一種獲取植物雄蕊表達啟動子sta3的方法及相應啟動子的製作方法

2023-11-11 01:23:47 3

一種獲取植物雄蕊表達啟動子sta3的方法及相應啟動子的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種獲取植物雄蕊表達啟動子STA3的方法，所述方法包括如下步驟：製備正、反向引物；以水稻品種日本晴的DNA序列為模板，利用所述正向引物和所述反向引物，對日本晴的DNA序列中的一目的片段進行PCR擴增；對所述目的片段進行加A並連接PGEM-T-Easy載體；將目的片段轉入到激活的感受態細胞中；挑取單克隆搖菌液提質粒；回收所述目的片段。本發明的分離方法能夠從日本晴水稻中有效地分離出能夠驅動雄蕊中的外源基因表達的啟動子。本發明的方法簡單易行，能夠為人們提供現有技術中尚未發現的STA3啟動子。該啟動子STA3能夠調控外源基因在植株的雄蕊中集中表達，具有顯著的研究和商業價值。
【專利說明】-種獲取植物雄蕊表達啟動子STA3的方法及相應啟動子

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種從植物中分離的啟動子，尤其涉及從水稻中分離的雄蕊特異表達 啟動子，本發明還涉及含有該雄蕊特異表達啟動子的重組表達載體、宿主細胞以及在改良 植物性狀、培育植物新品種等方面的應用，屬於植物組織或器官特異性表達啟動子的分離 及其應用領域。

【背景技術】
[0002] 植物生長過程中，基因表達的開啟、關閉、表達模式、表達豐度的高低往往會受到 精細細胞的調控。基因的表達調控是一個多層次的複雜過程，受不同的調節因素控制，也 是在多階段水平來實現的。儘管基因表達在高等生物中是多級調控系統，但是轉錄水平上 的調控是最關鍵的環節。啟動子作為轉錄水平上一個重要的調控元件，是眾多轉錄因子及 RNA聚合酶的最終作用靶標，因此，深入研究啟動子的結構、功能和作用模式等具有重大意 義（Xu et al. , 2011 ；yamamoto et al.，2011)〇
[0003] 通過分子生物學以及基因工程的手段去研究和改良作物在農業生產中具有很 好的應用前景（林擁軍，2001)。但是在其廣泛運用的過程中也逐漸暴露了一些問題，由 於組成型啟動子會使驅動的目的基因在受體植物各組織中持續而恆定的表達，所以有時 會帶來一些負面效應，如增加代謝負擔以及一些食品安全性方面的擔憂等等（Conner et al.，2003 ;Kuiper et al.，2001)。為此，隨著植物基因工程的發展，人們尋找更為有效的組 織、器官特異性表達啟動子來代替組成型表達啟動子，以更好地調控目的基因的表達。在組 織特異型啟動子調控下，基因的表達常常只發生在某些特定的器官或組織部位，並常常表 現出發育調節的特性。目前，組織器官特異啟動子的研究已經取得了很大的進展。
[0004] 雄蕊是高等植物生殖器官的重要組成部分，雄蕊的形成是一個十分複雜的過程， 在這個過程中，大量基因的協同表達受到不同啟動子的調節和控制，其中花葯特異表達啟 動子和花粉特異表達啟動子起到了十分重要的作用。Orysl是一個水稻來源的花粉過敏原 基因，Azria等分離克隆了其啟動子，然後在澳大利亞本地的水稻栽培種中做了功能驗證， 證實其啟動子具有花粉中特異表達的特性（Azria and Bhalla, 2011)。Zhou等分離克隆了 一個來源於馬鈴薯的花粉特異表達基因SBgLR的啟動子，研究發現一個ISbp長的回文對稱 序列在控制花粉特異表達過程中起非常重要的作用（Zhou et al.，2010)。ENDl是從豌豆 中分離得到的一個花葯特異表達基因，GUS組織化學分析表明ENDl啟動子可以驅動GUS基 因在菸草、擬南芥、番茄等植物的花葯中特異表達。
[0005] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，亦是禾本科作物功能基因組學研究的模式 植物（Zhang，2007)，啟動子是精確調控基因表達的"開關"。在過去的幾年裡，儘管克隆了 一些組織特異表達啟動子，但是這些組織特異表達的調控機理仍然很不清楚，用於作物遺 傳改良的高豐度表達特異啟動子仍然較少。因此對水稻組織器官尤其是雄蕊特異表達啟動 子的分離、克隆及深入研究，可以指導轉基因育種，創造巨大的經濟效益和社會效益，更好 的為人類的生產生活服務。
[0006] 但是目前現有的獲取啟動子的方法都或多或少存在其自身的問題。而且，從目前 的現有相關報導來看，現有方式所獲得的啟動子還不能夠很好地滿足人們對雄蕊特異表達 啟動子的需求，尤其是水稻雄蕊特異性表達啟動子的需求。因此，科研人員還是希望能夠獲 得更好地分離雄蕊啟動子的方法，也希望得到更好地雄蕊啟動子。


【發明內容】

[0007] 基於目前人們對啟動子的研究現狀，本發明的目的是提供一種獲取植物雄蕊表達 啟動子STA3的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟：
[0008] 步驟（1)製備正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N〇:2所示；
[0009] 步驟（2)製備反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDN〇:3所示；
[0010] 步驟⑶以水稻品種日本晴的DNA序列為模板，利用所述正向引物和所述反向引 物，採用KOD-plus高保真DNA聚合酶對日本晴的DNA序列中的一目的片段進行PCR擴增， 該目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示；
[0011] 步驟（4)對所述目的片段進行加A並連接PGEM-T-Easy載體；
[0012] 步驟（5)，利用該載體轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞，使感受態細胞激活，進 而將目的片段轉入到激活的感受態細胞中；
[0013] 步驟（6)挑取單克隆搖菌液提質粒，用所述正向引物和所述反向引物進行雙酶切 驗證，將經過鑑定的陽性克隆進行測序，驗證正確的克隆即為所要獲得的目的片段--啟 動子STA3,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示；
[0014] 步驟（7)，回收所述目的片段。
[0015] 優選地，所述擴增程序包括：步驟（3-1)在95 °C下進行預變性5min;步驟 (3-2)95 1：變性3〇8,58 1：退火3〇8,72 1：延伸21^113〇8，（3-3)重複步驟（3-1)和步驟 (3-2)35-40 個循環，步驟（3-4) 72°C延伸 lOmin。
[0016] 另一方面，本發明提供一種植物雄蕊表達啟動子STA3,其特徵在於，所述植物雄蕊 表達啟動子STA3包含SEQ ID No: 1所示的DNA序列或其變體、同源物或衍生物。
[0017] 另一方面，本發明提供一種表達盒、重組表達載體或轉化子，其特徵在於，所述表 達盒、重組表達載體或轉化子所述植物雄蕊表達啟動子STA3。
[0018] 另一方面，本發明提供一種宿主菌，其特徵在於，所述宿主菌包含所述植物雄蕊表 達啟動子STA3。
[0019] 另一方面，本發明提供一種所述植物雄蕊表達啟動子STA3的應用，其特徵在於， 所述植物雄蕊表達啟動子STA3用於驅動外源基因在植物雄蕊部位表達。
[0020] 本發明所提供的方法以及相應啟動子特別適合用於單子葉植物，例如水稻、小麥、 玉米、大麥、高粱或燕麥，尤其適合用於水稻。
[0021]該啟動子分離自日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)，本文中稱為STA3 或啟動子STA3。
[0022] 在所述重組表達載體中，所述植物雄蕊特異表達啟動子連接於待表達的基因序列 的上遊；優選地，所述待表達的基因為雄性不育基因。
[0023] 優選地，所述宿主菌為根癌農桿菌。
[0024] 優選地，所述轉化子優選為轉基因細胞系、愈傷組織或植株。
[0025] 本發明的啟動子的應用包括將本發明提供的上述植物雄蕊特異表達啟動子連接 於載體的待表達的基因序列上遊（例如，將所述啟動子序列置於目標基因之前），從而構建 重組表達載體，將所述重組表達載體轉化到植物細胞、組織或器官中進行培育。
[0026] SEQ ID Nol中的啟動子中，序列開頭"TTTCCTCAAGATTCCTAGCCTC"為獲得啟動子 過程中使用的正向引物的留存序列；序列末尾"CCGCGCCAAGAACTCGATCCTC"為獲得啟動子 過程中使用的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應序列互補）；該DNA序 列中剩餘的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列，是該序列的核心部分。需要強調的是， 本文中所提到的啟動子既可以指上述整個DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列後的 DNA序列。
[0027] 綜上所述，發明人採用本發明的分離方法從日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)中分離克隆STA3基因上遊包括轉錄起始位點在內的2140bp的DNA序列， 並將其命名為STA3(序列表中的SEQ ID No: 1)。本發明的分離方法可以用於從植物中提取 指定的目的片段，用於後續的研究應用。本發明所提取出的雄蕊啟動子經連接表達載體後， 可以轉入到植物細胞中，得到轉基因植株。
[0028]技術效果
[0029] 本發明的分離方法能夠從日本晴水稻中有效地分離出能夠驅動雄蕊中的外源基 因表達的啟動子。本發明的方法簡單易行，能夠為人們提供現有技術中尚未發現的STA3啟 動子。該啟動子STA3能夠調控外源基因在植株的雄蕊中集中表達，只要將該啟動子連接到 外源基因的上遊並轉入水稻植株中即可。通過該啟動子對農作物雄蕊的生長特性進行改 造，可以提高和改善水稻的生長特性和機制，從而培育出具有希望的繁殖特性的轉基因植 物品種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0031] 圖1為本發明的獲取方法的簡化流程示意圖；
[0032] 圖2為對本發明所獲得的啟動子進行酶切驗證的結果示意圖。
[0033] 圖3為利用STA3啟動子驅動Gus基因表達後對水稻植株進行Gus染色，在水稻植 株花的部位所得到的的染色結果。
[0034] 圖4為對水稻植株進行Gus染色，在水稻植株莖的部位所得到的的染色結果。
[0035] 圖5為對水稻植株進行Gus染色，在水稻植株葉子部位所得到的的染色結果。
[0036] 圖6為對水稻植株進行Gus染色，在水稻植株葉鞘部位所得到的的染色結果。
[0037] 圖7為對水稻植株進行Gus染色，在水稻植株根部位所得到的的染色結果。

【具體實施方式】
[0038] 以下參照具體實施例來說明本發明。
[0039] 1、植物材料
[0040]日本晴成熟種子，由安徽省農科院水稻所生技室保存。
[0041] 2、菌株及質粒
[0042] 本研究所用大腸桿菌菌株為XLl-blue;根瘤農桿菌為EHA105,安徽省農科院水稻 所生物技術室保存；植物表達載體PCAMBIA1391購自澳大利亞CAMBIA公司。
[0043] 3、試劑與藥品
[0044]次氯酸鈉（NaCIO,有效氯濃度4% )，Tween20購自Sigma公司。潮黴素B購自 Roche 公司；PEASY-Tsimple 和 DNA marker_Trans2K 購自 Transgen 公司；限制性內切酶購 自NEB公司；KOD高保真聚合酶和定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa寶生物技術有限公司； T4DNA連接酶購自Promega公司；DNA片段回收試劑盒購自TIANGEN公司；質粒DNA提取採 用Axygen質粒小提試劑盒。引物合成和測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。 緩衝液、試劑、細菌培養基配方、大腸桿菌感受態製備參見《分子克隆實驗指南》（第三版）。
[0045] 4、引物的設計
[0046] 為了獲取本發明所需要的啟動子，首先要針對性的設計引物。根據NCBI中提供的 水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因組序列，依據水稻STA3基因的 序列設計擴增引物，並根據選用的載體及靶標基因的特點，設計引物的酶切位點。具體設 計的引物為：正向引物（SEQ ID N〇:2)5'端帶Sail，酶切位點（GTCGAC)，反向引物（SEQ ID No: 3) 5'端帶EcoRI，酶切位點（GAATTC)，引物序列如下：
[0047] FP ：GTCGACTTCTCCACCCCTTGTAAGTAGC Sail
[0048] RP ：GAATTCCAGAATCTCCCTGCAAGCAAGC EcoRI
[0049] 由深圳華大基因公司合成。
[0050] 5、啟動子STA3的獲得
[0051] 接下來，需要以水稻品種日本晴DNA為模板，利用上面獲得的正向引物、反向引物 擴增啟動子STA3。按常規PCR體系，採用如下擴增程序：
[0052] 95°C 預變性 5min ;95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 2min30s，35 個從 95°C 預 變性到72°C延伸的循環；最後72°C延伸lOmin。回收PCR擴增的目的片段，目的片段長度 2140bp，將其連接到PGEM-T-Easy載體（購自Promega公司，按載體說明書中的比例混合） 上，按照熱激法轉化大腸桿菌。經過菌落PCR篩選重組子和雙酶切驗證，測序正確的重組 子，提取其質粒用於轉化農桿菌。農桿菌感受態細胞的製備方法如下：
[0053] (1)從_80°C超低溫冰箱取出甘油凍存的農桿菌EHA105菌株，在含10 μ g/mL Rif 的YEP培養基劃線，28 °C培養2?3d至長出單菌落。
[0054] (2)挑取單菌落接種於IOmL含10 μ g/mL Rif的YEP培養基，28°C，210r/min過夜 培養。
[0055] (3)將菌液全部轉移至250mL含10 μ g/mL Rif的YEP培養基（1L三角瓶）中 於28 °C、210r/min繼續培養4h左右，中間每隔一段時間測量一次OD值，培養0D600至 0· 5_0· 7〇
[0056] (4)將菌液均分於6支50mL (預冷的聚乙烯管）離心管，冰上靜置30min，然後於 4°C、4000r/min 離心 5min。
[0057] (5)棄上清，將離心管倒扣於無菌濾紙上，為除淨剩餘菌液。
[0058] (6)加入3mL預冷的IOOmM CaC12重懸菌體（可用移液槍輕輕吹打重懸）。
[0059] (7)將重懸菌液集中於2支離心管，配平，4°C 4000r/min，離心5min。
[0060] (8)棄上清，將離心管倒扣於無菌濾紙上，以除淨剩餘菌液；
[0061] (9)加入5mL預冷的IOOmM CaC12重懸菌體（可用移液槍輕輕吹打重懸）。
[0062] (10)加入5mL預冷的50 %甘油，混勻。
[0063] (11)冰浴lOmin，每管100 μ 1分裝於無菌Eppendorf管，液氮冷凍後，存於超低溫 冰箱，備用（槍頭和Eppendorf管需4°C預冷）。
[0064] 質粒提取方法如下：
[0065]用AXYGEN質粒DNA小量試劑盒提取相應的質粒，具體操作方法如下：第一次使用 時，將試劑盒攜帶的RNaseA全部加入到Buffer Sl中，混勻，4°C|C存。
[0066] (1)取約4mL過夜培養的菌液（菌液過濃時體積應減半或更少），12, 000 X g離心 30s，棄盡上清。
[0067] (2)加250 μ I Buffer Sl懸浮細菌沉澱，懸浮需均勻，不應留有小菌塊。
[0068] (3)加250 μ I Buffer S2,緩慢地上下翻轉4-6次，混合均勻使菌體充分裂解，直 至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5min。
[0069] (4)加350μ1 Buffer S3,溫和並充分地上下翻轉混合6-8次，12,OOOXg離心 IOmin0
[0070] (5)吸取步驟4中的上清並轉移到吸附柱（置於2mL離心管中），室溫靜止2min， 12, OOOXg離心lmin，棄濾液。
[0071](6)將吸附柱放回離心管，加500 μ I Buffer Wl，12, OOOXg離心30s，棄濾液。
[0072] (7)將吸附柱放回離心管，加700 μ I Buffer W2,12, OOO Xg離心30s，棄濾液；以 同樣的方法再用500 μ I Buffer W2洗滌一次。棄濾液。
[0073] (8)將吸附柱置回2mL離心管中，12, 000 Xg離心2min。
[0074] (9)將吸附柱移入新的I. 5mL離心管（試劑盒內提供）中，在吸附柱膜中央加 6(^1去離子水（651：預熱），室溫靜置21^11。12,000\8離心11^11。將洗脫下來的溶液重 新加到吸附膜的中央，復洗一次。
[0075] 提取質粒後再用Sail和EcoRI進行雙酶切驗證，如圖2所示。將經過鑑定的陽性 克隆送交Irwitrogen公司測序。驗證正確的克隆即為所要獲得的啟動子STA3,其核酸序列 如SEQID No: 1 所示。
[0076] 6、植物表達載體的構建
[0077] 從上面"啟動子STA3的獲得"過程中獲得的陽性克隆中提取質粒，用Sail和EcoRI 雙酶切，回收啟動子STA3片段。同時利用Sail和EcoRI對pCAMBIA1391進行線性化處理、 回收PCAMBIA1391，將上述的STA3片段和pCAMBIA1391片段用T4連接酶（購於TaKaRa公 司）進行連接，得到啟動子STA3與Gus基因融合的植物表達載體pCAMBIA1391-STA3(圖 1B)，利用凍融法將植物表達載體轉入根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105， 從凍融法所得產物中提取陽性質粒，用Sail和EcoRI進行酶切驗證，即質粒DNA用限制性 內切酶消化。電泳觀察酶切片段的位置和大小，以判斷所鑑定的質粒是否有外源片段插入 以及插入片段的大小。酶切反應體系為20 μ 1，組分如下：
[0078] 質粒 IO μΙ 酶I 1 μ? 酶II 1 μ? 1〇χ buffer 2 μ? ddH20 6 μ?
[0079] 上述各組分混勻後，置37°C反應2_4h，電泳觀察酶切結果。對獲得的轉基因水稻 進行GUS表達定量檢測發現，轉基因植株在雄蕊部位上的Gus基因表達水平提高，從而證明 該2140bp的序列具有驅動基因在雄蕊部位表達的活性，而且該啟動子驅動的Gus基因在水 稻雄蕊部位特異表達。
[0080] 7、農桿菌介導的水稻遺傳轉化
[0081] (1)愈傷組織誘導消毒後的種子用無菌水在30°C黑暗條件下浸泡過夜，用解剖 刀將胚剝下置於誘導培養基上。每皿（規格為100X 25mm的一次性塑料培養皿，內含50mL 誘導培養基）均勻放置12個胚，在30°C黑暗條件下放置2?3周誘導愈傷組織，至長出淡 黃色顆粒狀愈傷。
[0082] (2)預培養從誘導培養基上挑選顆粒狀、不帶病斑的愈傷組織置於新的誘導培養 基上，於30°C黑暗條件下培養3?5d。
[0083] (3)侵染及共培養將預培養的愈傷組織轉移至50mL無菌管中，加入超表達載體的 農桿菌菌液浸泡20min，倒出菌液，並用無菌濾紙將殘餘菌液吸乾。後將愈傷均勻撒在共培 養培養基上，於23°C黑暗條件下培養2?3d。
[0084] (4)恢復將共培養的愈傷轉移至恢復培養基上（愈傷之間儘量避免重疊）。23°C 黑暗培養3?5d。
[0085] (5)篩選從篩選培養基上挑選不帶菌斑顏色鮮亮呈淡黃色顆粒狀的抗性胚性愈傷 組織，每皿30粒接種於篩選培養基，30°C黑暗培養2?3周，至長出新的抗性顆粒狀愈傷。
[0086] (6)分化每一轉化事件（篩選時由一粒愈傷組織繁殖產生的所有愈傷組織）挑選 三個獨立的胚性愈傷到分化培養基某一區域，30°C光照培養室（16h光照/8h黑暗）條件下 培養3?4周，待幼苗長出。
[0087] (7)生根每一區域挑選兩棵健壯的幼苗移栽至生根培養基，30°C組織培養室（光 周期16h光照/8h黑暗）培養三周左右，進行鑑定並移栽至田間。
[0088] 8、⑶S組織化學染色的鑑定
[0089] ⑶S能與顯色底物X-gluc反應，顯現藍色，因而可以通過組織化學染色定性的研 究⑶S的表達水平和表達模式。因此，本發明收集上面步驟7中所獲得的轉基因植株，並分 別針對轉基因植株的不同部位進行Gus染色。
[0090] (1)⑶S染色底物的配製
[0091] 50ml 0· 5M 磷酸緩衝液（ρΗ7· 0)，50ul IOOmM 鐵氰化鉀 K3Fe (CN) 6 (將 3. 2924g 鐵氰 化鉀溶於水，定容至100ml，4°C保存），50ull00mM亞鐵氰化鉀K4〔Fe (CN)6〕. 3H20(將4. 2239 亞鐵氰化鉀溶於水，定容至l〇〇ml，4°C保存）。ImlO. 5MEDTA，250ullmmg/mlX-Gluc(用二甲 基甲醯胺溶解，-20°C避光保存，呈紫紅色）。
[0092] (2)染色步驟
[0093] ①染色：將待測樣品浸到⑶S染液中，37°C保溫箱中放置24h_36h。
[0094] ②脫色：加入100%乙醇浸泡直至完全脫色。可用含有30%甘油和70%乙醇的溶 液保存。
[0095] ③在顯微鏡下拍照記錄。
[0096] 按上述方法進行Gus染色，染色結果如圖3-7所示。圖3-7分別示出了 STA3:: gus轉基因水稻植株各部位Gus染色結果，圖3示出了花的染色結果；圖4示出了莖的染色 結果；圖5示出了葉的染色結果；圖6示出了葉鞘的染色結果；圖7示出了根的染色結果。 通過對各個圖中的GUS染色結構進行比較和觀察可以發現，Gus僅在轉基因植株的雄蕊部 位染色明顯，也就是說啟動子驅動雄蕊部分的Gus基因明顯表達，而不驅動其他部位的Gus 基因表達。（標尺=Icm)。
[0097] 實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例中所用的藥材原料、 試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0098] 本領域技術人員能夠理解，以上對本發明【具體實施方式】的描述並不限制本發明， 僅用於說明本發明，本領域技術人員可以根據本發明作出各種改變或變形，只要不脫離本 發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求的範圍。
[0099] 序列表 安黴省農業科學院水稻研究所 ·種獲取植物雄蕊表達啟動子STA3的方法及相應啟動子 Hd20140104 3 PalcniInversion3.3 <210〉 1<211〉 2140 DNA 啟動子 1: Ulcclcaag allcctagcc tcacclctca IgUatccat acacacgcll tccaaaalac 60 Iagaclalgc gaglUI.Ua aaagltaala lgca?aaagtl aclgtaaaaa aIcaiallaa I 20 UcalgllU caatlUiaa gUaacacU caltaatcat gtgltaaitc atcgillcgt 180 Ulacglacg acgaggaiga latcclaacc tcllcaaaal aacaaagccl IagaaUlga 240 Uaaacalac ctllglalal gcligglgla UtccaigU IgUllglgc Ucacaaaac 300 agcgaacala UUaItcac gggalaiaaa aIatclacU gagtgtaglg atacatlaal 360 ateLtaaaag aaacaaactl tacaaacaac Ltaggacagl IglcLaagca aUIaagaU 420 UUUgaca aaicctatll Uagaaacat aaagcaaata atcalaaaaa acaaiccaal 480 agaUaaUa caaaalcaca IaagaccUa ItggUlgga gaagaltaaa aaggattgga 540 gggaatlgal ggaaaataat ttaacacaal aalaagigta aalaaatigc Uccaatccc 600 lcclUacgg ggallaaclg aacalggict aacigaallg lcaclacagi cgatlgglai 660 I at gaga iga aaaacigaac aaltgltgac acglgcaalg gcaalalclc tccgagcalg 720 atccgaalcc ccigcaglll gaallgclaa lgclacaglc lticlcggla gcaengage 780 actlagatia aaaacgaaac ggticagalc agcaaglatt gtagcalcaa IaUliaUl 840 UlagcUgl actalcacgt taataccgta gaggtiggll alagccciag aatlaigaat 900 cigaciggLgca gciUtclcci aalliaattL acLgUigcac ctclccatti calaciclcia 960 tgeagaggcit cccaatccga gcaatacatg cttgatgaaa catgctggat acaacacaaa 1020 IaggattgLg atalgaltac gcuidtigtggl alggatUcg tgatgattgi igccuiagiac 10S0
[0100] cactgccgac catgtacgca aggaagcgcg agatgacgag gggcaaaalg gggaaaccac 1140 actggaaact ggctgcgcgg cgiagcccga gaccaaagag calccalclc calclccgag 1200 cccgaccicg cgaacagccc acacglacgl laclgacgcc alaacglccg agccacccac 1260 caaclaacca accgacatgl gggccacagc cgtigagccc cacactccag tglccgUta 1320 cgtalcgcgl ccagggagga gagcacggat cgcaacggaa aglgcggcgt gcacaaaaaa 1380 ctccgtatcc agcaaclggc atglgggccc cacaggatgg aggccccaca tgtcagttu 1440 Ulggggggl gtciccgtci tttctcuitg glUgaaigl tcttgggcgl acggclglca I 500 cgtgtltccg gcggacgagl cttltilcag cggtaggggt agtacggclg ccatgtggga I 560 cccaccaccg aaaaccglag tgacictcic lclclclcic lctclccatg caaaagaaag 1620 gaaagagaac agcttlcgcg aigggacggt igatlctcct gcttgtctcg clcgaccgcc 1680 gacgacgaag atacattgta clcccglctc actgccaggl gggcccggac glcglglgcg 1740 gUggcgcaa cgcgcaacga Ulgggcaac acgaciacca cgccggtUc gaggUUlg ! 800 Uglagacgc aglccaLgga ccgacgcgat cagiagccgt ccatlctggg cctctaagat ! 860 lcicgaagcg glcgalcclg tggacigggi clacgctgaa tciacggaac caaccgacia 1920 acgaggtaac caactglUa ctgglclcca tcaagltlat aaccgctcgc glcgcgccca 1980 ictccaccaa lccaccaccg ccacgccacl lcacccitgi UUUtUc cccilclcgc 2040 aaagtlcaaa ccccclctlc Uccctcccl cciclcclct cctcgcttcc gggUccgcc 2 I 00 gcggcttcat ccgatcgccc gcgccaagaa ctcgatcclc 2140 2 28 DNA 正向引物 2: gtcgacittc clcaagallc ctagcclc 2(s 3<211〉 28 DNA 反向引物 3:
[0101] gaaitcgagg alcgagitct tggcgcgg 28
【權利要求】
1. 一種獲取植物雄蕊表達啟動子STA3的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟： 步驟（1)製備正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID N〇:2所示； 步驟（2)製備反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID N〇:3所示； 步驟（3)以水稻品種日本晴的DNA序列為模板，利用所述正向引物和所述反向引物，採 用KOD-plus高保真DNA聚合酶對日本晴的DNA序列中的一目的片段進行PCR擴增，該目的 片段的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示； 步驟⑷對所述目的片段進行加 A並連接PGEM-T-Easy載體； 步驟（5)，利用該載體轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞，使感受態細胞激活，進而將 目的片段轉入到激活的感受態細胞中； 步驟（6)挑取單克隆搖菌液提質粒，用所述正向引物和所述反向引物進行雙酶切驗 證，將經過鑑定的陽性克隆進行測序，驗證正確的克隆即為所要獲得的目的片段--啟動 子STA3,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示； 步驟（7)，回收所述目的片段。
2. 根據權利要求1所述的獲取植物雄蕊表達啟動子STA3的方法，其特徵在於，所述 擴增程序包括：步驟（3-1)在95°C下進行預變性5min ;步驟（3-2)95°C變性30s，58°C退火 308,72°〇延伸21^11308，（3-3)重複步驟（3-1)和步驟（3-2)35-40 個循環，步驟（3-4)721： 延伸lOmin。
3. -種植物雄蕊表達啟動子STA3,其特徵在於，所述植物雄蕊表達啟動子STA3包含 SEQ ID No: 1所示的DNA序列或其變體、同源物或衍生物。
4. 一種表達盒、重組表達載體或轉化子，其特徵在於，所述表達盒、重組表達載體或轉 化子包含權利要求3中所述的植物雄蕊表達啟動子STA3。
5. -種權利要求3所述的植物雄蕊表達啟動子STA3的應用，其特徵在於，所述植物雄 蕊表達啟動子STA3用於驅動外源基因在植物雄蕊部位表達。
【文檔編號】C12N15/10GK104357449SQ201410614236
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 秦瑞英, 楊亞春, 李 浩, 馬卉, 許蓉芳 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所