定作為在做出治療決定中的一種工具的分值使用來自HIV患者的生物學樣品，該方法使得可能在評分系統中，考慮屬於B亞型和非B亞型的HIV病毒的遺傳和功能變異性的測量。
用按照本發明擴增的特定核酸序列，實施對遺傳變異性的測量，然後按照已知的測序技術(Trugene，ViroSeq)進行分析。通過這些檢測方法鑑定的蛋白酶基因和逆轉錄酶基因中的突變用定期修正的算法進行解釋。0-2的第一種分值賦予通過解釋而確定的三種抗性水平的每一種。下面的表11總結用Trugene和ViroSeq檢測方法給出的解釋，作為所鑑定的突變與所用的抗逆轉錄病毒劑(ARV)的函數，賦予對應於抗性數量級的表型分值。
表11
對HIV病毒的功能變異性的測量包括分析在存在抗逆轉錄病毒劑時(表型)或者不存在抗逆轉錄病毒劑時(適合)的病毒複製能力。
表型抗性檢測方法的原理是基於體外測量在存在藥物/活性試劑時患者病毒的生長，與參照病毒比較(抗性指數)。抗性水平被認為是靈敏度域值(截斷)的函數。第二種0-2的分值賦予通過解釋而確定的三種抗性水平的每一種。表12總結了用主要的表型分型檢測方法PhenoSense和Phenoscript得出的解釋，是它們的靈敏度域值的函數，賦予對應於抗性數量級的表型分值。
下面的表12總結表型分值的賦值，是表型域值的解釋的函數。
表12
測量在不存在抗逆轉錄病毒劑時的病毒的複製能力或者適合度，與參照病毒比較。提供了病毒自我複製能力的信息，並表示為相對於參照病毒的百分比。作為例子，可以存在具有100％適合度的病毒，其被認為具有強的複製活性，以及可以存在具有10％適合度的病毒，其被認為具有低的複製活性。
基因型和表型的兩種分值的組合以及使用同一份生物學樣品的複製能力的百分比應當使得較好地解釋臨床數據，並提供作為治療決定的輔助工具。實踐中，特定抗病毒劑的基因型分值和表型分值相加，並結合複製能力的測量值，使得可能確定治療選擇的方向。對於各種ARV來說，基因型分值加上表型分值在0和4之間，並且伴隨著複製能力的百分比。
因此，對於在取樣時正在使用的一種ARV來說，如果基因型分值加上表型分值小於1，並且複製能力升高(100％或更高)，有必要提出停止使用該分子，這是由於該病毒具有抗性，並且在存在這種ARV時仍保留很強的複製能力。
對於在取樣時正在使用的一種ARV來說，如果基因型分值加上表型分值小於1，並且複製能力低(10％)，與因為沒有其他可替代的治療而中止治療相比，臨床醫生應寧可繼續使用該分子。
序列表110尤若芬斯維拉蘭斯公司120研究HIV的遺傳和功能變異性的方法以及用於該方法的試劑盒13035422/FR140FR04/XXXXX1412004-04-1616010170PatentIn version 3.1210121124212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(24)223FIT primer ex+，sense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair of primers R1with FIT ex-4001cctccagggg caaatggtac atca 24210221130212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(30)223FIT primer ex-，antisense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair ofprimers R1 with FIT ex+4002cttgataaat ttgatatgtc cattggcctt 30210321120212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(20)223RT primer A+，sense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair of primers R2with RT A-
4003tcacctagaa ctttaaatgc 20210421124212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(24)223RT primer A-，antisense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair ofprimers R2 with RT A+4004ttaaatggct cttgataaat ttga 24210521120212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(20)223GP primer B+，sense primer used for the amplification in step(b)ofthe procedure of the invention and forming the pair of primers R3with RT B-4005agccaggtca gccaaaatta 20210621120212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(20)223Gp primer B-，antisense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pairs ofprimers R3 with RT B+4006catgcttccc atgtttcctt 20210721130212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(30)223FIT primer in+，sense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair of primers N1with FIT in-4007tggtacatca ggccatatca cctagaactt 30210821128212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(28)223FIT primer in-，antisense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair ofPrimers N1 with FIT in+4008taaatttgat atgtccattg gccttgcc 28210921120212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(20)223GP primer B+，sense primer used for the amplification in step(b)ofthe procedure of the invention and forming the pair of primers N2with RT B-4009agaactttaa atgcatgggt 202101021125212DNA213unidentified220
221misc_feature222(1)..(25)223RT primer B-，antisense primer used for the amplification in step(b)of the procedure of the invention and forming the pair ofprimers N2 with RT B+40010taaatttgat atgtccattg gcctt2權利要求
1.分析可能含有HIV病毒的樣品的方法，包括以下步驟a)提取可能含有HIV病毒的生物學樣品中的病毒RNA；b)逆轉錄在步驟(a)中獲得的RNA，並用第一對引物擴增以獲得擴增的逆轉錄產物，該產物包含HIV病毒基因組的至少兩種連續基因的全部或者部分；和-步驟(c)和/或-順序進行以下步驟(d)、(e)、(f)和(g)c)對步驟(b)中獲得的擴增的逆轉錄產物進行測序，以建立存在於所述樣品中的HIV病毒的基因型，並鑑定存在於擴增的逆轉錄產物中的突變；d)用第二對引物擴增步驟(b)中獲得的逆轉錄產物，所述引物與步驟(b)中的第一對引物互補並且能夠產生擴增產物，所述擴增產物可通過同源重組插入到在對應於步驟(b)中製備的擴增的逆轉錄產物的區域中具有缺陷的逆轉錄病毒載體中；e)將步驟(d)中製備的擴增產物與所述缺陷載體同源重組；f)對由在步驟(d)中重組入載體中的所述逆轉錄產物的至少兩個連續基因的全部或部分所編碼的病毒蛋白進行功能分析；g)在存在或者不存在至少一種活性物質時，測量步驟(e)中獲得的重組病毒的複製能力。
2.權利要求1的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物能夠獲得擴增的逆轉錄產物，所述擴增的逆轉錄產物包括可用於研究對抗逆轉錄病毒劑的抗性的至少兩種基因的全部或者部分。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物能夠獲得擴增的逆轉錄產物，所述擴增的逆轉錄產物-在其每一端具有允許對病毒群體進行擴增的保守區；和-可能存在感興趣的突變。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物能夠獲得擴增的逆轉錄產物，所述擴增的逆轉錄產物包括編碼蛋白酶和逆轉錄酶的gag基因和pol基因的全部或者部分，這兩種酶與病毒複製能力相關並且賦予病毒對治療的抗性。
5.權利要求4的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所獲得的擴增的逆轉錄產物包括-編碼gag並且包括裂解位點的核酸序列的一部分，-編碼蛋白酶的序列的全部，和-至少到密碼子340的編碼逆轉錄酶的序列。
6.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所獲得的擴增的逆轉錄產物小於2800bp，優選在2200和2700bp之間，最優選在2300和2600bp之間。
7.權利要求4至6中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物覆蓋-核酸序列，所述核酸序列在5』與包括裂解位點的gag基因的系統發生學上的保守區互補，含有編碼蛋白酶的核酸序列的全部，且在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補。
8.權利要求4至7中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子102(基因組上的位置1093)和蛋白質p24的密碼子76(基因組上的位置1415)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子325(基因組上的位置3520)和密碼子421(基因組上的位置3811)之間。
9.權利要求4至8中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中所述第一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子126(基因組上的位置1165)和蛋白質p24的密碼子21(基因組上的位置1250)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子335(基因組上的位置3550)和密碼子395(基因組上的位置3751)之間。
10.權利要求4至9中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中用選自如下一組中的一對引物進行擴增-SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5作為正向引物，-SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6作為反向引物，和-上述序列的片段或者類似物。
11.權利要求4至10中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(b)中用選自如下一組中的一對引物進行擴增-由序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2構成的一對引物R1，-由序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4構成的一對引物R2，和-由序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6構成的一對引物R3。
12.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，步驟(c)的測序使用從已知文獻中獲得的數據來鑑別已知突變、未知突變和組合突變。
13.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，在步驟(d)中，對步驟(b)中所獲得的擴增的逆轉錄產物的擴增使用一對引物，所述引物對能夠製備一擴增子，所述擴增子-在其每一端具有保守區，所述保守區允許與所述逆轉錄病毒載體進行重組，和-可能存在感興趣的突變。
14.權利要求13的方法，其特徵在於，在步驟(d)中，優選地使用與步驟(b)中所用的第一對引物互補的第二對引物對步驟(b)中所獲得的擴增的逆轉錄產物進行擴增，所述擴增的逆轉錄產物包括編碼蛋白酶和逆轉錄酶的gag基因和pol基因的全部或者部分，由此能夠獲得一擴增子，所述擴增子還包括-編碼gag並包括裂解位點的核酸序列的部分，-編碼蛋白酶的序列的全部，和-至少到密碼340的編碼逆轉錄酶的序列。
15.權利要求13或14的方法，其特徵在於，其中所述的擴增子小於2800bp，優選在2200和2700bp之間，最優選在2300和2600bp之間。
16.權利要求13至15中任一項的方法，其特徵在於，其中步驟(d)的擴增使用覆蓋一核酸序列的一對引物，所述核酸序列在5』與包括裂解位點的gag基因的系統發生學上的保守區互補，含有編碼蛋白酶的核酸序列的全部，且在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補。
17.權利要求13至16中任一項的方法，其特徵在於，步驟(d)中所用的一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子102(基因組上的位置1093)和蛋白質p24的密碼子76(基因組上的位置1415)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子325(基因組上的位置3520)和密碼子421(基因組上的位置3811)之間。
18.權利要求13至17中任一項的方法，其特徵在於，步驟(d)中所用的一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子126(基因組上的位置1165)和蛋白質p24的密碼子21(基因組上的位置1250)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子335(基因組上的位置3550)和密碼子395(基因組上的位置3751)之間。
19.權利要求13至18中任一項的方法，其特徵在於，使用選自如下一組的一對引物進行步驟(d)的擴增-SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9作為正向引物，-SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10作為反向引物，和-上述序列的片段或類似物。
20.權利要求13至19中任一項的方法，其特徵在於，使用選自如下一組的一對引物進行步驟(d)的擴增-由序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8構成的一對引物，和-由序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10構成的一對引物。
21.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，步驟(f)的功能分析包括在存在或者不存在一種或幾種活性物質時用步驟(e)中產生的重組病毒感染HIV靶細胞。
22.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，步驟(g)的測量複製能力包括測量指示基因應答於步驟(e)的重組病毒的感染的表達，並與參照病毒比較。
23.前述權利要求中任一項的方法，其特徵在於，當步驟(c)和(f)和(g)已經進行時，該方法還包括h)處理與如下相關的數據-步驟(c)中確定的突變的可能存在，-步驟(f)中的病毒蛋白功能分析，和-步驟(g)的複製能力，以獲得病毒和/或治療的特徵。
24.可用於權利要求1至23中任一項的方法的引物組，其特徵在於包括一對引物或由所述一對引物組成，所述一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列在5』與包括裂解位點的gag基因的系統發生學上的保守區互補，含有編碼蛋白酶的核酸序列的全部，且在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補。
25.權利要求24的引物組，其特徵在於所述一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子102(基因組上的位置1093)和蛋白質p24的密碼子76(基因組上的位置1415)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子325(基因組上的位置3520)和密碼子421(基因組上的位置3811)之間。
26.權利要求24或25的引物組，其特徵在於所述一對引物覆蓋一核酸序列，所述核酸序列-在5』與gag基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在蛋白質p17的密碼子126(基因組上的位置1165)和蛋白質p24的密碼子21(基因組上的位置1250)之間，和-在3』與編碼逆轉錄酶的基因的系統發生學上的保守區互補，該保守區包括在密碼子335(基因組上的位置3550)和密碼子395(基因組上的位置3751)之間。
27.權利要求24至26中任一項的引物組，其特徵在於所述一對引物選自-SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5作為正向引物，-SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6作為反向引物，和-上述序列的片段或者類似物。
28.權利要求24至27中任一項的引物組，其特徵在於所述一對引物選自-由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2構成的一對引物R1，-由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4構成的一對引物R2，和-由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6構成的一對引物R3。
29.可用於權利要求1至23中任一項的方法的引物組，其特徵在於包括選自如下一組的一對引物-SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9作為正向引物，-SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.10作為反向引物，和-上述序列的片段或類似物。
30.權利要求29的引物組，其特徵在於所述一對引物選自-由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8構成的一對引物，和-由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10構成的一對引物。
31.權利要求24至30中任一項的引物組，其特徵在於所述一對引物能夠擴增小於2800bp的序列、優選2200和2700bp之間的序列、最優選2300和2600bp之間的序列。
32.用於權利要求1至23中任一項的方法的試劑盒，其特徵在於包含權利要求24至31中任一項的至少一組引物組。
全文摘要
本發明涉及用於分析可能含有HIV病毒的樣品的方法，包括(a)提取病毒RNA；(b)逆轉錄(a)中獲得的RNA並用第一對引物擴增以獲得擴增的逆轉錄產物，該產物包括HIV病毒基因組的至少兩個連續基因的全部或部分；(c)對擴增的逆轉錄產物進行測序；(d)用第二對引物擴增(b)中獲得的擴增的逆轉錄產物；(e)將(d)中獲得的擴增產物與載體同源重組；(f)對由至少兩個基因的全部或者部分編碼的病毒蛋白進行功能分析；和(g)測量(e)中獲得的重組病毒的複製能力。
文檔編號C12Q1/70GK1969048SQ200580019710
公開日2007年5月23日 申請日期2005年4月15日 優先權日2004年4月16日
發明者索菲·勒貝爾－比奈, 伊莉莎白·達姆, 呂克·博布萊, 多米尼克·科斯坦蒂尼 申請人:尤若芬斯維拉蘭斯公司