冠心病易感性檢測試劑盒的製作方法

2023-11-11 04:17:17 1

專利名稱：冠心病易感性檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病易感性檢測甩的試劑盒，尤其是一種檢測冠心病易感性的試劑盒，通過檢翻三, 酸腺苷結合盒轉運體Al基因(ATP~binding cassette, sub-family A， member 1, ABCAl)的單核苷酸多 態性(SNP)位點來預測個體對冠心病的易感性。背錄技術冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart di幼ase)掛冠狀動IMIS:mit使血管 腔狹窄或阻塞，或(和)因冠狀動脈功H^改變(痙牽)導致心肌缺血缺氧或壞死0引起的心臟病，統稱冠狀 動脈性心臟病(coronary heart disease),簡稱冠心病(CHD)，亦稱缺血性心臟病(ischemic heart disease) 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，啦是嚴重餘害人^t康的常 見病，本病多發生在40歲以後，男性多於女性。發達國家常見，美國約有700萬人患本病，毎,50餘 萬人死於本病，佔人口死亡數的1/3 1/2,佔心臟病死亡數的50%~75%。在我國，ift^來呈增長趨勢， 20世紀70年代北京、上海、廣州本病的人口死亡率分別為21.7/10萬人口、 15.7/10萬人口和4.1/10萬 人口 90年代我國城市男性本病死亡率為49.2/10萬人口，女性為32.2/10萬人口。冠心病的發病隨年齡的增長而增髙，程度也隨年齡的增長而加重，有資料表明，自40歲開始，每堆 加10歲，冠心病的患病率增l倍。男性50歲，女性60歲以後，冠狀動脈硬化發展比較迅速，同樣心肌 梗塞的危險也隨著年齡的增長而增長。年輕的男性患者比年輕的女性患者多，但絕經後的女性以及年過六 十的婦女，其危險就幾乎與男性相等了，甚至大於男性。老年人心臟病發作的可能性較高，其發病機理是複雜的，綜合性的較長過程。可歸納為四個步驟1.心血管內皮細胞損害，平滑肌細 胞增生。2.血小板粘附於受損的血管壁後，釋放出血清素，血栓素A2、血小板IV、通因子等，3.低密度 脂蛋白由受損的內皮細胞滲入內腹下的平滑肌細胞，並被吞噬，進入細胞後被細胞內溶,體的水解,分解 而釋放出遊離膽固醇，後者與亞油酸結合，成為重要發病環節。4.在上述病理變化基礎上，最終發生冠 狀動脈纖維化、鈣化。冠心病是一種有遺傳因素和環境因素相互作用而發病的多基因病，尋找冠'6^枏關基因進而M明冠心 病發病的遺傳機制已經成為目前研究的熱點。三確酸腺苷結合盒轉運體A1基因(ABCA1)蛋白是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促^B胞內 游離膽圃醉和磷脂的流出，在膽固酵逆轉運(RCT)和HDL生成的起始步，中起^作用^被稱作RCT守門 人，核受體PPARs、 LXRs和FXR對abcal蛋白的表達具有調控作用。人體5 0種組織中存在有ABCA1戰NA , 在胰、肝、肺、腎上腺和胎兒組織中ABCA1表達水平最高，ABCA1功能降礙將導致巨敏細胞內大撒的膽困 醉沉積而成為泡沫細胞，繼而浸潤血管壁，促進冠心病的發生發展。SNP(single nucleotide polymorpHisin),即單核苷酸多態性標記，是一類基於單鹼基變異引起的DNA 多態性，被遺傳學界稱為第三代遺傳標記。主要是指由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性， 包括單鹼基轉換、顛換，以及單鹼基的插入/缺失等。它是基因組中最為廣泛存在的一類多態性標記，佔 大約90%。這些基因組序列變異可以導致個體間表型的差異以及不同個體對疾病，特別是複雜疾病的易感 性、和對環境因素、藥物反應的差異。研究表明，ABCAl基因上的re2230806號SNP位點(SEQIDNO: 1所示序列中136位)的多態性(G/A) 會引起基因編碼蛋白的的第219個胺基酸發生改變(Ais/Lys),而其中Lys 基酸的表達可提高鑫萊離 度鬆蛋白含量，對心膾血管疾病的發生有一定保護作用。國內外的大量的關聯分析表明，ABCA1的Lys 多態(SNP位點基因型為A)能夠降低冠心病的發生、延緩冠狀動脈粥樣硬化進展程度，這個SNP位點的 多態性可用於評估個體對冠心病的易感性，目前已通過中國科學院國家生物基因檢淵技術應用評估認證中 心的認證*
發明內容基於ABCA1基因上的ra2230806號SNP位點可用來評估個體對冠心病的易感性的基礎上，本發明提供 一種檢淵冠心病易感性的試劑盒。該試劑盒包括檢測ABCA1基因SEQ ID NO: 1中第136位SNP特異性螢光探針、 Taq酶、dNTP泡合液、MgCl,溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水.本試劑盒中所述的特異性弓l物對是指針對SEQ ID NO: 1中第136位SNP位點而艦，,異性擴增 出SEQ ID NO: 1中包含第136位SNP位點的DNA片段的引物對。設計這類引^Ptf是本0iJK技術人員能夠 輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物對，特異性引物對可用常規 的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的引物不限於這兩對引物，本試劑盒中所述的特異性螢光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第136位SNP位點而設計，艦過螢光 定置PCR技術特異性檢測出這個SNP位點冠心病易感基因型的探針。設計這類探針是本fW技術人員能壤 輕易完成的。優選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的Taqman探針。特異性螢光探針可用常 規的合成技術進行合成。本領域的技術人員能夠理解，本發明的特異性螢光探針不限於這條探針，所有可 W於螢光定量PCR檢測SEQ ID NO: 1中第136位SNP位點的探針均在本發明範圍內。本發明試劑盒的組分和含童包括 ljil 10 X螢光定量PCR反應緩衝液， 0. l il 25mM dNTP泡合液， 0.6^1 25mM HgCL溶液， 0.025^1 (5units/pl) T叫咖A聚合酶， 20(ill特異性引物對(兩條)各0.225ji1, lOjiM特異性螢光探針0. 25jU, 去離子水5. 575(11。本試劑盒供一人份檢淵應用，試劑盒的保存溫度為-20TC,具體實施方式
卜'面結合具體實施例，進一步闡述本發明。下列實施例中未註明具體*#的$ ^,通常接親常規 條件，或按照廠商所建議的條件。實施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取 用矽膠吸附法抽提口腔上皮細胞的基因組咖A。 步驟2:螢光定量PCR反應使用可檢測冠心病易感性的螢光定量PCR檢測試劑盒，其中，含有下列引物對和爽光探針有義引物5' - TGTGCMTGGATCAAAATCAG -3' (SEQ ID NO: 2〉 Tm值為54TC反義引物5' - GTGAGCAAGTCTACTCAC -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值為54TC螢光探針5' - ACCMGGGAGAAACTGGCTGC -3' (SEQ ID NO: 4) Tm值為661C螢光定量PCR反應體系為總體積lOnl,包含濃度為20ng/jU的DNA模板扭l、 lpl 10 X熒先定量PCR 反應緩衝液、0. lfil 25mM dNTP混合液、0.6^1 25nM MgCl:溶液、0.025)il (5units/|il) T叫D他聚合,、 20^的有義引物和反義引物各0.225|11、 lOfiM的螢光探針0.25^1，去離子水&575fU,在ABI9700型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為50TC、 2分鐘，訴1C、 10分鐘，進行60個糖環的 訴1C、加秒，60X:、 l分鐘。反應結束後在ABI7恥0型螢光定量PCR儀上讀取樣品螢光量，
步驟3: SNP基因型分析將螢光定董PCR儀上顯示的豕終樣品螢光量和正常對照相對比，螢光探針Jt^拍熒3fe傕號明量離於正 常對照，說明被檢測咖A的ABCA1基因上is2230806號SNP位點基因型攜帶有G型，為冠心瘸易感型，實施例2.指導人們主動預防冠心病的服務目前在上海主健生物工程有限公司已經開展了這項服務。 步簾l: DNA提取對被檢測者進行服務前諮詢，由,擁者籤署知情同意書，填寫生活飲食芽慣桐MS表，依照取樣 盒中的指示使用口腔採樣拭進行口腔上皮細胞取樣，採用矽膠吸附法進行口腔上^mJBft^ DNA 步驟2:基因分型檢測使用本發明提供的試劑盒,對被檢測者DNA的ABCA1基因上的r2230806號 位點港療螢光定營PCS 檢新，確定該SNP位點的基因型。步驟3:指導人們主動預防冠心病通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具基因分型4^報吿和被檢糖者個侔化健康指導報吿，基因堆 糖報吿詳細說明了被檢獮者冠心病易感程度的高低以及患病的概率大小，個體體健康指導錄吿以缺檢翻者 的基因分型檢測結果為基礎，結合其生活飲食習慣問巻調査結果，評估鹼餘攤賽^Alft傳易tt翁相對風 險，同時制定出針對於被檢獮者的個性化健康行動方案，方案包括在飲食習憤、生活方式上的改進建議等, 並為被檢測者普及預防冠心病的健康知識。序列表<110〉上海主健生物工程有限公司<120〉冠心病易感性檢測試劑盒<160〉 4<210〉 <212〉 1300 DNA 人厲,人種(Homo sapiens, human)<400〉 1ctctttgcattgtgc助tggtttgtggcctacatcctgaagctttcggaagaaatgcttc c鄉tatttt tgc幼ggcta ccagttacat ttgac卿tc 60atcaaaatca gaagagatga ttc助cttgg t卿caagaa gtttct柳c 120acc助gggag aaact鵬tg cagcagagcg agtacttcgt tcc助cat肪 180gccaatcctg gtgagtagac t.tgctcactg柳aaacttc幼gcact幼t 240tgtg鄉ctt ttccUggac agcatgactt t^ttttgtag咖agtacgg 300 221DNA人工序列<223〉引物 2tgtgcaatgg atcaaaatca g21 318DNA人工序列引物 3gtgagc助gt ctactcac18 4 21 DNA 人工序列〈223>探針 4ac0Bagggagpac^gp^c 21力
權利要求
1.一種冠心病易感性檢測試劑盒，其特徵在於包括檢測ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、螢光定量PCR反應緩衝液、去離子水。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性引物對是指針對SEQIDNO: 1中第136 位SNP位點而設計，能特異性擴增出包含SEQ ID NO: 1中第136位SNP位點的DNA片段的引物對。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的特異性螢光探針是指針對SEQ ID NO: 1中第 136位SNP位點而設計，能通過螢光定量PCR技術特異性檢測出該SNP位點冠心病易感基因型的探針。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性引物對選自具有SEQIDNO: 2和3所 示序列的引物對。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所含的特異性螢光探針選自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探針。
6. 根據權利要求l所述的試劑盒，其特徵在於試劑盒的組分和含量包括ljil IOX螢光定量PCR反 應緩衝液，0. lpl 25mH dim^混合液，0.6fil 25mM MgCl,溶液，0.025 il (5units/)il) Taq DNA,合瞎， 20jlM特異性引物對(兩條)各0.225nl， 10nM特異性螢光探針0.25nl，去離子水5.575pl。本試劑盒供 —人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20lC。
全文摘要
本發明公開了一種冠心病易感性檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測ABCA1基因SEQ ID NO1中第136位SNP位點的特異性引物對及特異性螢光探針、用於螢光定量PCR檢測的常規組件等。本發明的試劑盒通過檢測分析個體的ABCA1基因上SNP位點基因攜帶型來預測個體對冠心病的易感性。
文檔編號C12Q1/68GK101131357SQ20061003038
公開日2008年2月27日 申請日期2006年8月25日 優先權日2006年8月25日
發明者馮哲民, 屹 樓, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司