應用肽－藥物的結合減少受試者間藥物血清水平的變異的製作方法

2023-11-30 21:35:06

專利名稱：應用肽－藥物的結合減少受試者間藥物血清水平的變異的製作方法
相互有關的申請本申請要求於2002/2/22提交的美國臨時申請第60/358,382號和2002/3/7提交的美國臨時申請第60/362,083號的優先權。這裡將它們完整包括供作參考。
所述發明的領域所述發明旨在合成和藥物分子結合的胺基酸聚合物，並應用這些結合物將藥物輸入至血清中，這時個體之間的變異要比單獨給藥所見到的小。
口服藥物的吸收程度對於決定體循環中的藥物濃度或血清水平來說是關鍵的。在血流中，藥物分子將經歷各種命運，包括與血清蛋白質結合，分布到其作用的部位(理想的命運)，還有組織蓄積，生物轉化或代謝以及最終的排洩。這些命運之前有初始的吸收過程。雖然口服途徑通常被認為是最安全和最方便的途徑，但是它會帶來相對較高程度的變異。口服途徑安全的原因之一是因為胃腸道(GI)中的藥物在到達體循環之前可能被酶來自(從腸內菌叢，黏膜和肝臟)代謝。發生在吸收和體循環之間的藥物代謝指的是「首關效應(first pass effect)」。
在一些實例中，有可能在一組劑量之後測定血清水平並計算相關參數，但這不是常規做的。劑量方案的最優化更通常的是通過測定藥物治療作用和調整劑量直至獲得理想的作用的較實際的方法來決定。在治療作用更帶主觀性的一些情況中，例如通常用來治療精神疾病的許多藥物，可通過調整它們的劑量而消除不良作用，例如噁心或眩暈。在一些情況中，可證明藥物劑量的最優化要比它在每天的臨床醫療中接受的關注更少。無論如何，由於治療性藥物的監測通常在醫院外是很困難的，因此任何減少病人間變異的方法對於劑量指導的決定是有實際意義的。這對於那些剛剛開始用於特定病人的新藥物來說尤其如此。
所述發明的簡述所述發明包括一種共價結合於生物聚合物，例如肽，的藥物分子。在口服給藥之後，消化酶例如胰蛋白酶，催化肽的水解，從而導致藥物的吸收。這種吸收的發生使得病人間血清藥物水平的變異比單獨應用藥物時小。
所述發明的另外一種實施方案是所述活性藥物可與各種胺基酸組成的肽結合，賦予結合物特殊的物理化學特性，包括分子量、大小、功能團、pH敏感性、溶解性、三維結構和消化性，從而提供了理想的性能特點。相似的，多種活性藥物可與特別優選的肽一起應用產生特殊的性能特點。關於通過應用20種天然存在的胺基酸中的一種或多種賦予活性藥物穩定性、釋放和/或吸收特性的顯著優點在肽的下列物理化學特性中是顯而易見的，這種肽的物理化學特性賦予活性藥物形成的結合物特殊的穩定性、消化性和釋放特性。
在所述發明的其他實施方案中，有一個概念，就是組成載體肽的胺基酸是一組工具，以便使載體肽符合藥理要求和活性藥物的化學結構，從而達到組合物有最大的穩定性和最佳性能。
在其他優選的實施方案中，所述胺基酸鏈的長度可根據不同的傳輸標準變化。為了增加傳輸的生物利用度，所述活性藥物可連接至單個胺基酸到八個胺基酸，2-5個胺基酸的範圍是優選的。為了調節傳輸或增加活性藥物的生物利用度，所述寡肽的優選長度是在2-50個胺基酸長度之間。為了保護構象、延長消化時間並且持續釋放，優選的胺基酸長度在8-400個胺基酸之間。在其他的實施方案中，所述發明的結合物也適合於大和小分子的活性藥物。在所述發明其他的實施方案中，載體肽控制了活性藥物-肽結合物的溶解性，並不依賴於活性藥物的溶解性。因此，由結合物-藥物組合物提供的持續或0級動力學機制避免了不規則的釋放以及典型的由溶出控制的持續釋放方法造成的難處理的製劑。
在其他優選的實施方案中，所述活性藥物結合物可包含選出的佐劑，使組合物和特異性受體相互作用，從而實現靶向傳輸。這些組合物在腸道所有部位和沿著腸壁在特異性部位提供靶向傳輸。在其他優選的實施方案中，所述活性藥物在進入靶細胞之前的釋放和來自肽結合物的參考活性藥物一樣。在其他優選的實施方案中，所應用的特異性胺基酸序列不是針對特異性細胞受體，也不設計成被特異性基因序列所識別。在一種更優選的實施方案中，所述肽載體設計成被腫瘤細胞識別和/或不被識別。在其他優選的實施方案中，所述活性藥物傳輸系統不要求活性藥物在特殊的細胞中或細胞內釋放。在一種優選的實施方案中，所述載體和/或結合物在體內是通過特異性識別而起作用的。(例如通過癌細胞，引物(改善趨化活性)，通過血清蛋白質特異的結合位點的序列)(例如激肽或類花生四烯酸類)。
在其他實施方案中，所述活性藥物可與佐劑結合，這種佐劑被一種活性轉運蛋白識別和攝取。在一種更優選的實施例中，所述主動轉運蛋白不是膽汁酸主動轉運蛋白。在其他實施方案中，所述發明不要求活性藥物連接在傳輸時被主動轉運蛋白識別和攝取的佐劑。在其他實施方案中，所述佐劑提供了一種可供選擇的轉運機制，它克服了被動擴散的局限性。並且肽載體、佐劑或它們的組合可促進主動轉運。
在優選的實施方案中，所述活性藥物結合物不與固定化的載體結合，而它的設計更是為了通過消化系統轉運和轉化。
所述發明其他的實施方案是，通過利用肽對活性藥物的保護性作用增加藥物結合物的穩定性，從而減少變異。這種保護性作用可賦予那些對於酸不穩定的活性藥物，不然它們就會在胃中降解。此外，所述載體肽可保護活性藥物不受由胃或胰腺分泌的酶的作用，在那裡活性藥物受到保護直至被吸收，接著在腸上皮細胞中由肽酶釋放。
雖然微球體/膠囊可與所述發明的組合物聯合應用，所述組合物優選的不包含在微球體/膠囊中，並不需要另外的添加劑來改善持續釋放或調節吸收。
在一種優選的實施方案中，所述活性藥物不是激素、穀氨醯胺、甲氨喋呤、柔紅黴素、胰蛋白酶-激肽釋放酶抑制劑，胰島素、鈣調蛋白、降鈣素、L-多巴、白細胞介素、促性腺素釋放素、炔諾酮、託美汀、伐昔洛韋、紫杉醇或磺胺嘧啶銀。在一種優選的實施方案中，所述活性藥物是肽類活性藥物，優選的是所述活性藥物是未修飾的(例如胺基酸結構沒有被取代)。
在一種優選的實施方案中，所述發明提供了一種相互結合的載體和活性藥物，但在其他方面結構上沒有被修飾。在一種更優選的實施方案中，所述載體，不管是單胺基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽，僅僅包括天然存在的胺基酸。
在一種優選的實施方案中，所述載體不是蛋白質轉運蛋白(例如組蛋白、胰島素、運鐵蛋白、IGF、白蛋白或催乳素)，Ala、Gly、Phe-Gly或Phe-Phe。在一種優選的實施方案中，所述載體也不是一種和非胺基酸取代物例如PVP共聚的胺基酸，聚(亞烷基氧化物)胺基酸共聚物，或烷氧羰基(聚天冬氨酸鹽/聚穀氨酸鹽)或一種芳氧基羰基甲基(聚天冬氨酸鹽/聚穀氨酸鹽)。
在一種優選的實施方案中，所述載體或結合物都不用來分析提純、結合研究或酶分析。
在其他實施方案中，所述載體肽可與多種活性藥物結合。所述結合物提供了不僅僅是活性藥物，也可以是活性藥物與其他活性藥物的聯合，或其他被修飾過的分子多重結合的附加的好處，，它們能進一步改進傳輸，增加釋放，靶向傳輸入，和/或增加吸收。在其他實施方案中，所述結合物也可與佐劑結合或被裝入微囊。
在一種優選的實施方案中，所述發明提供了一種相互結合的載體和活性藥物，但其他方面在結構上沒有被修飾。這種實施方案可進一步描述為含有游離羧基和/或胺末端和/或側鏈基團的載體，它們不是活性藥物的結合位點。在一種更優選的實施方案中，所述載體，不管是單個胺基酸、二肽、三肽、寡肽或多肽，僅僅包括天然存在的胺基酸。
附圖簡述

圖1圖示了參考藥物與所述發明的肽軛合藥物的一種典型釋放曲線。
圖2闡明了影響生物利用度的因素的圖，來自Amindon等；圖3圖示了與單獨T4以及對照相比較的基底側T4-結合物的濃度；圖4圖示了頂側和基底側的T4-結合物濃度；圖5圖示了聚T4(T4-結合物)和T4鈉平均總T4(TT4)血清濃度和δ(TT4)；圖6圖示了聚T3和T3鈉平均總T3(TT3)血清濃度和δ(TT3)；圖7圖示了polythroid、T4鈉加T3鈉和T3鈉的總T3血清濃度曲線；圖8圖示了磷酸化AZT和胸苷的化學結構；圖9圖示了AZT和LeuGlu/AZT結合物血清濃度曲線；圖10圖示了聚T3和T3單體的人體臨床試驗。
優選實施方案的詳述應用生物利用度可有效的量化藥物吸收。這定義為到達體循環的劑量分數(F)。因此，在極端的場合，在GI道中完全不吸收的藥物F＝0，而完全吸收的藥物(且不經首過效應代謝)F＝1。所述生物利用度可根據血清水平對時間標給的曲線下面積(AUC)計算。它依賴於許多因素，這些因素在正常的個體間是不同的。所述變異係數(CV)典型的用來表達生物利用度的變異。這個值通過將標準差表達為佔算術平均數的百分比而獲得。
例如，在抗癲癇藥物加巴噴丁的研究中，Gidal及其同事發現在口服給藥後受試者間AUC的CV是22.5％。相似的，對於降低膽固醇的藥物西立伐他汀來說，個體間AUC的變異在30％和40％之間。在癌症病人的研究中發現嗎啡的CV是50％。和首過效應相關的高度變異是導致嗎啡高CV值的原因。大體上，許多藥物生物利用度的CV大約是20％。這在藥物動力學上不是罕見的，因為其他參數會變化更大。例如，穩態分布容積(Vss)的CV大約是30％，清除率(CL)的CV大約是50％。然而，藥物傳輸的改變會使得生物利用度的變異最小，這對於治療是有價值的。理想的，對於要開給藥物的個體來說所有這些藥物動力學參數的值，醫生是了解的，但情況很少如此。
在1998年，Stavchansky和Pade報導許多被研究的藥物在人體吸收的百分比和滲透性之間是線性相關的，但呋塞米是例外。有趣的是，和呋塞米在結構上密切有關的氯噻嗪，在人體中的滲透性和吸收率都很低，這和其他藥物很相關。(見，Linkbetween Drug Absorption Solubility and Permeability Measurements in Caco-2Cells；J.of Pharm.Sci.卷87，No.12160407(1998))。呋塞米的吸收要比標繪預計的高，實際上它的滲透性比氯噻嗪低。可以推斷呋塞米與氯噻嗪相比通過一種不同的機制轉運，雖然它們在化學上是十分相似的。此外，所述研究也顯示呋塞米、氯噻嗪和西咪替丁可能有與被動吸收相反的主動流出機制。因此，為克服其低滲透性和溶解性而改善氯噻嗪吸收的研究，對於它的總效能是一個重大的進步，也可減少利尿劑的吸收變異。
變異可被定義為較低的標準偏差或離群值數目的減少。它直接轉化為應用特定藥物所伴隨發生的不良事件次數的降低。本發明的一種實施方案是，受試者間變異的減少可通過減少吸收的離群值的數目而實現。
個體病人對於特定劑量的藥物生物反應的變異有多種原因。病人的一個正態總體對於以特定濃度存在於血中的藥物有不同程度的反應。本發明不涉及病人間差異的來源。這裡的焦點是在口服施用特定劑量後，病人間血藥水平的差異。具體說，它是從胃腸道吸收藥物。這個過程的關鍵是擴散和轉運的概念。轉運是指藥物在體內從一個地方轉移至另外一個地方。這個過程典型的包括移動通過生物膜，它通過任何一種或以下類型擴散的聯合而發生。
簡單非離子擴散和被動轉運—這種類型的移動用來描述無電荷分子通過無電梯度區域的隨機運動。一段時間內轉運通過膜的藥物淨數量(Q)的變化可通過Fick’s擴散定律計算dQ/dT＝DA(C1-C2)/x；其中D＝擴散係數，A＝面積；C1和C2是膜兩側的濃度，x是膜的厚度。所述膜的因子被合併成一個常數P，即滲透性常數或係數。因此，被動擴散可通過以下方程描述，dQ/dt＝P(C1-C2)。藥物通過濃度梯度的移動以一級過程繼續直至膜的兩邊濃度相等。
離子或電化學的擴散—離子藥物分子除了從高濃度移動至低濃度外，還根據電化學梯度分布。因此，帶負電荷的藥物和帶正電荷的藥物的擴散是不相同的。
易化擴散—這描述了和簡單擴散相比加速了的通過生物膜的移動。膜中一種特殊的載體分子被認為在膜一側和藥物結合，並沿著電化學梯度將它移動至另外一側。在那裡，藥物從載體解離，接著游離的載體重複那個過程。
主動轉運—和易化擴散相比，這個過程包括藥物逆著電化學梯度通過生物膜的能量依賴性的移動。轉運系統典型地顯示出要求被轉運的分子有一種特殊的化學結構，並且和化學結構主要部分密切相關的分子進行競爭。根據被轉運底物的物理特性，可將存在已知的腸轉運系統分為七類。它們包括胺基酸、寡肽、葡萄糖、一元羧酸、磷酸酯、膽汁酸，以及P-糖蛋白轉運系統，它們各自都有自己相關的轉運機制。所述機制依賴於氫離子、鈉離子、結合位點或其他輔因子。
胞飲作用和胞吐作用—這些過程分別描述了物質通過一種類型的吞噬作用移動進出細胞。細胞膜內陷將藥物包含在收緊的小泡中，並將其轉運通過膜。這種類型的轉運被認為在腸道中是重要的，在那裡這種轉運可能與大分子和較大微粒例如某些蛋白質的吸收有關。
改善的吸收—影響藥物由胃腸道(GI)吸收程度的物理化學和生物學因素包括溶劑化、氫鍵、構象的改變、pH、pKa、logP、代謝和外在以及內在的因素。將這些支配吸收的特殊機制的因素組合是每種藥物與生俱來的。絕大部分藥物是通過被動轉運、離子擴散、易化擴散、主動轉運或胞飲作用被吸收的。此外，如果藥物的滲透性很低，通常就觀察到生物利用度的變異較大。不管是改善通透性還是促進主動轉運機制，都將提高這類藥物的生物利用度。對於那些主要依賴主動轉運的藥物(例如DOPA、左甲狀腺素、碘塞羅寧)來說，改善藥物的溶解性或為藥物提供其他可供選擇的轉運途徑也會提高吸收。
較低的峰值—藥物治療中一個基本的考慮因素包括血藥水平和治療活性之間的關係。對於大多數藥物來說，最重要的就是血清水平保持在最小有效濃度和潛在毒性水平之間。在藥物動力學關係上，藥物血液水平的峰和谷值理想的完全與血清濃度治療窗符合。
低峰值某些治療藥物的。這個窗如此狹窄以致製劑變得很關鍵。用來治療心衰的藥物地高辛就是這樣的情況。治療血濃度包括的範圍是0.8ng/mL(低於它就觀察不到理想的作用)-2ng/mL(高於它就會產生毒性)之間。在觀察到臨床毒性的成人中，2/3的血清地高辛濃度大於2ng/mL。並且，只要在這個最大水平之上稍有上升，不良反應就明顯增加。例如，在血清藥物濃度為1.7、2.5、3.3ng/mL時，地高辛引起的心律失常的發生率分別是10％、50％和90％。
在口服施用地高辛後，通常在1-2小時內作用會顯現，而在4-6小時之間觀察到最大作用。在足夠長一段時間後，血漿中的濃度以及總的體內儲備依賴於每天一次的維持劑量。關鍵的是這種劑量對於每個病人來說應該是個體化的。因此擁有一種能在幾次給藥期間提供更穩定的血清水平的地高辛劑型是十分有益的。
另外一個例子由β-阻滯劑阿替洛爾提供。這種經常應用的藥物作用持續時間據推測通常是24小時。然而，如果以每天25-100mg一次的正常劑量範圍給藥，所述作用就會在下次劑量起效之前數小時消失。對於治療心絞痛、高血壓或預防心臟病發作的病人來說，這是尤為危險的。另外一種選擇是為了在血清水平最低時獲得理想的作用水平，給予比所需更大的劑量。這就有和給藥間期初始階段過高濃度相關的副作用危險。在這些較高的水平，阿替洛爾失去了其潛在的有利的β-1選擇性，和β-2受體阻滯相關的不良反應變得更顯著。這可以通過在施用聚阿替洛爾之後獲得更恆定的阿替洛爾水平而避免。
降低變異性—已經有幾種模型設計用來預測通過胃腸道的藥物的生物利用度。由Amidon等提出的模型提供了一種產生直觀算法的方便途徑。(見Amidon，GL，Lennernas，H；Shah，VP，Crison，JR(1995)。「A Theoretical Basis for aBiopharmaceutic Drug ClassificationThe Correlation of in Vitro and in VivoBioavailability.」Pharm.Res.，12(3)，413-20；Amidon，GL，Oh，D-M，Curl，RL(1993)。「Estimating the Fraction Dose Absorbed from Suspensions of Poorly SolubleCompounds in HumansA Mathematical Model.」Pharm.Res.，10(2)，264-70.)。所述Amidon模型應用三個關鍵的無量綱變量預測藥物的吸收或藥物吸收的分數(F)。第一個變量，吸收值(An)，它與藥物的有效滲透性(Peff)以及腸道的容積流速(tres/R)是成比例的，通過以下方程決定An＝(Pefftres)/R。第二個變量，劑量值(Do)，是劑量(M0)，藥物溶解度(Cs)和藥物利用水的體積(V0)的函數，通過以下方程決定Do＝M0/(CsV0)。第三個變量，溶出值(Dn)，包括擴散係數(D)、溶解度(Cs)、腸道轉運時間(tres)、微粒大小(r)和密度(ρ)，通過以下方程決定Dn＝(3DCstres)/(r2ρ)。
通過同時解這些和其他方程估計F，對它們的描述。這裡不打算討論只要說在給定An時能產生F估計值對Dn和Do的等高線圖就足夠了。圖2顯示了An＝10的高滲透性藥物的典型圖(圖2來自Pharm.Res.，12(3)，416)。可以看到曲線的斜率在Do(10-100)和Dn(0.2-2)的臨界區域是最大的。這個臨界區域和變異最大的藥物的吸收程度是相符的。如果An值低於10，臨界區域的斜率就更陡，Fmax的面積就更小。因此，藥物的生物利用度可通過增加An而提高，這可以通過促進主動轉運機制而實現。
為了闡明這一點，表1顯示了為獲得90％吸收或F＝90％導出的An、Do和Dn值。表中的數據表明在Do值的一定範圍內，增加An就會減少Dn的變化。例如，當An＝2.0時，Dn的變化是2.06-1.87＝0.19，這時Do的範圍為0.1-0.5。相比較而言，當An＝7.0時，Dn的變化是1.32-1.28＝0.04，這時Do的範圍相同。這意味著有一定Dn值的藥物，當An值上升時，它的Fmax可保持在更寬的Do值範圍內。換言之，藥物的An值越高，藥物的給藥劑量更靈活，吸收分數的變異更低。
表1.90％劑量吸收分數的吸收值(An)、劑量值(Dn)和溶出值(Dn)
a未假設Do限度b未假設bNo Dn限度甲狀腺激素T4就是一個例子，說明如何通過增加藥物的Dn減少藥物吸收的變異。(對於那些有臨界Do值的藥物來說，降低Do相似的也可以減少變異)。估計T4的Cs是6.9μg/ml，假定V0是250ml，應用典型劑量100μg，可估計T4的Do值是0.057。由於口服施用的甲狀腺激素極可能是主動轉運通過腸上皮的，可以推測T4的An近似為10。這是葡萄糖實驗測定的An，據所知它是主動轉運的。從圖2中的等高線圖以及報導的T4生物利用度推測，T4的Dn在0.2-2之間。如果Dn＝1，Cs＝6.9μg/ml，tres＝240min，r＝25μm，ρ＝1000mg/ml，T4的D估計為1.21×10-3cm2/min，這是一個相對較高的數值，因此對於T4來說Dn值大於1不太可能，除非Cs增加。保持所有其他變量相同，將T4的Cs增加至69μg/ml會使得Dn上升至10，Do下降至0.0057。這使T4的F值接近等高線圖的上面的平臺(即Fmax)，在這裡吸收是最大的，而變異是最小的。
假設T4的An等於7。為了使T4 90％被吸收，它的Dn需近似為1.3，這是很難實現的。因此，如果An＝7，Dn＝1，Do＝0.057，那麼T4的F將大大低於報導的48％。無論如何，增加藥物的生物利用度，不管是通過增加Dn或An還是通過降低Do，都會減少它吸收的變異。
注意這些類型的轉運以及以上的標準，就能清楚的知道以下因素為什麼能影響藥物的吸收濃度、製劑的物理狀態，溶出度、吸收表面積、血管分布和血流，胃的活動和排空，以及溶解度。一種增加吸收入細胞的方法是通過將藥物結合於肽。根據先前的討論，肽藥物結合物可能參與易化和主動轉運過程以及胞飲作用，否則在藥物吸收中不會觀察到它們。
有證據表明某些化合物通過特異性的轉運蛋白通過腸上皮細胞被有效的吸收。根據轉運底物的物理特性分類，存在七種已知的腸轉運系統。它們包括胺基酸、寡肽、葡萄糖、一元羧酸、磷酸酯、膽汁酸，以及P-糖蛋白轉運系統，它們各自都有自己相關的轉運機制。所述機制依賴於氫離子、鈉離子、結合位點或其他輔因子。所述發明也使腸上皮轉運系統的機制針對促進活性藥物的吸收。
整個膜轉運系統是內在不對稱的，不對稱的對手性化合物起作用，例如胺基酸。因此，人們預期膜轉運系統的激活將包括一些類型的特殊佐劑，這增加了活性藥物通過生物膜的轉運。合適的佐劑，例如包括木瓜蛋白酶，它是一種將氨基肽酶-N的催化域釋放入腔內的有效酶；糖識別物，它會激活刷狀緣膜中的酶；膽汁酸，它與肽結合，從而增加了肽的吸收。
Caco-2或其他腸上皮模型系統(例如培養的HT29-H杯狀細胞)可用來預測腸道對藥物的吸收。早期應用這些模型系統的研究表明通過被動跨細胞吸收途徑吸收的藥物更容易在這些模型系統中研究，因為它們需要相對較小的吸收表面積(出現於培養物模型，和廣泛摺疊的腸內襯相比)。此外，Caco-2細胞模型對於腫瘤細胞的再分化，因此對於關鍵的上皮標記物的再表達已經過最優化(這是通過將細胞平面培養在膠原原纖維支架上並將該細胞補充入規定的細胞活素的混合物中而實現)。然而，HT29細胞可產生粘液，但不能表達上皮細胞的其他分化標記物，並通常被認為是生物吸收較為不可靠的模型。
通過被動的細胞旁途徑(通常限制分子的大小)吸收的藥物不能有效的在Caco-2模型中吸收，可能是由於這種模型緊密連接中的孔相對較少。然而，這些分子的體外吸收之間的相關性在性質上和體內的吸收是相同的。
採用主動轉運過程吸收的藥物似乎需要闡明該轉運過程的特點以完全了解任何體外/體內的相關性。例如，Caco-2細胞不轉運L-dopa，這和它在體內通過大的中性胺基酸載體迅速有效的吸收不太相似。這是因為這種載體在培養基中表達較低。其他採用主動轉運機制的化合物，似乎和體內吸收更相關，這表明所述轉運機制必須在關聯之前被限定。
因此，優選的是所述活性藥物結合物通過細胞旁或主動轉運機制吸收。已經使得所述Caco-2模型能最優化地再表達細胞相關的蛋白酶，這樣前體藥物(結合物)的釋放潛力就更大。所述結合物也會促進通過細胞受體結合於細胞表面，例如二-和三-肽轉運蛋白或一些未知的，但特異的受體，它們提供了一種連續釋放劑量的機制。進而，所述再分化Caco-2細胞能夠再表達細胞表面分子所有適當的組成成分。下面是三種釋放/吸收產生可重現的攝取的可能機制(1)通過前體藥物片段促進結合至細胞表面，通過細胞表面相關的蛋白酶釋放。
(2)通過前體藥物片段促進結合至細胞表面，胞吞後在胞吞小泡的溶酶體環境中釋放。
(3)主動轉運小的以二聚物/三聚物為基礎的前體藥物，並在溶酶體腔或通過血清蛋白酶釋放。
所述發明的一種實施方案提供的方法，用來測定藥物結合至單個胺基酸、二肽、三肽、寡肽和/或一種肽如何改變吸收。在一種優選的實施方案中，所述活性藥物是呋塞米，它是通過將呋塞米結合至在蛋白質合成中應用的20種普通胺基酸中的每種胺基酸而合成的。在一種優選的實施方案中，所述呋塞米二肽絲氨酸結合物選自Ile-Ser(呋塞米)-Ome；Glu-Ser(呋塞米)-Ome以及Phe-Ser(呋塞米)-OH。接著測試每個胺基酸加入結合物後對於呋塞米通過Caco-2細胞吸收的任何影響。當觀察到易化轉運時，接著進行附加的實驗評價易化產生的過程。為了進一步改變胺基酸結合物的作用，可另外結合胺基酸改變藥物動力學參數。
所述發明還提供了一種控制活性藥物從組合物中釋放的方法，其中所述組合物包含一種肽，所述方法包括將受肽控制釋放的活性藥物共價結合至肽。在所述發明的其他實施方案中，通過延長治療窗內的持續血藥水平的時間實現提高來自多種化學和治療類別的活性藥物的性能的效果。對於標準製劑產生良好的生物利用度的藥物來說，所述血清水平到達峰值對於如圖1所示的最佳臨床效果來說是太快了，。設計和合成一種特殊的能通過腸道酶消化釋放活性藥物的肽結合物，就可以調節釋放和吸收特點，從而使活性藥物隨時間的吸收變得平緩，而仍在曲線下保持相當的面積。
所述發明的結合物前體藥物使得母體化合物持續或延長釋放。持續釋放典型的指接近緩慢的一級動力學吸收。延遲釋放典型的指為所述化合物的吸收提供0級動力學。生物利用度還可以被吸收速率以外的因素影響，例如通過腸上皮細胞和肝臟的首過代謝，腎臟的清除率。涉及這些因素的機制要求所述藥物-結合物在吸收之後是完整的。定時釋放的機制可能是由於許多因素中的任何一種或所有因素。這些因素包括1)通過腔內消化酶逐漸酶促釋放母體藥物，2)通過表面聯結的腸黏膜酶逐漸釋放，3)通過腸黏膜細胞的細胞內酶逐漸釋放，4)通過血清酶逐漸釋放，5)被動吸收機制轉化為主動攝取機制，使得藥物吸收依賴於受體結合的Km，以及受體密度，6)降低母體藥物的溶解性導致更緩慢的溶出，7)溶解度的增加會導致更大量藥物的溶出，因此由於可利用數量的增加吸收需要更長的時間。
酶介導釋放技術的潛在好處超越了以上描述的例子。對於那些可從吸收增加受益的活性藥物來說，所述發明一種實施方案的實施就是通過將那些活性藥物共價結合於肽的一個或多個胺基酸並如先前所述對病人給藥。所述發明也針對腸上皮轉運系統，促進活性藥物的吸收。反過來，更好的生物利用度有助於所需劑量更低。因此，所述發明的另外一種實施方案是以這裡所述的方式通過調節釋放和改善活性藥物的生物利用度實現降低活性藥物的毒性。
所述發明另外一種實施方案是連接一個胺基酸、寡肽或多肽，它可通過許多機制增加母體藥物的吸收/生物利用度，包括母體藥物轉化為聚合物-藥物結合物，使胺基酸前體藥物可被胺基酸受體和/或二肽、三肽受體攝取(PEPT轉運蛋白)。這對於聚合物藥物結合物也是正確的，因為腸道中酶活性的產物可產生連接1-3個胺基酸的前體藥物。而且，其他受體可能在前體藥物的結合和攝取中也是有活性的。為藥物吸收增加一種或多種其他機制會改善它的生物利用度，尤其在是附加的機制要比母體藥物吸收機制更有效時。許多藥物通過被動擴散吸收。因此，將胺基酸連接到化合物上可使吸收機制從被動轉化為主動，或在一些實例中變為主動和被動攝取的組合，這是由於前體藥物可通過腸腔中的酶活性逐漸轉化為母體藥物。
所述發明另外一種實施方案是活性藥物的效果通過較低的活性藥物血清濃度而增強。所述發明另外一種實施方案是將多種活性藥物結合至載體肽上，從而持續釋放和吸收所述活性藥物，這將會幫助實現精確的每天一次的藥物代謝動力學。在所述發明的其他實施方案中，峰和谷可被改善，例如在施用肽-阿替洛爾結合物後獲得更穩定的阿替洛爾水平。
在所述發明的其他實施方案中，所應用的胺基酸會使結合物在某些pH或溫度更不穩定或更穩定，這依賴於所要求的傳輸。進而，在其他實施方案中，所述胺基酸的選擇將依賴於理想的物理特性。例如，如果體積或親脂性的增加是理想的，那麼載體多肽將包括氨基乙酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。另一方面，極性胺基酸可被選來增加肽的親水性。在另外一種實施方案中，帶有反應性側鏈的胺基酸(例如穀氨醯胺、天冬醯胺、穀氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸)可被包含進來作為多個活性藥物或佐劑與同一個載體肽的結合位點。這種實施方案對於提供兩種或多種活性藥物之間的協同作用尤為有用。
在另外一種的實施方案中，所述肽通過任何一種在腸腔中發現的或與刷狀緣膜相連的氨基肽酶水解，這樣活性藥物的釋放和接下來的吸收將發生在空腸或迴腸。在另外一種實施方案中，所述載體分子的分子量可被控制，從而提供可靠的、可重複的和/或增加的活性藥物負荷。
調整意味著至少包括變化的影響，或改變總的吸收、吸收率和/或靶向傳輸，這是和參考藥物單用相比較的。持續釋放至少指的是和參考藥物單用相比，在輸入載體肽活性藥物組合物長達36小時之內，血流中參考藥物量的增加。持續釋放進一步被定義為和通過相似傳輸途徑釋放的傳統製劑中的活性藥物相比，所述活性藥物釋放進入全身血循環的時間更長。
所述活性藥物通過pH依賴性的載體肽解摺疊從組合物釋放，或通過酶催化從組合物釋放。在一種優選的實施方案中，所述活性藥物以時間依賴性的方式，通過pH依賴性的載體肽解摺疊和酶催化聯合作用從組合物中釋放出來。所述活性藥物以持續釋放的方式從組合物中釋放出來。在另外一種實施方案中，所述活性藥物從組合物中的持續釋放是0級或接近0級的藥物代謝動力學。
所述發明為活性藥物的傳輸提供了多種好處。第一，所述發明可穩定所述活性藥物，並保護其不在胃中被消化。此外，可通過活性藥物的延遲或持續釋放延長藥理作用。所述持續釋放的發生可通過利用將活性藥物共價結合到肽和/或通過另外的共價結合佐劑，後者能生物粘附於腸黏膜。而且，活性藥物可聯合產生協同作用。同樣，所述活性藥物在腸道中的吸收可通過共價結合於肽或通過加入的佐劑的協同作用而增加。所述發明同樣使活性藥物靶向傳輸至特殊的作用位點。
貫穿這個申請，「肽」的應用意味著包括單個胺基酸、二肽、三肽、寡肽、多肽或載體肽。短肽指的是包含2-70個胺基酸。進而，有時所述發明被描述為連接於胺基酸、二肽、三肽、寡肽、多肽的活性藥物，從而闡明活性藥物結合物的特殊實施方案。這裡還描述了所述結合物的優選長度和其他優選的實施方案。在其他的實施方案中，胺基酸的數目選自1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。在所述發明其他的實施方案中，所述結合物的載體部分分子量大約低於2,500，更優選的大約低於1,000，最優選的大約低於500。
所述發明其他的實施方案進一步通過例子和插圖闡述，但它們不是為了限制所述實施例實施例1Polythroid增加通過Caco-2單層的T4吸收在Caco-2跨孔(transwell)系統(n＝4)中監測T4的吸收。將Polythroid(10μg)加入到跨孔的頂面。將T4以Polythroid中T4含量相同的濃度加入到頂面。一種商業上應用的ELISA測定法被用來測定在37℃保溫4小時後基底側室中T4的水平(圖3)。和用包含於聚合物中相當量的T4保溫的Caco-2細胞相比，從Polythroid吸收的T4的量明顯更高。
為了測定Polythroid本身是否穿過Caco-2單層，在與高濃度(100微克)Polythroid保溫後，我們應用Polythroid特異性ELISA測定基底側室中聚合物的量。保溫4小時後，來自基底側的樣本(n＝4)在ELISA中顯示沒有反應性(圖4)。能探測到Polythroid的極限是10ng，因此少於1/10,000的Polythroid被吸收。結論是，在ELISA檢測之內，Polythroid不穿過Caco-2單層。
我們的研究通過一種體外實驗證明了病人中減少變異的可能。有三種方法通過這種體外的實驗模型減少病人中的變異，這就提供了三種選擇(1)變化Caco-2跨膜孔的環境，(2)變化Caco-2的細胞紗，和/或(3)變化連接於活性藥物的肽。由於Caco-2細胞的脆弱性，選擇一沒有提供一種似乎合理的證明，這是由於試驗應用的實驗條件的限制。選擇二，很難表明病人與病人之間的變異，這是因為選擇一種新細胞系可能不會表達吸收所需要的所有細胞轉運機制。作為結果，僅有選擇三，肽載體的變化提供了必要條件。接下來就可能測試在Caco-2細胞中表達的不同轉運蛋白和轉運機制的有效性和變異。選擇三也識別在Caco-2細胞中表達的肽轉運蛋白，並通過將活性藥物連接於被識別出的肽上，倘若所述Caco-2細胞表現出統計上可靠的變異，可以證明受試者的變異可以通過穿越Caco-2細胞的吸收而減少。
實施例2聚T4TM(左甲狀腺素)和聚T3TM(碘塞羅寧)在甲狀腺機能正常的狀態，甲狀腺是兩種碘化甲狀腺原氨酸激素即，四碘甲狀腺原氨酸(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)的來源。在大腦的發育過程以及其他器官系統的生長和發育過程中，T3和T4都起到了關鍵的作用。所述碘-代激素也刺激心臟、肝臟、腎臟和骨骼肌消耗更多的氧，直接和間接的影響心臟功能，促進膽固醇代謝為膽汁酸，並增加脂肪細胞的解脂反應。甲狀腺機能減退是甲狀腺最常見的疾病，並表現為甲狀腺不能產生足夠的甲狀腺激素。
現在，對於甲狀腺機能減退最普通的治療是施用左甲狀腺素鈉(或T4鈉)。現在，市場上存在數種包含T4鈉的產品，包括Levothroid(Forest)、Unithroid(Watson)，Levoxyl(Jones)和Synthroid(Abbott)。研究已經表明來自T4鈉鹽的T4的生物利用度在48％-80％之間變化，因此這使得以正確的劑量給藥變得困難，並時常需要延長調整時間。增加口服T4鈉的吸收應該不僅僅降低劑量過大的可能，還同樣需要縮短病人的調整時間。
甲狀腺素是一種胺基酸，可連接到載體肽的C-末端、N-末端或兩者(散置)。根據概念，通過將特殊的胺基酸共價的連接於T4，T4的吸收會得到改善，正如大鼠餵飼和放血研究中所闡明的，它們給予等效劑量的T4鈉鹽和聚T4作比較。將八個獨立的研究求平均值，大鼠T4血清濃度對時間繪圖揭示了兩種化合物之間相似的藥物動力學(圖5)。然而，聚T4的Cmax大於T4鈉鹽的Cmax。並且，兩種化合物相對AUC的分析顯示聚T4要比T4鈉鹽多吸收37％(表2)。
可通過應用附加的一種轉運機制來解釋增加的吸收，例如一種肽轉運蛋白。作為選擇，增加的吸收可能是由於聚T4的溶解度(pH7.4時70.5μg/ml)要比T4鈉(pH7.4時6.9μg/ml)的高。
將聚T3應用於同類的大鼠餵飼和放血研究，和T4一樣，也獲得相似的結果。圖6顯示了大鼠模型中聚T3和T3鈉之間的相對藥物代謝動力學。如表3中所見，從聚T3所吸收的T3相對於T3鈉為150％。
一種T4/T3複方產品設計用來模擬甲狀腺機能正常個體中的天然甲狀腺功能。一種標準的大鼠餵養和放血研究，證明來自Polythroid的T3的Cmax稍微低於來自T4/T3鈉鹽的cmax，雖然AUC較高。而且，通過將Polythroid的T3的劑量調整至參考混合物中T3劑量的2/3，就觀察到Cmax大大下降，但AUC相等(圖7)。多巴和卡比多巴是具有與T4和T3相似化學特性的胺基酸。合成了一種多巴-穀氨酸共聚物和卡比多巴-穀氨酸共聚物。
例1和2中討論的T3和T4結合物表明(i)T3和T4的吸收都增加會減少變異；(ii)T3的Cmax的降低降低了T3尖峰形成的可能性；(iii)T3的延遲釋放導致T3的血清水平更持久；
實施例3聚AZT通過在包含穀氨酸殘基的肽中加入AZT合成聚AZT，該肽預先被一溴三吡咯烷-1-基鏻六氟磷酸鹽(PyBrop)活化。可應用相似的步驟連接其他含醇基的藥物。例如，通過這種步驟連接的其他藥物包括，但不局限於喹硫平、託特羅定、對乙醯氨基酚和曲馬多。
所述AZT肽結合物和母體藥物相比有明顯的臨床優勢。例如，已經知道核苷類似物腸道吸收增加，它們作胺基酸酯前體藥物施用，母體本核苷類似物腸通滲透性可增加至3到10倍(見，Han H，de Vrueh RL，Rhie JK，Covitz KM，Smith PL，LeeCP，Oh DM，Sadee W.，Amidon GL(1998).「5』-Amino Acid esters of antiviralnucleosides，acyclovir，and AZT are absorbed by the intestinal PEPT1 peptidetransporter.」PharmRes15(8)1154-9.)。另外一個潛在的優勢和藥物一旦進入細胞後的激活有關。和核苷母體相似，AZT之類類似物依賴於細胞內5』-OH的磷酸化(圖8)。在它們能抑制逆轉錄酶之前，核苷類似物必須經受由特殊激酶催化的連續磷酸化。磷酸化發生的速率依賴於底物的濃度，在這個實例中是AZT。所述AZT結合物使得靶細胞中藥物濃度隨時間而變化，這部分是因為結合物在它被吸收之前必須被消化。輸入細胞的藥物數量被分散在更長的一段時間。因此，所述肽結合物能夠以一定濃度將藥物輸入細胞，這種濃度更接近激酶磷酸化核苷所需要的最佳水平，並導致所給劑量藥物在給藥間期內效果增強。
其他的核苷類似物也可以作為緩慢消化的肽結合物施用，這種結合物保留了較低的血清濃度峰值(因此避免了激酶的飽和)，和更長時間的維持中等濃度(更接近磷酸化速率最佳時的水平)。這對於核苷類逆轉錄酶抑制劑來說是尤為有價值的，因為相同的酶會催化不同核苷類似物的磷酸化。當同時施用兩種或三種核苷類似物時，就像它們現在經常是「以雞尾酒(混合)」施用的那樣，最佳底物水平的維持變的更為重要。因此所述發明的結合物也可使多種核苷類似物作為肽結合物給藥而改善治療效果。
AZT的一種肽結合物在大鼠中有所述藥物動力學特點(圖9)，它表明了與給予等摩爾的母體藥物相比，AZT保持較高血漿水平的時間超過兩倍，而同時Cmax時降低超過35％。因此，聚AZT的PK應該增加藥物的磷酸化效率，並減少副作用。
實施例4聚-T3(一種甲狀腺激素)碘塞羅寧(T3)是一種天然存在的甲狀腺激素，它被作為一種藥物施用來治療各種內分泌疾病。
所述合成的聚合物，聚-T3，包括結合於T3分子的聚-L-穀氨酸。它通過標準的肽化學方法製造，通過總％I含量測定它的T3效價。上面顯示了一種可能類型的聚T3分子的化學結構。
圖10顯示了人體聚T3和T3單體臨床試驗的數據。在這個研究中，在整夜禁食10小時後，對20個健康的男性受試者施用一種藥物。儘可能的將年齡、身高和體重相近的受試者配對。測試每組中10個受試者的17個時間點總T3血清水平，應用他們的原始數據。計算每個時間點10個值的平均值以及標準差。為了比較相同時間點兩組數據的變異，用平均值除標準差。條線圖代表所獲得的值，這樣更高的條線代表更大的變異。
從數據中可以看出，對於吸收最大的時間點(0.5-4小時)，T3單體受試者間的變異要比聚T3的大。差異在劑量給藥1、1.5和2小時後最大，在這期間吸收最多。然而，應該注意的是，聚T3以溶液給藥，而T3以片劑給藥。
例5各種結合物實例應用所述發明的方法合成了以下呋塞米的二肽結合物，包括Boc-Ala-Ser(Furo)-Ome；Boc-Gly-Ser(Furo)-OmecBoc-Leu-Ser(Furo)-Ome；Boc-Val-Ser(Furo)-Ome；Boc-Trp-Ser(Furo)-Ome；Boc-Cys-Ser(Furo)-Ome；Boc-Ile-Ser(Furo)-Ome；Boc-Met-Ser(Furo)-Ome；Boc-Phe-Ser(Furo)-Ome；Boc-Pro-Ser(Furo)-Ome；Boc-Arg-Ser(Furo)-Ome；Boc-Asp-Ser(Furo)-Ome；Boc-Glu-Ser(Furo)-Ome；Boc-His-Ser(Furo)-Ome；Boc-Lys-Ser(Furo)-Ome；Boc-Asn-Ser(Furo)-Ome；Boc-Gln-Ser(Furo)-Ome；Boc-Ser-Ser(Furo)-Ome；Boc-Thr-Ser(Furo)-Ome；Boc-Tyr-Ser(Furo)-Ome。
權利要求
1.一種和參考藥物相比，改變病人群體生物利用度而產生圖1中所述血清曲線的方法。
2.一種通過施用口服活性肽-活性藥物組合物減少病人與病人間變異的方法。
3.如權利要求1所述的方法，其中所述組合物改善了AUC。
4.如權利要求1所述的方法，其中與單獨傳輸的參考藥物相比，所述組合物改善了活性藥物的易化擴散率。
5.如權利要求1所述的方法，其中與單獨傳輸的參考藥物相比，所述組合物改善了活性藥物的主動轉運。
6.如權利要求1所述的方法，其中與單獨傳輸的參考藥物相比，所述組合物改善了活性藥物的吸收。
7.如權利要求1所述的方法，其中與單獨傳輸的參考藥物相比，所述組合物改善了活性藥物的峰值。
8.一種提供圖1中血清曲線的組合物。
9.一種配製以藥物減少受試者間變異的方法，包括(i)藥學上有效的藥物；和(ii)一種共價結合於所述藥學活性藥物的肽，其中所述藥學活性藥物根據和圖1大體相同的血清曲線釋放。
10.一種控制藥學活性藥物的釋放以減少一組病人中受試者之間變異的方法，包括對該組病人施用權利要求1的組合物。
11.一種組合物，包括(i)藥學上有效的藥物；和(ii)一種共價結合於所述藥學活性藥物的肽，其中所述藥學活性藥物根據和圖1大體相同的血清曲線釋放。
全文摘要
所述發明提供了顯著減少患者間特別是全身藥物濃度變異的組合物和方法。更特殊的是，所述發明涉及與肽或相關載體結合的口服藥物，和類似的游離藥物相比，它們改變了釋放的特性。
文檔編號A61K38/22GK1650024SQ03809002
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月24日 優先權日2002年2月22日
發明者T·皮卡雷洛, R·J·科克 申請人:新河藥品股份有限公司