日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因的克隆及在家蠶系統中的表達的製作方法
2023-11-11 04:19:22
專利名稱：日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因的克隆及在家蠶系統中的表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程疫苗，具體涉及一種日本血吸蟲中國大陸株脂肪酸結合蛋白基因的克隆及在家蠶系統中的表達。
血吸蟲病是一種嚴重嚴重危害人、畜健康的寄生蟲病，長期研究和實踐證明，在應用已有防治技術的基礎上，開展疫苗預防研究，特別是基因工程疫苗研究是防治血吸蟲病的重要發展戰略、1994年世界衛生組織(WHO)曾推薦幾種較好的曼氏血吸蟲候選抗原，例如Sm 14FABP(脂肪酸結合蛋白)，見BergquistN K，Hall B F，James S.Schistosomiasis vaceine deve lopment.The lmmunologist.1994.2(40)131-134。
本發明的目的在於對日本血吸蟲中國大陸株脂肪酸結合蛋白(Sj14FABP)基因進行克隆，並應用家蠶宿主生產重組蛋白用於製備疫苗。
本發明公開了一種日本血吸蟲脂肪結合蛋白基因的克隆及在家蠶系統中的表達。
本發明所用材料如下含Sj14FABP基因的重組質粒Sj14/pGEX-2T由本實驗室構建；修飾的BmNPV由中國科學院上海生物化學研究所構建；BmN細胞、轉移質粒pBacPAK Hisl(為Clontench公司產品)和用於擴增重組質粒及重組轉移質粒的大腸桿菌TG1均為中國科學院上海生物化學研究所保存；各種工具酶、Lipofectin、NicK Translation Kit和低熔點瓊脂糖均為GIBCO BRL公司產品、硝酸纖維膜(NC)為Chleicher Schuell或浙江黃巖產品；辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG、X-gal為Sigma公司產品。家蠶(75新×7532)由中國農業科學院蠶業研究所提供。
本發明的方法包括下列步驟1、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5』-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3』和引物5』-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3』日本血吸蟲中國大陸株成蟲cDNA文庫中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook實驗手冊中的方法將其克隆到PSK(+)質粒上，按USB T7測序試劑盒說明書操作，測定其核苷酸序列；2、重組轉移質粒的構建 按Sambrook實驗手冊進行基因操作，篩選出含Sj14FABP基因的重組子，用Sal I酶切及按USB測序試劑盒說明書測序以確定連接方向和對碼情況；
3、病毒重組 參照Summers實驗手冊用Lipofectin共轉染法製備重組病毒。修飾的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)多角體蛋白啟動子調控下的LacZ基因，同時在多角體基因(ph)的兩側引入Bsu36 I位點，通過酶切使基因組DNA線性化。共轉染混合物由2μg線性化病毒DNA、3μg重組轉移質粒DNA和等體積的50μl Lipofectin組成。傳染後的BmN細胞於27℃培養一周後取上清擴增一次；4、重組病毒的篩選、鑑定與純化 取擴增共轉染病毒上清作1∶10-3和1∶10-4稀釋，感染1×105細胞1小時，鋪上含0.2mg/mlX-gal的低熔點瓊脂糖(1％)，培養4-6天後挑取多個白斑於24孔培養板(2×104細胞/孔)，27℃培養3-4天，收集細胞，用32P標記的Sj14FABP基因探針進行dot-blot DNA雜交分析，選擇陽性克隆按上述方法進行第二輪空斑分析，得純化的重組病毒Bm-Sj14FABP；5、Sj14FABP基因的表達 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN細胞後1至6天分別收集細胞和上清用SDS-PAGE(15％分離膠)檢測。5齡家蠶在環節皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，於次日開始逐日收集血淋巴和蠶體組織。血淋巴經PBS 1∶3稀釋，組織用PBS勻漿、液氮凍融、超聲、離心(11953g×10min)後收集上清，以SDS-PAGE(15％分離膠)方法進行檢測；6、表達產物的純化 表達產物為融合蛋白，含Sj14FABP和來自pBacPAK Hisl的含6個組氨酸的部分表達蛋白。參照文獻方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱純化，上柱前血淋巴用緩衝液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀釋；組織用上述緩衝液勻漿、凍融、超聲、離心(11953g×10min)製備上柱樣品。用100mM EDTA洗脫，用紫外吸收法測蛋白含量；7、表達產物的鑑定 以大腸桿菌表達的Sj14FABP免疫Balb/c鼠製備抗血清，用該血清與蠶表達產物及純化產物作Westernblot反應，檢測蠶表達產物的抗原性；本發明方法各步驟的驗證結果如下1、從日本血吸蟲中國大陸株成蟲cDNA文庫中克隆出一段大小為600bp左右的DNA片段，其核苷酸序列如下1 CAGGATCCAT GTCTTTCTTG GGAAAGTGGA AACTAAGCGA ATCACACAAC TTCGATGCTGGTCCTAGGTA CAGAAAGAAC CCTTTCACCT TTGATTCGCT TAGTGTGTTG AAGCTACGAC61 TTATGTCAAA GCTCGGTGTC TCGTGGGCGA CCCGACAAAT TGGGAACACA GTGACGCCAAAATACAGTTT CGAGCCACAG AGCACCCGCT GGGCTGTTTA ACCCTTGTGT CACTGCGGTT121 CTGTCACTTT CACAATGGAT GGGGGATACG ATGACCATGC TGACAGAGTC GACTTTCAAGGACAGTGAAA GTGTTACCTA CCCCCTATGC TACTGGTACG ACTGTCTCAG CTGAAAGTTC181 AACCTCTCAG TCACGTTCAA ATTTGGTGAG GAATTTGACG AGAAAACCAG TGATGGCAGATTGGAGAGTC AGTGCAAGTT TAAACCACTC CTTAAACTGC TCTTTTGGTC ACTACCGTCT241 AGCGTTAAGT CAGTCGTTAC CAAAGATTCA GAGTCAAAGA TAACTCAAAC TCAAAAGGATTCGCAATTCA GTCAGCAATG GTTTCTAAGT CTCAGTTTCT ATTGAGTTTG AGTTTTCCTA301 AGTAAGAACA CAACTGTAAT CGTTCGTGAA ATAGTAGGTG ATACTATGAA AACTACTGTATCATTCTTGT GTTGACATTA GCAAGCACTT TATCATCCAC TATGATACTT TTGATGACAT361 ACTGTCGATG ATGTTACGGC TATTCGGAAT TACAAACGAT TGTAACCCCT GCAAACTGATTGACAGCTAC TACAATGCCG ATAAGCCTTA ATGTTTGCTA ACATTGGGGA CGTTTGACTA421 AGACTGGTCA AATGTTTCTT GAAAGCGCTT GTATTTCAGT TGACATTATT ACGAAAATGATCTGACCAGT TTACAAAGAA CTTTCGCGAA CATAAAGTCA ACTGTAATAA TGCTTTTACT481 CCACCGGTGG ACGTATTTGG TTACTCGCGT CATCCTATAT TTAATTAATC AGCTCCACTTGGTGGCCACC TGCATAAACC AATGAGCGCA GTAGGATATA AATTAATTAG TCGAGGTGAA541 TTGGTTCAAT AAACATTGCT TATTATTTAA AAAAAAAACCAAGTTA TTTGTAACGA ATAATAAATT TTTTTT
2、重組轉移質粒的構建轉移質粒的構建過程如
圖1所示。轉移載體pBacPAK Hisl是帶多角體基因啟動子的融合蛋白轉移載體。用BamH I酶切Sj14/pGEX-2T，分離得Sj14FABP基因片段。該片段大小為600bp左右，內含Sj14FABP基因，該基因ORF為399bp，編碼132個胺基酸，其160bp處有一個Sal I位點。將該基因片段與同樣酶切的pBacPAKHisl連接、轉化。重組質粒經Sal I酶切及測序表明插入方向和對碼均正確。
3、重組病毒Bm-Sj14FABP的篩選與鑑定第一輪空斑挑出的23個白斑經dot-blot檢測，基中22個白斑能被32P標記的Sj14FABP基因探針識別。選擇其中的17#強陽性斑進行第二輪空斑分析，挑取23個空斑同法進行檢測，全部為陽性斑(圖2)。選擇其中的強陽性斑1#、8#、17#和19#作表達用。
4、Sj14FABP在家蠶細胞及幼蟲中的表達Bm-Sj14FABP感染BmN細胞和幼蟲後的表達產物Sj14FABP(his)為Sj14FABP與載體的融合蛋白，分子量為18KD，其中Sj14FABP為14.8KD，載體部分為3.2KD。
Bm-Sj14FABP感染BmN細胞後2天開始有Sj14FABP(his)表達，感染後3-6天表達量基本持平。在細胞培養上清中，Sj14FABP(his)自感染後3天開始逐日增加(圖3)。1×106細胞的得量為約100μg(第4天)，培養上清中的得量為約33μg/ml。
Bm-Sj14FABP感染家蠶幼蟲後3天出現發病症狀，4天病情加重，蠶體皺縮，4天半後蠶體出現死亡。SDS-PAGE顯示Sj14FABP(his)在血淋巴和組織中均自感染後3天出現，4天達高峰(圖4)，此時Sj14FABP(his)的產量經GDS8000凝膠掃描分析軟體分析約佔血淋巴總蛋白的33％(圖5)。在空白對照蠶及BmNPV感染的血淋巴和組織中均無此蛋白條帶。感染Bm-Sj14FABP病毒4天的血淋巴及組織經NiSO4-Cheling Sepherose柱純化後，每毫升血淋巴可得4mg純化蛋白，每克蠶組織可得4.6mg純化蛋白，按每條蠶得0.25ml血淋巴、0.6g蠶組織計，每條蠶可得約3.5mg表達產物。圖6所示為純化蛋白的SDS-PAGE圖譜。
5、表達產物的免疫特性以大腸桿菌表達的Sj14FABP免疫的小鼠血清進行western blot實驗，圖譜如圖6所示。感染BmSj14FABP病毒4天的血淋巴及純化的rSj14FABP(his)在18kD處有明顯雜交條帶(圖7)，說明該重組蛋白有較好的抗原性。用BmNPV感染4天的蠶血淋巴在30kD處有一條較弱反應條帶。
用本發明方法獲得的日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白Sj14FABP(his)分子大小為18kD。
用rSj14FABP的動物免疫試驗如下材料與方法一、寄生蟲試驗用日本血吸蟲尾蚴由本所釘螺房提供，血吸蟲生活史循環由紐西蘭大白兔和中國大陸湖北釘螺維持。
二、實驗動物6-8周齡的昆明系小鼠和Wistar大鼠購自中國科學院上海實驗動物中心；1.0-1.5歲雄性綿羊都是血吸蟲陰性，試驗前兩周所有綿羊都用Closantel(比利時揚森公司)治療，驅除羊體內可能存在的其他寄生蟲。
三、基因表達、重組抗原的純化和抗原性測定見蔡學忠等的報導。
四、動物免疫先後進行了一批昆明系小鼠、Wistar大白鼠和綿羊免疫試驗。
五、動物攻擊和剖殺第三次免疫後兩周，小鼠、大白鼠和綿羊分別用40、600和300條尾蚴玫擊，小鼠和大白鼠於玫擊後6-8周剖殺，綿羊於玫擊後11周剖殺，通過門靜脈灌洗法收集蟲體，用以下公式計算減蟲率
六、綿羊糞便、組織蟲卵計數綿羊於玫擊感染後第6至第22周每周採集一次糞便，剖殺時採集肝、大腸、小腸組織樣品，按文獻方法計算每克糞便/組織蟲卵數(EPG)，用以下公式計算減蟲率
結果一、rSj14FABP在小鼠、大鼠，綿羊中誘導的減蟲效果在小鼠、大鼠，綿羊中分別獲得33％、31.85％和59.2％的減蟲率。二、rSj14FABP在綿羊中誘導的減卵效果觀察和對照組相比，rSj14FABP免疫綿羊自攻擊感染後第6周至第11周，糞便中平均每克蟲卵數(EPG)分別減少23.6％、35.0％、63.3％、43.8％、34.9％和57.6％，平均減少42.97％。肝組織EPG減少44.9％；小腸EPG減少69.6％；但大腸EPG未見減少。三、又據文獻報導Tendler M等報導應用重組曼氏血吸蟲FABP(rSmFABP)免疫小鼠和家兔，分別誘導了51.4％-67.8％和56.7％-72.1％的減蟲率。
上述試驗結果表明，Sj14FABP有較好的免疫原性，並能誘導較強的抗玫擊感染作用，它在家蠶幼蟲中得量很高，在感染BmSj14FABP病毒4天的家蠶血淋巴中，Sj14FABP(his)佔血淋巴總蛋白的33％，每毫升血淋巴可得4mg純化的Sj14FABP(his)，而且每克蠶體組織中亦可獲得4.6mg純化的Sj14FABP(his)，這對未來的疫苗生產極具實用價值。家蠶易於飼養，生產成本低，目前已有家蠶人工飼養技術，本發明的方法宜於規模型工業化無菌生產疫苗。實施例一1、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5』-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3』和引物5』-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』日本血吸蟲中國大陸株成蟲cDNA文庫中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook實驗手冊中的方法將其克隆到PSK(+)質粒上，按USB T7測序試劑盒說明書操作，測定其核苷酸序列；2、重組轉移質粒的構建 按Sambrook實驗手冊進行基因操作，篩選出含Sj14FABP基因的重組子，用Sal I酶切及按USB測序試劑盒說明書測序以確定連接方向和對碼情況；3、病毒重組 參照Summers實驗手冊用Lipofectin共轉染法製備重組病毒。修飾的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)多角體蛋白啟動子調控下的LacZ基因，同時在多角體基因(ph)的兩側引入Bsu36 I位點，通過酶切使基因組DNA線性化。共轉染混合物由2μg線性化病毒DNA、3μg重組轉移質粒DNA和等體積的50μl Lipofectin組成。傳染後的BmN細胞於27℃培養一周後取上清擴增一次；4、重組病毒的篩選、鑑定與純化 取擴增共轉染病毒上清作1∶10-3稀釋，感染1×105細胞1小時，鋪上含0.2mg/ml X-gal的低熔點瓊脂糖(1％)，培養4天後挑取多個白斑於24孔培養板(2×104細胞/孔)，27℃培養3天，收集細胞，用32P標記的Sj14FABP基因探針進行dot-blot DNA雜交分析，選擇陽性克隆按上述方法進行第二輪空斑分析，得純化的重組病毒Bm-Sj14FABP；5、Sj14FABP基因的表達 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN細胞後1至6天分別收集細胞和上清用SDS-PAGE(15％分離膠)檢測。5齡家蠶在環節皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，於次日開始逐日收集血淋巴和蠶體組織。血淋巴經PBS 1∶3稀釋，組織用PBS勻漿、液氮凍融、超聲、離心(11953g×10min)後收集上清，以SDS-PAGE(15％分離膠)方法進行檢測；6、表達產物的純化 表達產物為融合蛋白，含Sj14FABP和來自pBacPAK Hisl的含6個組氨酸的部分表達蛋白。參照文獻方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱純化，上柱前血淋巴用緩衝液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀釋；組織用上述緩衝液勻漿、凍融、超聲、離心(11953g×10min)製備上柱樣品。用100mM EDTA洗脫，用紫外吸收法測蛋白含量；7、表達產物的鑑定 以大腸桿菌表達的Sj14FABP免疫Balb/c鼠製備抗血清，用該血清與蠶表達產物及純化產物作Westernblot反應，檢測蠶表達產物的抗原性。
權利要求
1.一種日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因序列，其特徵在於該序列用下式表示1 CAGGATCCAT GTCTTTCTTG GGAAAGTGGA AACTAAGCGA ATCACACAAC TTCGATGCTGGTCCTAGGTA CAGAAAGAAC CCTTTCACCT TTGATTCGCT TAGTGTGTTG AAGCTACGAC61 TTATGTCAAA GCTCGGTGTC TCGTGGGCGA CCCGACAAAT TGGGAACACA GTGACGCCAAAATACAGTTT CGAGCCACAG AGCACCCGCT GGGCTGTTTA ACCCTTGTGT CACTGCGGTT121 CTGTCACTTT CACAATGGAT GGGGGATACG ATGACCATGC TGACAGAGTC GACTTTCAAGGACAGTGAAA GTGTTACCTA CCCCCTATGC TACTGGTACG ACTGTCTCAG CTGAAAGTTC181 AACCTCTCAG TCACGTTCAA ATTTGGTGAG GAATTTGACG AGAAAACCAG TGATGGCAGATTGGAGAGTC AGTGCAAGTT TAAACCACTC CTTAAACTGC TCTTTTGGTC ACTACCGTCT241 AGCGTTAAGT CAGTCGTTAC CAAAGATTCA GAGTCAAAGA TAACTCAAAC TCAAAAGGATTCGCAATTCA GTCAGCAATG GTTTCTAAGT CTCAGTTTCT ATTGAGTTTG AGTTTTCCTA301 AGTAAGAACA CAACTGTAAT CGTTCGTGAA ATAGTAGGTG ATACTATGAA AACTACTGTATCATTCTTGT GTTGACATTA GCAAGCACTT TATCATCCAC TATGATACTT TTGATGACAT361 ACTGTCGATG ATGTTACGGC TATTCGGAAT TACAAACGAT TGTAACCCCT GCAAACTGATTGACAGCTAC TACAATGCCG ATAAGCCTTA ATGTTTGCTA ACATTGGGGA CGTTTGACTA421 AGACTGGTCA AATGTTTCTT GAAAGCGCTT GTATTTCAGT TGACATTATT ACGAAAATGATCTGACCAGT TTACAAAGAA CTTTCGCGAA CATAAAGTCA ACTGTAATAA TGCTTTTACT481 CCACCGGTGG ACGTATTTGG TTACTCGCGT CATCCTATAT TTAATTAATC AGCTCCACTTGGTGGCCACC TGCATAAACC AATGAGCGCA GTAGGATATA AATTAATTAG TCGAGGTGAA541 TTGGTTCAAT AAACATTGCT TATTATTTAA AAAAAAAACCAAGTTA TTTGTAACGA ATAATAAATT TTTTTT
2.一種日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因的表達產物Sj14FABP(his)，其特徵在於該蛋白基因的產物是通過日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因克隆及在家蠶中表達後得到分子大小為18kD的融合蛋白。
3.一種如權利要求2所述的一日本血吸蟲脂肪酸結合蛋白基因的表達產物Sj14FABP(his)的製備方法，該方法包括下列步驟(1)、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5』-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3』和引物5』-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』日本血吸蟲中國大陸株成蟲cDNA文庫中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook實驗手冊中的方法將其克隆到PSK(+)質粒上，按USB T7測序試劑盒說明書操作，測定其核苷酸序列；(2)、重組轉移質粒的構建 按Sambrook實驗手冊進行基因操作，篩選出含Sj14FABP基因的重組子，用Sal I酶切及按USB測序試劑盒說明書測序以確定連接方向和對碼情況；(3)、病毒重組 參照Summers實驗手冊用Lipofectin共轉染法製備重組病毒。修飾的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角體病毒(AcNPV)多角體蛋白啟動子調控下的LacZ基因，同時在多角體基因(ph)的兩側引入Bsu36 I位點，通過酶切使基因組DNA線性化，共轉染混合物由2μg線性化病毒DNA、3μg重組轉移質粒DNA和等體積的50μ1 Lipofectin組成，傳染後的BmN細胞於27℃培養一周後取上清擴增一次；(4)、重組病毒的篩選、鑑定與純化 取擴增共轉染病毒上清作1∶10-3和1∶10-4稀釋，感染1×105細胞1小時，鋪上含0.2mg/mlX-gal的低熔點瓊脂糖(1％)，培養4-6天後挑取多個白斑於24孔培養板(2×104細胞/孔)，27℃培養3-4天，收集細胞，用32P標記的Sj14FABP基因探針進行dot-blot DNA雜交分析，選擇陽性克隆按上述方法進行第二輪空斑分析，得純化的重組病毒Bm-Sj14FABP；(5)、Sj14FABP基因的表達 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN細胞後1至6天分別收集細胞和上清用SDS-PAGE(15％分離膠)檢測，5齡家蠶在環節皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，於次日開始逐日收集血淋巴和蠶體組織，血淋巴經PBS 1∶3稀釋，組織用PBS勻漿、液氮凍融、超聲、離心(11953g×10min)後收集上清，以SDS-PAGE(15％分離膠)方法進行檢測；(6)、表達產物的純化 表達產物為融合蛋白，含Sj14FABP和來自pBacPAK Hisl的含6個組氨酸的部分表達蛋白，參照文獻方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱純化，上柱前血淋巴用緩衝液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀釋；組織用上述緩衝液勻漿、凍融、超聲、離心(11953g×10min)製備上柱樣品，用100mM EDTA洗脫，用紫外吸收法測蛋白含量；(7)、表達產物的鑑定 以大腸桿菌表達的Sj14FABP免疫Balb/c鼠製備抗血清，用該血清與蠶表達產物及純化產物作Western blot反應，檢測蠶表達產物的抗原性。
全文摘要
本發明旨在生產抗日本血吸蟲病疫苗,它涉及一個編碼日本血吸蟲中國大陸株脂肪酸結合蛋白的基因,一個含有該基因的重組家蠶核型多角體病毒及在家蠶系統中的表達和該蛋白質的製備方法。本發明的表達產物為分子大小18kD的融合蛋白,它具有較好的免疫原性,能誘導較強的抗攻擊感染作用。
文檔編號C12N15/12GK1255548SQ9812204
公開日2000年6月7日 申請日期1998年11月27日 優先權日1998年11月27日
發明者林矯矯, 吳祥甫, 劉金明, 蔡學忠, 蔡幼民, 施福恢, 沈緯, 付志強 申請人:中國農業科學院上海家畜寄生蟲病研究所, 中國科學院上海生物化學研究所