一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌ylzz-2及其分離方法

2023-11-30 17:05:51 2

專利名稱：：一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌ylzz-2及其分離方法
技術領域：
：本發明屬於微生物
技術領域：
，涉及一種新的嗜麥芽寡養單胞菌(6^/70trap/0/z70;7as/za"o//Wi'a)，具體涉及一種能夠有效降解瘋草主要毒素苦馬豆素(Swainsonine，SW)的降解菌嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2,還涉及該降解菌分離鑑定和培養方法及其應用。
背景技術：
：瘋草(Locoweed)是豆科棘豆屬(fl^^^w's)和黃芪屬(A^ra^a7"s)有毒植物的總稱，也是世界範圍內危害草原畜牧業最嚴重的一類毒草。在我國，瘋草廣泛分布於西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達1100萬hm2，佔全國草場面積的2.8%。。由於瘋草具有很強的適應能力，在荒漠草原上生長旺盛，而且返青早，枯萎遲，放牧動物在其它植物缺少或長勢不好的情況下，長期或大量採食，造成大批家畜中毒死亡，或母畜不孕、流產、胎兒畸形、公畜不育及畜產品質量下降，給草原畜牧業造成巨大的經濟損失。苦馬豆素(Swainsonine，SW)是瘋草(Locoweed)類植物體內含有的水溶性吲哚茲定生物鹼，分子式為C8H15N03，化學名稱為1，2，8-三羥基八氫吲哚裡西啶(1，2，8-trihydroxyoctahydroindoliziding)，是瘋草類植物的主要有毒成分之一。苦馬豆素能抑制溶酶體ci-甘露糖苷酶活性，使細胞內低聚糖聚積，造成細胞空泡化，從而使細胞失去正常功能，甚至造成細胞死亡，還能抑制高爾基甘露糖苷酶II，影響糖蛋白的合成、處理和轉移，這些導致細胞粘附、激素轉運及細胞表面受體功能障礙。動物中毒的臨床表現包括精神沉鬱、感覺遲鈍、神經過敏、四肢無力、惡病質、生殖機能受損等，慢性中毒常造成神經系統的持久的不可恢復的損害。瘋草雖然是毒草，其營養價值也很豐富，有些棘豆的粗蛋白含量高達20%，超過"飼料之王"的苜蓿。針對我國而言，將西部草原30%以上的生長茂盛的瘋草變成可利用的優質牧草，可以增加近一倍的飼草資源，可對當地畜牧業的發展起到強大的促進作用。近年來，國內外在瘋草的危害、有毒成分、毒理機制、防除和利用等方面的研究取得了重要進展，但迄今還沒有控制瘋草蔓延的特效方法，致使瘋草中毒問題日趨嚴重，成為草原畜牧業的大患。國內學者曾嘗試用水浸法、酸水浸泡法和高溫處理法等處理瘋草，在去除瘋草毒性的同時破壞了瘋草的適口性和營養價值，並且費用高，不適宜推廣。王凱等研製出"棘防E號"等系列解毒劑，能有效推遲瘋草中毒症狀出現的時間，童德文等將SW與大分子載體蛋白BSA連接合成SW-BSA,以SW-BSA免疫原接種動物，使動物獲得免疫力並在採食瘋草時得到保護，這兩項研究已取得一定進展，為防除動物瘋草中毒病帶來希望。目前，應用微生物降解有毒物質一直是國內外研究的熱點，涉及的領域十分廣泛，但在微生物降解植物毒素方面的研究較少，不過也取得了一定的成果，周斌從菜籽餅中分離到能夠降解芥子甙的多種微生物70多株，經鑑定這些菌是白色球擬酵母(7b2i/Jop幻'scs77力Va)、華根黴(^Zj'zo/iASc/n'/7e/7s^)、總狀毛黴(M/corrac柳。ms)、米麴黴"spe，7ii/s。2yzae)，通過發酵試驗確定其脫毒率為80%。譚蓓英等從廣西潿洲島的黃牛瘤胃中，分離出4株厭氧細菌，經鑑定為乳桿菌屬(lactoneJ77i/s)(2株)、牛鏈球菌(5"z^印tococc^6ow's)和生孢梭菌(C/os^ri'必咖sparoge/7es)，上述菌株對含羞草素和二羥基吡啶類毒素具有降解活性，這些脫毒菌生活在瘤胃中，可以保護宿主動物免受銀合歡的毒害。瘋草毒素生物降解研究還未見報導，但這些研究方法可供借鑑，探索一條sw生物降解的途徑，篩選出能夠降解sw的微生物，並將降解該毒素的酶基因轉入動物胃腸道正常菌群或動物機體上，不僅能從根本上解決動物瘋草中毒問題，還能帶來很好的經濟效益和環境效益，對草原毒草的生物學控制和草原生態學研究起到積極作用。
發明內容本發明的目的在於提供一種降解瘋草毒素苦馬豆素的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2(5^e/7"rop力oyzo/7as^3"o/力WiaYLZZ-2);它能夠有效減少瘋草中的苦馬豆素含量，使之對動物毒性降低。為實現上述目的，本發明的技術方案如下本發明提供的一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2(5Ye;7"ro;/o/z70/7as歷a7i^。力ih'aYLZZ-2)，屬於寡養單胞菌屬，已於2007年7月20日保藏於中國典型培養物保藏中心，本保藏中心保藏編號為CCTCCN0:M207109，保藏地址中國.武漢.武漢大學。本發明還有一目的是提供嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2的分離方法，具體包括下列步驟1)採集草樣採自甘肅、西藏、內蒙、青海等生長地的瘋草；2、製備土樣將lkg瘋草埋於土壤中，深度為1020cm,半年後取出草樣周圍的土壤，將採集的土樣充分混合；3、菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內，置於搖床上，200r/min充分振蕩10min，製備菌懸液，然後取10mL菌懸液加入100mL富集培養液中，並在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養過夜，然後再以10%接種量接種於新鮮的含SW30mg/L的馴化培養基中培養，以後每隔4d移種一次，並逐漸增加SW含量分別為50，80，100，120，150，180，200mg/L。當SW濃度達到200mg/L時,再以10%接種量接種於新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養基中培養7d，然後將培養液稀釋平板法塗布SW無機鹽固體培養基上，挑選菌落形態各異的單菌落菌株，純化後保存於普通營養瓊脂培養基斜面上，得到一株嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2。所述的富集培養液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，12rC高壓滅菌20min。所述的普通營養瓊脂培養基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2P041.0g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的無機鹽培養基的組分及配比為NH4N031.0g，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g，KH2P040.5g，NaClO.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，121'C滅菌20min，滅菌後加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養基中SW的濃度為0200mg/L。所述的馴化培養基根據不同需要，向滅菌後的富集培養液中無菌加入過濾除菌的SW溶液，使馴化培養基中SW的濃度為0200mg/L。嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2菌株具有以下述性質1、形態與生理生化特徵YLZZ-2菌株的菌體呈球桿狀，(0.30.5)umX(1.31.5)um,革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，無芽孢，有運動性，數根鞭毛；菌落呈圓形，淺黃綠色，表面光滑，溼潤，隆起，邊緣整齊，不透明，培養時間長時有同心圓狀半透明內環；不發酵葡萄糖，不產生吲哚，M.R試驗陰性，V.P試驗陽性，不水解澱粉，不還原硝酸鹽，不能利用檸檬酸鹽，利用丙二酸鹽，不產生H2S,液化明膠，接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿素酶陽性，在5XNaCl中生長，但較緩慢，7%NaCl中不生長。具體生理生化特徵見表l。表l.YLZZ-2菌株的生理生化特徵tableseeoriginaldocumentpage8注"+"表示生長或反應陽性；"一"表示不生長或反應陰性。YLZZ—2株的16SrDNA序列同源性分析YLZZ-2菌株16SrDNA序列如SEQIDNO.1所述，其GenBank登錄號為EU022689(序列未公開)。經16SrDNA序列同源性分析，依據同源性在系統發育中的分類原則並結合形態、生理生化特徵，參考《伯傑細菌學手冊(第八版)》，最終確定YLZZ-2菌株為嗜麥芽寡養單胞菌(&，加/ta謹51鵬7t。//y力'a)。該苦馬豆素降解菌YLZZ—2經形態、生理生化特性分析和16SrDNA基因序列同源性分析，鑑定為嗜麥芽寡養單胞菌，該菌株能以苦馬豆素為惟一碳源生長。本發明的苦馬豆素降解菌YLZZ—2可降解瘋草類有毒植物的主要毒素SW，為徹底解決瘋草的毒害奠定基礎。圖1是YLZZ-2菌株在顯微鏡鏡下的形態；圖2是YLZZ-2菌株的單個菌落形態；圖3利用DNAStar軟體構建系統進化樹；圖4是YLZZ-2降解SW的對照組氣相色譜圖；圖5是YLZZ-2降解SW的試驗組中期氣相色譜圖；圖6是YLZZ-2降解SW的試驗組後期氣相色譜圖；圖7是YLZZ-2降解SW的降解曲線。具體實施方式實施例l:嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2菌株的製備方法1)採集草樣採自甘肅、西藏、內蒙、青海等生長地的瘋草；2)製備土樣將lkg瘋草埋於土壤中，深度為1020cm，半年後取出草樣周圍的土壤，將採集的土樣充分混合；3)菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內，置於搖床上，200r/min充分振蕩10min，製備菌懸液，然後取10mL菌懸液加入100mL富集培養液中，並在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養過夜，然後再以10%接種量接種於新鮮的含SW30mg/L的馴化培養基中培養，以後每隔4d移種一次，並逐漸增加SW含量分別為50，80，100，120，150，180，200mg/L。當SW濃度達200mg/L時，再以10%接種量接種於新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養基中培養7d，然後將培養液稀釋平板法塗布SW無機鹽固體培養基上，挑選菌落形態各異的單菌落菌株，純化後保存於瓊脂斜面上，得到一株嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2。所述的富集培養液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的普通營養瓊脂培養基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，歸041.Og，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的無營養培養基的組分及配比為NH4NO:,1.Og，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g,KH2P040.5g，NaCl0.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，12rC滅菌20min，滅菌後加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養基中SW的濃度為200mg/L。所述的馴化培養基根據需要，向滅菌後的富集培養液中無菌加入過濾除菌的SW溶液，使其濃度為50，80，100，120，150，180，200mg/L。試驗例1YLZZ-2菌株的16SrDNA序列的同源分析將YLZZ-2菌株的16SrDNA序列(SEQIDNO.1)通過NCBI的Blast檢索系統進行序列同源性分析，利用DNAStar軟體構建系統進化樹，見圖3。由圖3得出，YLZZ-2菌株的遺傳進化距離與寡養單胞菌屬最近，它與嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)同處於一個最小的分支，與己知菌株Stenotrophoraonasmaltophilia(AB194708)的同源性達到99.5%,說明該菌在分子系統發育分類學上屬於嗜麥芽寡養單胞菌。試驗例2:嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2菌株的降解SW試驗採用氣相色譜法測定該菌對SW的降解率。以5%的接種量將降解菌接種到含有50mg/LSW的無機鹽培養基中，30°C，180r/min搖動培養，以不接菌的SW無機鹽培養基為對照，每隔2h取樣，用氣相色譜法測定苦馬豆素的含量(圖4，圖5，圖6)，結果見表2，計算降解率，繪製降解曲線(圖7)。表2.不同培養時間SW的降解率(％)菌tableseeoriginaldocumentpage11總結YLZZ-2菌株在14h內基本上將50mg/L的苦馬豆素降解完全，而對照組苦馬豆素無降解。該菌最適生長條件為pH為68，溫度為25T:35。C。西北農林科技大學<120〉一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2及其分離方法〈160〉11<211〉1443腿<213〉5te/3otro;力cw7an3S鵬J鄉力/JisYLZZ—2〈400〉1MTGCAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGT60GAGGMTACATCGGMTCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTMTA120CCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGMTGAGCC180GATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAMGGCCCACCMGGCGACGATCCGTAGCTGGT240CTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAG300CAGTGGGGMTATTGGACMTGGGCGCMGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGA360AGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAG嵐TCCAGCCGGCTMTACCTGGT420TGGGATGACGGTACCCAAAGMTMGCACCGGCTMCTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTMT480ACGAAGGGTGCMGCGTTACTCGGMTTACTGGGCGT嵐GCGTGCGTAGGTGGTTGTTT540MGTCTGTTGTG嵐GCCCTGGGCTCMCCTGGGAACTGCAGTGG嵐CTGGACMCTAG600AGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGT歸GATCGGGAGG660MCATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGG720GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTT780GGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTMCGCGTTMGTTCGCCGCCTGGGGAGTAC840GGTCGCMGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGTATGTG900GTTTMTTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAG960AGATGGATTGGTGCCTTCGGGMCTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT1020GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCMCCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCA1080CGTAATGGTGGGMCTCTAAGGAGACCGCCGCTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGATGAC1140CTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACMTGGTAGGGACAGA1200GGGCTGCMGCCGGCGACGGTMGCCMTCCCAG嵐CCCTATCTCAGTCCGGATTGGAG1260TCTGCMCTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTMTCGCAGATCAGCATTGCTGCGG1320TGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCA1380GMGCAGGTAGCTTMCCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTG1440MG144權利要求1、一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2(StenotrophomonasmaltophiliaYLZZ-2)，於2007年7月20日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNOM207109。2、權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於包括下列步驟1)採集草樣採自甘肅、西藏、內蒙、青海等生長地的瘋草；2)製備土樣將lkg瘋草埋於土壤中，深度為1020cm，半年後取出草樣周圍的土壤，將採集的土樣充分混合；3)菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內，置於搖床上，200r/min充分振蕩10min，製備菌懸液，然後取lOmL菌懸液加入lOOmL富集培養液中，並在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養過夜，然後再以10%接種量接種於新鮮的含SW30mg/L的馴化培養基中培養，以後每隔4d移種一次，並逐漸增加SW含量分別為50，80,100，120，150，180，200mg/L。當SW濃度達200mg/L時，再以10%接種量接種於新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養基中培養7d，然後將培養液稀釋平板法塗布SW無機鹽固體培養基上，挑選菌落形態各異的單菌落菌株，純化後保存於普通營養瓊脂培養基斜面上，得到一株嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2。3、根據權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於所述的富集培養液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，121。C高壓滅菌20min。4、根據權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於所述的普通營養瓊脂培養基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白腖10g，NaCl5g，KH2P041.Og，瓊脂20g，蒸餾水1L,pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。5、根據權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於所述的無機鹽培養基的組分及配比為NH4N031.0g，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g，KH2P040.5g，NaC10.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，121。C滅菌20min，滅菌後加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養基中SW的濃度為0200mg/L。6、根據權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於所述的馴化培養基是在富集培養液中加入過濾除菌的SW溶液，使馴化培養基中SW的濃度為0200mg/L。7、根據權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特徵在於所述的無機鹽固體培養基是在無機鹽培養基中加入瓊脂，使瓊脂在其中的濃度為20g/L。8、權利要求1所述的嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ—2在降解瘋草毒素苦馬豆素中的應用。全文摘要本發明公開了一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養單胞菌YLZZ-2，菌體呈杆狀，(0.3～0.5)μm×(1.3～1.5)μm，革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽孢，有運動性，數根鞭毛；菌落呈圓形，淺黃綠色，表面光滑，溼潤，隆起，邊緣整齊，不透明，培養時間長時有同心圓狀半透明內環；該菌株從埋藏過從甘肅、西藏、內蒙、青海等地生長的瘋草的土壤中經人工分離、篩選而得，其於2007年7月20日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM207109。該菌株具有降解瘋草主要毒素苦馬豆素(Swainsonine，SW)的特性。文檔編號C12N1/20GK101220339SQ20071001872公開日2008年7月16日申請日期2007年9月21日優先權日2007年9月21日發明者王建華,耿果霞,趙興華申請人:西北農林科技大學