一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株的製作方法

2023-12-05 06:24:26

專利名稱：一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物病毒領域，涉及病毒新毒種，具體涉及一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株及其生物學特性。
背景技術：
2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先後發病，其中一頭小豬在發病兩天後死亡，發病豬臨床症狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。採集發病豬的腸道、淋巴結，置於冰盒中並在24h內送至實驗室。研磨病料，12000 r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細胞，結果分離到一株疑似豬傳染性胃腸炎病毒，經分子水平鑑定後確定其為HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒。

發明內容
本發明的目的是提供一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，分類命名豬傳染性胃腸炎病毒 TGEN HN-2012,拉丁文學名swine transmissible gastroenteritis virus,保藏單位中國典型培養物保藏中心，保藏單位簡稱CCTCC，保藏單位地址湖北省武漢市武昌區珞珈山路16號武漢大學，保藏日期2012年4月13日，保藏編號CCTCC NO :V201216。本發明的技術方案是一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o所述的豬傳染性胃腸炎病毒毒株具有下述特點
(I)所述毒株在電鏡下顯示呈圓形，有的呈橢圓形或多邊形。有雙層膜，囊膜上覆有花瓣狀纖突。病毒粒子的直徑為90 200 nm，符合豬傳染性胃腸炎病毒粒子的形態特徵。
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(2)分離的病毒能夠感染ST細胞，出現典型的病變。(3)經豬傳染性胃腸炎病毒陽性血清中和後不能引起細胞病變。(4)所述毒株對乙醚、氯仿和酸敏感；日光下6 h、紫外線照射均能使其滅活；不凝集雞、豚鼠和小鼠的紅細胞。(5)病毒的 TCID5tl 為 I(T7 67A). 2mL。(6)所述毒株的核酸類型是單股RNA病毒。(7)利用TGEV N基因的特異性引物對所述毒株進行PCR擴增並克隆測序，在NCBI上進行blast結果顯示其為TGEV的N基因序列。(S)TGEV N基因全場1171bp，編碼382個胺基酸，同源性結果分析顯示，所述毒株與美國強毒株代表DQ811785同源性最高，為99. 5%。進化樹結果分析顯示，所述毒株與韓國AF302264毒株是一大分支。HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒毒株可應用於製備TGEV疫苗的生產毒種。本發明的有益效果是本發明的HN-2012豬傳染性胃腸炎病毒滅活後免疫豬只，可以給豬提供有效的保護，是一株比較理想的制苗候選毒株。


圖1為TGEV N基因的測序結果，M =Marker 2000 ；1 =TGEV陽性對照；2 :分離樣品；3 :陰性對照；
圖2為TGEV N基因同源性分析；
圖3為TGEV N基因進化樹分析。
具體實施例方式2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先後發病，其中一頭小豬在發病兩天後死亡，發病豬臨床症狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。其發病表現與國內報導的其他地區發病的豬傳染性胃腸炎症狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。採集發病豬的腸道、淋巴結，置於冰盒中並在24 h內送至實驗室。研磨病料，12000r/min,離心10 min,過濾上清,接種ST細胞,結果分離到一株疑似傳染性胃腸炎病毒,用特異性引物進行分子鑑定後確定其為豬傳染性胃腸炎病毒。
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該病毒能夠感·染ST細胞，造成細胞拉網脫落等病變。對所述毒株進行N基因的PCR擴增並克隆測序，NCBI上BLAST得出其為豬傳染性胃腸炎病毒。本發明中，毒株定名為TGEV HN-2012。1、流行病學調查2012年I月，鄭州市新鄭市某豬場豬群10頭7日齡豬只先後發病，其中一頭小豬在發病兩天後死亡，發病豬臨床症狀為嘔吐、嚴重腹瀉、脫水。並且具有傳染性，其發病表現與國內報導的其他地區發病的豬傳染性胃腸炎症狀大致相似，初步判斷為豬傳染性胃腸炎。採集發病豬的腸道、淋巴結，置於冰盒中並在24 h內送至實驗室。2、病毒分離採集病死豬的空腸及腸繫膜淋巴結，用緩衝鹽水或含0.5%乳白蛋白水解物的D-HankJ S液製成1:5 1:10懸液，加入青黴素和鏈黴素各1000 u/ml或1000ug/ml,超聲波出來後,2000 r/min離心沉澱20 min,吸取上清液用濾膜(孔徑0. 2 um)過濾，濾液即為接種材料。接種細胞為豬睪丸細胞(ST細胞)。結果表明最初幾代無細胞病變(CPE)，盲傳至5-6代後出現典型的CPE，表現為細胞聚集、變圓，皺縮，細胞呈拉網狀，最後出現空泡病變。3、病毒PCR鑑定根據GenBank資料庫中已有的豬傳染性胃腸炎病毒的N基因核苷酸序列，用Clustal、DNAstar等生物軟體進行同源性分析後，選出較為保守的核苷酸區域，應用Primer 5. 0設計N基因的特異性引物。參照GENEray高純總RNA快速提取試劑盒的說明書進行，具體操作步驟如下取新鮮的病毒樣品400 U L加入裝有400 V- L Trizol的1. 5 mL RNase-free離心管中混合均勻，劇烈震蕩直到液體清亮；加入100 u L氯仿/異戊醇,劇烈震蕩混勻30 s ;臺式離心機上12000 r/min,離心5 min ;將上清液小心轉到無菌1. 5 mL RNase-free離心管裡,加入150 u L無水乙醇，混勻(此處可能會出現絮狀沉澱物);將上述溶液(包括沉澱)轉移到套放於2 mL收集管內的GenClean柱中，室溫放置2 min, 12000 r/min離心I min ;小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450 UL RPE Solution, 12000 r/min,室溫離心30 s ;重複上一步驟一次；小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，10000 r/min,室溫離心30 s ;小心取出柱子,放入無菌RNase-free的1. 5 mL離心管裡，在柱內膜的中央小心加入40 uL DEPC-H2O, 55 58 °C放置2 min (室溫放置產率約低20%左右)；12000 r/min，室溫離心I min。收集管內的溶液為RNA樣品，可立即使用或者-70°C保存。反轉錄過程，根據Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit試劑盒說明書進行，具體步驟是取11 uL DEPC處理水溶液中的RNA;oligo (dT)18primer I iiL,70°C水浴 10 min,快速放置冰上 5 min ;按順序加入 5XReaction buffer 4U L, RiboLock RNase Inhibitor I u L, 10 mM dNTP Mix 2 u L,瞬時離心後，放入 42°C水浴 2min ;快速加入 I u L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase,總體積 20 uL,瞬時離心後繼續放入42 °C水浴60 min, 70 °C水浴15 min,即為反轉錄的cDNA,可立即使用或者-70°C保存。PCR反應體系
cDNA2 UL
Premix EX Taq12. 5 U L
上遊引物PlI UL
上遊引物P2I UL
ddH208. 5 u L
Total Volume25 u L
PCR反應條件依次加入表中各成分，混勻離心，PCR擴增程序為95 °C預變性5 min,94 °C變性30 s，53 °C退 火30 s，延伸72 °C I min，運行30個循環後於72 °C延伸10 min。反結束後取PCR產物5 y L，採用1%瓊脂糖凝膠電泳鑑定。結果如圖1所示。圖1為TGEV的結構蛋白N基因的PCR擴增結果，圖中M泳道為DNA ladder marker 2000 (2000, 1000,750，500，250, 100);泳道2為目的基因PCR擴增結果，片段大約都在1171bp，陽性毒株和分尚毒株均在1171bp出擴出條帶，與預期大小相符。4、生物學特性研究
4.1 TGEV紅細胞凝性的測定
用新鮮製備的雞、豚鼠、小鼠等動物的I %紅細胞懸液與新鮮收穫的病毒液做HA試驗，結果顯示所述毒株對上面幾種動物的紅細胞均無凝集性。4. 2脂溶劑敏感性試驗
4.2.1對乙醚的敏感試驗
將病毒液加入兩個滅菌小管中，I mL/管，於其中I管內加入乙醚0. 2 mL至終濃度為200 mL/L，另一管加滅菌生理鹽水作陰性對照，斡旋振蕩10 min, 4 °C作用24 h。加入乙醚的小管，可分為清晰的兩層。吸取下層病毒液，移入另一小管內，使殘餘乙醚全部揮發。然後分別取上述兩份病毒液測定TCID5tl,如經過乙醚處理的病毒液和對照組的病毒液血凝價相差2個滴度以上，則判為病毒對乙醚敏感。4. 2. 2對氯仿的敏感試驗
將新鮮病毒液加入兩個滅菌小管中，I mL/管，加入終濃度為48 mL/0.2分析純氯仿混合振蕩，置於4 V作用10 min。另一組用滅菌生理鹽水代替氯仿作陰性對照，每個處理樣品測定TCID5tl,氯仿處理過的病毒液滴度比對照管病毒液滴度下降2個滴度以上，則判為病毒對氯仿敏感。
4. 2. 3對酸(PH 2. 0)的敏感性試驗
取2隻經高壓滅菌的離心管，在超淨臺內分別加入3 mL的新鮮病毒液，一組用0.1mol/L的鹽酸調PH至2.0，於37°C水浴中作用I h，隨後用500 r/min的速度離心5 min，然後吸取上層液體測定病毒TCID5tlt5另一組加入和鹽酸用量相等的滅菌生理鹽水室溫用作為對照，同樣處理後測定TCID5Q。試驗管和對照管相差2個滴度以上者判為敏感。理化特性試驗表明所述毒株經過氯仿、乙醚和酸處理後，不能再感染細胞，判斷其對脂溶劑敏感。4. 3病毒滴度TCID5tl的測定
將消化吹散的ST細胞懸液加入96孔細胞培養板，於5% CO2, 37 °C恆溫培養箱中培養，待其貼壁後棄上清及非粘附細胞。取新鮮病毒液用2% DMEM分別連續倍比稀釋KT1 10_8，每個稀釋度各做8個重複，接種96孔細胞培養板，每孔0. 2 mL,設一行正常細胞生長對照孔，逐日觀察細胞病變並統計結果。按照Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5tlt5具體計算如下
權利要求
1. 一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特徵在於豬傳染性胃腸炎病毒(SWine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o
全文摘要
本發明公開了一種豬傳染性胃腸炎病毒毒株，其特徵在於豬傳染性胃腸炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus)，CCTCC NOV201216。本發明的豬傳染性胃腸炎病毒滅活後免疫豬只，可以給豬提供有效的保護，是一株比較理想的制苗候選毒株。
文檔編號C12R1/93GK103045543SQ20121052232
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月7日 優先權日2012年12月7日
發明者胡慧, 魏戰勇, 崔保安, 陳雅君, 張莉娟, 劉中原, 寇亞楠 申請人:河南農業大學