一種檢測奶牛乳房炎抗性的分子標記及其用途的製作方法

2023-11-11 03:06:02

本發明涉及遺傳育種
技術領域：
，尤其是涉及一種用於檢測奶牛乳房炎的分子標記的選擇確定和應用。
背景技術：
：奶牛乳房炎是影響奶牛業發展的第一大疾病,遺傳因素在乳房炎的發生中起著重要作用。尋找奶牛乳房炎抗性基因或者分子標記,從而進行標記輔助性選擇，成為目前奶牛抗病育種研究熱點。臨床乳房炎的遺傳力較低，為0.01～0.10(chu等，2012)，在奶牛育種中直接選擇的效果差。奶牛體細胞數(somaticcellcount,scc)或體細胞評分(somaticcellscore,scs)遺傳力為0.05-0.29(rupp等，1999；heringstad等，2006)，且在生產中便於記錄。因此，目前常用scs和scc對奶牛乳房炎進行間接選擇(shook，2006；chu等，2012；陳仁金等，2013)。乳腺癌1基因(breasecancer1,brca1)在人類的研究較多，被認為是早期乳房癌症的的易感基因(miki等，1994)，具有參與dna損傷修復、細胞周期調控、轉錄調控、抑制腫瘤以及確保基因組穩定的作用(xu等，2012)。brca1基因突變與乳房癌高發病率相關(krum等，2003；mahfoudh等，2012)。牛brca1基因位於19號染色體，位於或者靠近scs數量性狀位點(qtl)(rebbeck等，1999；kennedy等，2002；bennewitz等，2004；daetwyler等，2008)。技術實現要素：本發明的技術目的是選擇和確定用於檢測奶牛乳房炎的抗性基因或分子標記，分析該突變與產奶乳房炎的相關性，以為奶牛的分子育種提供依據。本發明首先選定牛brca1基因作為荷斯坦牛乳房炎抗性的有力候選基因。牛brca1基因多態性豐富。據ncbi報導，牛brca1基因snp有2196個。經過研究發現，brca1基因突變與牛的乳房炎相關性很高，故而選定牛brca1基因。緊接著，本發明通過brca1基因外顯子14及其側翼序列克隆和序列比對方法挖掘該基因的多態位點，採用snapshot技術檢測了brca1基因50439inst突變位點在北京郊區荷斯坦奶牛群體中的分布，並對突變位點與體細胞評分進行了關聯分析。結果表明，荷斯坦奶牛brca1基因50439inst為新發現突變位點，共檢測到3種基因型，其中aa基因型為優勢基因型，aa基因型體細胞評分高於ab型和bb型(p<0.01)。表明brca1基因50439inst位點的b等位基因可作為荷斯坦牛乳房炎抗性的分子標記使用。在此基礎上，本發明提供了牛brca1基因50439inst位點的b等位基因作為檢測奶牛乳房炎抗性的分子標記的用途。所述奶牛優選是荷斯坦母牛。本發明進一步提供一種用於檢測奶牛乳房炎抗性的分子標記，是brca1基因內含子14上的50439inst位點的b等位基因。可用於乳房炎抗性的奶牛的遺傳育種選育。再進一步提供一組引物，其可特異性擴增所述的分子標記。根據一種具體的實施方式，引物的序列優選如下：50439f：tcacattgctaatactacacgttg；50439r：gaaggcttggtcattaggga；50439y(f)：ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc。所述引物具有高度特異性，可快速準確特異性擴增brca1基因內含子14上的50439inst位點附近的基因序列，並準確判斷荷斯坦奶牛個體在該位點上的基因型。本發明的引物和方法可製備成成品試劑盒，結合測序儀，可快速準備確定待測奶牛個體在該位點上的基因型，選育優良品種。試劑盒中除包含上述特異性引物外，還含有dna提取試劑、擴增用試劑以及dna純化回收試劑等。所述的分子標記用於檢測奶牛乳房炎抗性的方法，採用上述引物，用snapshot技術進行檢測。包括步驟：奶牛dna樣品經預擴增、預擴增產物消化、延伸反應、延伸產物純化後在測序儀檢測snp信號。測序儀優選使用3730xl型測序儀。檢測結果的分析步驟包括：配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較奶牛體細胞評分在基因型之間的差異：yijkl＝μ+hi+sj+gk+eijkl其中，yijkl為奶牛體細胞評分值；μ為群體平均值；hi為第i個牛場的固定效應；sj為第j頭公牛的固定效應；gk為brca1基因第k種基因型的固定效應；eijkl為隨機殘差效應。分析結果的判定是：brca1基因50439inst位點有3種基因型：野生型aa、雜合型ab和突變純合型bb，其體細胞評分的最小二乘平均值，突變純合型bb和雜合型ab的體細胞評分低於野生型aa(p<0.01)。本發明經過對1980頭荷斯坦母牛該位點體細胞評分的統計分析發現，本次發現的位於內含子14的50439inst突變為新的snp位點，該新snp位點突變純合型bb和雜合型ab的體細胞評分低於野生型aa(p250萬和體細胞數<5萬的荷斯坦母牛個體各20頭。採用直接測序法篩查brca1基因外顯子14及其側翼序列多態性。設計測序引物擴增brca1外顯子14及其側翼序列，引物序列如表1所示(引物no.1-2)。擴增產物用dna片段快速純化回收試劑盒純化，連接到pgem-teasy載體，並轉化大腸桿菌(escherichiacoli)top10菌株，酶切鑑定後在3730(abi)測序儀上測序。測序反應由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。taqdna聚合酶、dntps、dna回收和克隆試劑盒等均購自北京天根生物技術有限公司。對測序結果進行比對，尋找brca1基因與乳房炎抗性相關潛在的snp位點。表1奶牛brca1基因檢測引物信息在序列表中的位置引物名稱引物序列(5′→3′)如seqidno.1所示14fagagggaaccccttatctgaaatc如seqidno.2所示14rgggaaacacatctggagacact如seqidno.3所示50439ftcacattgctaatactacacgttg如seqidno.4所示50439rgaaggcttggtcattaggga如seqidno.5所示50439y(f)ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc1.3snapshot對於參試奶牛群體brca1基因的1個snp位點，50439inst(相對於ac_000176)，利用美國應用生物公司(abi)的snapshot技術進行檢測。引物信息如表1所示(引物no.3-5)。奶牛dna樣品經預擴增、預擴增產物消化、延伸反應、延伸產物純化後在3730xl測序儀檢測snp信號。1.4統計分析配合下列模型進行最小二乘方差分析，比較奶牛體細胞評分在基因型之間的差異：yijkl＝μ+hi+sj+gk+eijkl其中，yijkl為奶牛體細胞評分值；μ為群體平均值；hi為第i個牛場的固定效應；sj為第j頭公牛的固定效應；gk為brca1基因第k種基因型的固定效應；eijkl為隨機殘差效應。用sas(6.12版)的glm(generallinearmodel)過程完成。2結果2.1brca1基因外顯子14及側翼序列分析外顯子14測序結果與奶牛brca1基因序列(ac_000176)比對後發現內含子14中存在一個50439inst突變(詳見圖1)。2.2brca1基因50439inst基因型和等位基因頻率分析在參試奶牛brca1基因50439inst位點發現3種基因型：aa(野生型)、ab(雜合型)和bb(插入突變型)，3種基因頻率和等位基因頻率如表2所示，在該位點上野生型是優勢基因型。表2brca1基因50439inst位點等位基因頻率和基因型頻率2.3brca1基因50439inst位點與乳房炎抗性的關聯分析brca1基因50439inst位點體細胞評分的最小二乘平均值見表3，該位點插入突變的3種基因型間體細胞評分存在差異，bb和ab基因型體細胞評分比aa型分別降低了1.78和1.31(p0.05)。表3brca1基因型與乳房炎抗性的關聯性註：同一列不同大寫字母表示存在顯著差異(p0.05).3.結論牛brca1基因多態性豐富。據ncbi報導，牛brca1基因snp有2196個。本次發現的位於內含子14的50439inst突變為新的snp位點。經過對1980頭荷斯坦母牛該位點體細胞評分的統計分析發現，該新snp位點突變純合型bb和雜合型ab的體細胞評分低於野生型aa(p<0.01)，說明brca1基因是荷斯坦牛乳房炎抗性的有利候選基因，50439inst位點的b等位基因可以作為乳房炎抗性的分子標記使用。序列表北京市畜牧總站一種檢測奶牛乳房炎抗性的分子標記及其用途p17100885patentinversion3.5124dna人工序列1agagggaaccccttatctgaaatc24222dna人工序列2gggaaacacatctggagacact22324dna人工序列3tcacattgctaatactacacgttg24420dna人工序列4gaaggcttggtcattaggga20547dna人工序列5ttttttttttttttttttttttttttttttctatggtggcatcaggc47當前第1頁12