一種靶向幹擾socs1基因的重組腺相關病毒載體的構建方法與應用的製作方法

2023-11-11 04:34:57 3

專利名稱：一種靶向幹擾socs1基因的重組腺相關病毒載體的構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學與生物醫藥技術領域，特別是涉及ShRNA重組腺相關病毒載體及其構建方法與其在製備抗腫瘤藥物和疫苗中的應用。
背景技術：
細胞因子信號抑制因子(Suppressor of cytokine signaling, S0CS)是信號傳導通路JAK/STAT (Janus kinase/signal transduction and activators of transcription)的一個負性調控分子家族。SOCS家族包括八個成員(CIS，S0CS1-7)，其中S0CS1與多種細胞因子的信號轉導有關。S0CS1是多種細胞因子的負性調控因子，TLR信號活化的DC產生大量的細胞因子，包括IL-12、TNF-a、IL_6、IFN-a / β、IFN-Y等，其中大部分被SOCSl調節。研究表明，S0CS1參與DC的發生、成熟和活化，對DC的免疫負反饋調節起重要作用，S0CS1可通過負反饋降低DC對細胞因子和LPS刺激的反應，能限制DC的抗原提呈能力，下調其表達可以有效增強DC的抗腫瘤免疫反應。RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)對靶基因轉錄後的mRNA的分解，從而抑制靶基因表達的一種轉錄後基因沉默現象。RNA幹擾技術可以高效、特異地下調目標基因的表達，為研究內源性基因功能和信號轉導途徑提供了強有力的研究工具。RNAi因具有特異、快速、高效等優點，現已廣泛應用於抗腫瘤、抗病毒和基因治療等研究。在RNAi技術的應用方式中，採用化學合成siRNA，存在小分子RNA在體外易被RNase降解、轉染效率低、持續時間短等缺點；質粒介導RNAi也存在局限性，瞬時轉染在不同的宿主細胞質粒的轉染效率差別很大，尤其對於原代細胞、幹細胞等體系難以滿足實驗要求，而腺病毒、逆轉錄病毒本身具有生物毒性，具有很大的潛在相關危險，限制了其臨床應用。腺相關病毒(AAV)是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其他病毒(如腺病毒)的基因產物輔助才能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。美國國立衛生研究院(NIH)和食品及藥品管理局(FDA)宣布，AAV是基因治療最安全的病毒載體。目前，主要是歐美國家在進行以AAV為基礎的基因治療臨床試驗。
腺相關病毒載體介導的RNA幹擾能將自身攜帶片斷整合入宿主細胞基因組中，能夠長期穩定並特異性抑制靶基因的表達，並且與腺病毒和逆轉錄病毒相比，還具有低免疫原性的特點，因而成為基因治療載體的首選
發明內容
本發明的目的主要是提供一種靶向幹擾S0CS1基因的重組腺相關病毒載體。本發明所提供的重組腺相關病毒載體，是攜帶人U6啟動子和RNAi核苷酸序列，其針對S0CS1的RNAi序列為:
5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'用於轉錄該shRNA的DNA序列為:正義鏈:5 ' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGCTCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3'；反義鏈:5' -CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTTTCCAGATACAGTTAAGCTGG-3'；本發明的第二個目的是提供上述shRNA重組腺相關病毒載體的構建方法。本發明所提供的構建方法，是使用常規的基因重組方法，先將腺相關病毒載體中的結構基因剔除，再將人U6 snRNA啟動子與shRNA核苷酸序列與AAV質粒連接，構建成靶向SOCSl基因的RNAi表達質粒，然後將shRNA重組腺相關病毒載體質粒和pHelper質粒共轉染AAV-HEK293細胞得到相應的重組腺相關病毒(rAAV/shRNA)。本發明的最後一個目的是提供上述shRNA重組腺相關病毒載體及其相關產品在製備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。


圖1為人U6啟動子PCR擴增鑑定圖。
圖2重組腺相關病毒載體的結構示意圖。
圖3為重組腺相關病毒載體rAAV的雙酶切鑑定圖。
圖4為重組腺相關病毒rAAV的製備流程圖。
圖5為重組腺相關病毒的病毒滴度檢測結果。
圖6為重組腺相關病毒載體感染效率流式檢測圖。
圖7為RT-PCR檢測靶基因幹擾效率。
圖8為western blot檢測祀基因幹擾效率。
具體實施例方式實施例1目的基因片段的獲取所用引物、DNA序列由上海生工生物公司合成，DNA測序由華大基因公司完成。hU6 啟動子引物序列:U6F:5' -ATATGCATCCAAGGTCGGG CAGGAAGAGGGCCTAT-3'和U6R:5/ -ATCTCGAGATCGATGC GGCCGCCA TATGGA-3'。根據NCBI Genebank中登錄的人SOCSl基因序列(NM_003745)及shRNA設計原則，利用Ambion公司的RNAi Design軟體，設計合成針對SOCSl基因有效的RNAi序列:
5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'用於轉錄該shRNA的DNA序列為:正義鏈:5 ' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGCTCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3'；反義鏈:5'-CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTGG-3/ ； 實施例2pAAV2_S0CS1-shRNA載體構建及鑑定A.採用PCR擴增技術擴增hU6啟動子利用引物 U6F: 5' -ATATGCATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG CCTAT-3'
和 U6R:5' -ATCTCGAGATCGATGCGGCCGCCA TATGGA-3'，
通過PCR反應從PAVU6+27質粒中擴增出含hU6啟動子的序列片段，經瓊脂糖凝膠電泳鑑定(圖1)，膠回收純化產物。B.將擴增出的片段經SalI和XbaI雙酶切後，和S0CSl_shRNA幹擾序列連接，行瓊脂糖凝膠電泳鑑定，膠回收純化產物，獲得完整的hU6啟動子及幹擾序列，並行測序鑑定。C.以XhoI和NsiI雙酶切pAAV2和hU6啟動子及幹擾序列，分別回收大片段，以T4DNA連接酶將hU6啟動子及幹擾序列插入pAAV2質粒，得到重組腺相關病毒載體(pAAV2-S0CSl-shRNA)。D.將連接後的導入基因工程大腸桿菌(E.coli)DH5 α感受態細胞(按分子克隆實驗指南方法製備)，塗板到含lOOug/mlAmp的LB瓊脂培養基上進行抗性篩選，挑選陽性單克隆菌落，提取質粒並純化，行後續雙酶切鑑定(圖3)，經鑑定正確的質粒再擴增培養，大量抽提質粒。實施例2重組腺 相關病毒(rAAV)的製備及滴度測定A.按照Lipofectin說明書進行操作:將1.0ug rAAV載體質粒、phelper質粒、
4.0ul Lipofectin和50ulDMEM混勻，共轉染AAV-HEK293細胞培養過夜。次日換液，加入完全培養基。培養至72hr後，收集培養液和細胞於50ml無菌離心管中，劇烈振蕩I分鐘，4°C，IOOOOrmp離心15min。取上清,過濾除菌,即可獲得相應的重組腺相關病毒(rAAV/shRNA)。B.病毒滴度的測定:以地高辛(DIG)標記的探針進行斑點雜交法檢測rAAV的病毒滴度。以已知病毒滴度的質粒作為對照，製備的rAAV/shRNA病毒滴度(拷貝數)為lX1012eg/ml(圖 5)。實施例3重組腺相關病毒轉染效率的檢測無菌抽取健康志願者外周血50mL,肝素抗凝,採用Ficoll密度梯度法分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),培養於 6 孔板,貼壁 5h 後,輕輕洗去懸浮的淋巴細胞，剩餘貼壁的細胞即為DC前體細胞，每孔加2.5ml含GM-CSF(800U/mL)的AIM-V培養基，隔天半量換液，從培養第2天起加入IL_4 (1000U/mL)。在DC培養第3天用重組腺相關病毒(rAAV/shRNA)感染，實驗分為幹擾組、陰性對照組(NC)和空白對照組(Mock)。感染複數MOI為100，8小時後除去含病毒的培養基，以新鮮的AIM-V培養基取代之，並於第4天起給予TNF-a(20ng/mL)刺激DC成熟，第6天收集懸浮細胞，即為成熟的DC細胞，流式細胞儀檢測GFP表達量，每個樣本測10000個細胞，GFP陽性細胞的陽性率即為感染效率。可見重組腺相關病毒的感染效率高達90%以上(圖6)。實施例4重組腺相關病毒體外抑制效率檢測A.qRT-PCR檢測幹擾後SOCSlmRNA的表達情況
按照Trizol試劑盒操作說明分別提取幹擾組、陰性對照組和空白對照組細胞總RNA，經逆轉錄獲得cDNA。以GAPDH基因為內參，採用實時螢光定量PCR法檢測SOCSlmRNA的表達情況。S0CS1基因上遊引物序列為V -AGAGCTTCGACTGCCTCTTC-3 '，下遊引物序列為V -GATGCGCTGGCGGCACAGCT-3 ' ； GAPDH基因為內參照，上遊引物序列為5' -GCATCCTGGGCTACACTGAG-3'，下遊引物序列為 5' -TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3'。實驗操作按試劑盒說明書進行。PCR反應採用美國羅氏LightCycler480螢光定量PCR儀完成。採用相對定量法計算SOCSlmRNA的變化。實時螢光定量PCR結果顯示，與空白細胞組及陰性對照組比較，幹擾組mRNA表達量下調達82.5 %，較對照組顯著下調，差異有統計學差異(P < 0.05) ο (見圖 7)B.Western blot檢測幹擾後SOCSl蛋白的表達情況
轉染96h後收集各組細胞進行總蛋白提取，BCA法測定總蛋白濃度，樣品蛋白SDS-PAGE電泳分離，電轉至PVDF膜上，封閉液中孵育，加入鼠抗人SOCSl單克隆一抗(I: 1000)，4°C孵育過夜。TBST洗滌後加入山羊抗鼠二抗(I: 1000)室溫下搖床孵育2h，TBST洗滌後用化學發光試劑孵育lmin，用X線片曝光顯影。以β-actin為內參照驗證蛋白的含量。Western blot檢測結果顯示:與空白細胞組及陰性對照組相比，幹擾組SOCSl蛋白的表達顯著降低(P < 0.05)(見圖8)。臨床應用
實驗證明，本發明的shRNA重組腺相關病毒載體能有效下調人DC中SOCSl基因的表達，這為後續研究、製備SOCSl受抑的DC抗腫瘤效應和製備新型DC疫苗奠定了基礎，有很好的臨床應用前 景。
權利要求
1.一種針對 SOCSl 的 RNAi 序列:5' -CAGCTTAACTGTATCTGGA-3'
2.一種用於轉錄權利要求1所述的shRNA的DNA序列，其DNA序列的正義鏈: 5' -TCGAC CAGCTTAACTGTATCTGGA AAGC TCCAGATACAGTTAAGCTGTTTTTT-3;； 反義鏈:5' -CTAGAAAAAA CAGCTTAACTGTATCTGGA GCTT TCCAGATACAGTTAAGCTG G-3,
3.權利要求1、2所述的RNAi序列及shRNA的DNA序列在製備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。
4.一種重組腺相關病毒基因治療載體及構建方法，其特徵在於:所述的重組腺相關病毒載體攜帶有權利要求2所述的DNA序列和適宜的啟動子和終止子。
5.權利要求4所述的shRNA重組腺相關病毒載體及相關產品的製備方法，包括如下步驟: (a)設計合成具有靶向抑制SOCSl基因的shRNA的DNA序列； (b)將人U6snRNA啟動子與RNAi核苷酸序列連接，分別經雙酶切後與AAV載體質粒相連接，構建成靶向SOCSl基因的RNAi表達質粒； (c)將上述shRNA重組腺相關病毒載體質粒和pHelper質粒共轉染AAV-HEK293細胞得到相應的重組腺相關病毒(rAAV/shRNA)。
6.權利要求4、5所述的shRNA重組腺相關病毒載體及其相關產品在製備抗腫瘤藥物及疫苗中的用途。
全文摘要
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種特異性抑制SOCS1基因表達的shRNA(short hairpin RNA，shRNA)重組腺相關病毒載體的構建方法及其應用。本發明的shRNA重組腺相關病毒載體輸送入單核細胞-巨噬細胞-樹突狀細胞系中，下調SOCS1基因的表達，增強CTL的抗腫瘤活性。因此，本發明將在生物醫藥領域及基因功能的研究中發揮重要作用，可被用於製備抗腫瘤藥物，有很好的臨床應用價值。
文檔編號A61P35/00GK103173446SQ20111044273
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者呂成偉 申請人:呂成偉