親脂組分和血管活性腸肽片段的綴合物的製作方法

2023-11-01 12:55:32

專利名稱：親脂組分和血管活性腸肽片段的綴合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及親脂部分和具有3-12個胺基酸的肽的新綴合物。本發明進一步涉及包含所說新綴合物作為活性組分的藥物組合物。所說的藥物組合物優選用於治療男性陽痿或治療神經變性疾病。
背景技術：
血管活性腸肽(VIP)(其是廣泛分布在哺乳動物神經系統中的28個胺基酸的神經肽)具有有效的神經營養作用，這一作用影響神經細胞的功能。在中樞神經系統中，VIP的作用被解釋為發育效應，顯示出生長因子活性並維持神經組織的生存和功能。神經元(其能釋放VIP)，使全身的血管及肺臟的氣管受神經支配，並且釋放的VIP作為一種有效的血管舒張劑可使平滑肌舒張。放射配體結合分析，藥理學實驗，分子克隆以及超活性新衍生物的研製曾表明幾類VIP的受體位點和幾種潛在的治療用途。
我們以前的專利IL 87055,EP 0354992和US 5,147,885以及出版的專利申請EP 0540969，以及EP 0620008報導了VIP和修飾VIP或親脂VIP衍生物的兩種可能的治療用途，它們分別用於男性陽痿治療(透皮給藥)和神經變性疾病的治療。
VIP是血清中的一種半衰期十分短的親水肽(Said S.I.編，肽激素研究進展(Advances in Peptide Hormone Research Series),Raven出版社，紐約，1-512(1982)中題為「血管活性腸肽」的文章)，其具有下列序列1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Tyr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Leu-Arg-Lys-Gln-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-25 25 27 28Ser-Ile-Leu-Asn-NH2
為提高其生物利用度並增加其穩定性，本發明發明人曾採取所說專利和申請中報導的兩種化學修飾。第一種是親脂化，即增加脂肪酸成分，以加強VIP穿透生物膜的能力而不喪失活性；這樣就設計出了硬脂醯-VIP即VIP與硬脂酸(其在VIP的N-端)相結合的分子(EP 0354992)。第二種修飾是用非天然的胺基酸置換天然胺基酸，即，正亮氨酸取代甲硫氨酸(VIP的第17個胺基酸)，旨在提高分子抗氧化穩定性及增加親脂性；這樣，設計出了硬脂醯-Nle-VIP(Gozes等，內分泌學(Endocrinolgy)，134:2121-2125(1994)；Fauchere等，國際肽蛋白質研究雜誌(Int.J.PetideProtein Res.),32:169-278(1988)；EP 0540969)。在EP 0225020中描述了VIP序列第17-24個位置的未修飾VIP片段作為潰瘍抑制劑。
任何物質作為藥物的主要障礙是它在體內的分布問題。上述EP0354992和EP 0540969所報導的用於皮膚施用治療男性陽痿的修飾VIP或親脂VIP必須透過真皮，並且儘可能在短時間範圍內到達勃起組織。
EP 0620008所描述的用於治療神經變性疾病的VIP，修飾VIP或親脂VIP必須通過血腦屏障才能發揮它們對人腦細胞的治療效應。
為治療男性陽痿及通過CNS施用以治療神經變性疾病，希望利用具有VIP全肽的生理活性且體積較小、因而能夠提高治療化合物在靶組織的生物利用度的分子。此外，通常小分子與較大的分子相比對降解總是更穩定，因為它們供降解利用的位點更少。
發明概要本發明基於驚人地發現偶聯親脂組分的VIP短片段或修飾VIP(其長度為3-12個胺基酸)在治療陽萎和/或治療神經變性疾病中有生理活性。相對於利用全長VIP分子，利用偶聯親脂組分的具生理活性的短肽的優點是在體中更好的生物分布和更高的生物利用度並且容易製備。此外，本發明涉及包含VIP的或偶聯親脂組分的修飾VIP的所說短片段的短環肽，除上述有利特徵之外的優點是相對來說具抗降解的能力。
本發明涉及偶聯親脂組分的肽綴合物，其中所說的肽至少具有3個且至多具有12個胺基酸殘基，所說的綴合物選自下式。(ⅰ)R1-X1-X1′-X1″-X2-NH-R2；(ⅱ)R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2；


其中R1是H或親脂組分；R2是H，親脂組分，被X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR2所取代的親脂組分或與X1-X1′-X″-X2-NHR2偶聯的由1-3個非荷電胺基酸殘基組成的間隔基團，其條件是R1和R2至少一個是親脂組分；X1是共價鍵，Ala,Val,Ala-Val,Val-Ala,L-Lys,D-Lys,Ala-Lys,Val-Lys,Ala-Val-Lys；Val-Ala-Lys或Orn；X1′是L-Lys,D-Lys或Orn；X1″是L-Tyr,D-Tyr,Phe,Trp或對氨基苯丙氨酸的殘基；X4是Ile或Tyr；X5是疏水脂肪族胺基酸的殘基；X2是X5,X5-Asn,X5-Ser,X5-Ile,X5-Tyr,X5-Leu,X5-Nle,X5-D-Ala,X5-Asn-Ser,X5-Asn-Ser-Ile,X5-Asn-Ser-Tyr,X5-Asn-Ser-Ile-Leu,X5-Asn-Ser-Tyr-Leu,X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X3是共價鍵，Asn,X5,X5-Asn,Tyr-X5,Tyr-X5-Asn,Lys-X5,Lys-X5-Asn,Lys-Tyr-X5,Lys-Tyr-X5-Asn,Lys-Lys-Tyr-X5,Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn；X6是共價鍵或Asn,Ser,Ile,Tyr,Leu,Asn-Ser,Asn-Ser-Ile,Asn-Ser-Tyr,Asn-Ser-Ile-Leu,Asn-Ser-Tyr-Leu,Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X7是共價鍵或Asn；X8是共價鍵，X5,Tyr,Lys,Tyr-X5,Lys-X5,Lys-Tyr-X5,Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Ala-Lys-Lys-Tyr-X5，或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5；Z是-CONH-,-NHCO-,-S-S-,-S(CH2)tCO-NH-或-NH-CO(CH2)tS-；m當Z是-CONH-,-S-S-，或-S(CH2)tCO-NH-時m是1或2，或當Z是-NH-CO-或-NH-CO(CH2)tS-時m是2,3或4；n當Z是-NH-CO-,-S-S-，或-NH-CO(CH2)tS-時n是1或2，當Z是-CONH-或-S(CH2)tCO-NH-時，n為2、3或4，並且t是1或2其條件是排除綴合物硬脂醯-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
前面X5所代表的疏水脂肪族胺基酸可以是選自Ala,Ile,Leu,Met,Val,Nva和Nle的D-或L-殘基。
本發明的綴合物的親脂組分本文定義為飽和或不飽和烴基或羧醯基且其具有至少3個碳原子，如丙醯，己醯基，月桂醯基，棕櫚醯，硬脂醯，油醯基，二十烷醯基，二十二烷醯基及相應的烴基丙基，己基，十二烷基，十六烷基，十八烷基，二十烷基，二十二烷基等。優選的烴基或醯基是飽和的並且具有3-22個碳原子。
術語″間隔基團″是指不帶電荷的天然或非天然的胺基酸殘基諸如丙氨酸，脯氨酸和氨基己酸。
本發明綴合物的例子是親脂組分與下述肽的綴合物，得自VIP序列第20-23位置的Lys-Lys-Tyr-Leu序列的肽和/或第24-28位置的Asn-Ser-Ile-Ler-Asn序列的肽，或其修飾肽(其中胺基酸殘基被取代，添加，缺失或化學修飾)或這兩個序列的組合，例如
St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2.
以後，符號″St″代表硬脂醯，″Lau″代表月桂醯及″Cap″代表己醯基。
另一個方面，本發明涉及包含本發明活性綴合物(其作為活性組分)以及一種藥學上可接受的載體的藥物組合物。
包含本發明的綴合物或包含EP 0620008所描述的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(下文″肽6″)綴合物的本發明藥物組合物，可用於治療性機能障礙如男性陽痿，優選通過皮膚或泌尿道施用。用於這一目的的優選綴合物是St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
本發明藥物組合物也可以用於治療神經變性疾病，如阿耳茨海默氏綜合症，唐氏綜合症，低氧症，由於中樞和外周神經系統的局部缺血、中風、及遺傳疾病而引起的運動機能或認知機能的衰退，由於中樞或外周神經系統受傷而引起的運動機能或認知機能的衰退，由於年老引起的認知機能的衰退和與血液循環和神經元存活相關的神經學上疾病。術語″治療″在本發明此文中應理解為緩和、改善或根治那些疾病的症狀，尤其是改善由於那些疾病而損傷的認知機能。用於這一目的的優選綴合物是St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；
St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；St-Ser-Ile-Lau-Asn-NH2；Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NHe；St-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2。
施用本發明藥物組合物的可選擇方式是皮下、靜脈內、口內、鼻內、眼內、及通過腦室內的泵，通過泌尿道或透皮給藥。
本發明的藥物組合物在用來治療陽痿時，優選泌尿道或透皮給藥。用於透皮給藥的載體優選那些能提高活性組分的組織透過性的載體。合適的載體例子是橄欖油、甘油、潤滑劑、硝酸甘油、和SefsolTM，以及其混合物。SefsolTM是1-單辛酸甘油酯、丙二醇二癸酸酯、丙二醇二辛酸酯、三辛酸甘油酯和脫水山梨糖醇單辛酸酯的商標(Nikko Chemicals，東京)，並且它們是本發明組合物中的優選載體。在這些中，特別優選1-單辛酸甘油酯和橄欖油。對於泌尿道應用，優選凝膠作為載體。
為本發明綴合物的緩釋，本發明進一步提供了包括載有所述綴合物並且適用於皮膚施用的塗藥器的透皮給藥器。
如果需要，塗藥器中的綴合物可配製成上述藥物組合物。
透皮施用治療男性陽痿比腸胃外方式(如皮下)有幾個優點。首先，它是非外科的，不需損傷組織。還有，它不造成其它施用方式引起的陰莖異常勃起或灼疼。此外，透皮施用與陰莖海綿體內注射方式相比更謹慎和更方便。透皮施用可利用連續緩慢的釋放器，該釋放器能允許自發的性行為而無需長時間的準備，這樣解除了患者許多通常的困窘。
當本發明藥物組合物用作中樞神經系統的藥物時，優選通過鼻子施用它們(其能使氣霧劑組合物通過嗅覺神經進入CNS(WO 91/07947))，或通過眼途徑(Chiou,G.C.Y.,(1991)An.Rev.Pharmacol.Toxical.,31:457-67)或W.M Pardridge，肽藥物運輸(Peptide Drug Delivery,RavenPress N.Y.1991.)中所描述的任何其它合適的給藥方法。
本發明的藥物組合物也可通過腦室內泵直接作用於人腦。
本發明進一步涉及治療神經變性疾病或男性陽痿的方法，包括給予需這種治療的宿主治療有效劑量的本發明綴合物。
本發明進一步提供了本發明綴合物在製備藥物組合物中的應用。
如本領域任何技術人員將認識到的，上述式Ⅰ定義的綴合物包括大量可能的綴合物。落在本發明範圍之內的和定義為本發明藥物組合物中的″活性綴合物″的那些是那些在下列測定的至少一種中具有活性的綴合物(1)在動物陽痿模型(正常和閹割動物)中能夠引起勃起的綴合物；(2)具有保護電阻滯神經元不死亡活性的綴合物；(3)能保護培養中的未處理神經元免受天然發生的死亡的綴合物；(4)能夠保護培養的神經元免受由β-澱粉樣肽的25-35片段引起的死亡的綴合物；(5)在學習或記憶獲得的適當實驗中，能避免老齡動物或經致痴呆藥劑處理動物的學習和記憶獲得的衰退的綴合物，和能改善經致痴呆藥劑處理的動物(例如，實施例中所描述的)對以前所獲取任務的回憶的綴合物。(6)在動物局部缺血模型和/或中風模型中，能夠避免或改善運動機能和認知機能衰退的綴合物；(7)能夠保護神經元免受缺氧所造成損傷的綴合物；(8)在中樞和外周神經系統的遺傳神經變性疾病模型中，能改善運動和認知機能的綴合物，這些模型有諸如帶有ApoE缺損的小鼠模型(細胞(Cell),71:343(1992))；澱粉樣蛋白過份表達的轉基因模型((自然(Nature),373:523(1995))；超氧化物岐化酶表達突變體的ALS模型(科學，264,1772(1994))，及16號染色體三體型的唐氏綜合症模型；以及(9)在中樞和外周神經系統的損傷模型中能改善運動和認知機能的綴合物，這些模型諸如大鼠核基底的損傷(PNAS,85:9481(1988))；東莨菪鹼引起的腹側海馬處乙醯膽鹼釋放(PNAS,90:11287(1993))；NMDA引起的驚厥(腦研究(Brain Res.)448:(1988))。
在下文中，本發明將進一步參考一些非限制的附圖和實施例進行說明。
附圖簡述

圖1顯示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2濃度變化對經β-澱粉樣肽處理的神經元的存活情況的作用；圖2顯示膽鹼能阻斷劑AF64A(○)和與St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的AF64A(●)對老年痴呆症(Alzheimer)動物模型中的學習和記憶的作用；圖3顯示膽鹼能阻斷劑AF64A(●)和與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(▲)對老年痴呆症動物模型中的學習和記憶的作用；圖4顯示施用鹽水對照(○)；與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的鹽水(■)；膽鹼能阻斷劑AF64A(▲)和與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(◆)在老年痴呆症的動物模型中對保持記憶的作用；圖5顯示分別經鹽水(○)；與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的鹽水(■)；膽鹼能阻斷劑AF64A(▲)和與St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2一起的AF64A(◆)處理的動物的運動機能；圖6顯示與載體一起施用鹽水(○)和綴合物St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala(□)對正常對照動物的學習和記憶的作用；圖7顯示在老年痴呆症動物模型中施用鹽水(●)；與St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的鹽水(■)；膽鹼能阻斷劑AF64A(▲)和與St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2一起的AF64A(◆)對以前已學任務記憶保持的影響(第一次遊泳)；圖8顯示與圖7相關描述相同的第二次遊泳實驗；圖9顯示與圖7相關描述相同的實驗，即測量動物在平臺過去所在區域中花費的時間；圖10顯示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2)和鹽水對正常新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；鹽水(○))及ApoE缺損的新生小鼠(APO E)(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；鹽水(●))的前肢放置行為獲知的作用；圖11顯示St-Nle17-VIP-NH2和鹽水對正常新生小鼠(St-Nle17-VIP-NH2()；鹽水(●))及ApoE缺損的新生小鼠(St-Nle17-VIP-NH2(▲)；鹽水(◆))的前肢放置行為獲知的作用比較；圖12顯示St-Lye-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KEYL-NH2)和鹽水對正常新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2()；鹽水(●))及ApoE缺損的新生小鼠(St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(▲)；鹽水(◆))的懸崖逃避獲知的作用；圖13顯示St-Nle17-VIP-NH2對正常新生小鼠及ApoE缺損的新生小鼠的懸崖逃避獲知的作用比較；圖14顯示對照組和經St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2處理的ApoE缺損小鼠的膽鹼乙醯基轉移酶活性；圖15顯示經過鼻內施用127I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的大鼠的腦提取物的HPLC分析；圖16顯示DMSO中的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(肽6)對杯狀結構和E2數量的作用；圖17顯示DMSO中的St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2(肽6)和St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(肽26)對杯狀結構和E2數量的作用；圖18顯示5％SefsolTM/20％異丙醇中的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2對杯狀結構的數量和E2數量的作用(C=載體對照；E=實驗肽)；
圖19顯示SefsolTM/異丙醇中的St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2對杯狀結構的數量和E2數量的作用(C=載體對照；E=實驗肽)；圖20顯示SefsolTM/異丙醇中的St-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2對杯狀結構的數量和E2數量的作用(C=載體對照；E=實驗肽)；圖21顯示SefsolTM/異丙醇中的St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2對杯狀結構的數量和E2數量的作用(C=載體對照；E=實驗肽)；圖22顯示SefsolTM/異丙醇中的St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2對杯狀結構的數量和E2數量的作用(C=載體對照；E=實驗肽)；圖23顯示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)對杯狀結構數量的作用；圖24顯示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)對第一杯狀結構潛伏期的作用；圖25顯示St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(KKYO)和St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2(KKYV)對E2數量的作用；圖26顯示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2對杯狀結構數量的作用；圖27顯示St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2對杯狀結構數量的作用；圖28顯示局部施用125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2後的生物分布情況；圖29顯示局部施用125I-St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2(St-KKYL-NH2)的動物的腸抽提物的HPLC分析；及圖30顯示將0.1μg St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2和10μg St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2及載體注射入體腔內對陰莖血壓的影響。
發明詳述A．合成線型肽利用自動肽合成儀以獲得一組短肽。本發明的肽合成是通過Fmoc策略用供應商的方案採用ABIMED AMS 422合成儀(ABIMED,Langenfeld，德國)的自動合成方法完成的。公司推薦了所有帶保護基的胺基酸衍生物。這樣則利用了下列側鏈保護基Lys,N-s-叔丁氧羰基(Boc),Tyr,Thr,Ser,O-叔丁基；Arg；2,2,5,7,8-五甲基苯並二氫吡喃-6-磺醯基(PMC)；Trp,Nin-Boc；Cys,S-三苯甲基，Asn,β-三苯甲基，PyBOP，即苯並三唑-1-基-氧-三-吡咯烷基-鏻六氟磷酸鹽用作偶聯劑。肽鏈在4-([2″,4″-二甲氧苯基]Fmoc氨乙基)苯氧基樹脂(Rink醯胺樹脂，Nova，瑞士)上進行合成。
伴隨側鏈脫保護而完成從樹脂上最後裂解肽鏈的操作如下裂解混合物90％TFA,5％水，5％三乙基甲矽烷。100mg載有肽的樹脂與3ml切割混合物在用於固相合成的反應柱內溫育30分鐘。30分鐘後，從裂解後的樹脂中分離反應物，並繼續裂解3小時。用冰預冷的叔丁基甲基醚沉澱裂解後的肽並離心(40℃,2000rpm)。為確保最佳沉澱，有時加入石油醚(b.p.40-60℃；1∶1v/v)。倒出溶液，用水溶解沉澱，並且冷凍並凍幹以產生白色粉末。通過RP-8柱上進行半製備性HPLC(Merck 7μM；250×10mm)純化粗肽，採用線型梯度(在含0.1％TFA的35％乙腈的水溶液至含0.1％TFA的75％乙腈水溶液之間)以10ml/分鐘的流速洗脫。在220nm下監測洗脫。產量是30-45％。在徹底酸水解後，產品純度由RP-18柱上的分析型HPLC(Merck 7μM；250X4mm)和胺基酸分析法進行確定，給出每一胺基酸組分的期望值。
包含線型肽(其由該方法合成)的綴合物例子是那些在上文5-9頁所列出的那些，和下列綴合物1． CapKKYLZZ*29．StYLNSILN*2． LauKKYLZ*30．StKKYLNle*3． KKYLZ*31．StKKYLO*4． KKYLZZ*32．StKKYLL*5． KKYLB*33．StKBYL*6． KKYLZZZ*34．StBKYL*7． NauNSILNZ*35．StBBYL*8． NSILNZ*36．StKKFL*9． NSILNZZ*37．StKKOL*10．CapNSILNZZ*38．StKKYZ*11．NSILNZZZ*39．StKKWL*12．NSILNB*40．StKKXL*13．KKYLZNSILN*41．StKOmYl*14．KKYLZZNSILN*42．StOmKYL*15．KKYLZZZNSILN*43．StOmOmYL*16．KKYLBNSILN*44．OlKKYL*17．StKKYLXXXNSILN*45．PropylKKYL*18．StKKLYAAANSILN*46．StKKYLAAKKYL*
19．StKKYLPNSILN*47．StKKYLPPKKYL*20．StKKYLPPNSILN*48．StKKYLAcaKKYL*21．StKYLNSILN*49．StKKYLAm.LaurylKKYL*22．StKKYLNSILN*50．StKKYLNle*23．StKKYLN*51．StKKYLdA*24．StKKYLNS*52．StKKYLL*25．StKKYLNSI*53．CapKKYL*26．StKKYLNSIL*54．LauKKYL*27．LauKKYLNSILN*55．CapNSILN*28．StKYLN*56．LauNSILN*其中Cap=己酸，Lau=月桂酸，St=硬脂酸；Z=氨基己酸，B=氨基月桂酸，X=d,1Ala,O=D-Ala；B=dK,O=dY,Z=dL,X=p=氨基Phe，*=醯胺，Ol=油酸。
B．合成環肽Ⅰ．包含分子內醯胺鍵的環肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定義的Z=-CONH2-或NH2CO-)可通過常規固相合成法而製備。這樣，可在固相支持物上合成肽鏈，而在所選環化位置處摻入合適的氨基和羧基側鏈帶保護基的胺基酸衍生物。肽鏈合成完成後，可從對應的氨基與羧基官能團選擇性地移去保護基，留下其它保護基和完整的肽-支持物鍵。利用已知肽偶聯劑則可完成環化。最後，利用已知方法伴隨側鏈組分的脫保護從支持物上裂解環肽，並用層析技術純化所需環肽。Ⅱ．包含分子內二硫鍵的環肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定義的Z=S-S)可通過常規固相合成法製備，而在所選環化位置處摻入合適的S-帶保護基的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基。肽鏈合成完成後，可用兩種可能的途徑進行環化1．通過選擇性地撤除S-保護基及隨之發生對應的游離SH-官能團在支持物上的氧化，而形成S′-S鍵。接下來進行從支持物上常規移走產物操作並進行適當的層析純化。2．在高度稀釋的水溶液中，伴隨著側鏈脫保護從支持物移走肽，其後為游離SH-官能團的氧化。兩條途徑均可得到相同的最後所需產物。Ⅲ．包含分子內S-烷基的環肽(即上述式Ⅲ或Ⅳ定義的Z=-S(CH2)t-NH或-NH-CO(CH2)tS-)可通過常規固相合成法而製備。這樣，在肽鏈合成期間所選環化位置處摻入攜帶合適氨基保護側鏈的胺基酸殘基，和合適的S-帶保護基的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基。接下來通過溴醯基化選擇性地使保護的側鏈氨基官能團脫保護。在酸性條件下伴隨著側鏈脫保護可從支持物上分離出所說的肽。在中性或微鹼性條件下，則對應的游離SH部分和溴醯基部分在高稀釋液中能選擇性地相互作用從而提供所需環肽。
實施例B1
通過瑞士Nova所提供的對甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂可人工合成肽。所有溶劑，二氯甲烷(CH2Cl2)，N-甲基吡咯烷酮(NMP)以及二甲基亞碸(DMSO)都是德國Merck的分析產品。三氟乙酸(TFA)，二異丙基乙胺(DIEA)和N,N′-二環己基碳化二亞胺(DCC)購自美國Aldrich。1-羥苯並三唑(HOBT)購自瑞士Nova。所有帶保護基的胺基酸衍生物(Boc-AA)均為L-構型，購自瑞士Bachem。Na-胺基酸官能團在整個合成中由叔丁氧羰基(t-Boc)保護。側鏈官能團的保護基如下Asp的保護基為9-芴基甲基(Fm),Lys的保護基為2-氯-苄氧基羰基，在肽鏈1位處的保護基為9-芴基甲氧基羰基，Tyr的保護基為2,6-二氯苄基。
利用DCC(0.42g 2mmol)和HOBT(0.272,2mmol)作為試劑通過連接Boc-Asp(OFm)(0.82g,2mmol)至甲基二苯甲胺樹脂(1g)上從而啟動合成反應。通過胺基酸分析測定載樣(0.39mmol/g)。聚合物上未反應的剩餘氨基在CH2Cl2(10ml)中通過與乙酸酐和三乙胺(相應為1ml和0.5ml)反應而封閉。用Boc-Asp(OFm)-MBHA樹脂開始合成肽鏈，按表Ⅰ中所概述的方案進行。
表1人工固相合成的方案

所有用於洗滌及反應的溶劑體積為10ml/g樹脂。所有連接均利用Boc-胺基酸衍生物的HOBT活性酯而完成，所說的活性酯在每一連接步驟之前由DCC製備。進行連接所採用的Boc-胺基酸1-苯並三唑酯(Boc-AA-OBT)與延長中肽鏈的α-氨基的摩爾比分別為4∶1。連接反應通過在吡啶-水中的茚三酮的溶液中使幾毫克聚合物(-3)加熱沸騰2分鐘進行監測。Boc-胺基酸連接重複兩次以便確保完成反應。第二次連接時，利用一半量的Boc-AA-OBT。通常，在完成每個連接步驟後，剩餘氨基在二氯甲烷中通過用乙酸酐(10％)和二異丙基乙胺(3％)處理樹脂而被封閉，接著在二氯甲烷中用10％的乙酸進行處理。
在肽鏈合成完成後，通常通過溶於CH2Cl2的50％TFA移走Lys-1的t-Boc保護基，並且新的游離α-氨基通過利用DCC(0.42g,2mmol)和HOBT(0.27g,2mmol)作為試劑(方案)與硬脂酸(0.37g,2mmol)相連接。反應進行120分鐘，並重複兩次。利用DMF中的50％哌啶經1小時分別除去Asp6和Lys1的側鏈保護基OFm與Fmoc。在用DMF(3×10ml)，二氯甲烷(3×10ml),CH2Cl2中的10％的DIEA(3×10ml),DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)洗滌後，在七倍過量的DIEA(2.8mmol)存在下，將樹脂懸浮在7ml DMF中並與五倍過量(2mmol)的(苯並三唑基氧基)三(二甲基)氨基鏻六氟磷酸鹽(BOP)相混合8小時。該操作後重複環化。茚三酮檢驗陰性顯示環化的完成。根據方案用CH2Cl2洗滌完全合成的環肽-樹脂，然後真空環境下用P2O5過夜乾燥。用無水HF技術去掉保護基並從樹脂上切割下肽。這樣，0℃下在TeflonTMHF裝置中，在1.5ml對甲苯硫酚和對甲酚(1∶1v/v)混合物的存在下用9ml的HF處理肽-樹脂1小時。真空去除HF，用無過氧化物的醚(4×25ml)抽提樹脂，然後過濾，乾燥並用溶於水的50％的乙酸(3×25ml)提取。將含水濾液凍幹則產生了硬脂醯

的粗粉末。
使粗提品溶於50％的含水乙酸中，並利用0.1N的乙酸作洗脫劑使其流經SephadexG-25柱(75×2cm)。在274nm下用分光光度分析法監測洗脫液。將水溶液凍幹而產生無芳香添加劑的肽，所說的添加劑在HF-切割步驟時添加作為清除劑。產率為50-70％。
然後對Sephadex分離產品通過高效液相層析(HPLC)進行純化。但是也可對粗肽進行這一操作。通過Merck RP 8柱(7μM,250×10mm)完成純化。將肽置於10％的乙腈水溶液中，並用線型梯度(其為從0.1％的TFA水溶液到含0.1％的TFA和75％乙腈的水溶液而建立的梯度)以10ml/分鐘的流速進行洗脫。收集級分並在分析型HPLC檢查之後進行分段。合併並凍幹各級分。純肽產率是30-35％。
在徹底酸水解(6N HCI)後，產物純度由分析性HPLC(Merck RP-8,250×4mm柱)和胺基酸分析法進行測定，給出每種胺基酸成分的期望值。
上述式(ⅲ)和(ⅳ)的其它相關環狀衍生物(其中Z為-NH2-CO-或-CO-NH-)使用對應的胺基酸衍生物，由完全相同的方法製備。
此外，環衍生物可由上述方法製備然後將硬脂醯或其它合適的親脂組分摻入進分子N端。
實施例B2
如上述實施例所概述的，在對甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂(1g)上人工合成所說的肽。用Boc-Cys(S-4-MeBz1-)-OH作為構件將半胱氨酸殘基1和6摻入進肽鏈中。在完成鏈合成和添加N-端硬脂醯組分後，如上述用無水HF處理肽-樹脂。將凍幹後獲得的粗肽白色粉末溶於0.1％的乙酸(約0.5mg/ml)中，並用無氧氮充氣於溶液中使其冒泡2小時以去掉溶液中的氣體。用濃NH4OH水溶液調整溶液pH至約8.5，並慢慢滴加K3Fe(CN)6(2.5當量)水溶液(約1N)。在添加氧化劑之後，室溫下攪拌反應混合物1小時。然後用旋轉蒸發使溶液濃縮，並如上述在葡聚糖凝膠G-25上分級分離環狀粗產物。然後通過HPLC在Merck RP 8柱上完成純化(參見以前的實施例)。純化產物的產率是35-40％。在上述操作後，當用Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH和Boc-Homocys(S-4-MeBzl)-OH作為構件(其在所選擇環化位點處被摻入)可製備其它包含S-S內部鍵的環肽。
實施例B3
如上述實施例所概述的，在對甲基二苯甲胺(MBHA)樹脂(1g)上人工合成所說的肽。用Boc-Cys(S-4-MeBzl)-OH將半胱氨酸殘基1摻入進肽鏈中，而以Boc-Lys(ε-Fmoc)-OH引入Lys-6。在完成鏈合成和添加N-端硬脂醯組分後，經過在DMF中用20％哌啶處理30分鐘除去Lys-6的保護基ε-Fmoc。用DMF(3×10ml)，二氯甲烷(3×10ml),CH2Cl2中的10％的DIEA(3×10ml),DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)徹底洗滌樹脂。將樹脂懸浮在10ml DMF中並與五倍過量(2mmol)的溴乙酸酸酐相混合6小時。用DMF(3×10ml)洗滌樹脂並重複該反應。茚三酮檢驗陰性顯示醯化反應完成。然後用DMF(3×10ml)和CH2Cl2(3×10ml)洗滌樹脂，真空環境下乾燥，並利用甲氧基苯(10％)作為唯一清除劑用無水HF處理樹脂。利用以前實施例中所描述的相同操作獲得溴乙醯化粗產物。然後將白色粉末(約0.5mg/ml)溶於0.1％乙酸中，並用1N NaOH調整pH至約7.0。室溫下反應4小時後，溶液經Ellman試劑(Aldrich)表明無SH-官能團後則可用旋轉蒸發進行濃縮。然後如實施例A中所描述的通過流經葡聚糖凝膠G-25柱純化粗品，接著經製備型HPLC純化。純化產物的產率為25-30％。在上述操作後，用對應的胺基酸衍生物(在所選環化位點處和其它位置)可製備其它包含-S-(CH2)t-CO-NH-或-NH-CO-(CH2)t-S-內部鍵的環肽。
C．本發明的神經變性治療方面實施例C1生物試驗-本發明綴合物對於β-澱粉樣肽所處理的神經元存活的作用方法眾所周知β-澱粉樣肽與老年痴呆症疾病有關，並且是對培養基中所培育的神經元有毒的一種物質(Pike等，神經科學雜誌(J.Of Neurosci,13(4),1676-1687(1993)；Yankner等，科學，250:279-282(1990)；Gozes等，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),93:927-432(1996))。
通過對Forsythe和Westbrook所描述的(生理學雜誌(J.Physiol.Lord.)365:515,(1988))的一種技術稍作改變，製備大鼠腦皮層細胞培養物，其中用大腦皮質代替海馬，並用新生大鼠代替E16小鼠。將大腦皮層細胞(1.5-15×105細胞/35mm平皿)鋪在所述(Gozes等，J.Pharmacol.Exp.Therap.,257:959-966(1991))匯合腦皮層的膠質飼養培養基上。培養基是DMEM-(Dulbeco改進的Eagle培養基)，其包含5％的馬血清和N3[一種包含激素混合物的培養基補充物，見Romijn等，腦研究，254:(4),583-589(1981)]。在體外培養八天後，培養物完全更換培養基，然後用β-澱粉樣肽(胺基酸25-35)處理5天。
將β-澱粉樣肽片段溶於水中，終濃度為2.5mM。用遞增劑量的本發明綴合物進行實驗(最初1mg與10μl DMSO混合，接著與另一個10μ1的DMSO混合以便完全溶解，並用PBS稀釋以獲得10-3M的貯存液)，在神經元倒板九天後，將該綴合物與25μM β-澱粉樣肽(胺基酸25-35)一起加入至所分離的腦皮層中。將十μl綴合物溶液添加至1ml培養基中。處理持續時間為5天，不更換培養基。在培養基中14天後，固定細胞進行細胞免疫化學分析，並用抗NSE(神經元特異性烯醇化酶，一種神經元標記)的抗體進行標記。在60個區域總面積25mm2內對神經元細胞計數。如以前，不知道處理的類型即對神經元進行計數。每個值為3個培養皿的平均數±SEM。
結果如圖1和表2中所示。圖1顯示五個獨立實驗(含對照，包括164,225,130,319,173個神經元)的總和。如圖1所示，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2是一種活性很高的綴合物，在10-13和10-9M間具有活性並且在10-12和10-10M間活性最高。經綴合物和β-澱粉樣肽處理的細胞的細胞計數比未經處理的對照細胞的更高，這表明該綴合物能夠保護細胞也能減少天然發生的死亡。
表2神經元存活試驗中的肽活性，抗β-澱粉樣肽毒性的保護作用

如表2中所示，與對照組比較，St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2綴合物(1)的幾個修飾顯示了保護神經元使之免受因β-澱粉樣肽所造成死亡的類似活性。在某些情況下(其中與對照相比較，神經元存活超過100％)綴合物也能防止天然發生的死亡。令人注意的是，綴合物1中Leu被Val(3),D-Ala(3),Nle(4)取代，在N-端(8)或C-端(9,10,11,12,13)處胺基酸殘基的增加，N-端(7)的胺基酸殘基的缺失或親脂組分硬脂醯被月桂醯(Lau)(5)或己醯基(Cap,6)置換，導致與St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2活性類似的綴合物。
實施例C2本發明綴合物在老年痴呆症動物模型(Morris水迷宮)中對學習和記憶的作用在體內膽鹼能抑制作用模型中，用與塑料管(PE-20)相連的25G針，以0.21μl/分鐘的速率，對18隻雄鼠(Wistar,250-300g)進行腦室內注射(i.c.v)，對照組接受2μl/側的生理鹽水注射，實驗動物接受3nmol/2μl/側的膽鹼能阻斷劑(乙基膽鹼吖丙啶鎓)的注射。
在AF64A注射後，開始藥物處理7-10天。將動物劃分為兩個相等的組。對試驗組每日通過鼻道施用溶於10％SefsolTM和40％異丙醇的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2，濃度為10μg/40μl(每一個鼻孔施用20μl)。對照動物鼻內施用載體。在鼻道施用前，將大鼠用乙醚部分地麻醉。在藥物施用七天後，另10天進行行為分析。在試驗前1小時，通過鼻道施用藥物。所有動物用50,000個單位的持久性抗生素長期處理(每隔兩天)以避免感染。
按照Morris水迷宮方法(Morris等，自然，297:681-683,1982；Morris等，自然，319:774-776,1986)進行學習試驗操作。Ⅰ．St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的施用將大鼠放置在環狀水池中，池直徑1.26m，深0.2m，裝有清明的有機玻璃柱，且具有恰在水(22-24℃)表面下的13.3cm高的平臺。在試驗前1小時，每日由鼻道施用藥物。記錄每隻大鼠到達平臺的潛伏期(用秒計)，並將經過幾天訓練的變化做成圖表，這反映了學習能力和記憶力。
如圖2所示，用AF64A注射的對照動物(O)與用AF64A注射和鼻道施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的動物(●)相比較，到達平臺的潛伏期改善較少。這些結果表明本發明的綴合物能夠改善老年痴呆症的動物模型中的學習能力和記憶力。Ⅱ．St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2的施用圖3描述如上述的體內檢測(AF64A-膽鹼毒性試驗)中St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(圖中所注的KKYO)對老年痴呆症中學習能力和記憶力的作用。所獲得的結果類似於上述那些，用AF64A注射的對照動物(●)與用鼻道施用AF64A和St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2(▲)的動物相比較，到達平臺的潛伏期改善較少。此外也進行了探針試驗(Gozes等，Proc.Natl.Acad.Sci.美國93:427-432,1996)，在這一試驗中在動物知道平臺在水池中的位置後，撤走平臺，記錄動物在平臺原來所在區域花費的時間，該段時間表明以前學習試驗的記憶保持。如從圖4所觀察的，與用AF64A處理沒有注射肽的動物相比，用St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2處理的動物顯示更好的記憶保持能力。在這一試驗後將平臺放回水池中，但這次平臺可被遊泳的大鼠看見，並測量達到平臺所需時間。在這種情況下，所測量的參數可能反映了運動缺陷。如圖5所示，在各組間沒有任何區別，因此總體上該試驗測量了學習、記憶而不是運動機能的改變。
實施例C3本發明綴合物對正常動物的學習和記憶的作用重複實施例C2中所描述的實驗，但這些動物用鹽水注射代替AF64A，並且是正常的動物不是具類老年痴呆症的認知力遭損壞特性的動物。將動物劃分為兩組，一組只是鼻內施用載體(如上述的Sefsol+異丙醇)而另一組鼻內施用St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2。如圖6所示，可觀察到經肽處理的那組動物多少明顯顯示了更快地學習能力，這表明也可能提高未遭損壞的正常動物的認知機能。
實施例C4本發明綴合物對記憶保持模型的作用研製了一個新模型以評估動物對以前學習試驗的記憶保持能力。首先教動物(N=5-10)在上述的水迷宮內找到水下平臺。為了評價記憶保持力，讓動物每日遊泳(每天一次試驗)以便學會找到暗藏的平臺。一周後，挑選在學習試驗中顯示最高成績的動物，進行實驗。將AF64A或生理鹽水注射到第三腦室，在復原一周後，如上述對動物鼻道施用肽St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2。在肽處理一周後，在水迷宮中再次試驗動物，並如下重複學習任務(即找到平臺)的記憶保持實驗將動物在平臺上放置1分鐘。然後放置在水中讓其遊到平臺並測量到達平臺所需的時間。圖7總結了第一次遊泳的結果。如該圖所示，很明顯用肽處理的動物能防止記憶丟失，並且對於用AF64A注射的動物(由於它們的行為方式與對照組類似)也能保持以前學習任務的記憶。
1分鐘後，在平臺上，將動物放回水中讓其再遊泳並找到暗藏的平臺。圖8顯示第二次遊泳的結果。由圖可見，圖8也顯示用肽處理的動物的學習和記憶的改善。這一模型是肽活性和利於記憶保持的第一個實證。
最後，撤走平臺和將動物在平臺區域花費的時間在圖9中記錄下來。上面總結的結果，清楚地顯示了St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2與學習、任務記憶和記憶保持的關係。
實施例C5本發明綴合物對精神發育遲緩模型的作用一種精神發育遲緩的模型載脂蛋白E缺陷的小鼠近來發現小鼠載脂蛋白E缺陷(Plump等，細胞，71:343-363(1992))延遲了小鼠發育裡程的獲取。試驗ApoE缺陷小鼠的行為裡程發展，發現它們比對照動物(出生後2-5天)明顯地延緩了前肢放置行為的獲得(出生後11-13天)。在這些小鼠中還觀察到獲得離開懸崖行為也延遲一兩天。
給8隻新生正常小鼠注射(s.c.1.2μg-120μl)St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或生理鹽水。類似處理8隻ApoE缺陷的新生小鼠。
圖10和11顯示了前肢放置行為獲得的結果。可見用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或已知的St-Nle17-VI-NH2(只用於比較)St-Nle17-VIP處理的ApoE缺陷小鼠，與未處理的ApoE缺陷小鼠相比較，其放置行為的獲得被提高到與對照組水平基本相同的水平。
圖12和13顯示上述處理的動物的懸崖逃避的獲得。可見，用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2或St-Nle17-VI-NH2(只用於比較)處理的ApoE缺陷小鼠，與正常的對照小鼠相比較顯示了更好的懸崖逃避的獲得，或與對照類似的懸崖逃避行為。
實施例C6本發明綴合物對載脂蛋白E缺陷小鼠的膽鹼能活性的作用如Fonnum F.A.，神經化學雜誌(J.Neurochem)21:413-413,1975中所描述的，對Apo-E缺陷小鼠進行膽鹼能活性試驗。簡言之，對21天大的正常(對照)小鼠和ApoE-缺陷小鼠通過測量Chat活性以評估其腦狀態。如上述(參見正文)，膽鹼乙醯轉移酶(Chat)活性通過測量膽鹼和[14C]乙醯CoA合成[14C]乙醯膽鹼的速率而檢測。在缺少膽鹼的情況下，測量非特異性背景。在特氟隆勻漿器中，用10體積的50mM磷酸緩衝液(pH=7.4)(其包含300mM NaCl,30mM EDTA和0.5％triton)勻漿每個腦(300-400mg)。12000g離心勻漿物15分鐘，將10μl上清液(三份)與10μ1溶液混合，該溶液包含14μM 14C-乙醯基-CoA(56mCi/mmolNEN),20mM乙醯膽鹼，1.6mM氯化膽鹼，0.25mM毒扁豆鹼，以及磷酸緩衝液。在37℃反應15分鐘。通過添加在3-庚酮中製備的50μl的15mg/ml四苯基硼，並且渦旋混合30秒以終止反應。2分鐘後收集20μl有機相，微離心，然後與閃爍液相混合，並用β-計數器測量放射活性。
對長期注射肽或生理鹽水的21天齡的動物進行實驗。注射採用皮下注射，用DMSO溶解肽(100μg/30μl)並用生理鹽水稀釋以獲得所需濃度。1-4天4μg肽/20μl生理鹽水；5-10天8μg/40μl生理鹽水；11-14天16μg/8μl生理鹽水。
膽鹼能活性的結果顯示在Apo-E缺陷的小鼠上的減弱。施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu的小鼠的膽鹼能活性如圖14所示。該圖說明了用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2處理的ApoE小鼠具有比對照組水平提高的膽鹼乙醯轉移酶活性。
圖14表明St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2提高了載脂蛋白E缺陷小鼠的膽鹼能活性(在所有膽鹼乙醯轉移酶活性試測中100％活性說明669-758pmol/mg蛋白/分鐘)。
實施例C7St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2的生物分布通過利用氯胺T方法(如Gozes等，內分泌學(Endocrinology)134:2121-2125(1994))對St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2進行放射性碘標記，並對250-300g的大鼠鼻道施用約7.8X106cpm/2μl 5％SefsolTM，20％異丙醇/大鼠。藥物施用30分鐘後，處死動物取下額皮質稱重並用γ計數器測定放射活性。此後勻漿放射性組織樣品(其包含1400cpm/克樣品)，並離心(5400g,25分鐘)。然後用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2作標記(利用乙腈梯度在第25級分被洗脫)對上清液進行HPLC分析。在γ計數器中監測樣品的放射活性。
如圖15所示，在施用30分鐘後在腦內觀察到完整的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2，這表明本發明綴合物通過鼻道施用時可到達腦部。
D．本發明的陽痿預防方面陰莖反射的生物試驗該生物試驗涉及在透皮施用本發明綴合物後，對閹割大鼠測量陰莖反射。在第一種類型的生物實驗中，測量了用帶有各種載體的組合物對陰莖反射的作用，發現SefsolTM是最有效的載體。(a)方法陽痿動物模型採用因閹割而減少了性潛能的大鼠。將雄鼠(250-300g，鼠齡約三個月)飼養在12小時亮，12小時黑暗的循環中。通常在黑暗期進行實驗，即黑暗開始後的2-6小時。將雄鼠閹割，在連續的14-21天內(實驗的持續時間)通過每日注射形式進行部分睪酮替代(4μg/100g體重)。外科手術一周後，進行實驗。
陰莖反射(勃起)的直接評估利用一種採用測量陰莖性反射這一技術的方法，這能直接評估在透皮施用藥物後陰莖勃起的情況。成功的繁殖很大程度上取決於精確實施時間上安排的功能上相關的行為單元。在這些實驗中，我們集中在勃起過程的最後的階段(陰莖變紅並膨脹和延伸，最後導致完成勃起)並監測第一個E2和第一個杯狀結構的潛伏期(Okumura,M.，等，Chem.Pharm.Bull.37,1375(1989))。
為了試驗，使每個動物處於仰臥姿勢，並在其身體前端罩一個較松地固定的量筒(7cm直徑)。在軀幹周圍用帶子系好後，通過位於陰莖後的一個薄木製敷料器，使陰莖頭從它的鞘中伸出並輕輕地保持垂直於腹部。觀察員固定雄鼠的腿，並在整個試驗過程中保持這一位置。實驗持續時間為45分鐘。對E2及杯狀結構的數量和潛伏期進行記錄並繪圖。
E2定義為一種完全的勃起，其後可為杯狀，其中陰莖尖端變成一種杯狀結構，因為龜頭張開以致陰莖遠端部分比其根部更大。這一最後階段是E2所要求的，並可能是射精的必要條件。利用所有參數可獲得一種可靠的對所試驗大鼠的性功能進行測量的方法。
E2的持續時間通過監測動物45分鐘，並且通過測量單個勃起事件的長度或累加幾個非連續勃起事件的長度統計勃起的全部時間。計算單個勃起事件的最小持續時間為半分鐘。
實施例D1本發明綴合物在陽痿大鼠模型中的作用使綴合物溶於二甲基亞碸(DMSO)，濃度為10-3M，每次施用10μl。所用的大鼠是通過部分睪酮替代的閹割處理的大鼠(Gozes等，J.Clin.Inves.,90:810-814(1992))。簡言之，閹割雄鼠(鼠齡為90-100天)後立即每日皮下注射4μg/100g BW睪酮，連續21天，即實驗的持續時間。外科手術後一周開始實驗。如上述測量陰莖反射。
圖16顯示肽6(St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2)與對照比較能顯著提高杯狀結構及E2的數量。圖17描述肽6與肽26的比較。用本發明的其它綴合物大體上按上述過程重複實驗，但肽溶於5％的SefsolTM和20％異丙醇中且其終濃度為每隻動物7μg/10μ1。所試驗的綴合物是St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
結果如圖18-27所示，這些結果表明所有試驗的綴合物與對照相比能夠改善所有被檢測的陽痿參數(杯狀結構數，E2數以及第一個杯狀結構的潛伏期)。
實施例D2局部施用St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2後的生物分布如上述對St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2進行放射性碘標記，並對250-300g大鼠的性器官局部施用約2.2×106cpm/2μl 5％SefsolTM，20％異丙醇/大鼠。在指定時間，處死動物對組織稱重並用γ計數器測定放射活性。
結果如圖28所示。這些結果表明透皮施用的綴合物能夠穿透到動物的內部組織。
實施例D3腸抽提物的HPLC分析按實施例D2的說明進行實驗。藥物施用30分鐘後，處死動物，取下腸稱重並用γ計數器測定放射活性。此後勻漿放射性組織樣品，並離心(5400g,25分鐘)。然後用放射性碘標記的St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2作標記(利用乙腈梯度在第25級分被洗脫)對上清液進行HPLC分析。用γ計數器監測樣品放射活性。
結果如圖29所示。從圖26和27的施用2.2×106cpm/g的結果可看出，施用後30分鐘80,000cpm/g以上位於腸內。作為比較，利用等量放射標記的St-Nle17-VIP，僅僅在腸內獲得3700cpm/g(Gozes等，內分泌學，134:2121-2125(1994))，這說明本發明的短綴合物比全長的28個胺基酸的綴合物具有更好的穿透性。
實施例D4本發明綴合物對陽痿兔模型的作用用Rompun和Ketavet麻醉紐西蘭白兔(其來自Yokneam，以色列)。此外耳靜脈注射戊巴比妥10mg/kg。通過大團注射戊巴比妥(5-10mg/kg)保持麻醉。在溫度可調節的環境下，將動物以仰臥姿勢置於手術臺上。刮去陰莖周圍區域的毛，將20G的針插入到海綿體的左或右側，並將導管連續到壓力轉換器上以便連續記錄海綿體內(i.c.)的壓力情況。所利用的轉換放大器是PM-1000型(裝有CWE)；系統1000電源(裝有CWE)；軟體DI 200 PGH/PGL(DATA Q Instrument Inc.)。當要求注射時，將另一根導管置於海綿體另一側以施用藥物，兩根導管均充滿了血液。用0.5ml 2％的肝素衝洗用於記錄血壓的導管。將海綿體內血壓升高以mmHg為單位用圖表表示。
圖30顯示經St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2注射後所獲得的海綿體壓力變化的初步結果。這裡10μg顯示提高的活性，且陰莖血壓上升至75mmHg(從15-20mmHg)，這表明通過直接注射這一綴合物也可影響陰莖勃起。
E．用於透皮施用的藥物組合物一種用Sefsol 318TM作載體的用於透皮施用的親脂偶聯肽的本發明軟膏組合物的例子，包括每1mg肽714μl 10％Sefsol 318TM(單辛酸甘油酯)和714μl 40％異丙醇(終濃度5％Sefsol,20％異丙醇和約0.7mg/ml肽)。
權利要求
1．一種偶聯了親脂組分的肽綴合物，其中所說的肽至少具有3個且至多具有12個胺基酸殘基，所說的綴合物選自下式(ⅰ)R1-X1-X1′-X1″-X2-NH-R2；(ⅱ)R1-X3-Ser-X4-Leu-Asn-NH-R2；
其中R1是H或親脂組分；R2是H，親脂組分，被X3-Ser-X4-Leu-Asn-NHR2所取代的親脂組分或與X1-X1′-X1″-X2-NHR2偶聯的由1-3個非荷電胺基酸殘基組成的間隔基團，其條件是R1和R2至少一個是親脂組分；X1是共價鍵，Ala,Val,Ala-Val,Val-Ala,L-Lys,D-Lys,Ala-Lys,Val-Lys,Ala-Val-Lys；Val-Ala-Lys或Orn；X1′是L-Lys,D-Lys或Orn；X1″是L-Tyr,D-Tyr,Phe,Trp或對氨基苯丙氨酸的殘基；X4是Ile或Tyr；X5是疏水脂肪族胺基酸的殘基；X2是X5,X5-Asn,X5-Ser,X5-Ile,X5-Tyr,X5-Leu,X5-Nle,X5-D-Ala,X5-Asn-Ser,X5-Asn-Ser-Ile,X5-Asn-Ser-Tyr,X5-Asn-Ser-Ile-Leu,X5-Asn-Ser-Tyr-Leu,X5-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或X5-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X3是共價鍵，Asn,X5,X5-Asn,Tyr-X5,Tyr-X5-Asn,Lys-X5,Lys-X5-Asn,Lys-Tyr-X5,Lys-Tyr-X5-Asn,Lys-Lys-Tyr-X5,Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn,或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5-Asn；X6是共價鍵或Asn,Ser,Ile,Tyr,Leu,Asn-Ser,Asn-Ser-Ile,Asn-Ser-Tyr,Asn-Ser-Ile-Leu,Asn-Ser-Tyr-Leu,Asn-Ser-Ile-Leu-Asn或Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn；X7是共價鍵或Asn；X8是共價鍵，X5,Tyr,Lys,Tyr-X5,Lys-X5,Lys-Tyr-X5,Lys-Lys-Tyr-X5,Val-Lys-Lys-Tyr-X5,Ala-Lys-Lys-Tyr-X5，或Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-X5；Z是-CONH-,-NHCO-,-S-S-,-S(CH2)tCO-NH-或-NH-CO(CH2)tS-；m當Z是-CONH-,-S-S-,或-S(CH2)tCO-NH-)時，m是1或2；當Z是-NH-CO-或-NH-CO(CH2)tS-時，m是2、3或4；n當Z是-NH-CO-,-S-S-，或-NH-CO(CH2)tS-時，n是1或2；當Z是-CONH-或-S(CH2)tCO-NH-時；n為2、3或4，並且t是1或2其條件是排除綴合物硬脂醯-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
2．按照權利要求1的綴合物，其中X5是選自Ala,Ile,Leu,Met,Val,Nva和Nle的D-或L-胺基酸的殘基。
3．按照權利要求1和2的綴合物，其中親脂組分R1選自至少具有5個碳原子的飽和或不飽和烴基或羧醯基。
4．按照權利要求3的綴合物，其中R1選自硬脂醯(St)，己醯基(Cap)和月桂醯(Lau)。
5．按照權利要求4的綴合物，其選自下組St-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-D-Ala-NH2；St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Asn-5er-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Nle-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Val-NH2；和St-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
6．按照權利要求4的綴合物，其選自下組St-Asn-Ser-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Asn-Ser-Ile-Tyr-Asn-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Pro-Pro-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2。
7．按照權利要求4的綴合物，其選自下組Lau-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；Cap-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Nle-NH2；St-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-NH2；St-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-NH2；St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-NH2；和St-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-NH2。
8．一種藥物組合物，其包含按照權利要求1的作為活性組分的綴合物，及藥學上可接受的載體。
9．一種用於治療性功能障礙的藥物組合物，其包含作為活性組分的選自按照權利要求5或6的綴合物及綴合物St-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn-NH2的綴合物，及藥學上可接受的載體。
10．按照權利要求9的藥物組合物，其用於治療男性陽痿。
11．按照權利要求9或10的藥物組合物，其適於透皮給藥。
12．按照權利要求11的藥物組合物，其中藥學上可接受的載體是1-單辛酸甘油酯。
13．按照權利要求8的藥物組合物，其用於治療神經變性疾病，並包含選自作為活性組分的按照權利要求5或7的綴合物的綴合物。
14．按照權利要求13的藥物組合物，其中神經變性疾病選自下列疾病老年痴呆症，唐氏綜合症，因局部缺血、中風、中樞和外周神經系統的遺傳疾病而造成的運動或認知機能衰退，因中樞或外周神經系統的損傷或與血液循環和神經元存活有關的神經元紊亂而造成的運動或認知機能的衰退。
15．按照權利要求13或14的藥物組合物，其適於鼻內給藥。
16．按照權利要求15的藥物組合物，其為鼻內噴霧劑。
全文摘要
本發明涉及具有3－12個胺基酸殘基的肽和親脂部分(它們位於肽的N－或C－端)的新綴合物。本發明進一步涉及包含所說新綴合物的藥物組合物,其能用於治療男性陽痿或治療神經變性疾病。
文檔編號A61K38/00GK1219938SQ97194970
公開日1999年6月16日 申請日期1997年4月18日 優先權日1996年4月23日
發明者I·谷茨斯, M·弗裡德金 申請人:維茲曼科學研究所耶達研究與開發有限公司, 拉莫特大學應用研究與工業開發有限公司