治療性營養組合物或聯合藥物及其使用方法

2023-12-02 13:47:21 2

專利名稱：治療性營養組合物或聯合藥物及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種能夠用於治療重症患者或者用於改善線粒體功能的營養組合物。更特別地，本發明涉及包含高濃度胺基酸、抗氧化劑或其組合的組合物在治療重症患者或改善線粒體功能中的用途。
背景技術：
許多年來已經認識到營養缺乏和免疫狀態改變之間的關係。而且，某些重症救護情況可能進一步加重營養缺乏，使患者傾向於免疫功能受損以及較高的發展感染併發症、器官功能障礙和死亡的危險。因此，在過去幾十年來，大量實驗研究已經研究了諸如穀氨醯胺、精氨酸、ω-3脂肪酸等營養物的免疫調節性質。幾種添加了一種或多種這些營養物的營養製劑已經開發並且在當前可以獲得。「免疫營養物」、「免疫增強飲食」和其它術語用來描述這些產品。遺憾的是，儘管開發了這些產品，但是沒有充分地科學地理解這些營養物在重症救護情況中對臨床上重要的結果具有什麼樣的效果。
獲益於各種基質或營養物的治療將隨宿主的基礎病理生理學和該基質是否影響細胞免疫功能和/或炎症介質的合成和/或活性氧簇(ROS)的產生和/或線粒體功能而不同。免疫活性需要最低水平的主要營養物(穀氨醯胺、精氨酸和ω-3脂肪酸)。然而，特別是對於產生過量一氧化氮(NO)的精氨酸和產生二十碳化合物(eicosanoid)合成的ω-3脂肪酸，過量的這些營養物可能具有免疫抑制效果，並且可能與較差的臨床結果有關。
假定這種異源的和可變的治療反應，人們不能在手術患者(或AIDS、肥胖等患者)中檢查免疫營養物的臨床試驗以及將這些結果推廣到重症患者。一般說來，選擇的手術患者在手術應激後具有最低的細胞因子活化和一定程度的細胞防禦功能的抑制，這使他們處於較高的獲得性感染髮病率和死亡率的危險中。由此得出結論，刺激細胞防禦系統的營養物可以減少選擇的手術患者中的感染併發症。相反，與伴隨重症的全身炎症應答有關的改變更加強烈、複雜、可變，並且所知甚少。
推薦的腸胃外營養攝取或標準劑量的微量營養物基於健康受試者的需要和代謝，在重症患者中具有極小的意義。在高劑量時，顯示維生素C、維生素E和硒具有一定的助氧化劑性質(Abuja PMWhenmight an antioxidant become aprooxidant？Acta Anaesthesiol Scand 1998；42(Suppl 112)229-230；Spallholz JEThe negative effects of excessiveamounts of naturally occuring selenium.The selenium-TelluriumDevelopment Association 1998；二月)。因此，較多並不一定導致較好的結果。需要進一步的研究來確定對臨床結果可能具有有益效果的微量營養物的理想劑量，特別是在與穀氨醯胺聯合施用時。另外，給重症患者提供高含量的穀氨醯胺有幾個困難，這是由於溶解度和穩定性有限的問題，特別是對於具有體積受限的情況的患者。
線粒體功能障礙在重症患者中可能是一個問題，這是由於大量因素，包括但不限於，活性氧簇(ROS)引起的損傷或治療性化合物的毒副作用。其他患者組，如癌症患者，也可能具有線粒體功能障礙，這是癌症治療方案的副作用。其他患者組，如AIDS/HIV患者，也可能具有線粒體功能障礙，這是抗病毒治療方案的副作用。再有另外一些患者組可能在遺傳學上傾向於線粒體功能障礙。因此，改善線粒體功能的方法可能有利於重症患者以及其他具有線粒體功能障礙的患者。
因此，需要確定主要的營養物，以及它們在治療重症或改善線粒體功能上可能提供有益結果的施用途徑。

發明內容
本發明涉及一種能夠用於治療重症患者或改善線粒體功能的營養組合物。更特別地，本發明涉及含有高濃度胺基酸、抗氧化劑或其組合的組合物在治療重症患者或改善線粒體功能中的用途。
本發明的一個目的是提供改善的治療性營養組合物、治療性營養聯合藥物或其使用方法。
根據本發明的一個方面，提供了一種組合物，其含有每升溶液大約35至大約380克或介於之間的任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素，及其組合。
上述組合物可以腸胃外施用，用於治療重症患者或改善線粒體功能。
根據本發明的一個方面，提供了總體積為大約50至大約1000毫升的單位劑量形式，該單位劑量形式含有每升溶液大約35至大約380克或介於之間的任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素，及其組合。
上述單位劑量形式可以腸胃外施用，用於治療重症患者或改善線粒體功能。
根據本發明的一個方面，提供了一種聯合藥物，其包括每升溶液大約35至大約380克或介於之間的任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素，及其組合。在某些實例中，該聯合藥物的成分同時施用，而在另外一些實例中，這些成分分開施用。在某些實例中，使用相同的施用模式施用該聯合藥物的成分，而在另外一些實例中，使用不同的施用模式施用這些成分。
上述聯合藥物可以腸胃外施用，用於治療重症患者或改善線粒體功能。
在某些實例中，單位劑量的總體積可以是大約50至大約1000毫升或介於之間的任意範圍或量。例如，總體積可以是大約200至大約500毫升。作為另一個例子，總體積可以是大約1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介於之間的任意體積。
在某些實例中，硒可以以每升溶液大約400至大約10000微克的濃度或介於之間的任何範圍或量使用。例如，硒濃度可以是大約1000至大約4000微克每升。作為另一個例子，硒可以以每升溶液大約400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、8000、9000或10000微克的濃度或介於之間的任意濃度使用。
在某些實例中，穀氨醯胺可以以每升溶液大約35至大約380克的濃度或介於之間的任意範圍或量使用。例如，穀氨醯胺濃度可以是每升溶液大約50至大約150克。作為另一個例子，穀氨醯胺可以以每升溶液大約35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180、190、200、250、300或350克的濃度或介於之間的任意濃度使用。
在某些實例中，本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式可以在不存在脂質或碳水化合物的情況下製備。
根據本發明的一個方面，提供了一種治療重症患者的方法，包括給需要這種治療的重症患者施用本發明的組合物或聯合藥物。作為一個例子，以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重到大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量或介於之間的任意範圍或量給患者腸胃外施用本發明的組合物。作為另一個例子，以大約400至大約2000微克硒的每日劑量或介於之間的任意範圍或量給患者施用本發明的組合物。
根據本發明的一個方面，提供了一種改善線粒體功能的方法，包括給需要這種治療的患者施用本發明的組合物或聯合藥物。作為一個例子，以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重到大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量或介於之間的任意範圍或量給患者腸胃外施用本發明的組合物。作為另一個例子，以大約400至大約2000微克硒的每日劑量或介於之間的任意範圍或量給患者施用本發明的組合物。在某些實例中，患者具有與線粒體功能障礙相關的細胞退化。
本發明的一個優點是這些組合物可以小量配製，因此可以給體積受限的患者施用。
該發明概述沒有必要描述本發明的所有特徵。


通過以下描述，並參考附圖，本發明的這些和其它特徵將更加明顯。在附圖中圖1示出了第1組/對照(圖1A)、第2組(圖1B)、第3組(圖1C)、第4組(圖1D)和第5組(圖1E)患者的各種器官系統的平均日SOFA得分(SOFA評分系統的概述見表6)的圖；圖2示出了第1組/對照(圖2A)、第2組(圖2B)、第3組(圖2C)、第4組(圖2D)和第5組(圖2E)患者的總日SOFA得分(對於每名患者將每個器官系統的SOFA得分相加來計算總SOFA得分)的圖，在圖2F的單圖中匯集了來自圖2(A-E)的回歸線；
圖3示出了第2組(圖3A)、第3組(圖3B)、第4組(圖3C)和第5組(圖3D)患者紅細胞中穀胱甘肽(GSH)含量的圖，在圖3E的單圖中匯集了來自圖3(A-D)的回歸線；圖4示出了第2組(圖4A)、第3組(圖4B)、第4組(圖4C)和第5組(圖4D)患者中硫代巴比妥酸反應性物質(TBARS；脂質過氧化作用的指標和氧化應激的標誌)的血漿濃度的圖，在圖4E的單圖中匯集了來自圖4(A-D)的回歸線；圖5示出了第2組(圖5A)、第3組(圖5B)、第4組(圖5C)和第5組(圖5D)患者中線粒體DNA和核DNA水平之比(mtDna/nDNA；線粒體功能的一個指標)的圖，在圖5E的單圖中匯集了來自圖5(A-D)的回歸線；圖6示出了被歸類為存活的或死亡的個體患者的mtDna/nDNA比的圖，以較大的點示出了回歸線；圖7示出了被歸類為第2組患者或第3、4、5組患者的個體患者的mtDna/nDNA比的圖，以較大的點示出了回歸線；圖8示出了第1組/對照、第2組、第3組、第4組和第5組患者的肌酸酐血漿濃度(腎功能的一個指標)的回歸線圖。
發明詳述本發明涉及一種能夠用於治療重症患者或改善線粒體功能的營養組合物。更特別地，本發明涉及包含高濃度胺基酸、抗氧化劑或其組合的組合物在治療重症患者或改善線粒體功能中的用途。
以下描述了優選的實施方案。
幾項以前的隨機化試驗未能證明當經腸提供關鍵營養物時對重症患者有效的治療(Novak等人.Glutamine supplementation in seriousillnessA systematic review of the eVidence，Crit.Care Med.2002；30；2022-29)。但是，鑑於胃腸道作為細胞因子來源和白細胞活化和活性氧簇形成的主要作用，直接向胃腸道腔提供關鍵營養物在理論上是有意義的。不希望受限於理論，缺少觀察到的治療效果的一個原因可能是當經腸提供並與腸營養產品組合時，患者可能在耐受腸進食上有困難，從而限制關鍵營養物的攝入。在某些實例中，本發明通過腸胃外施用高濃度的關鍵營養物而不需要存在典型地包含在營養補充劑中的大量營養物，例如脂質或碳水化合物，將這些關鍵營養物的提供與腸(或腸胃外)營養的提供分離開來。然而，為了有利於特定患者或患者群體，任選地可以向本發明的組合物中添加這些大量營養物或一起使用。
本發明的一個方面涉及一種組合物，其包含每升溶液大約35至大約380克或介於之間任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺和選自硒、維生素C、鋅、維生素E、β-胡蘿蔔素及其組合的抗氧化劑。在某些實例中，可以選擇兩種或多種抗氧化劑。在某些實例中，可以給患者腸胃外施用該組合物。在另外一些實例中，該組合物可以用於治療重症患者。另外，該組合物可以用於治療線粒體功能障礙或改善線粒體功能障礙患者的線粒體功能。
在本發明的某些實例中，該組合物可以用來治療重症及患有線粒體功能障礙的患者。
在本發明的某些實例中，給重症患者或線粒體功能障礙患者腸胃外施用一種組合物，該組合物包含每升溶液大約35至大約380克或介於之間任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素，及其組合。作為另一個例子，所述抗氧化劑是濃度為每升大約1000至大約4000微克的硒，穀氨醯胺的濃度為每升溶液大約50至大約100克。在某些實施例中，該組合物可以包含兩種或多種抗氧化劑。在某些實例中，包含本發明的組合物的單位劑量形式的總體積為大約50至大約1000毫升或介於之間的任意範圍或量。例如，總體積為大約1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介於之間的任意體積。此外，該組合物優選不含脂質、碳水化合物或既不含脂質也不含碳水化合物。
「重症」、「重症救護」「病危」或其它變化形式涉及需要在重症監護病房(ICU)接受治療的患者或具有死亡或發展多器官衰竭危險的患者，例如，表現多器官功能障礙證據或與多器官功能障礙發生有關的證據的患者，這是本領域技術人員應當認識到的。
不希望受理論的束縛，認為活性氧簇(ROS)在重症的病理生理學中起關鍵作用。ROS不僅導致細胞成分的直接損傷，而且引發細胞因子的釋放，該細胞因子進一步激活炎症級聯(Grimble RF.Nutritionalantioxidant and the modulation of inflammationTheory and practice，New Horizons 1994；2175-1 85)。自由基能夠激活駐留的巨噬細胞或枯否氏細胞，這些細胞釋放炎症細胞因子(例如，TNF、IL-1、IL-6、IL-18)。這些致炎介質又引起炎症細胞(單核細胞和白細胞)的活化和向組織和器官內的流入，並且可以直接引起線粒體功能障礙，導致進一步的局部缺血和組織損傷。此外，被活化的枯否氏細胞也產生大量的氧自由基，由此產生缺陷的炎症循環、細胞活化和ROS產生。
在一個極其簡單的模型中，宿主對侵入的微生物的應答可以分為兩類1)細胞防禦，包括先天(非特異性)免疫和獲得性(特異性)免疫，和2)全身炎症應答。細胞防禦功能包括多形核粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的所有功能以及它們的增殖行為。相反，免疫活性細胞引發的全身炎症應答主要在組織水平上起作用。全身炎症反應的特徵在於介質、自由基和活化的免疫細胞對代謝、血管和支氣管系統的內皮、血小板和平滑肌的效果。
各種基質或營養物的療效將隨患者的基礎病理生理學和該基質是否影響細胞免疫功能和/或炎症介質的合成和/或ROS的產生、線粒體功能或其組合而不同。例如，對於通過過量一氧化氮(NO)產生的精氨酸和通過二十碳化合物合成的ω-3脂肪酸，過量的這些營養物可能具有免疫抑制效果，並且可能與較差的臨床結果有關。作為另一個例子，進一步刺激全身炎症應答的營養物可能對重症患者有害。不希望受理論的束縛，重症患者的特徵似乎在於同一患者或患者群體中共存的過度炎症(hyperinflammation)和細胞免疫功能障礙。因此，對於重症患者，加強細胞防禦(特異性和非特異性免疫功能)和改善活性氧簇，而不間接提高炎症應答的營養物可能是期望的。
本發明的某些實施例提供了通過減輕或改善(例如)過度炎症、細胞免疫功能障礙或氧化應激而可能有益於重症患者的穀氨醯胺、抗氧化劑或其組合。此外，重症患者以及其他患者組，例如癌症患者或AIDS患者，可能受益於線粒體功能的改善。
在本發明的一個方面，提供了一種聯合藥物，包括每升溶液大約35至大約380克或介於之間任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，和濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素。在某些實例中，一種聯合藥物可以包括穀氨醯胺和兩種或多種抗氧化劑。
在某些實例中，包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物可以腸胃外施用，用於治療重症患者，而在另外一些實例中，該聯合藥物可以用於腸胃外施用以改善線粒體功能。
聯合藥物的成分不一定配製在同一組合物中。在某些實例中，包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物可以配製在同一組合物中；而在另外一些實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑可以配製在單獨的組合物中。在另外的實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑劑量的一部分可以在同一組合物中提供，其餘的劑量在分別的組合物中提供。
聯合藥物的成分不一定使用相同的施用模式施用。在某些實例中，包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物可以使用相同的施用模式施用，而在另外一些實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑可以通過單獨的施用模式施用。在一個實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑腸胃外施用。在另外一個實例中，穀氨醯胺腸胃外施用，而抗氧化劑經腸施用。在另外一些實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑劑量的一部分可以通過相同的施用模式(例如腸胃外)提供，其餘的劑量通過單獨的施用模式(例如經腸)提供。
在某些實例中，包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物同時施用，而在另外一些實例中，穀氨醯胺和抗氧化劑在分開的時間施用。在另外一些實例中，在持續數天的治療方案中，穀氨醯胺和抗氧化劑可以在某些時間期限內同時施用，而在另外的時間期限內在分開的時間施用。一般來說，穀氨醯胺和抗氧化劑每日(24小時的時間期限)施用。但是，為了方便、有效或實用起見，本領域技術人員基於不同的時間期限，例如但不限於72小時、48小時、36小時、24小時、12小時、6小時或3小時或介於之間的任何時間期限，可以容易地施用穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物。
在ROS或氧自由基的許多有害活性中包括對線粒體DNA(mtDNA)的直接損傷。mtDNA損傷的漸進性積累可以使細胞不能有效地進行氧化磷酸化反應，從而導致生物能量缺乏的細胞。隨著時間過去，線粒體DNA損傷積累，並且導致線粒體和細胞功能障礙，具有隨後器官衰竭及最終死亡的可能。此外，在老年患者中常常觀察到氧化劑保護性超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶的減少。因此，在許多患者中ROS的有害作用的增加可能同時伴隨有針對ROS的保護所需的酶和線粒體代謝物的減少。
線粒體產生維持哺乳動物生命所需的90％以上的能量。因此，線粒體功能障礙可以阻止細胞維持和更新自身的能力，甚至可能導致細胞死亡。
眾所周知，線粒體功能障礙導致大量有害的結果，包括但不限於，鈣緩衝受損，產生自由基，線粒體通透性轉變的活化和繼發的興奮性中毒。
根據United Mitochondrial Disease Foundation，Inc.(www.umdf.org)，線粒體功能障礙可導致對腦、心、肝、骨骼肌、腎和內分泌和呼吸系統的細胞的大量損害。來自長壽命組織、具有高能量需求的細胞，如神經元、胰島細胞、心和肌細胞，可能特別容易具有線粒體功能障礙。根據哪種細胞受到影響，症狀可包括運動控制、肌無力和疼痛、胃腸道病症和吞咽困難、發育不良、心臟病、肝病、糖尿病、呼吸系併發症、癲癇發作(seizures)、視覺/聽覺問題、乳酸性酸中毒、發育遲緩和易患感染。
與線粒體功能障礙有關的細胞退化是各種疾病的一個重要因素。已知線粒體功能障礙是幾種疾病中的重要因素，所述疾病包括但不限於進行性嬰兒灰質營養不良(阿爾佩斯病)、NADH脫氫酶(NADH-CoQ還原酶)缺陷(複合物I缺陷)、泛醌-細胞色素c氧化還原酶缺陷(複合物III缺陷)、呼吸鏈的複合物IV缺陷引起的細胞色素c氧化酶缺陷(複合物IV缺陷/COX缺陷)、慢性進行性外眼肌麻痺症候群(CPEO)、卡恩斯-塞爾症候群(KSS)、萊伯遺傳性視神經病(LHON)、肌陣孿癲癇破碎紅纖維綜合症(MERRF)、神經病、共濟失調和色素性視網膜炎(NARP)。已知與線粒體功能障礙有關的另外一些變性性疾病，如美國專利No.20020173543(於2001年12月14日提交)所述，包括阿耳茨海默氏病、糖尿病、帕金森氏病、神經元和心肌缺血、亨延頓舞蹈病、和其他有關的聚穀氨醯胺病、延髓肌萎縮、馬-約病(SCA-3)、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮(DRPLA)和脊髓小腦性共濟失調、張力障礙、萊伯遺傳性視神經病、精神分裂症和肌退化性病症，如線粒體腦病、乳酸性酸中毒和中風(MELAS)。另外，作為諸如癌症治療或AIDS/HIV患者的抗逆轉錄病毒治療等治療性治療的毒副作用，可能導致線粒體功能障礙。例如，大多數抗生素(包括但不限於四環素、紅黴素和氯黴素)和抗病毒劑可能引起線粒體功能障礙。因此，本文所述的組合物、聯合藥物或單位劑量形式可用於治療具有廣泛不同的遺傳性和獲得性病因學的多種病症，它們通常與線粒體功能障礙有關。
美國專利公開No.20020173543描述了線粒體功能障礙的各種後果，包括但不限於(i)ATP產量減少，(ii)高反應性自由基(例如超氧化物、過氧化亞硝酸鹽和羥基和過氧化氫)的產生增多，(iii)細胞內鈣穩態的紊亂，和(iv)啟動凋亡級聯的因子的釋放。美國專利公開No.20020173543描述了幾種測定線粒體完整性的方法，包括(i)使用2-，4-二甲基氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶(DASPMI)對線粒體通透性轉變(MPT)的測定；(ii)用線粒體保護劑處理的細胞凋亡的測定；和(iii)分離的線粒體中電子傳遞鏈(ETC)活性的測定。如本文所述，可以比較線粒體和核DNA水平，以測定線粒體的功能。本領域技術人員已知其他測定。
本發明人發現穀氨醯胺、抗氧化劑或其組合可以改善線粒體功能，並且可能有益於重症患者以及其他患者組，例如癌症患者或患有某些神經變性疾病的患者。
胺基酸穀氨醯胺在體內氮轉運中起中心作用，是快分裂細胞的，特別是淋巴細胞的燃料，是穀胱甘肽的前體，並且具有許多其它的基本代謝功能。在正常生理條件下，人體大量合成穀氨醯胺，因此認為它是非必需的。
在分解代謝疾病患者中穀氨醯胺可能成為條件必需胺基酸。幾項研究表明，在過度身體鍛鍊後、在大手術後(Blomqvist BI，HammarqvistF，von der D，Wernerman JGlutamine and alpha-ketoglutarate preventthe decrease in muscle free glutamine concentration and influence proteinsynthesis after total hip replacement.Metabolism 1995；441215-1222)和重症期間(Parry-Billings M，Evans J，Calder PC，Newsholme EADoesglutamine contribute to immunosuppression after major burns？Lancet1990；336523-525)，穀氨醯胺水平下降。
在動物研究中，穀氨醯胺缺乏與腸上皮完整性的喪失有關，而穀氨醯胺補充在完全胃腸外營養過程中降低了腸黏膜萎縮，保持了腸和腸外IgA的水平。但是，關於動物模型中的細菌轉移，補充了腸胃外或腸穀氨醯胺的製劑的研究顯示混合的結果。其中一些顯示降低，而另外一些證明沒有這種效果。
已經提出穀氨醯胺補充有益於人體保持胃腸結構、降低腸通透性、保持骨骼肌、改善氮平衡、提高免疫細胞功能(Novak等人，Glutamine supplementation in serious illnessA systematic review of theevidence.Crit Care Med 2002；30；2022-29)。然而，尚未對重症患者建立在臨床上重要的劑量和施用途徑。此外，由於物理和化學性質，臨床條件下游離L-穀氨醯胺的使用可能是不利的。首先，在加熱滅菌或長時間貯存過程中由於結晶和氨釋放，穀氨醯胺是不穩定的。其次，游離穀氨醯胺在水中具有低溶解度(在20攝氏度下約為36g/L H2O)，因此難以給重症患者，特別是體積受限的患者施用足夠的穀氨醯胺。
與單獨使用游離穀氨醯胺相比，本發明的某些實例允許更高濃度的前體穀氨醯胺分子形式的穀氨醯胺。因此，本發明的組合物包含前體穀氨醯胺分子，該分子含有濃度為每升溶液大約35克至大約380克或介於之間的任意範圍或量的穀氨醯胺。例如，穀氨醯胺的濃度可以是每升溶液大約50至大約150克。作為另一個例子，穀氨醯胺的濃度可以是每升溶液大約35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360或380克，或介於之間的任意濃度。
在許多因素中，每種特定前體穀氨醯胺分子的溶解度性質決定了穀氨醯胺濃度的上限。例如，丙氨酸-穀氨醯胺二肽在20攝氏度下具有每升568克的溶解度。這種二肽的飽和溶液含有濃度為每升大約380克的穀氨醯胺。作為另一個例子，甘氨酸-穀氨醯胺二肽的飽和溶液(在20攝氏度下溶解度為每升154克)含有濃度為每升大約110克的穀氨醯胺。
比游離穀氨醯胺具有更高溶解度的前體穀氨醯胺分子的使用允許以小於1.5-2升的體積施用較高含量的穀氨醯胺，1.5-2升的體積與補充穀氨醯胺的完全胃腸外營養有關。本發明的單位劑量形式一般具有大約50至大約1000毫升的總體積或介於之間的任意範圍或量。例如，總體積可以是大約200至大約500毫升。作為另一個例子，單位劑量形式的總體積可以是大約500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介於之間的任意體積。
因此，本發明通過以較小的體積達到穀氨醯胺的有效劑量而有益於重症患者。有效劑量的一個例子是大約0.3g穀氨醯胺/kg體重至大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量，或介於之間的任意範圍或量。其它例子包括大約0.4g穀氨醯胺/kg體重至大約0.8g穀氨醯胺/kg體重，或大約0.5g穀氨醯胺/kg體重至大約0.7g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量，或從介於之間的任意劑量開始的範圍，包括但不限於0.35、0.4、0.45、0.5或0.55g穀氨醯胺/kg體重。
穀氨醯胺在患者體內可以由前體穀氨醯胺分子釋放。前體穀氨醯胺分子的例子包括但不限於用烷基、羧基、乙醯基、酯或醯胺基衍化的穀氨醯胺。穀氨醯胺前體分子的一種優選形式是含有穀氨醯胺的短鏈肽。該短鏈肽的長度優選為2個殘基至大約10個殘基，包括例如二肽或三肽。涉及由不同殘基和不同殘基長度組成的短鏈肽混合物。例如，本發明的組合物可以包含短鏈肽，該短鏈肽選自丙氨酸-穀氨醯胺-穀氨醯胺、甘氨酸-穀氨醯胺-甘氨酸、甘氨酸-穀氨醯胺-穀氨醯胺、甘氨酸-穀氨醯胺、丙氨酸-穀氨醯胺、精氨酸-穀氨醯胺、脯氨酸-穀氨醯胺、絲氨酸-穀氨醯胺、纈氨酸-穀氨醯胺及其任意組合。因此，不需要類似高濃度的另外一種胺基酸即可達到所需的穀氨醯胺高濃度。
除了一起使用各種類型的含有穀氨醯胺的短鏈肽以外，也可以使用單一類型的穀氨醯胺前體或不同穀氨醯胺前體的任意組合，條件是總穀氨醯胺濃度高到足以治療重症患者。例如，α-酮戊二酸可以與含有穀氨醯胺的短鏈肽組合。作為另一個例子，羧基衍生化的穀氨醯胺前體分子可以與游離穀氨醯胺和長度為2-5個殘基的含穀氨醯胺短鏈肽的混合物相組合。
本領域技術人員應當知道獲得含有穀氨醯胺的短鏈肽的各種來源。例如，可以使用N-保護的胺基酸酯作為親電子試劑，游離穀氨醯胺作為親核試劑，使用植物無花果蛋白酶，實現酶催化的二肽的合成(Furst PNew developments in glutamine delivery，Amer Soc NutritionalSci 20012562s-2568s)。此外，可以從諸如角豆蛋白(1998年12月15日授權的美國專利No 5,849,335)等天然富含穀氨醯胺的蛋白質的水解產物中分離含有穀氨醯胺的短鏈肽。另外，含有穀氨醯胺的短鏈肽也可以從構建的轉基因細胞或生物中獲得，該轉基因細胞或生物產生具有被識別蛋白質酶切位點隔開的含穀氨醯胺序列重複單位的蛋白質(2003年11月18日授權的美國專利No.6,649,746))。此外，含有穀氨醯胺的二肽可以作為商品獲得，例如Dipeptiven，Glamin和Intestamin(Fresenius Kabi，Uppsala，Sweden)。
Dipeptiven是含穀氨醯胺二肽N(2)-L-丙氨醯-L-穀氨醯胺的20％溶液。100ml Dipeptiven含有20g N(2)-L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(＝8.20gL-丙氨酸，13.46g L-穀氨醯胺)。該二肽在水中高度可溶(在20℃下為568g/l H2O)，並且在加熱滅菌和貯存期間保持穩定。相反，游離穀氨醯胺的物理和化學性質(低溶解度，20℃時為36g/L H2O，和較差的貯存特性)妨礙了它在水溶液中的應用。因此，沒有游離穀氨醯胺的缺點的ala-gln二肽是在臨床條件下可以作為游離穀氨醯胺前體的短鏈肽的一個非限制性實例。
Dipeptiven可以腸胃外施用，優選靜脈內輸注。靜脈內輸注後，二肽ala-gln快速水解為胺基酸L-穀氨醯胺和L-丙氨酸。由於幾乎存在於身體所有區室內的高肽酶活性，這可以得到保證。幾項研究通過測定游離丙氨酸和穀氨醯胺的量證明，在靜脈內輸注後人體中的ala-gln二肽水解。給健康志願者快速靜脈注射不同量的ala-gln後，報導了2.4至3.8分鐘的半衰期和1.92 1/分鐘的血漿清除率。計算的分布體積與胞外區室相當。給健康志願者連續4小時輸注24mg ala-gln/kg體重/小時後，觀察到穀氨醯胺和丙氨酸血漿濃度的快速等摩爾升高。在輸注期在血漿中只發現痕量的ala-gln。輸注結束15分鐘後，該二肽在血漿中不再檢測到。另外，在尿中未檢出ala-gln。其它胺基酸的濃度未受影響。ala-gln溶液良好耐受，沒有主觀不適的報導(Albers S，WemermannJ，Stehle P，Vinnars E，Furst P.Availability of amino acids supplied byconstant intravenous infusion of synthetic dipeptides in healthyVolunteers.Clinical Science 1989；76643-648)。
Glamin是含有30.27g/L甘氨醯-L-穀氨醯胺(gly-gln)的胺基酸溶液。象ala-gln二肽一樣，gly-gln在加熱滅菌和貯存期間保持穩定。gly-gln的溶解度(在20攝氏度下為154g/L H2O)小於ala-gln(568g/L)，但卻比游離穀氨醯胺(36g/L)高大約5倍。Glamin可以腸胃外施用，優選靜脈內輸注在某些實例中，本發明的組合物可以與腸胃外或腸補充劑組合使用。例如，Intestamin是含有穀氨醯胺作為二肽和抗氧化劑的腸補充劑(每100ml Intestamin含有60μg硒、4mg鋅、2mgβ-胡蘿蔔素、100mg維生素E和300mg維生素C)。推薦的每日劑量(RDD)遞送500ml的體積內的營養物。因此為具有有限腸耐受及需要補充穀氨醯胺和抗氧化劑的重症患者的飲食管理設計了產品。500ml的RDD遞送30g作為二肽提供的穀氨醯胺。Intestamin用作腸胃外或腸營養的腸補充劑。
隨機化臨床試驗的結果顯示，在重度胰腺炎患者中應用Intestamin是安全的、良好耐受的。而且，幾項觀察研究的結果顯示含有穀氨醯胺的腸補充劑在手術後早期情況下良好耐受，Intestamin的大劑量微量營養物供應與5天內低術後血漿值的更正有關(BergerMM，Goette J，Stehle P，Cayeux M，Chiolero R，Schroeder J.Enteralabsorption of a solution with high dose antioxidants and glutamine earlyafter upper gastrointestinal surgery.ClinNutr 2002，Vol.21，Supplementl，p17)。
本發明的一個方面涉及抗氧化劑的施用，例如但不限於硒、維生素C、鋅、維生素E、β-胡蘿蔔素或其組合。
硒是穀胱甘肽酶功能的一種必需的輔因子，對細胞免疫功能具有有利的作用。硒通過其他含有硒代半胱氨酸的含硒蛋白質可以具有另外的影響。在哺乳動物中已知有大約20種含硒蛋白質。硒作為胺基酸硒代半胱氨酸插入蛋白質內。這些蛋白質具有一系列新發現的抗氧化活性，即氧化還原穩定性質，包括基因表達的調節。
Pharmacological Basis of Therapeutics第9版，The McGraw-HillCompanies，1996的第1540頁報告，元素硒的推薦每日供給量為每天10至75微克。較高的硒劑量在重症患者治療或改善線粒體功能方面可能具有顯著的效果。本發明包括給重症患者或線粒體功能障礙患者施用每天大約400至大約2000微克的每日劑量。每天大約400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000微克的劑量或介於之間的任意劑量可能是有用的。
硒可以作為元素硒或作為元素硒前體的無毒性有機或無機鹽、螯合物或其它硒化合物摻入本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式中。在本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式中，硒可以用作能夠被身體吸收的幾種無毒、有機或無機硒化合物之一。
無機硒化合物的例子有亞硒酸鹽或硒酸鹽陰離子形式的含硒的脂肪族金屬鹽。有機硒化合物一般比無機化合物毒性低。有機硒化合物的非限制性例子包括在鏈中具有大約7-11個碳原子的硒胱氨酸、硒甲硫氨酸單和雙硒基羧酸。也可以使用硒基胺基酸螯合物。此外，也可以使用作為商品獲得的硒基化合物。
為了給具有有限體積需要的患者提供有效劑量，本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式包含高濃度的硒。例如，硒的濃度可以是每升溶液大約400微克至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量。例如，硒的濃度可以是每升大約1000至大約4000微克。硒濃度的另外的例子包括但不限於每升溶液大約400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、8000、9000或10000微克的濃度或介於之間的任意濃度。
硒是抗氧化劑的一個非限制性例子，可以與前體穀氨醯胺分子組合使用，用於治療重症患者或改善線粒體功能。本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式可以無限制地包含任意類型的抗氧化劑。例如，抗氧化劑可以選自硒、β-胡蘿蔔素、維生素E、維生素C、鋅及其任意組合。與硒的舉例說明一樣，為了在重症患者或線粒體功能障礙患者中達到顯著的臨床效果，本發明涉及劑量高於對健康個體的推薦飲食供應量(RDA)或容許上限攝取水平(UL)的其他抗氧化劑。例如，在The National Academies發表的Dietary Reference Intake報告(該報告可以從www.nap.edu獲得)已經測定了RDA和UL值。本發明包括濃度至少高於RDA水平的抗氧化劑。在某些非限制性實例中，抗氧化劑濃度高於UL。
β-胡蘿蔔素是天然存在的維生素原A，具有脂質抗氧化性質。另外，β-胡蘿蔔素是脂溶性的，並且在循環脂質中濃縮。在體外，β-胡蘿蔔素是一種不同尋常的類型的鏈斷裂的脂質抗氧化劑。由於它有許多偶聯的雙鏈，β-胡蘿蔔素表現出良好的自由基捕獲抗氧化劑行為。在本發明的上下文中，可以以每天10mg至1000mg的劑量或介於之間的任意範圍或劑量提供β-胡蘿蔔素。
維生素E(α-生育酚)是一種脂溶性維生素。它的主要功能是作為脂質抗氧化劑保護脂質免於氧化修飾。維生素E的水溶性衍生物(例如，如美國專利Nos.6,022,867和6,645,514所公開的)已知，並且可以在基於水的組合物中使用。此外，也可以使用穩定的水可混合乳劑提高維生素E的溶解度。在本發明上下文中，可以以每天500mg至3000mg的劑量或介於之間的任意範圍或劑量提供維生素E。
維生素C是水溶性抗氧化劑，它對於膠原蛋白的產生是關鍵的，因此是創傷癒合所需的。此外，維生素C幫助保護脂溶性維生素A和E以及脂肪酸免於氧化。維生素C也參與鐵吸收。在本發明上下文中，可以以每天1000mg至5000mg的劑量或介於之間的任意範圍或劑量提供維生素C。
鋅是一種具有抗氧化性質的必需微量礦物質。鋅在細胞生物學中起關鍵作用，並且參與事實上非常重要的細胞過程，如轉錄、翻譯、離子轉運等。在本發明的上下文中，可以以每天20mg至200mg的劑量或介於之間的任意範圍或劑量提供鋅。
在人體中存在複雜的內源防禦系統，用來保護組織免於活性氧簇(ROS)或活性氮-氧簇(RNOS)誘導的細胞損傷。特定酶，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和穀胱甘肽過氧化物酶(包括它們的輔因子硒、鋅、鎂和鐵)，巰基供體(即穀胱甘肽)和維生素(包括但不限於維生素E、C和β-胡蘿蔔素)，形成功能上重疊的防禦機制的網絡。在重症患者中有越來越多的證據表明由於ROS/RNOS產生增加和消除能力降低之間局部或系統的不平衡，這些防禦機制可以被打破。此外，大量的研究提供了證據表明低內源性抗氧化劑「貯存」與自由基產生的增加、系統炎症應答加強、隨後的細胞損傷、死亡率增加、甚至較高的重症死亡率有關(Alonso de Vega JM，Diaz J，Serrano E等人.Oxidativestress in critically ill patients with systemic inflammatory responsesyndrome.Crit Care Med 2002；301782-1786)。本發明提供有效劑量的內源抗氧化劑微量營養物，來抵消循環抗氧化劑的消耗，從而抵抗可以導致線粒體功能障礙的毒性氧自由基的過度產生。此外，可以任選地在腸或腸胃外營養範圍外提供外源性抗氧化劑，例如，在不含碳水化合物或脂質時。
因此，本發明的某些實例提供組合物、聯合藥物或單位劑量形式，其含有每升溶液大約35至大約380克或介於之間的任意範圍或量的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克或介於之間的任意範圍或量的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克或介於之間的任意範圍或量的維生素E，和濃度為每升大約20至大約4000毫克或介於之間的任意範圍或量的β-胡蘿蔔素。在某些實例中，抗氧化劑是濃度為每升大約1000至大約4000微克或介於之間的任意範圍或量的硒，穀氨醯胺的濃度為每升溶液大約50至大約150克或介於之間的任意範圍或量。在某些實例中，可以給重症患者或線粒體功能障礙患者腸胃外施用組合物、聯合藥物或單位劑量形式。此外，任選地不含脂質、碳水化合物或脂質和碳水化合物。該組合物、聯合藥物或單位劑量形式可以以大大低於通常獲得的腸胃外營養組合物的體積配製，並且可以用於給體積受限的患者施用。
本發明的某些實例涉及包含高濃度穀氨醯胺、抗氧化劑或其組合的組合物、聯合藥物或單位劑量形式在治療重症患者或線粒體功能障礙患者中的用途。因此，治療包括給需要這種治療的患者施用如下組合物、聯合藥物或單位劑量形式，其含有每升溶液大約35至大約380克或介於之間的任意範圍或量，例如每升溶液大於35克的作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和選自硒、維生素C、鋅、維生素E、β-胡蘿蔔素及其組合的抗氧化劑，或用於改善線粒體功能障礙患者的線粒體功能。
在某些實例中，本發明的組合物或聯合藥物可以製備為易於施用的單位劑量形式。單位劑量形式是用於治療重症患者或線粒體功能障礙患者的適量的穀氨醯胺和抗氧化劑，可以作為常規方案的一部分給患有施用。單位劑量形式可以是任何方便的形式，包括但不限於乾燥固體、凍乾粉末、凍幹劑或液體。例如，含有穀氨醯胺和抗氧化劑的組合物可以作為分別測量的固體貯存，然後在施用前可以容易地溶解在適量的鹽水溶液中。作為另一個例子，包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物可以以兩個單獨的預先確定的體積包裝並且貯存，然後可以直接給患者施用。
根據製備腸胃外使用的藥物形式採納的常規技術製備本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式。本發明的組合物和單位劑量形式一般配製用於腸胃外施用，但是也可以使用其它施用方法實現提高的穀氨醯胺、抗氧化劑或其組合的施用。本發明的組合物優選以液體形式施用，單位劑量形式小於1000毫升的體積。例如，體積為大約1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100或50毫升或介於之間的任意體積。作為另一個例子，體積為大約50毫升至大約500毫升或介於之間的任意範圍或體積。
如實施例所述，本發明的組合物、聯合藥物或單位劑量形式已經給患者施用，並且觀察到幾個益處。例如，使用監測患者中線粒體DNA(mtDNA)相對於核DNA(nDNA)水平的測定法，包括穀氨醯胺和硒的聯合藥物顯示改善線粒體功能。在另外的實施例中，例如，氧化應激標記物的減少和穀胱甘肽水平的保持表明，患者證明了氧化或自由基損傷得到改善。在另外一些實施例中，可以給患者施用包括穀氨醯胺和抗氧化劑的聯合藥物，而對器官功能或炎症細胞因子水平沒有任何明顯的不良作用。
本發明將在下列實施例中進一步說明。
實施例實施例1亞硒酸在Dipeptiven/生理鹽水混合物中的相容性以大體積溶液施用營養物，如全腸胃外營養，限制了在體積受限患者中的應用。因此，為了提高穀氨醯胺和硒聯合藥物的臨床應用，需要確定這種聯合藥物是否能夠小量提供。一個問題是亞硒酸可能還原為元素硒，元素硒是不可溶的，可以形成顆粒物質。因此，評價了通過連續靜脈內輸注提供穀氨醯胺二肽與硒的相容性。
A.試驗設計1.試驗製劑使用下列試驗製劑·a)MicroSe 40μg/ml，Baxter 10ml，Lot 120669(硒酸USP)·b)Dipeptiven Fresenius Kabi 100ml，Lot SD 1667(20％L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(Ala-Gln)注射用水溶液，pH5.4-6.0)Dipeptiven是含穀氨醯胺二肽N(2)-L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(AlaGln)的20％溶液。100ml Dipeptiven含有20g N(2)-L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(＝8.20g L-丙氨酸，13.46g L-穀氨醯胺)。該二肽在水中高度可溶(在20℃下為568.0g/l H2O)，並且在加熱滅菌和貯存期間保持穩定。相反，游離穀氨醯胺的物理和化學性質(具有有限的溶解性和較差的貯存特性)妨礙了它在水溶液中的應用。因此，沒有游離穀氨醯胺的缺點的AlaGln二肽在臨床條件下作為游離穀氨醯胺的前體。每克Dipeptiven含有0.7克游離穀氨醯胺，產生總劑量為0.35克/kg/天的穀氨醯胺。
該研究中使用的硒是亞硒酸注射液(MICRO Se，Sabex IncQuebec，Canada)。它是為全腸胃外營養而提供的靜脈內溶液的添加物。每ml MICRO Se含有65.36μg亞硒酸(相當於40μg硒/ml)。
2.容器和載體溶液使用以下載體溶液和容器·a)250ml 0.9％NaCl USP，Lot W4H16C0，Baxter(PVC-袋)·b)250ml 0.9％NaCl USP，Lot J4H721，B.Braun(非-PVC-袋)·c)500ml 0.9％NaCl USP，Lot W4H09B1，Baxter(PVC-袋)，·d)500ml 0.9％NaCl USP，Lot J4H636，B.Braun(非-PVC-袋)3.試驗混合物，其製備、貯存條件和採樣在層流條件下製備試驗混合物，方法是使用無菌注射器通過注射孔從袋中的0.9％NaCl USP溶液中抽取相應的體積，然後加入Dipeptiven。棄去抽取的這些量的生理鹽水溶液，使用無菌注射器通過注射孔向袋中0.9％NaCl USP的剩餘部分中加入相同體積的Dipeptiven。
在這些步驟之後，用無菌注射器加入12.5ml(約500μg硒)MicroSe(40μg/ml)。
250ml和500ml的兩種不同大小使用兩個不同性質的袋，非-PVC-聚烯烴-袋和PVC-袋。
以下表1中給出了得到的試驗樣品的組成。
表1.試驗樣品的組成

*數值是在假定體積相加下，基於0.9％NaCl USP的理論摩爾滲透壓濃度308mOsm/1和Dipeptiven的921mOsm/l而計算的。
採樣時間為室溫貯存後0、24、48、72和96小時。
用於硒測定的樣品通過0.22μm濾膜過濾，以除去可能的硒沉澱物。
用以下如表2所示的組成製備具有過量硒的其他應激混合物。
表2.應激混合物的組成

試驗期0、96小時後貯存條件室溫每種組合物分析2袋樣品。
4.試驗參數和方法使用以下試驗參數和方法·外觀根據歐洲藥典·變色根據歐洲藥典·UV-光吸收E 4/400(在4cm單元中在400nm處的消光)·亞可見顆粒物質根據歐洲藥典·pH根據歐洲藥典·根據方法AP-S542的L-丙氨醯-L-穀氨醯胺測定(根據Fresenius Kabi AP-542)·硒測定(根據USP的原子吸收法)4.1外觀根據歐洲藥典該試驗是關於可見顆粒物質，乳色/不透明度(根據歐洲藥典，第8版，StrasbourgCouncil of Europe；2005)，沉澱和氣泡產生。
4.2變色根據歐洲藥典根據歐洲藥典，將來自試驗溶液的樣品與標準顏色溶液比較。
4.3 UV-光吸收E 4/400(在4cm單元中在400nm處的消光)根據歐洲藥典，利用UV/VIS-雙光束分光光度計(Hitachi U-2000)進行測量。使用一個4cm石英玻璃杯測量400nm處的吸光度。也用水進行測量作為參比溶液。
4.4亞可見顆粒物質根據歐洲藥典用9064型顆粒計數器(HIAC-ROYCO)進行根據歐洲藥典的光阻斷法檢測。測量到顆粒的量＞10μm/ml和＞25μm/ml。如果檢測單元中存在的顆粒平均數不超過25個計數/ml≥10μm和3個計數/ml≥25μm，則溶液滿足試驗的需要。
4.5 pH根據歐洲藥典根據歐洲藥典使用pH-計(pH-計761 Calimatic，Knick)進行檢測。
4.6 L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(AlaGln)測定L-丙氨醯-L-穀氨醯胺(AlaGln)水平通過HPLC測定。
4.7硒測定(根據USP的原子吸收法)根據USP用原子吸收法檢測硒。
為了排除有機基質對樣品的幹擾，選擇氫化物法的變化形式。
方法描述在氮下用鹼硼氫化鈉將硒還原為氫化物，並轉移到原子吸收光譜儀的樣品單元中。在196.0nm處以2.0nm的裂隙進行測量。
使用來自Perkin Elmer的原子吸收光譜儀272，Hydride-systemMHS-1和EDL燈。
試劑·硼氫化鈉p.A.Merck(產品號106371)·氫氧化鈉p.A.Merck(產品號106495)·鹽酸37％p.A.Merck(產品號100317)用蒸餾水由試劑製備在3％氫氧化鈉和3％鹽酸中的1.5％硼氫化鈉。
樣品製備將在250ml袋中的30μl混合物和在500ml袋中的60μl混合物加入5ml 1.5％HCl。應激樣品預先用水1∶10稀釋。按照Perkin Elmer推薦的程序向該樣品溶液中加入過量的硼氫化鹼溶液。
標準製劑也使用MicroSe 40μg Baxter Lot 120669作為標準，它是用於測定穩定性的一批。在進行適應性檢測之前使用第二獨立工作標準檢測該產品的硒含量。用105％的硒說明(declaration)證實與根據USP的說明(95-105％的說明)的一致性。
方法在實際使用條件下的適應性向第3點的Dipeptiven和0.9％NaCl USP的混合物中加入450、500和550μg的硒(形式為11.25、12.50和13.75ml Microselen 40μg/ml)，以檢查在根據第3點的90％、100％和110％硒添加量時該方法的回收率。
測定結果(三次實驗的平均值和標準差)在下表3中給出。
結果表3的結果顯示混合物的回收率在102-111％之間，標準差在3.3-6.3％之間。對於稀釋的有機基質中痕量元素的分析方法來說，這是令人滿意的。
表3.混合物的回收率


*x＝平均值4.8時程檢測研究溶液的製備，貯存條件，和採樣研究方案使用不同範圍的高和低濃度的AlaGln和硒來覆蓋被認為在臨床上相關的濃度的例子。使用兩種不同的靜脈袋大小(250ml和500ml)的生理鹽水(0.9％NaCl)。所有情況均使用聚氯乙烯(PVC)和非-PVC袋。首先抽取將要加入袋中的Dipeptiven的體積，然後將125ml和200ml的Dipeptiven加入250ml袋，將125和250ml的Dipeptiven加入500ml袋。在這些步驟之後，將500μg硒(12.5mlMicro Se)加至每個袋中。除了這些標準混合物以外，我們還加入過量的硒(125ml Micro Se，200ml Dipeptiven，和50ml鹽水)，以進一步評價高劑量硒和沒有生理鹽水的一種溶液(僅有250mlDipeptiven和12.5ml Micro Se)的穩定性。所有測試溶液都使用無菌條件在層流條件下製備然後將樣品貯存在室溫下0、24、48、72和96小時，在這些時間時進行以下的觀察和檢測。
試驗參數和方法所有檢測都按照歐洲藥典進行(Ph.Eur.；European Pharmacopeia，第8版.StrasbourgCouncil of Europe；2005)，歐洲藥典闡述了用於在製藥中使用的物質組合物的常用標準。仔細檢查檢查混合物的可見顆粒物質、乳色/不透明度、沉澱、變色和氣泡產生。也利用光阻斷法用9064型顆粒計數器(HIAC-ROYCO)檢測混合物的亞可見顆粒物質。測得顆粒的量≥10μm/ml和≥25μm/ml。如歐洲藥典所述，如果檢測的單位中存在的顆粒平均數不超過25個計數/ml≥10μm和3個計數/ml≥25μm，則該溶液滿足檢測的需要。為了定量變色，利用UV/VIS-雙光束分光光度計(Hitachi U-2000)將樣品進行UV光吸收E 4/400(在4cm單元中在400nm處的消光)檢測。因此，使用一個4cm石英玻璃杯測量400nm處的吸光度，也用水進行測量作為參比溶液。
按照歐洲藥典用pH-計(pH-Meter 761 Calimatic，Knick)測量所有溶液的pH。最後，按照實驗室標準程序用高效液相層析(HPLC)法測定AlaGln的濃度。使用等度反相C18-HPLC法，在214nm處進行UV檢測，使用磷酸二氫鉀緩衝液(0.05摩爾)作為流動相，測定穀氨醯胺二肽。用於測定硒水平的樣品首先通過0.22um濾膜過濾，除去可能的硒沉澱物，然後用原子吸收法測定。為了排除有機基質對樣品的幹擾，根據歐洲藥典選擇氫化物法的變化形式。AlaGln和硒的含量在每個時間點測定兩次，結果表示為平均值。初始或基線值(時間＝0)設置為等於100％。
結果任何混合物在任何時間點均沒有渾濁、變色或亞可見顆粒物質的證據。所有溶液的pH隨時間穩定。對於任何混合物，AlaGln和硒的濃度隨時間沒有明顯變化(見表4)。
表4.Dipeptiyen(AlaGln)和硒的測定結果(％)


圖例NaCl-氯化鈉；AlaGln-N(2)-L-丙氨醯-L-穀氨醯胺；Se-硒所有結果都用非聚氯乙烯(PVC)袋報告。結果與在PVC袋中的結果類似。
-未做。
穩定性研究方案覆蓋了各種濃度的兩種活性成分硒和L-丙氨醯-L-穀氨醯胺的混合物的各種例子，也考慮大小/體積以及用於主要包裝材料的不同材料。
這個相容性研究顯示在臨床研究的預期混合物/劑量範圍內，活性成分L-丙氨醯-L-穀氨醯胺和硒是穩定的，並且試驗中的所有樣品滿足大體積腸胃外劑的一般規格，在96小時室溫貯存下沒有顯著改變。
在兩個主要的袋系統PVC袋和非PVC袋之間未見差異，也未記錄到對250ml和500ml袋的體積/大小的任何依賴性。
結果表明，當活性成分AlaGln和硒組合時，在室溫下貯存96小時未引起營養物物理或化學性質的任何變化。在兩個主要的袋系統PVC袋和非PVC袋之間未見差異，袋的大小或生理鹽水的體積之間也未見任何差異。在室溫下貯存時，穀氨醯胺二肽(AlaGln)和硒在溶液中顯示相容可達96小時。通過提供研究用營養物作為單一靜脈內施用，給患者施用這些營養物發生錯誤的危險減少。
實施例2穀氨醯胺二肽和抗氧化劑在重症患者中的施用研究設計單中心、公開標籤、I期劑量範圍臨床試驗，使用預期的對照設置Kingston General Hospital(RGH)，三級保健ICU，Ontario，Canada研究人群進入ICU的機構通氣的成年患者(≥18歲)，具有血流灌注不足的臨床表現。出於安全的原因排除體重過輕(＜50kg)的患者和嚴重頭部創傷患者(GCS＜8或者需要腦室造口術)。
血流灌注不足的臨床表現定義為·需要血管加壓藥(去甲腎上腺素、腎上腺素、去氧腎上腺素、≥5mg/kg/min的多巴胺或加壓素)1小時以上；或·收縮壓≤90mmHg或平均動脈壓≤70mmHg，1小時以上，儘管有足夠的流體衝擊；或者·不清楚的代謝性酸中毒，pH≤7.30或鹼過量≥5.0，與血液乳酸鹽濃度升高(≥4mmol/l)有關。
研究幹預如表5所總結的，將患者順序加入5個組之一·第1組滿足研究合格標準的30名患者，用於測定研究測定值的基線率，包括不利事件、器官功能和透析的需要。該組不接受穀氨醯胺/硒，但是如同後面幾組一樣進行相同的常規臨床和生物化學測定，例外是血清氨、胺基酸水平、穀胱甘肽過氧化物酶和其它機械標記物(IL-18，TBARS等)。這些測定值用來確定研究測定值的基線率，包括不利事件、器官功能和透析的需要。
·第2組下面7名患者接受標準劑量的Dipeptiven，0.5g/kg/天的穀氨醯胺二肽(0.35克/kg/天的穀氨醯胺)，靜脈內，不經腸·第3組下面7名患者靜脈內接受Dipeptiven，0.5g/kg/天的穀氨醯胺二肽(0.35克/kg/天的穀氨醯胺)，每天經由鼻胃管輸注經腸提供作為250ml Intestamin的21.25克/天的穀氨醯胺二肽(15克/天的穀氨醯胺)和150微克硒(在表5中表示為″1/2can″)；·第4組下面7名患者靜脈內接受Dipeptiven，0.5g/kg/天的穀氨醯胺二肽(0.35克/kg/天的穀氨醯胺)，每天經由鼻胃管輸注經腸提供作為500ml Intestamin的42.5克/天的穀氨醯胺二肽(30克/天的穀氨醯胺)和300微克硒(在表5中表示為「full can」)；
第5組下面7名患者腸胃外接受與第4組相同劑量的Dipeptiven，經腸接受相同劑量的Intestamin(在表5中表示為「full can」)，但是腸胃外接受另外500微克硒(總計800微克)。
表5.研究幹預概述

^″full can ″是500mL Intestamin入組後，儘可能快地開始施用Dipeptiven和腸胃外硒。持續到死亡或到最多21天而退出。最初的復甦後，開始施用Intestamin，持續到營養支持中斷、死亡或離開ICU。如果個體患者達到預先確定的安全閾值，則停止任一種研究補充劑。在收集基線數據(第1組)後確定最後的安全性閾值，並分析。如果一組中3/7的患者(42％)達到安全性閾值，則不進行進一步的劑量增加，但是在以前的劑量範圍處將評價另外5名患者。所有患者都根據臨床實踐指南進食；腸進食將按照臨床實踐開始。
當提供Dipeptiven時，至少在24小時的20小時裡經由靜脈內中心線連續提供每日劑量。當提供Intestamin時，至少在一天24小時的20小時裡經由鼻胃管或鼻腸飼管輸注每日體積。與穀氨醯胺/硒劑量無關，所有患者都按照臨床實踐指南進食；按照臨床實踐開始並進行腸進食。當患者施用腸進食和Intestamin時，需要2個泵，用管直接連接到進食管的兩個口，或利用「Y」形連接器將來自兩個泵的管與原位的一個進食管連接起來。關於腸進食和腸研究藥物施用相對於高胃殘留的延遲，同我們的普通實踐一樣，在高胃殘留體積24小時時或者在高危患者(連續麻醉、收縮(inotropes)或麻痺的患者和那些不能升高其床頭的患者)中立即開始動力藥和/或採用小腸進食。
後果該研究的最主要後果是序貫器官衰竭評價(SOFA得分)改變(delta)。第二個後果是穀胱甘肽、穀胱甘肽過氧化物酶、TBARS、IL-18、血清化學(BUN、AST、ALT、GGT、氨和血漿胺基酸和二肽水平)、腸營養耐受、機械通氣持續時間，入院時間，和28天死亡率。
多器官功能障礙被認為是重症患者死亡前最後的共同途徑。每種器官(呼吸、腎等)可以分開考慮或綜合起來考慮，使用評分系統，如序貫器官衰竭評價(SOFA；見表6)。
表6.SOFA得分系統的總結


a腎上腺素能藥物施用至少1小時(劑量以μg/kg·min表示)在入組時(開始研究幹預之前)和之後在ICU中每日，測定每日參數，以計算每個器官系統的基線、每日、總SOFA和SOFA的改變，以及綜合(白細胞計數，血清肌酐，動脈血氣，吸入氧分離，血壓，血管加壓藥的使用，尿輸出和格拉斯哥昏迷評分)。根據在對照組中觀察到何種改變，建立與器官功能障礙有關的停止原則，如果滿足該原則，研究患者將取消研究幹預。根據對照組建立如下的終止原則關於綜合SOFA得分，2天或更多天SOFA由基線增加＞3，並且不是由於基礎疾病引起的。腎衰竭的發展和/或開始透析不認為是終止研究幹預的標準。取消臨床幹預的所有患者仍然每日評價其器官功能障礙(或消除)的進展。
除了以上指出的測定外，當臨床上可以時，監測肝功能檢測的常規測定指標(AST，ALT，GGT)和血液尿素氮。每日從常規臨床實踐抽取的血液中檢測膽紅素和CRP。對於第2、3、4組，在基線時從研究患者中抽取14ml血液，在星期一、三、五抽取12ml血液，而在研究方案中，在停用Dipeptiven和/或Intestamin12小時後抽取，在研究方案中每周兩次(星期二和星期四)抽取2ml血液。處理該血液，貯存，並送至實驗室檢測血漿氨、胺基酸和二肽水平，以及其它標記物，包括穀胱甘肽、穀胱甘肽過氧化物酶和T-BARS。最後，評價患者的腸營養耐受，機械通氣持續時間，入院時間，和28天死亡率。
樣品大小和持續時間作為陰性對照的預期組中的30名患者和預期加入劑量範圍研究的28名患者來自KGH，6個月。
顯著性在該劑量研究中測試的治療策略說明了穀氨醯胺和抗氧化劑的需要的劑量和持續時間。可以進一步利用這些結果通知重症患者進行穀氨醯胺和抗氧化劑補充的大的、多中心的、III期隨機化試驗。
結果58名重症患者在兩年期間加入，接受劑量逐漸增加的穀氨醯胺和抗氧化劑(幹預概述見表5)。測定第1-5組的各種器官系統(心血管(CVS)；中樞神經系統(GNS)；凝血系統；腎；肝；呼吸(P/F比))的日SOFA得分。SOFA得分的降低指示改善。圖1A至1E分別示出了第1-5組的平均日SOFA得分。
圖2A至2E分別示出了第1-5組個體患者的總日SOFA得分的圖。圖2F中編繪的回歸線顯示第1-5組的日綜合SOFA得分相似，並且在整個研究幹預中遵循類似的下降趨勢表明對第2-5組施用的高劑量的穀氨醯胺和抗氧化劑無毒性，並且對器官功能沒有副作用。第2組所示的SOFA得分的增加(見圖2B中第6天至第10天的範圍)是由於7名患者中的2名在死亡前的SOFA得分顯著升高所致。發現這兩名患者的死亡和SOFA得分的升高是由於基礎疾病所致，與研究幹預無關。
由於穀氨醯胺是氮供體，高劑量的穀氨醯胺預期可使尿素和氨升高至不希望的水平。尿素和氨水平的測定顯示略微而不顯著的提高。如所預期的，硒水平顯著升高，特別是在第5組中。但是，這些化合物水平的升高不會不利地影響腎功能，如圖8中穩定的肌酐水平和圖1A至E中降低的SOFA得分所示。
圖3至7示出了研究幹預對紅細胞中穀胱甘肽(GSH)含量、氧化應激標記(TBARS)、線粒體功能指標(mtDNA/nDNA)的影響。
圖3示出了第2組(圖3A)、第3組(圖3B)、第4組(圖3C)和第5組(圖3D)患者紅細胞中穀胱甘肽(GSH)含量的圖，以較大的點示出了回歸線。第2組的線性回歸線證明GSH水平降低，P值具有顯著性(P＝0.0336)。其它第3-5組都不顯示這種類型的顯著性降低。該結果暗示接受較大抗氧化劑補充的組中GSH水平較高地保持。
圖4示出了第2組(圖4A)、第3組(圖4B)、第4組(圖4C)和第5組(圖4D)患者中硫代巴比妥酸反應性物質(TBARS)的血漿濃度的圖。用TBARS分析作為氧化應激的標記。第2-4組TBARS水平的線性回歸線沒有達到顯著性的P值。但是，第5組的TBARS線性回歸線顯示下降的斜率，達到顯著性(P＝0.0278)，暗示較高的抗氧化劑補充可以改善氧化應激的消除。
圖5示出了第2組(圖5A)、第3組(圖5B)、第4組(圖5C)和第5組(圖5D)患者的線粒體DNA和核DNA水平之比(mtDNA/nDNA)的圖。mtDNA/nDNA是線粒體功能的測定指標。第3、5組的線性回歸線顯示在治療過程中線粒體功能改善，兩條回歸線都顯示顯著性的P值(分別為P＜0.0001和P＝0.0280)。此外，在單張圖(圖5E)上對第2-5組的線性回歸線的編繪也達到了顯著性(P＝0.0012)。
圖6示出了被歸類為「存活的」或「死亡的」個體患者的mtDNA/nDNA比的圖，並以較大的點示出了回歸線。該結果表明改善的線粒體功能顯然與存活率有關，因為「存活的」或「死亡的」患者的線性回歸線達到顯著性(P＝0.04)。
圖7示出了被歸類為第2組患者或第3、4、5組患者的個體患者的mtDNA/nDNA比的圖，並以較大的點示出了回歸線。另外，線性回歸線達到顯著性(P＝0.033)。該結果表明第3、4、5組中的每一組都證明與第2組相比線粒體功能顯著改善，提示抗氧化劑和穀氨醯胺補充能夠改善線粒體功能。
這些附圖中的數據表明逐漸增加的穀氨醯胺和抗氧化劑劑量的效果是改善的線粒體功能，較高的氧化應激標記物的減少，較高的穀胱甘肽保存，對器官功能沒有明顯副作用。此外，如同IL-18的穩定水平所說明的(數據未示出)，炎症細胞因子沒有惡化。
所有引用文件都引入本文作為參考。
已經參照一個或多個實施方案描述了本發明。但是本領域技術人員應當清楚，在不背離如權利要求書限定的本發明範圍的情況下可以進行大量的變化和修改。
權利要求
1.一種組合物，包含每升溶液大約35至大約380克作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克的維生素E，和濃度為每升大約20至大約4000毫克的β-胡蘿蔔素。
2.根據權利要求1的組合物，其中所述抗氧化劑是濃度為每升大約1000至大約4000微克的硒。
3.根據權利要求1的組合物，其中所述穀氨醯胺的濃度為每升溶液大約50至大約150克。
4.根據權利要求2的組合物，其中不含脂質或碳水化合物。
5.含有權利要求1所述的組合物、總體積為大約50至大約1000毫升的單位劑量形式。
6.根據權利要求5的單位劑量形式，其中所述抗氧化劑是濃度為每升大約1000至大約4000微克的硒。
7.根據權利要求5的單位劑量形式，其中所述穀氨醯胺的濃度為每升溶液大約50至大約150克。
8.根據權利要求5的單位劑量形式，其中所述總體積為大約50至大約500毫升。
9.一種治療重症患者的方法，包括給需要這種治療的重症患者腸胃外施用權利要求1所述的組合物。
10.根據權利要求9的方法，其中以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重至大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
11.根據權利要求9的方法，其中所述抗氧化劑是硒，並且以大約400至大約2000微克的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
12.一種治療重症患者的方法，包括給需要這種治療的重症患者腸胃外施用權利要求4所述的組合物。
13.根據權利要求12的方法，其中以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重至大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
14.根據權利要求12的方法，其中所述抗氧化劑是硒，並且以大約400至大約2000微克的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
15.一種改善線粒體功能的方法，包括給需要這種治療的患者腸胃外施用權利要求1所述的組合物。
16.根據權利要求15的方法，其中以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重至大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
17.根據權利要求15的方法，其中所述抗氧化劑是硒，並且以大約400至大約2000微克的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
18.一種改善線粒體功能的方法，包括給需要這種治療的患者腸胃外施用權利要求4所述的組合物。
19.根據權利要求18的方法，其中以大約0.3g穀氨醯胺/kg體重至大約0.9g穀氨醯胺/kg體重的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
20.根據權利要求18的方法，其中所述抗氧化劑是硒，並且以大約400至大約2000微克的每日劑量給所述患者施用所述組合物。
21.根據權利要求1的組合物，其中給重症患者腸胃外施用所述組合物。
22.根據權利要求4的組合物，其中給重症患者腸胃外施用所述組合物。
23.根據權利要求1的組合物，其中為了改善患者的線粒體功能而腸胃外施用所述組合物。
24.根據權利要求4的組合物，其中為了改善患者的線粒體功能而腸胃外施用所述組合物。
25.根據權利要求5的單位劑量形式，其中給重症患者腸胃外施用所述組合物。
26.根據權利要求5的單位劑量形式，其中為了改善患者的線粒體功能而腸胃外施用所述組合物。
27.一種聯合藥物，包括每升溶液大約35至大約380克作為短鏈肽提供的穀氨醯胺，和抗氧化劑，該抗氧化劑選自濃度為每升大約400至大約10000微克的硒，濃度為每升大約1000至大約20000毫克的維生素C，濃度為每升大約20至大約800毫克的鋅，濃度為每升大約500至大約12000毫克的維生素E，和濃度為每升大約20至大約4000毫克的β-胡蘿蔔素。
28.根據權利要求27的聯合藥物，其中所述抗氧化劑是濃度為每升大約1000至大約4000微克的硒。
29.根據權利要求27的聯合藥物，其中所述穀氨醯胺的濃度為每升溶液大約50至大約150克。
30.根據權利要求28的聯合藥物，其中不含脂質或碳水化合物。
31.一種治療重症患者的方法，包括給需要這種治療的重症患者腸胃外施用權利要求27所述的聯合藥物。
32.一種治療重症患者的方法，包括給需要這種治療的重症患者腸胃外施用權利要求30所述的聯合藥物。
33.一種改善線粒體功能的方法，包括給需要這種治療的患者腸胃外施用權利要求27所述的聯合藥物。
34.一種改善線粒體功能的方法，包括給需要這種治療的患者腸胃外施用權利要求30所述的聯合藥物。
35.權利要求31-34中任一項的方法，其中所述穀氨醯胺和所述抗氧化劑同時施用。
36.權利要求31-34中任一項的方法，其中所述穀氨醯胺和所述抗氧化劑分別施用。
全文摘要
本發明可以總結如下。給重症患者腸胃外施用的或者用於改善線粒體功能的聯合藥物。該聯合藥物包括在臨床上有效的足夠濃度的穀氨醯胺前體分子和抗氧化劑。該聯合藥物可以在不存在脂質和碳水化合物的條件下製備。該聯合藥物可以小量製備，從而有利於體積受限的患者。也提供了含有該聯合藥物的組合物或單位劑量形式和施用該聯合藥物、組合物或單位劑量形式的方法。
文檔編號A61K31/015GK101084003SQ200580044021
公開日2007年12月5日 申請日期2005年12月21日 優先權日2004年12月21日
發明者D·K·海蘭德 申請人:重症救護聯絡公司