用於製備牛口蹄疫o型肽疫苗的多肽及其製備方法和用途的製作方法

2023-11-11 16:39:57 1

專利名稱：用於製備牛口蹄疫o型肽疫苗的多肽及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，具體而言，本發明涉及一種用於製備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，以及含有這些多肽的疫苗及它們的製備方法。
背景技術：
口蹄疫(foot and mouth disease,簡稱FMD)是一種偶蹄動物發生的急性、高度接觸性、發熱性傳染病，在世界範圍內廣泛分布。口蹄疫的傳染性高，傳播迅速，感染豬、牛、羊等牲畜後將導致幼畜死亡，成年動物生產能力急劇下降，因此嚴重危害畜牧業的發展和肉食及其畜產品的生產和供應。目前，口蹄疫使動物及動物產品的市場流通和國際貿易受到極大的封鎖和限制，給流行國家和地區畜牧業生產造成巨大的經濟損失。口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的。口蹄疫病毒屬於細小核糖核酸病毒，具有多型性、易變性等特點。目前，已知全世界有7種血清型的口蹄疫病毒:A、O、C、Satl(南非I型)、Sat2 (南非II型)、Sat3 (南非III型)和Asia I (亞洲I型)。這些主型中的每一種又分若干亞型，目前發現的亞型已有70多種。血清型A、0、C和Asia I型的口蹄疫病毒最為常見，其中血清型A病毒的變種最多，具有超過30種亞型。研究結果表明，口蹄疫病毒的衣殼蛋白是由四種結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4 (Logan D等，1993年)組成的，每種各60個。VP1-VP3組成衣殼蛋白亞單位，位於衣殼蛋白的外側，而VP4位於病毒顆粒的內部。VPl是主要的保護性抗原，現已發現O型口蹄疫有3個主要的抗原位點位於VPl上，其中133-160和200-213位構成了 VPl上最重要且最容易變異的保護性抗原位點。口蹄疫病毒各型之間的抗原性不同，彼此之間不能交互免疫。而且，在同一種血清型中抗原差異的程度也很大，以至於能夠有效地抵抗一種亞型的口蹄疫疫苗可能針對同一血清型中的另一種亞型沒有保護性。此外，口蹄疫毒株的抗原性還在不斷發生變化，隨著時間的推移，原有疫苗的效力 減弱甚至消失，因此給口蹄疫的防治工作帶來了很大的困難。當前在我國牛群中流行的口蹄疫主要是O型、Asia I型和A型口蹄疫。我國對口蹄疫實行強制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。但是，我國現行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒滅活疫苗，其存在著生物安全性差、副反應大、產品質量不穩定等問題。相比之下，目前世界上很多國家已經停止使用滅活疫苗，也禁止從使用滅活疫苗的國家進口畜產品。由此可見，在口蹄疫防治方面，我國已落後於世界發展形勢。在口蹄疫新型疫苗的研究方面，先後有基因工程亞單位疫苗、口蹄疫病毒載體疫苗、口蹄疫基因工程修飾疫苗的研究報導，但是其在免疫效果、生物安全性方面都存在著諸多問題，影響了這些新型疫苗的使用。此外，這些疫苗對於當前已經發生變異的流行毒株往往效果較差，不能有效地保護動物。因此，本領域仍然存在對於安全、有效的口蹄疫新型疫苗的需求。

發明內容
因此，本發明的目的在於提供一種用於製備牛口蹄疫O型合成肽疫苗的多肽，以及含有該多肽的疫苗。本發明的另一個目的是提供一種上述多肽以及疫苗的製備方法。本發明的又一個目的是提供上述多肽以及疫苗的用途。為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案:一方面，本發明提供一種用於製備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列。此序列為口蹄疫O病毒的核心B細胞表位序列，負責產生針對口蹄疫病毒的中和抗體。SEQ ID N0.1:YNGSCKYGDASANNVRGDLQVLALKTEKCLPTSFNYGAIK本發明中提及的「多肽」和「合成肽」為同一概念，均是指通過固相有機合成得到的肽物質。優選地，所述多肽還包含具有增強免疫作用的口蹄疫內源或外源性T細胞表位胺基酸序列，其中，所述胺基酸序列選自SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4中的一個或多個。在本發明中，由計算機預測口蹄疫O病毒的T細胞表位，然後利用軟體設計新的T細胞表位肽，再通過體外評價 動物細胞免疫水平，由此篩選得到上述胺基酸序列的多肽，其能夠輔助B細胞表位產生中和抗體。SEQ ID N0.2:AGLAGVMVTESVAFRKKVSEQ ID N0.3:HLEFNNFTVLRVPSFWKVSASKVSEQ ID N0.4:SHLEFNNFTVSVPKVFWLRSAKV進一步優選地，所述多肽包含如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的胺基酸序列。SEQ ID N0.5:AGLAGVMVTESVAFRKKVYNGSCKYGDASANNVRGDLQVLALKTEKCLPTSFNYGAIKSEQ ID N0.6:HLEFNNFTVLRVPSFWKVSASKVYNGSCKYGDASANNVRGDLQVLALKTEKCLPTSFNYGAIKSEQ ID N0.7:SHLEFNNFTVSVPKVFWLRSAKVYNGSCKYGDASANNVRGDLQVLALKTEKCLPTSFNYGAIK根據本發明的具體實施方式
，本發明的多肽的胺基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6 或 SEQ ID N0.7 所示；優選地，所述多肽的胺基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基可以經氧化連接在一起形成~■硫鍵；進一步優選地，所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基之間可以反應形成共價連接。其中本文提供的序列是從N端到C端，也就是N端和C端的殘基反應形成連接。具體而言，所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。本發明提供的上述多肽可以直接向商業肽合成公司定製獲得，或者採用可商購的自動合成儀、根據製造商的操作規程合成。另一方面，本發明還提供了上述多肽的製備方法，所述製備方法包括以下步驟:(I)以氨基樹脂為起始原料，以由9-芴甲氧羰基保護的胺基酸為單體，按照所述胺基酸序列依次縮合接上胺基酸以合成所述多肽，每步縮合反應後用乙醯咪唑封閉未反應的氣基端；(2)合成完畢後加入裂解試劑，從而將所述多肽從氨基樹脂上裂解下來；(3)使用乙醚沉澱所述多肽；和(4)對所述多肽進行超濾純化，然後進行無菌處理。在上述製備方法中，所述步驟(I)具體包括以下步驟:(Ι-a)脫保護反應:將氨基樹脂置於體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，在20-28°C條件下反應25-40分鐘，從而脫除氨基樹脂上的9-芴甲
氧羰基保護基團；(Ι-b)洗滌:氮氣吹乾，然後用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；(Ι-c)縮合反應:加入1-羥基苯丙三唑(Η0ΒΤ)、二環己基碳二亞胺(DCC)與由9-芴甲氧羰基保護的胺基酸，然後在20-28°C條件下反應0.5-2.5小時；

(Ι-d)洗滌:氮氣吹乾，然後用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；和(Ι-e)封閉反應:加入重量體積百分比為1.5-4%的乙醯咪唑的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液，在20-28°C條件下反應20-40分鐘。在上述製備方法中，所述步驟(2)中裂解試劑的組分為體積比為85:8:6:1的三氟乙酸:三異丙基矽烷:苯酚=H2O ;並且，所述步驟(2)的裂解時間為1-4小時。在上述製備方法中，所述步驟(3)具體包括:(3-a)使用乙醚沉澱所述多肽，然後用二甲基甲醯胺洗滌；(3-b)在加入佔反應體系總體積10%的二甲基亞碸(DMSO)情況下，使沉澱得到的多肽的胺基酸序列中兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵；和(3-c)使所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基之間反應形成共價連接；優選地，在加入佔反應體系總體積1%的二異丙基碳二亞胺(DIC)和0.5%的1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑(HOAT)情況下使所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基的羧基與氨基、或者在加入0.1M H2SO4情況下使羧基與羥基之間反應形成共價連接。在上述製備方法中，所述步驟(4)具體包括以下步驟:(4-a)使用切向過濾膜包在20_28°C條件下超濾所述多肽，從而除去小分子雜質；和(4-b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。又一方面，本發明提供了一種肽疫苗，所述肽疫苗包含一種或多種上述多肽。並且，所述肽疫苗優選還包含佐劑；優選地，所述佐劑為選自白油、50V、50VII中的一種或多種。進一步優選地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐劑的體積比為1:1。再一方面，本發明提供了該肽疫苗的製備方法，所述製備方法包括以下步驟:(I)用注射用水將所述多肽稀釋為50 μ g/ml的濃度，從而得到多肽抗原水相；(2)將佐劑在121°C條件下滅菌30分鐘；和(3)在20-28°C條件下，按照所述多肽抗原水相與所述佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內，在90-150轉/分鐘下攪拌1.5-3分鐘，然後緩慢加入多肽抗原水相，攪拌20-30分鐘，再在8000-10000轉/分鐘下攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝。還一方面，本發明提供了上述多肽或肽疫苗在製備用於預防牛口蹄疫O型的藥物中的用途。具體而言，本發明人通過對國內口蹄疫新近流行毒株的序列測定並結合口蹄疫疫苗毒株序列，研究口蹄疫主要抗原位點的變異情況，針對主要變異的胺基酸位點統計其變異的頻率，同時結合計算機輔助進行口蹄疫抗原位點的分析預測，對可能的抗原位點肽段進行化學合成，即針對易變異位點根據統計的變異頻率，在這些位點使用不同的胺基酸，得到涵蓋當前所有可能變異位點的多種候選多肽抗原。進而，通過大量的動物試驗對這些候選多肽抗原進行篩選，得到能夠引起動物的免疫反應，而且免疫反應水平高，能夠很好的保護動物免受口蹄疫流行毒株的攻擊的多肽抗原。此外，本發明人根據篩選實驗結果對口蹄疫病毒抗原位點進行了優化，並有效組合了 T細胞表位和B細胞表位，增強了多肽抗原的免疫效果。肽疫苗效力實驗、安全性實驗結果表明，本發明提供的牛口蹄疫O型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，並且不會引發傳統疫苗存在的發熱、紅腫等問題，因此本發明的疫苗可以有效應對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易於大規模合成，具有良好的應用前景。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。實施例1牛口 蹄疫O型合成肽抗原的固相合成本發明的合成肽抗原可以使用ABI公司433型全自動多肽合成儀，利用Merrifield固相合成法製備,其中採用了由9-荷甲氧羰基(Fmoc)修飾的胺基酸，固相載體為購自美國Sigma公司的Rink Amide MBHA樹脂。生產過程通常包括多肽抗原的固相合成、多肽的裂解、抗原純化與除菌保存。1.1合成肽抗原的固相合成1.1.1合成原料準備合成多肽抗原的序列分別如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示。依據抗原的序列以及Immol的合成規模，準備合適的Fmoc修飾的胺基酸(購自上海吉爾生化),加入相應的胺基酸小瓶中。同樣按要求稱量Rink Amide MBHA樹脂，放入反應腔中，將上下蓋子擰緊，貼標籤，記錄所合成肽的名稱、批號、反應腔的皮重及所稱樹脂的重量。將反應腔裝入合成儀。配製合成試劑，包括N-甲基吡咯烷酮(NMP)、乙醯咪唑(AM)、哌啶(PIP)、甲醇等放置到相對應的試劑瓶中。1.1.2合成儀狀態檢測檢查多肽合成儀是否正常運行。開機後，運行Run Self Test程序，儀器自檢各項指標是否正常。另外檢查N2是否充足，系統表壓是否正常。合成前應對儀器的性能有所了解，所以要對每種合成試劑的流速進行測定。發送Flow Ratel-18到合成儀，選擇MainMenu—Module Test一按 Prer 或 next 找 ModuleA、ModuleD、Module1、Module1、ModuleA—按Start—按more進行測量或觀察，若流量不合適，則調節下閥門壓力，直至達到要求。1.1.3合成肽抗原的合成開始在合成儀的程序中將合成需要的方法Std Fmoc 1.0 Sol DIC90發送到合成儀上。File-New-Sequence-編輯合成妝的序列，保存。File-New-Run,檢查 Chemistry ；Sequence是否為所存名字；設定Cycles ;保存。最後發送到合成儀上。Main Menu—Cycle Monitor—begin,開始運行。1.1.4合成肽抗原的合成如上述的多肽序列，合成的時候是從C端開始至N端，依照給定的順序，依次不斷地重複如下合成步驟:(I)脫保護反應:將上述氨基樹脂置於體積百分比為15%_30%的六氫吡啶的NMP溶液中，在20-28°C條件下反應25-40分鐘脫除氨基樹脂上的Fmoc保護基團；(2)洗滌:氮氣吹 幹，NMP洗滌氨基樹脂；(3 )縮合反應:加入Η0ΒΤ、DCC與Fmoc保護的胺基酸在20_28 °C條件下反應0.5-2.5 小時；(4 )洗滌:氮氣吹乾，NMP洗滌氨基樹脂；(5)封閉反應:加入重量體積百分比為1.5%_4%的乙醯咪唑的NMP溶液，在20-28 °C條件下反應20-40分鐘。1.1.5合成肽抗原合成結束抗原合成結束後合成儀將自動停止。然後從多肽合成儀上取下反應器，再用100%甲醇洗滌多肽樹脂3次，然後在通風櫥內吹乾，將多肽樹脂轉移至棕色瓶內，放入-20°C冰箱內，封口膜密封備用。1.2合成肽抗原的裂解及鑑定1.2.1合成肽抗原的裂解按照體積比例(三氟乙酸(TFA)/三異丙基矽烷(TIS)/苯酚/H20=85/8/6/l)配製裂解液，然後從冰箱內取出合成的多肽樹脂，放入圓底燒瓶內，在通風櫥內向燒瓶內加入配製好的裂解液和磁攪拌子，然後穩定地放置在磁力攪拌器上，室溫下持續攪拌I小時直至反應完全。反應結束後，使用帶冷阱的旋轉蒸發儀持續蒸發30至120分鐘除去粗產品中的TFA。接著使用乙醚收集、沉澱多肽，然後用二甲基甲醯胺(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最後將混合在一起的樹脂用砂芯漏鬥過濾出來，即得到多肽抗原。1.2.2合成肽抗原的鑑定多肽抗原合成完畢後用基質輔助雷射解吸飛行時間質譜法(MALDL-T0F)和反相高壓液相色譜法(RP-HPLC)進行定性定量分析。1.3合成肽抗原的構象形成用15% DMSO將多肽抗原配製成濃度為2mg/ml的多肽溶液，然後用0.1N NaOH或
0.1N HCl調整初步分離多肽溶液的pH值=8.5，在25°C的環境下在轉速為IlOrpm的搖床上放置48小時，使形成二硫鍵。進而進行首尾環化，首尾胺基酸的「 -C00H 」與「 -NH2 」環化方法參見Mengfen等Peptide Protein Reserch 1996.48:229-239 ;使首尾胺基酸的「-C00H」 與「-0H」進行反應而形成環狀結構的方法參見Mmenhofer等Chem.Soc 1970.92:3771-3777。由此得到能夠模擬病毒粒子天然構象的多肽環化結構。1.4合成肽抗原的純化除菌合成肽抗原使用循環式切向過濾膜包在20-28°C條件下進行超濾(TangentialFlow Device循環式切向過濾膜包以及與其配套的蠕動泵)，多肽抗原是大分子不能通過一定孔徑的濾膜，而前期合成過程以及後期環化反應形成或引進的小分子雜質則可以通過濾膜。然後再通過孔徑為0.2μπι在線過濾器除菌，將最後得到的溶液分裝到無菌塑料瓶內，貼上標籤。標籤上註明多肽的名稱、編號、生產批號、濃度、生產日期、保存期限及保存條件，分裝後，儲存於-20 V或-40 V備用。為了便於運輸和長期保存的需要，將多肽抗原進行冷凍乾燥以得到固體狀態的多肽。將預先凍好的多肽抗原取 出，在Labconco冷凍乾燥機上進行乾燥，得到固體狀態的多肽抗原。同時貼上標籤。標籤上註明多肽的名稱、編號、生產批號、濃度、生產日期、保存期限及保存條件。實施例2合成肽疫苗的配製2.1抗原水相的配製分別稱取依照實施例1製備的序列分別如SEQ ID N0.5,SEQ ID N0.6或SEQ IDN0.7所示的合成肽抗原，然後用滅菌注射用水將合成肽抗原濃度稀釋至50μ g/ml。將所得抗原溶液經孔徑為0.2 μ m的過濾器過濾，除菌。2.2油相佐劑製備將油相佐劑50V經121°C滅菌30分鐘，備用。2.3合成肽疫苗的乳化用滅菌的蒸餾水2000ml清洗IKA乳化設備3次，然後在20_28°C條件下按油相佐劑和抗原水相為1:1的體積比，先將油相加入乳化罐內，開動電機以90 150r/m慢速轉動攪拌2分鐘後，同時緩慢加入水相抗原,加完後攪拌30分鐘，再以10000r/m高速攪拌20分鐘，靜置5分鐘，使疫苗乳化成油包水的單相疫苗。實施例3牛口蹄疫O型合成肽疫苗效力試驗1.材料與方法1.1合成肽疫苗按照實施例1製備序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的多肽抗原，然後按照實施例2分別配製的對應批號為:ZM01、ZM02和ZM03的O型口蹄疫合成
肽疫苗。1.2試驗動物挑選口蹄疫抗體陰性(乳鼠中和抗體滴度< 1: 4)的6月齡健康黃牛37頭(購自蘭州地區牛場)。1.3 毒種 0S/99用3-4日齡乳鼠測定並調整毒價，置於_25°C冷凍保存備用。1.4試驗方法將3組試驗肽疫苗中的每組疫苗分別免疫5頭牛，同時用常規滅活疫苗(牛口蹄疫O型二價滅活疫苗，由中牧股份蘭州生物藥廠提供，批號1112001)作為陽性對照，免疫5頭牛。陰性對照2頭牛。免疫時採用耳後肌肉注射，注射劑量均為2ml/牛。免疫21天後，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側分兩點皮內注射牛口蹄疫O型病毒強毒OS/99，每點0.1ml (共0.2ml，含IOOOOID5q)。攻毒10天後，觀察記錄試驗結果。1.5結果判定對照牛均應至少3蹄出現水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現水泡或潰瘍、而其它部位無病變時判為保護，除舌面以外任一部位出現典型口蹄疫水泡或潰瘍時判為不保護。2.試驗結果與討論2.1試驗結果免疫21天後，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側分兩點皮內注射牛口蹄疫O型病毒強毒0S/99，每點0.1ml (共0.2ml，含10000ID5(i)。攻毒10天後，結果詳見表I。表I牛口蹄疫O型合成肽疫苗效力試驗結果
權利要求
1.一種用於製備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，其特徵在於，所述多肽包含如SEQ IDN0.1所示的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的多肽，其特徵在於，所述多肽還包含具有增強免疫作用的口蹄疫內源或外源性T細胞表位胺基酸序列，其中，所述胺基酸序列選自SEQ ID N0.2、SEQID N0.3和SEQ ID N0.4中的一個或多個； 優選地，所述多肽包含如SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.7所示的胺基酸序列。
3.根據權利要求2所述的多肽，其特徵在於，所述多肽的胺基酸序列如SEQID N0.5、SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.7 所示； 優選地，所述多肽的胺基酸序列中的兩個半胱氨酸的巰基經氧化連接在一起形成二硫鍵； 進一步優選地，所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基之間反應形成共價連接；更優選地，所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基的羧基與氨基、或者羧基與羥基之間反應形成共價連接。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的多肽的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟: (O以氨基樹脂為起始原料，以由9-芴甲氧羰基保護的胺基酸為單體，按照所述胺基酸序列依次縮合接上胺基酸 以合成所述多肽，每步縮合反應後用乙醯咪唑封閉未反應的氨基端; (2)合成完畢後加入裂解試劑，從而將所述多肽從氨基樹脂上裂解下來； (3)使用乙醚沉澱所述多肽；和 (4)對所述多肽進行超濾純化，然後進行無菌處理。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(I)包括以下步驟: (Ι-a)脫保護反應:將氨基樹脂置於體積百分比為15-30%的六氫吡啶的N-甲基吡咯烷酮溶液中，在20-28 °C條件下反應25-40分鐘，從而脫除氨基樹脂上的9-芴甲氧羰基保護基團； (Ι-b)洗滌:氮氣吹乾，然後用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂； (Ι-c)縮合反應:加入1-羥基苯丙三唑、二環己基碳二亞胺與由9-芴甲氧羰基保護的胺基酸，然後在20-28°C條件下反應0.5-2.5小時； (Ι-d)洗滌:氮氣吹乾，然後用N-甲基吡咯烷酮洗滌氨基樹脂；和(Ι-e)封閉反應:加入重量體積百分比為1.5-4%的乙醯咪唑的N-甲基吡咯烷酮溶液，在20-28 °C條件下反應20-40分鐘。
6.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中裂解試劑的組分為體積比為85:8:6:1的三氟乙酸:三異丙基矽烷:苯酚=H2O ； 優選地，所述步驟(2)的裂解時間為1-4小時。
7.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述製備方法的步驟(3)中還包括: (3-a)使用乙醚沉澱所述多肽，然後用二甲基甲醯胺洗滌； (3-b)在加入佔反應體系總體積10%的二甲基亞碸情況下，使沉澱得到的多肽的胺基酸序列中兩個半胱氨酸之間形成二硫鍵；和(3-c)使所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基之間反應形成共價連接；優選地，在加入佔反應體系總體積1%的二異丙基碳二亞胺和0.5%的1-羥基-7-偶氮苯並三氮唑情況下使所述多肽的胺基酸序列的首尾胺基酸殘基的羧基與氨基、或者在加入0.1M H2SO4情況下使羧基與羥基之間反應形成共價連接。
8.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟(4)包括以下步驟: (4-a)使用切向過濾膜包在20-28°C條件下超濾所述多肽，從而除去小分子雜質；和 (4-b)使用0.2微米在線濾器除菌保存。
9.一種牛口蹄疫O型肽疫苗，其特徵在於，所述肽疫苗包含一種或多種根據權利要求1至3中任一項所述的多肽。
10.根據權利要求9所述的肽疫苗，其特徵在於，所述肽疫苗還包含佐劑； 優選地，所述佐劑為選自白油、50V、50VII中的一種或多種； 進一步優選地，所述肽疫苗中所包含的多肽和佐劑的體積比為1:1。
11.根據權利要求9或10所述的肽疫苗的製備方法，其特徵在於，所述製備方法包括以下步驟: (1)用注射用水將所述多肽稀釋為50μg/ml的濃度，從而得到多肽抗原水相； (2)將佐劑在121°C條件下滅菌30分鐘；和 (3)在20-28°C條件下，按照所述多肽抗原水相與所述佐劑1:1的體積比，先將佐劑加入乳化罐內，在90-150轉/分鐘下攪拌1.5-3分鐘，然後緩慢加入多肽抗原水相，然後攪拌20-30分鐘，再在8000-10000轉/分鐘下攪拌15-30分鐘，靜置5分鐘，分裝。
12.根據權利要求1至3中任一項所述的多肽或者根據權利要求9或10所述的肽疫苗在製備用於預防牛口蹄疫O型的藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供一種用於製備牛口蹄疫O型肽疫苗的多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO. 1所示的胺基酸序列以及含有該多肽的肽疫苗。提供的牛口蹄疫O型合成肽疫苗具有良好的免疫效力，並且不會引發傳統疫苗存在的發熱、紅腫等問題，因此本發明的疫苗可以有效應對目前口蹄疫病毒的抗原變異、不存在生物安全性，易於大規模合成，具有良好的應用前景。本發明還提供了所述多肽和肽疫苗的製備方法以及其製藥用途。
文檔編號C07K1/06GK103214560SQ20131009794
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月25日 優先權日2013年3月25日
發明者肖進, 齊鵬, 巴利民, 慄利芳, 宋芳, 董春娜, 王楠, 張蕾, 周強, 郭麗清, 鄭應華 申請人:中國牧工商(集團)總公司, 中牧實業股份有限公司