牛樟芝液體發酵過程快速表徵三萜化合物含量變化的方法與流程
2023-11-12 02:38:37 1
本發明涉及牛樟芝液體發酵過程快速表徵三萜化合物含量變化的方法，屬於微生物發酵領域。
背景技術：
牛樟芝(antrodiacamphorata)，屬於擔子菌綱、非褶菌目、多孔科、多年生擔子菌，只生長在臺灣地區的牛樟樹，是一種稀有的食要用真菌，其菌絲體和子實體都具有很多生理活性，如保肝、抗氧化、抗炎症等。多糖、萜類和甾體類化合物為牛樟芝的主要活性化合物。三萜類化合物是其最主要活性物質之一，是以異戊二烯為組成單元，去掉羥基後首尾相連構成的天然化合物，藥理研究表明牛樟芝三萜具有多種生物活性，如保肝、調節免疫、抗炎症、抗氧化、降血壓等，對腫瘤和癌症有很好的治療效果。自然界存在的牛樟芝生長在牛樟樹上，生長及其緩慢、數量稀少、價格昂貴。
傳統的食藥用真菌常採用固體栽培方式進行培養，其生長環境條件接近自然狀態，但固體栽培培養周期較長、代謝產物生物活性不穩定、易染菌；同傳統的固體栽培相比，液體發酵周期短，易規模化特點則更凸顯，許多採用人工固體栽培亦不易成功的真菌如牛樟芝、斑金錢菌等也成功實現液體發酵。但是，由於牛樟芝三萜類化合物主要存在於菌絲體內(即胞內)，在發酵過程對牛樟芝三萜類化合物的測定需要①取樣，②固液分離、③有機溶劑對菌絲體進行室溫浸提、煎煮或加熱回流提取，④對提取樣品進行分析測定等步驟，需要較長的時間，尤其是第三步就需要3個小時以上，具有明顯的延時性。無論是在實驗研究，還是工業化生產中，這種延時性對於以三萜類化合物為目的產物的牛樟芝液體發酵過程的實時監測與控制非常不利。因此建立一種在牛樟芝液體發酵過程中快速表徵三萜類化合物含量變化趨勢的方法緊迫且必要。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種牛樟芝液體發酵過程快速表徵三萜類化合物含量變化趨勢的方法，其原理是通過分析牛樟芝發酵液中的揮發性芳香物質，建立某種揮發性物質和三萜類化合物之間的定量關係，使其成為發酵過程三萜類化合物含量變化快速表徵的參數。
本發明所述的牛樟芝液體發酵過程快速表徵三萜類化合物含量變化的方法，是在發酵過程中通過快速測定揮發性芳香物質α-松油醇對三萜類化合物含量變化進行表徵。
在本發明所述的α-松油醇，為牛樟芝液體發酵過程中產生的一種單萜類揮發性芳香物質，為無色粘稠液體，具有特有的丁香香氣。在發酵過程中，其含量變化趨勢與三萜類化合物含量變化趨勢一致，能夠很好的對發酵過程三萜類化合物含量變化進行表徵。
本發明對α-松油醇的測定可以是通過發酵體系在線檢測系統進行分析測定，也可以是離線檢測。
本發明所述的在線檢測裝置為在發酵罐尾氣分析部位安裝過程質譜儀和電子鼻等在線檢測儀器以及參數採集系統，對發酵過程α-松油醇進行在線檢測分析。
在本發明的一種實施方式中，所述在線檢測裝置為發酵過程產生的尾氣通過軟管與電子鼻連接即可，組成一個循環迴路。我們採用電子鼻監控發酵過程中尾氣中的α-松油醇濃度，從而推測出發酵液中α-松油醇的量。
在本發明的一種實施方式中，所述電子鼻檢測方法為：電子鼻測定時間100s；頂空溫度25℃；內部流量300ml/min；進樣流量300ml/min。
在本發明的一種實施方式中，所述離線檢測裝置為頂空固相微萃取-氣相-質譜儀，定時取樣牛樟芝發酵液，對發酵過程α-松油醇進行離線檢測分析。
本發明的優點：
本發明提供所述方法檢測牛樟芝三萜類化合物發酵過程含量變化，可以對發酵過程進行接近於實時的快速動態過程初步判定(即使是取樣離線檢測，每個樣品的測定時間也不超過50分鐘)，也可以以此為依據判斷發酵是否異常，實現了發酵過程的自動化控制。根據在線實時參數的變化進行發酵過程的三萜類化合物預測分析增加了發酵過程的可控性和生產可預測性。這對於開發利用兼具多種生物活性的牛樟芝產品以及對其在工業生產上的應用具有十分重要的意義。
附圖說明
圖1實施例1發酵過程中α-松油醇與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況。
圖2實施例2發酵過程中α-松油醇與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況。
圖3實施例3發酵過程中α-松油醇與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況。
圖4實施例4發酵過程中α-松油醇與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況。
圖5實施例1發酵過程中其他揮發性物質與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況；(a)1，2-癸二醇，(b)芳樟醇，(c)1-辛烯-3-醇，(d)3-呋喃甲酸甲酯，(e)3-辛酮，(f)苯乙醇，(g)蓽澄茄油烯醇，(h)正辛酸，(i)反式-橙花叔醇，(j)反式-2-辛烯-1-醇。
圖6實施例2發酵過程中其他揮發性物質與三萜類化合物的產量隨時間變化的情況；(a)1，2-癸二醇，(b)芳樟醇，(c)1-辛烯-3-醇，(d)3-呋喃甲酸甲酯，(e)3-辛酮，(f)苯乙醇，(g)蓽澄茄油烯醇，(h)正辛酸，(i)反式-橙花叔醇，(j)反式-2-辛烯-1-醇。
具體實施方式
三萜類化合物的測定方法：
1)發酵液離心所得菌絲體用去離子水衝洗乾淨(洗去培養基成分)，凍幹得乾燥的菌絲體。幹菌絲體經液氮研磨後準確稱量500mg，加入15ml無水乙醇，用90℃熱水浸提1h，重複提取三次。最後提取液7104×g離心力條件下離心10min，定容到25ml。稀釋至適當濃度，取樣1ml，按標準曲線測定方法測定，以試劑空白為對照，550nm處測定吸光值，依據標準曲線計算三萜類化合物的含量。
2)齊墩果酸標準曲線測定：精密稱取齊墩果酸標準樣品5.00mg，無水乙醇溶解定容成0.1g·l-1溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml於25ml比色管中，沸水蒸乾，然後加入新鮮配製的5％(質量體積比)香草醛-冰醋酸0.3ml，高氯酸1.00ml，60℃水浴20min，冷卻後加入冰醋酸4ml，搖勻使其充分反應，以試劑空白為對照，550nm處測定其吸光值。
α-松油醇的離線檢測方法(頂空固相微萃取-氣相-質譜儀)：
1)對α-松油醇進行含量檢測所添加的內標為色譜純正丁醇。
2)對α-松油醇進行含量計算採用的是內標法，即將一定重量的正丁醇作為內標物加到一定量的牛樟芝液體發酵液混合物中，然後對含有正丁醇的樣品進行色譜分析，分別測定正丁醇和待測組分的峰面積及相對校正因子，按公式和方法即可求出被測組分在樣品中的百分含量。
3)頂空固相微萃取條件為：萃取頭在gc進樣口老化至無雜峰，然後在55℃下萃取30min。被吸附的揮發性化合物在gc進樣口250℃下解吸5min，衝入gc色譜柱。同時啟動儀器採集數據。萃取頭：dvb/car/pmds。
4)氣相色譜條件為：色譜柱：db-wax；載氣：氦氣，1.2ml·min-1；程序升溫條件：40℃維持1min，4℃·min-1升溫至120℃，10℃·min-1升溫至240℃，維持6min。
5)質譜條件為：接口溫度250℃；電離源溫度：250℃；四級杆溫度150℃；電離電勢：70ev；離子化模式：ei+；質量掃描範圍m/z30～450amu。
實施例1
(1)培養條件1
牛樟芝菌種：atcc200183
pda斜面培養基(g·l-1)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20。
種子液體培養基(g·l-1)：麩皮10，玉米粉10，葡萄糖20，mgso4·7h2o2，vb10.1，kh2po43。
發酵液體培養基(g·l-1)：麩皮10，玉米粉10，葡萄糖20，mgso4·7h2o2，vb10.1，kh2po43，ph5.5。
種子斜面：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，接種於pda斜面培養基，28℃培養20d。
一級種子液體發酵：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，取1cm2的小方塊接種到液體種子培養基。種子培養基(250ml)每瓶裝液量80ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養10d。
二級搖瓶液體發酵：將生長好的一級種子液混合，均勻接種到500ml搖瓶，每瓶裝液量150ml，接種量為10ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養15d。
(2)離線測定α-松油醇和三萜類化合物含量
在實施例1的培養條件下，α-松油醇和三萜類化合物發酵過程含量變化趨勢如圖1所示，兩者的變化趨勢依一致，用spss21.0軟體α-松油醇和三萜類化合物進行相關性分析和一元線性回歸分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.958。進一步對二者進行一元直線回歸分析，得到二者之間定量回歸方程為y＝0.460x+8.976。
在本實施例中，牛樟芝發酵液取樣後，取至少10ml發酵液在大於等於7104×g離心力的條件下離心10分鐘，之後取上清液5ml置於頂空瓶中，按說明書中所述方法採用頂空固相微萃取-氣相-質譜儀對α-松油醇進行測定。
實施例2
(1)培養條件2
牛樟芝菌種：atcc200183
pda斜面培養基(g·l-1)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20。
種子液體培養基(g·l-1)：麩皮10，玉米粉10，葡萄糖20，mgso4·7h2o2，vb10.1，kh2po43。
發酵液體培養基(g·l-1)：麩皮10，玉米粉10，葡萄糖20，mgso4·7h2o2，vb10.1，kh2po43，ph4.5。
種子斜面：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，接種於pda斜面培養基，28℃培養20d。
一級種子液體發酵：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，取1cm2的小方塊接種到液體種子培養基。種子培養基(250ml)每瓶裝液量80ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養10d。
二級搖瓶液體發酵：將生長好的一級種子液混合，均勻接種到500ml搖瓶，每瓶裝液量150ml，接種量為10ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養15d。
(2)離線測定α-松油醇和三萜類化合物含量
在實施例2的培養條件下，α-松油醇和三萜類化合物發酵過程含量變化趨勢如圖2所示，兩者的變化趨勢依一致，對此培養條件下的α-松油醇和三萜類化合物進行相關性分析和一元線性回歸分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.942。進一步對二者進行一元直線回歸分析，得到二者之間定量回歸方程為y＝2.721x+12.057。
α-松油醇的測定同實施例1。
實施例3
(1)培養條件3
牛樟芝菌種：共鱗實業(深圳)有限公司保藏jma01
pda斜面培養基(g·l-1)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20。
種子液體培養基(g·l-1)：麩皮2.0，葡萄糖20，蛋白腖10，mgso41.5，vb10.1，kh2po43。
發酵液體培養基(g·l-1)：麩皮2.0，葡萄糖20，蛋白腖10，mgso41.5，vb10.1，kh2po43。
種子斜面：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，接種於pda斜面培養基，28℃培養20d。
一級種子液體發酵：將4℃下保存的牛樟芝菌種活化，取1cm2的小方塊接種到液體種子培養基。種子培養基(250ml)每瓶裝液量80ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養10d。
二級搖瓶液體發酵：將生長好的一級種子液混合，均勻接種到500ml搖瓶，每瓶裝液量150ml，接種量為10ml，接種後於28℃、110r·min-1條件下培養15d。
(2)離線測定α-松油醇和三萜類化合物含量
在實施例3的培養條件下，α-松油醇和三萜類化合物發酵過程含量變化趨勢如圖2所示，兩者的變化趨勢依一致，對此培養條件下的α-松油醇和三萜類化合物進行相關性分析和一元線性回歸分析，可知，α-松油醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.961。進一步對二者進行一元直線回歸分析，得到二者之間定量回歸方程為y＝2.360x+2.927。
α-松油醇的測定同實施例1。
實施例4
實施條件同實施例1，相比於圖1，圖4中α-松油醇在第8-9天之後不升反將，提示發酵出現異常。經取樣鏡檢發現染菌，其所感染微生物為細菌。這說明本發明不僅能夠表徵正常發酵過程中三萜類化合物的含量變化，還能夠在發酵異常時發出提示信號。
對照實施例1
在實施例1的培養條件下，將同等條件下所檢測到的其他揮發性化合物和三萜類化合物進行含量上的相關性分析，其相關係數均較低，且都低於α-松油醇和三萜類化合物的相關係數，數據統計分析結果見表1。
其中，1,2-癸二醇在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，皮爾遜相關係數為0.630。芳樟醇在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，相關係數分別為0.301。1-辛烯-3-醇在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，皮爾遜相關係數為0.436。3-呋喃甲酸甲酯在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.899。3-辛酮在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.233。苯乙醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.869。蓽澄茄油烯醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.875。正辛醛在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，皮爾遜相關係數為0.202。反式-橙花叔醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.512。反式-2-辛烯-1-醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.326。
表1實施例1發酵過程中其他揮發性物質與三萜類化合物相關性分析
對照實施例2
在實施例2的培養條件下，將同等條件下所檢測到的其他揮發性化合物和三萜類化合物進行含量上的相關性分析，其皮爾遜相關係數均較低，且都低於α-松油醇和三萜類化合物的相關係數，數據統計分析結果見表2。
其中，1,2-癸二醇在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，皮爾遜相關係數為0.601。芳樟醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，相關係數分別為0.405。1-辛烯-3-醇在含量上和三萜類化合物呈現負相關性，皮爾遜相關係數為0.171。3-呋喃甲酸甲酯在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.585。3-辛酮在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.306。苯乙醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.809。蓽澄茄油烯醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.501。正辛醛在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.530。反式-橙花叔醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.853。反式-2-辛烯-1-醇在含量上和三萜類化合物呈現正相關性，皮爾遜相關係數為0.120。
表2實施例2發酵過程中其他揮發性物質與三萜類化合物相關性分析
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。