生產l－穀氨酸的細菌和生產l－穀氨酸的方法

2023-11-01 06:45:27

專利名稱:生產l－穀氨酸的細菌和生產l－穀氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及新的生產L穀氨酸的細菌和通過利用同樣細菌發酵生產L-穀氨酸的方法。L-穀氨酸是可作為食物，藥物和諸如此類的重要胺基酸。
背景技術：
通常L-穀氨酸已經利用所謂的生產L-穀氨酸的棒狀細菌通過發酵方法產生，該細菌原則上屬於短桿菌屬，棒狀桿菌，和微桿菌或它們的變異體(「胺基酸發酵」，Gakkai Shuppan中心，第195-215頁，1986)。至於通過利用其它細菌菌株發酵生產L-穀氨酸的方法，已知有利用芽孢桿菌，鏈黴菌，青黴菌和諸如此類的微生物的方法(美國專利號3,220,929)，利用假單孢菌，節桿菌，沙雷伯氏菌，念珠菌屬和諸如此類的微生物的微生物的方法(美國專利號3,563,857)，利用大腸桿菌的變異體菌株的方法(日本未審專利申請公開號(KOKAI)5-244970(1993))和諸如此類的方法。
雖然通過前面所述培育這樣的微生物或改善的生產方法已經相當大地提高L-穀氨酸的生產率，仍然需要開發更廉價和更有效的生產L-穀氨酸的方法，以便滿足將來對胺基酸的明顯增長的需要。

發明內容
本發明的目的是發現生產L-穀氨酸的能力高的新的生產L-穀氨酸細菌，從而開發生產L-穀氨酸的更廉價和更有效的方法。
為了達到前面的目的，本發明人廣泛地尋找和研究具有生產L-穀氨酸能力的微生物，這些微生物與過去報導的微生物不同。作為結果是，他們發現了某些起源於屬於克雷伯氏菌屬或歐文氏菌屬的微生物的菌株具有高的生產L-穀氨酸的能力，並且已經完成本發明。
所以，本發明提供(1)屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物並且具有生產L-穀氨酸的能力的微生物
(2)是植生克雷伯氏菌或草生歐文氏菌的上面(1)的微生物；(3)增加了催化L-穀氨酸生物合成反應的酶的活性的上面(1)或(2)中的微生物；(4)上面(3)中的微生物，其中催化L-穀氨酸生物合成的反應的酶至少選自包括檸檬酸合成酶(下面簡寫為「CS」)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下面簡寫為「PEPC」)，和穀氨酸脫氫酶(下面簡寫為「GDH」)中的一種；(5)上面(4)的微生物，其中催化L-穀氨酸生物合成的反應的酶包括CS，PEPC和GDH三者；(6)上面(1)到(5)中的任何一個的微生物，其中催化L-穀氨酸生物合成的分支反應途徑並且產生不是L-穀氨酸的化合物的酶的活性減少或缺乏；(7)上面(6)的微生物，其中催化L-穀氨酸生物合成的途徑的分支反應和生產不是L-穀氨酸的化合物的酶是α-酮戊二酸脫氫酶(下面簡寫為「αKGDH」)；(8)生產L-穀氨酸的方法，包括在液體培養基中培育如上面(1)到(7)的任何一個定義的微生物以便生產和在培養基中積累L-穀氨酸，並收集來自培養基的L-穀氨酸。
由於本發明的微生物具有高的生產L-穀氨酸的能力，通過利用前面已知的生產L-穀氨酸的棒狀細菌和諸如此類的培育技術使微生物具有更高的生產能力被認為是可能的，可以期望通過適當選擇培養條件和諸如此類能夠發展更廉價和更有效的生產L-穀氨酸的方法。



圖1顯示具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的質粒pMWCPG的構建。
圖2顯示了具有gdhA基因的質粒pMWG的構建。
圖3顯示了具有gltA基因的質粒pMWC的構建。
圖4顯示了具有廣譜寄主範圍的質粒RSF1010的複製原點和四環素抗性基因的質粒RSF-Tet的構建。
圖5顯示了具有廣譜寄主範圍的質粒RSF1010的複製原點，四環素抗性基因，gltA基因，ppc基因和gdhA基因的質粒RSFCPG的構建。
具體實施方式
下面將詳細解釋本發明。
可用於本發明的屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物的例子如下列出。
植生克雷伯氏菌土生克雷伯氏菌草生歐文氏菌(現在也劃分為成團泛菌)菠蘿歐文氏菌滅仙人掌歐文氏菌菊歐文氏菌野梧桐歐文氏菌桃色歐文氏菌番石榴歐文氏菌櫟歐文氏菌大黃歐文氏菌生紅歐文氏菌柳歐文氏菌噬夏孢歐文氏菌成團泛菌分散泛菌更優選地，可以提到下面列出的那些細菌菌株植生克雷伯氏菌AJ 13399草生歐文氏菌IAM1595(成團泛菌AJ2666)植生克雷伯氏菌AJ 13399於1998年2月19日保藏在通商產業省，工業技術院，生命工學工業技術研究所，接受的登記號是FERM P-16646，然後於1999年1月11日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，登記號是FERM BP-6616。已經劃分為草生歐文氏菌的微生物現在被劃分為成團泛菌。因此，草生歐文氏菌IAM1595被命名為成團泛菌AJ2666，並且於1999年2月25日保藏於通商產業省，工業技術院，生命工學工業技術研究所，根據布達佩斯條約進行國際保藏，登記號是FERM BP-6660。
植生克雷伯氏菌AJ 13399是在Sapporo-shi，Hokkaido，日本的土壤分離的菌株。
AJ13399的生理特性如下(1)細胞形態杆狀(2)遊動性沒有(3)孢子形成沒有(4)在LabM營養瓊脂培養基上菌落形態環狀，表面光滑，奶白色，規則，隆起，有光澤(5)葡萄糖OF測試發酵能力陽性(6)革蘭氏染色陰性(7)氧行為兼性厭氧菌(8)過氧化氫酶陽性(9)氧化酶陰性(10)脲酶陽性(11)細胞色素氧化酶陰性(12)β-半乳糖苷酶陽性(13)精氨酸脫水酶陰性(14)烏氨酸脫羧酶陰性(15)賴氨酸脫羧酶陽性(16)色氨酸脫氨酶陰性(17)Voges-Proskauer反應陽性(18)吲哚產生陽性(19)在TSI培養基中產生硫化氫陰性(20)檸檬酸同化能力陽性(21)間羥基苯甲酸同化能力陰性(22)明膠液化陰性(23)從糖產生酸葡萄糖陽性甘露醇陽性鼠李糖陽性阿拉伯糖陽性蔗糖陽性山梨醇陽性肌醇陽性蜜二糖陽性苦杏仁苷陽性阿東糖醇-腖-水陽性纖維二糖-腖-水陽性半乳糖醇-腖-水陰性棉籽糖-腖-水陽性(23)生長溫度在37℃生長很好，在45℃不能生長。
從這些細菌特性，確定AJ13399是植生克雷伯氏菌。
在細菌伯傑氏手冊，第9版中沒有描述草生歐文氏菌並且將已經劃分為草生歐文氏菌的微生物劃分為成團泛菌。因此，屬於歐文氏菌屬的微生物和屬於泛菌屬的微生物互相密切相關。因此，屬於歐文氏菌屬的任何微生物和屬於泛菌屬的任何微生物可用於本發明。
由屬於例如上面介紹的克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的任何細菌的通過Embden-Meyerhof途徑完成糖代謝，在這一途徑產生的丙酮酸在需氧條件下的三羧酸循環中氧化。通過GDH或穀氨醯胺合成酶/穀氨酸合成酶從三羧酸循環的中間產物α-酮戊二酸生物合成L-穀氨酸。所以，這些微生物擁有同樣的L-穀氨酸生物合成途徑，並且屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物包含在本發明的一個構思中。所以，除了特別上面提到的種類和菌株，屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的其它微生物也在本發明的範圍內。
本發明的微生物是屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬並且具有產生L-穀氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述「具有生產L-穀氨酸的能力」指具有在培養過程中在培養基中積累L-穀氨酸的能力。產生L-穀氨酸的能力可以是具有類似於野生型特性的能力，或通過育種授予的或加強的能力。屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬並且具有生產L-穀氨酸能力的微生物的例子包括例如催化L-穀氨酸生物合成反應的酶的活性增加了的這樣的微生物，和催化L-穀氨酸生物合成途徑的分支反應並且產生不是L-穀氨酸的化合物的酶的活性減少或缺乏的微生物。所述的微生物的例子進一步包括催化L-穀氨酸生物合成反應的酶的活性增加，和催化L-穀氨酸生物合成途徑的分支反應並且產生不是L-穀氨酸的化合物的酶的活性減少或缺乏的微生物。
作為催化L-穀氨酸的生物合成的反應的酶的例子，可以提到的是GDH，穀氨醯胺合成酶，穀氨酸合成酶，異檸檬酸脫氫酶，烏頭酸水合酶，CS，PEPC，丙酮酸脫氫酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸變位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，丙糖磷酸異構酶，果糖二磷酸醛縮酶，磷酸果糖激酶，葡糖磷酸異構酶和諸如此類。在這些酶中，CS，PEPC和GDH中的一個或兩個或三種是優選的。作為本發明的微生物，更加優選的是所有三種酶CS，PEPC和GDH的活性增加。是否微生物增加了靶酶的活性，活性增強的程度通過細菌細胞提取物或純化部分的酶活性的測量，並且將它與野生型菌株或親本菌株比較可以確定。
本發明的微生物，屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬，並且催化L-穀氨酸生物合成反應的酶的活性增強，例如這種微生物可以作為變異體獲得，其中在編碼該酶的基因中已經產生突變，或通過利用上面提到的微生物作為起始親本菌株的遺傳重組菌株獲得。
為了增強CS，PEPC或GDH的活性，例如，編碼CS，PEPC或GDH的基因可以克隆進入適當質粒，可以利用得到的質粒轉化作為寄主的前面提到的起始親本菌株。這可以增加編碼各個CS，PEPC和GDH的基因的拷貝數(下面分別簡寫為「gltA基因」，「ppc基因」，和「gdhA基因」)，結果，增強了CS，PEPC和GDH的活性。
將選自克隆的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的一種或兩種或三種以任何聯合導入上面提到的起始親本菌株。當導入兩或三種基因時，將這兩或三種基因克隆進入一種質粒，並且導入寄主，或者它們分別克隆進入兩或三種質粒，所述質粒可以在同一寄主中存在，並且導入寄主中。
對質粒沒有特別限制只要它能夠在屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物中自主複製。質粒的例子包括，例如，pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218和諸如此類。除了這些質粒，也可以使用噬菌體DNA載體。
通過例如，D.M.Morrison(酶學方法68，326(1979))的方法，利用氯化鈣增強受體細胞對DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學雜誌，53，159(1970))，或諸如此類的方法可以達到轉化。
CS，PEPC和GDH的活性也可以通過存在於作為寄主的起始親本菌株的染色體DNA上的gltA基因，ppc基因和/或gdh基因的多個拷貝增強。為了在屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物的染色體DNA中導入多個拷貝的gltA基因，ppc基因和/或gdhA基因，可以利用多個拷貝數的染色體DNA上的序列如重複DNA，和存在於轉座因子末端的倒轉重複。可選擇地，也可以將多個拷貝的基因導入染色體DNA，方法是利用攜帶gltA基因，ppc基因或gdhA基因的轉座子的轉座。這些技術可以增加轉化體細胞中的gltA基因，ppc基因，和gdhA基因的拷貝數，結果增強了CS，PEPC和GDH的活性。
可以利用任何生物體作為用於增加拷貝數的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的來源，只要生物體具有CS，PEPC和GDH活性。在這些生物體中，細菌，即原核生物，如那些屬於腸桿菌，克雷伯氏菌，歐文氏菌，泛菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒狀桿菌，短桿菌，或芽孢桿菌屬的細菌是優選的。作為特定的實例，可以提到大腸桿菌。從上面提到的這樣的微生物的染色體DNA可以得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。
通過分離補充缺乏CS，PEPC或GDH活性的變異體菌株的營養缺陷型的DNA片斷可以從前面提到的任何微生物的染色體DNA分別得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。可選擇地，因為已經闡明了埃希氏菌或棒狀桿菌屬的細菌的這些基因的核苷酸序列(生物化學，22卷，5243-5249，1983；生物化學雜誌，95卷，909-916，1984；基因，27卷，193-199，1984；微生物學，140卷，1817-1828，1994；分子遺傳學，218卷，330-339，1989；和分子微生物學，6卷，317-326，1992)，利用根據每個闡明的核苷酸序列合成的引物和染色體DNA作為模板，通過PCR可以獲得這些基因。
除了通過上面提到的基因擴增，通過增強gltA基因，ppc基因或gdhA基因的表達也可以增強CS，PEPC或GDH的活性。例如，通過利用另一個強啟動子替代gltA基因，PPc基因或者gdhA基因的啟動子增強表達。這樣的強啟動於的例子包括，例如lac啟動子，trp啟動子，trc啟動子，tac啟動子，λ噬菌體PR啟動子和PL啟動子和諸如此類。啟動子已經被替代的gltA基因，ppc基因，gdhA基因可以克隆進入質粒和導入寄主微生物，或利用重複DNA，倒轉重複，轉座子或諸如此類導入寄主微生物的染色體DNA。
通過利用另一個較強啟動子(參見WO87/03006，和日本來審專利申請公開號(KOKAI)，61-268183(1986))替代染色體上的gltA基因，ppc基因，gdhA基因的啟動子或在每個基因的編碼序列的上遊插入強啟動子(參見基因，29，231-241，1984)也可以增強CS，PEPC或GDH的活性。特定地說，通過在gltA基因，ppc基因，gdhA基因(這些基因的啟動子用強啟動子替代)或含有它們的一部分的DNA，和染色體上對應的基因之間的同源重組可以達到。
屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物的特定例子包括例如，植生克雷伯氏菌ATJ13399/RSFCPG，和草生歐文氏菌IAM1595/RSFCPG，其中這些微生物的CS，PEPC或GDH活性增強。
催化L-穀氨酸生物合成途徑的分支反應並產生不是L-穀氨酸的化合物的酶的例子包括例如，αKGDH，異檸檬酸裂合酶，磷酸乙醯轉移酶，乙酸激酶，乙醯羥酸合成酶，乙醯乳酸合成酶，甲酸乙醯轉移酶，乳酸脫氫酶，L-穀氨酸脫羧酶，1-吡洛啉脫氫酶和諸如此類。在這些酶中間，αKGDH是優選的。
為了在屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物中獲得上面提到的酶活性的下降和缺乏，可以通過常規誘變技術或遺傳工程技術在編碼該酶的基因中導入引起酶活性的下降或缺乏的突變。
誘變技術的例子包括例如，利用X-射線或紫外光輻射的方法，利用誘變試劑如N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍和諸如此類處理的方法。導入突變的基因的位置可以是編碼酶蛋白的編碼區或如啟動子的表達調節區。
遺傳工程技術的例子包括，例如遺傳重組，遺傳轉導，細胞融合和諸如此類。例如，在靶基因中插入藥物抗性基因以便產生功能失活的基因(缺陷基因)。然後，這一缺陷基因可以導入屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物的細胞，並且在染色體上的靶基因可以用缺陷基因通過同源重組替代(基因破壞)。
通過測量候選菌株的細菌細胞提取物或純化部分的酶活性，並且將它與野生型菌株或親本菌株的比較可以確定是否微生物降低了靶酶的活性或缺乏該活性，和該酶活性的降低程度。通過例如Reed等人的方法可以測量αKGDH酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶學方法，1969，13，p55-61)。
根據靶酶，可以在變異體的表現型的基礎上選擇靶變異體。例如，在含有葡萄糖的基本培養基或含有乙酸或L-穀氨酸作為唯一碳源的基本培養基上缺乏αKGDH活性或降低該活性的變異體不能生長，或顯示了明顯的在需氧條件下生長速率降低。但是，甚至在同樣條件下，通過在含有葡萄糖的基本培養基中加入琥珀酸或賴氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸可以展示出正常的生長。根據這些現象，可以選擇缺乏αKGDH活性或降低該活性的變異體。
在WO95/34672詳細敘述了通過同源重組生產缺乏αKGDH基因的產穀氨酸短桿菌菌株的方法，同樣的方法可以用於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的微生物。
另外，在分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)和諸如此類中詳細敘述了基因克隆，DNA切割和連接，轉化和諸如此類。
如上所述得到的缺乏αKGDH活性或降低該活性的變異體菌株的例子是植生克雷伯氏菌AJ13410。將植生克雷伯氏菌AJ13410於1998年2月19日保藏在通商產業省，工業技術院，生命工學工業技術研究所，接受的登記號RERM P-16647，然後按照布達佩斯條約在1999年1月11日轉為國際保藏，接受的登記號是FERM BP-6617。
屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬並且αKGDH活性降低或缺失該活性，或增加了如上所述獲得的CS，PEPC或GDH活性的那些細菌菌株具有在下文的實施例中顯示的產生L-穀氨酸的能力。
就屬於埃希氏菌的微生物而言，已經被劃分為克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬的腸細菌，已經已知αKGDH的活性減少或缺乏該活性的菌株可以產生L-穀氨酸(日本未審專利申請5-244970(1993))，αKGDH的活性減少或缺乏該活性的菌株並且PEPC和GDH活性增加了的菌株可以產生進一步提高產量的L-穀氨酸(日本未審專利申請7-203980(1995))，和顯示纈氨酸敏感性和具有CS和GDH的增加的活性的菌株可以產生L-穀氨酸(WO97/08294)。
就屬於腸桿菌屬的微生物而言，類似地被劃分為腸細菌，本發明人發現αKGDH的活性減少或缺乏該活性的菌株，或具有PEPC，CS和GDH的增加的活性的菌株可以產生L-穀氨酸(日本專利申請10-69068(1998))。
此外，如也是屬於沙雷伯氏菌的微生物，本發明人發現具有增加的PEPC和GDH和CS活性的菌株可以產生L-穀氨酸(日本專利申請10-69068(1998))。
根據該事實，可以預期除了描述於實施例的菌株以外，就屬於克雷伯氏菌，歐文氏菌，泛菌，埃希氏菌，腸桿菌或沙雷氏伯菌屬的細菌而言，αKGDH的活性減少或缺乏該活性的菌株，或具有PEPC，CS和GDH的增加的活性的菌株可以產生L-穀氨酸。如在實施例中證明的，強烈地支持事實通過缺失αKGDH使植生克雷伯氏菌AJ13399具有產生L-穀氨酸的能力這一事實可應用到克雷伯氏菌，歐文氏菌，泛菌屬的其它細菌。
通過培養屬於克雷伯氏菌，歐文氏菌，或泛菌屬並且具有在液體培養基中產生L-穀氨酸的能力的微生物在該培養基中產生和積累L-穀氨酸，並且從該培養基中收集L-穀氨酸。
培養基可以是如果需要，含有碳源，氮源，和無機鹽，以及有機營養如胺基酸，維生素，和諸如此類的普通營養培養基。這可以是合成培養基或天然培養基。任何碳源和氮源可以用於培養基，只要它們可以被培養的微生物利用。
碳源可以是糖，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麥芽糖，甘露糖，半乳糖，澱粉水解物，糖蜜和諸如此類。另外，有機酸如乙酸和檸檬酸也可以單獨利用或聯合其它碳源利用。
氮源可以是氨，銨鹽如硫酸銨，碳酸銨，氯化銨，磷酸銨，和乙酸銨，硝酸鹽和諸如此類。
作為微量有機營養，可以使用胺基酸，維生素，脂肪酸，核酸，含有它們的物質如蛋白腖，酪蛋白胺基酸，酵母提取物，和大豆蛋白質分解產物和諸如此類物質，並且當利用其生長需要胺基酸和諸如此類的營養缺陷型變異體時，必需補充需要的營養。
作為無機鹽，可以使用磷酸鹽，鎂鹽，鈣鹽，鐵鹽，錳鹽和諸如此類。
至於培養條件，可以在需氧條件下進行培養，溫度為20到42℃，pH為4到8。可以連續培養10小時到4天以便在液體培養基中積累相當量的L-穀氨酸。
在完成培養後，通過已知方法可以收集培養基中積累的L-穀氨酸。例如，通過包括在除去細胞後濃縮培養基以便結晶產物，離子交換層析和諸如此類的方法可以分離L-穀氨酸。
參考下面的實施例將更具體地說明本發明。
(1)構建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的質粒參考圖1，2和3將能夠解釋構建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的質粒的方法。
利用HindIII和SphI消化含有起源於大腸桿菌的gdhA基因的質粒pBRGDH(日本未審專利申請公開號(KOKAI)7-203980(1995))，通過T4DNA聚合酶處理將兩個末端平齊化。然後，純化和收集含有gdhA基因的DNA片斷。在另一方面，利用XbaI消化含有起源於大腸桿菌的gltA基因和ppc基因的質粒pMWCP(WO97/08294)，利用T4 DNA聚合酶處理將兩個末端平齊化。將這與含有上面純化的含有gdhA基因的DNA片斷混合，利用T4連接酶連接，得到質粒pMWCPG，該質粒對應於另外攜帶gdhA基因的pMWCP(附圖1)。
純化和回收利用HindIII和SalI消化pBRGDH得到的含有gdhA基因的DNA片斷，並導入質粒pMW219(從Nippon Gene購買)的HindIII-SalI位點，從而得到質粒pMWG(圖2)。此外，利用HindIII和EcoRI消化含有起源於大腸桿菌的gltA基因的質粒pTWVC(WO97/08294)，和純化和回收消化含有gltA基因的DNA片斷，並導入質粒pMW219的HindIII-EcoRI位點，從而得到質粒pMWC(圖3)。
在同一時間，將通過用NotI消化含有廣譜宿主範圍質粒RSF1010(日本未審專利申請公開號(KOKAI)8-047397(1996))的複製原點的質粒pVIC40，接著通過T4 DNA聚合酶處理和PstI消化得到的產物，和通過利用EcoT141消化pBR322，接著T4 DNA聚合酶處理和PstI消化得到的產物混合，並用T4連接酶連接以便得到含有RSF1010的複製原點和四環素抗性基因的質粒RSF-Tet(圖4)。
然後，利用EcoRI和PstI消化pMWCPG，純化和回收含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的DNA片斷。同樣，利用EcoRI和PstI消化RSF-Tet，純化和回收含有RSF1010的複製原點的DNA片斷。混合這些DNA片斷，利用T4連接酶連接以便得到由攜帶gltA基因，ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet組成的質粒RSFCPG(附圖5)。在缺乏gltA基因，ppc基因或gdhA基因的大腸桿菌菌株的營養缺陷型的補充和每種酶活性的測量的基礎上證實了得到的質粒RSFCPG表達gltA基因，ppc基因和gdhA基因。類似地，在缺乏gltA基因，或gdhA基因的大腸桿菌菌株的營養缺陷型的補充和每種酶活性的測量的基礎上證實了質粒pMWG或pMWC表達gdhA基因，或gltA基因。
(2)在克雷伯氏菌細菌和歐文氏菌(泛菌屬)細菌中導入RSFCPG，pMWC和pMWG，和評估L-穀氨酸生產率利用RSFCPG，pMWC和pMWG通過電穿孔轉化草生歐文氏菌IAM1595(成團泛菌AJ2666)，和植生克雷伯氏菌AJ13399(Miller J.H.，「細菌遺傳學的簡短方法，手冊」，冷泉港實驗室出版，美國，1992)以便得到展示四環素抗性的轉化體。
將每種得到的轉化體和親本菌株接種到50毫升體積的大小的試管，在試管中含有5毫升培養基，培養基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸銨，0.5克/升7水硫酸鎂，2克/升磷酸二氫鉀，0.5克/升氯化鈉，0.25克/升7水氯化鈣，0.02克/升四水硫酸亞鐵，0.02克/升四水硫酸錳，0.72毫克/升二水硫酸鋅，0.64毫克/升5水硫酸銅，0.72毫克/升六水氯化鈷，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水鉬酸納，2克/升酵母提取物，和30克/升碳酸鈣，並且在37℃振搖培養，直到在培養基中含有的葡萄糖耗盡。在轉化體的培養基中，加入25毫克/升的四環素。在完成培養後，測量培養基中積累的L-穀氨酸。結果表示在表1。
表1L-穀氨酸的積累量細菌菌株 L-穀氨酸的積累量IAM1595 0.0克/升IAM1595/RSFCPG 5.0AJ13399 0.0AJ13399/RSFCPG 3.1AJ13399/pMWC 2.5AJ13355/pMWG 0.8單獨培養基 0.2
儘管草生歐文氏菌IAM1595，和植生克雷伯氏菌AJ13399不積累L-穀氨酸，但通過導入RSFCPG擴增了CS，PEPC和GDH活性的菌株分別積累5.0克/升，3.1克/升L-穀氨酸。CS活性單獨擴增的AJ13399菌株積累2.5克/升L-穀氨酸，GDH活性單獨擴增的菌株也積累0.8克/升的L-穀氨酸。
(3)植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH部分基因片段的克隆利用各具有其核苷酸序列已經被報導的生物體即維涅蘭德固氮菌，枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，穀氨酸棒狀桿菌，流感嗜血菌，人和啤酒酵母(歐洲生物化學雜誌，第187卷，第235-239頁，分子遺傳性，第234卷，第285-296頁，1992；歐洲生物化學雜誌，141，351-359，1984；微生物學，142，3347-3354，1996；科學，第269卷，第496-512頁，1995；美國科學院年報，第89卷，第1963-1967頁，1992；和細胞分子生物學，第9卷，第2695-2705頁，1989)的αKGDH基因的同源區域的核苷酸序列和EcoRI位點的寡聚核苷酸作為引物進行PCR克隆具有植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH基因的一部分的片段。
特別是，將下列序列用作為引物。
(引物1)5』CCGGGAATTCGGTGACGTNAARTAYCA3』(SEQ ID NO1)(引物2)5』GGCGAATTCGGGAACGGGTASAGYTGYTC 3』(SEQ ID NO2)通過如常規使用的從大腸桿菌提取染色體DNA的同樣方法分離植生克雷伯氏菌AJ13399的染色體DNA用作PCR模板(Seibutsu KogakuJikken-sho(生物工程實驗教科書)，發酵和生物工程協會編輯，日本，97-98，Baifukan，1992)。
進行PCR的循環包括94℃，1分鐘，50℃，1分鐘，和73℃進行3分鐘，重複30個循環，和用EcoRI消化獲得的DNA片段並且插入到已經用EcoRI消化的載體質粒pT7Blue以獲得重組質粒pT7KP。所使用的載體質粒pT7Blue(氨苄青黴素抗性)是來源於Novagen的商品。
克隆的片段的DNA核苷酸序列和由該序列編碼的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO3。相同的胺基酸序列單獨表示在SEQ ID NO4。該序列顯示與大腸桿菌的αKGDH-E1亞單位基因有82.3％的同源性(下文稱之為「sucA基因」)，已經被認作為植生克雷伯氏菌AJ13399的sucA基因的一部分。在顯示於SEQ ID NO3的核苷酸序列中，核苷酸編號18-1659來源於sucA基因，核苷酸編號0-17和1660-1679來源於引物。
(4)獲得起源於植生克雷伯氏菌AJ13399的αKGDH缺陷菌株利用具有如上所述獲得的植生克雷伯氏菌的sucA基因的一部分的片段，通過同源重組獲得植生克雷伯氏菌的缺乏αKGDH的菌株。
首先，利用BstEII消化pT7KP，在這一裂解位點，將從質粒pNEO(從Pharmacia購買)經過PCR克隆的並且在其兩個末端導入了BstEII位點的卡那黴素抗性基因片段導入以獲得質粒pT7KPKm，其中卡那黴素抗性基因插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分。
用於克隆卡那黴素抗性基因的引物如下。
(引物3)5』TACTGGGTCACCTGACAGCTTATCATCGAT3』(SEQ ID NO5)(引物4)5』CGTTCGGTGACCACCAAAGCGGCCATCGTG3』(SEQ ID NO6)然後，用KpnI裂解pT7KPKm，在該裂解位點，將從質粒pBR322(從Takara Shuzo購買)經過PCR克隆的並且在其兩個末端導入了KpnI位點的四環素抗性基因片段導入以獲得質粒pT7KPKmTc，其中卡那黴素抗性基因與插入的側面四環素抗性基因一起插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分。
用於克隆四環素抗性基因的引物如下。
(引物5)5』GGGGTACCCAAATAGGCGTATCACGAG3』(SEQ ID NO7)(引物6)5』GGGGTACCCGCGATGGATATGTTCTG3』(SEQ ID NO8)隨後，用SacI和XbaI消化質粒pT7KPKmTc，以去除具有與插入的側面四環素抗性基因一起插入到植生克雷伯氏菌的sucA基因的中央部分的卡那黴素抗性基因的DNA片段，並且將它插入到插入了革蘭氏陰性細菌染色體的質粒載體pGP704(Marta Herrero等人，細菌學雜誌，1990，172，p6557-6567)，所述質粒已經用SacI和XbaI消化以獲得質粒pUTONOTK。
利用如上所述獲得的質粒pUTONOTK，通過電擊穿轉化植生克雷伯氏菌AJ13399，和基於四環素抗性和卡那黴素抗性，選擇其中通過sucA基因片段的同源重組將質粒pUTONOTK插入到染色體的菌株。從該菌株，基於四環素的敏感性和卡那黴素抗性進一步獲得了失去sucA的植生克雷伯氏菌AJ13410菌株，其中用已經在中央部分插入了卡那黴素抗性基因的sucA基因替代染色體上的sucA基因。
為了證實如上所述獲得的AJ13410菌株缺乏αKGDH活性，通過Reed的方法確定它的酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶學方法1969，13，p55-61)。結果，如表2所示，在AJ13410菌株中不能檢測到αKGDH活性，從而證實該菌株缺乏需要的sucA。
表2αKGDH活性細菌菌株 αKGDH活性(ΔABS/分鐘/毫克蛋白質)AJ13399 0.101AJ13410 ＜0.002(5)評估缺乏αKGDH的植生克雷伯氏菌的L-穀氨酸生產率在含有20毫升培養基的500毫升體積燒瓶中接種AJ13399和AJ13410菌株，該培養基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸銨，0.5克/升7水硫酸鎂，2克/升磷酸二氫鉀，0.5克/升氯化鈉，0.25克/升7水氯化鈣，0.02克/升7水硫酸亞鐵，0.02克/升四水硫酸錳，0.72毫克/升二水硫酸鋅，0.64毫克/升五水硫酸銅，0.72毫克/升六水氯化鈷，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水鉬酸納，2克/升酵母提取物，30克/升碳酸鈣，200毫克/升L-賴氨酸單鹽酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和DL-α，ε-二氨基庚二酸(DAP)，在37℃振搖培養直到培養基中含有的葡萄糖耗盡。在完成培養後，測量在培養基中積累的L-穀氨酸和α-酮戊二酸(下文中簡寫為「αKG」)。表3顯示了結果。
表3L-穀氨酸和αKG的積累量細菌菌株 L-穀氨酸的積累量 αKG的積累量AJ13399 0.0克/升 0.0克/升AJ13410 12.8 1.5缺乏αKGDH活性的AJ13410菌株積累12.8克/升L-穀氨酸，同時積累了1.5克/升αKG。
(6)在缺乏αKGDH的植生克雷伯氏菌中導入RSFCPG和評估L-穀氨酸的生產率利用RSFCPG轉化AJ13410，將獲得的RSFCPG導入得到的菌株，AJ13410/RSFCPG接種到500毫升體積的燒瓶，該燒瓶含有20毫升培養基，該培養基中包括40克/升葡萄糖，20克/升硫酸銨，0.5克/升7水硫酸鎂，2克/升磷酸二氫鉀，0.5克/升氯化鈉，0.25克/升7水氯化鈣，0.02克/升7水硫酸亞鐵，0.02克/升四水硫酸錳，0.72毫克/升二水硫酸鋅，0.64毫克/升五水硫酸銅，0.72毫克/升六水氯化鈷，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水鉬酸納，2克/升酵母提取物，25毫克/升四環素，30克/升碳酸鈣，200毫克/升L-賴氨酸單鹽酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和DL-α，ε-DAP，並在37℃振搖培養直到在培養基中含有的葡萄糖耗盡。在完成培養後，測量在培養基中積累的L-穀氨酸和αKG。表4顯示了結果。
表4L-穀氨酸和αKG的積累量細菌菌株 L-穀氨酸的積累量 αKG的積累量AJ13410 12.8克/升 1.5克/升AJ13410/RSFCPG 24.2 0.0在通過導入RSFCPG擴增CF，PEPC和GDH活性的菌株中，αKG的積累量減少了，L-穀氨酸的積累量進一步提高。
序列表110Ajinomoto Co.，Inc.
120生產L-穀氨酸的細菌和生產L-穀氨酸的方法130
150JP 10-691061511998-03-18150JP 10-2249091511998-08-071608170PatentIn Ver.2.0210121127212DNA213人工序列220
221特徵222(19)223n＝a或c或g或t220
223人工序列的描述引物4001ccgggaattc ggtgacgtna artayca 27210221129212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4002ggcgaattcg ggaacgggta sagytgytc 2921032111679212DNA213植生克雷伯氏菌220
221CDS222(1)..(1679)4003ggt gac gtg aaa tat cac atg ggc ttc tct tct gac atg gaa acc gaa 48Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu1 5 10 15ggc ggc ctg gtg cac ctg gcg ctg gcg ttt aac ccg tca cac ctc gaa 96
Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu20 25 30atc gtc agc ccg gtg gtt atc ggg tcg gtt cgc gcg cgt ctc gat cgt 144Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg35 40 45ctc gac gag ccg agc agc aat aaa gtg ctg ccg att act atc cac ggc 192Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly60 55 60gac gcc gca gtg acg ggt cag ggc gtg gtt cag gaa acc ctg aac atg 240Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met65 70 75 80tcc aag gcg cgt ggc tac gaa gtg ggc gga acc gta cgt atc gtt atc 288Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile85 90 95aac aac cag gtg ggc ttc act acc tcg aac ccg ctg gat gcg cgc tcc 336Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser100 105 110acg cca tac tgc acc gat atc ggt aaa atg gtt cag gcg ccg atc ttc 384Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe115 120 125cac gtg aac gcg gac gat ccg gaa gcc gtt gct ttc gtt acc cgc ctg 432His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu130 135 140gcg ctg gat ttc cgt aat acc ttc aaa cgc gat gtc ttc atc gac ctg 480Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu145 150 155 160gtg tgc tac cgc cgt cac ggc cat aac gaa gcc gac gag ccg agc gca 528Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu pro Ser Ala165 170 175acg cag ccg ctg atg tat cag aaa atc aaa aaa cat ccg acc ccg cgc 576Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr pro Arg180 185 190aaa atc tac gcc gac aaa ctt gag cag gac aaa gtg tcg acc ctg gaa 624Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu195 200 205gat gcg acc gaa ctg gtt aac ctc tat cgt gat gcg ctg gat gcc ggc 672Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly210 215 220gaa tgc gtg gtt gag gaa tgg cgt ccg atg aac ctg cac tcc ttt acc 720Glu Cys Val Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr225 230 235 240tgg tca ccg tac ctc aac cac gag tgg gat gag agc tac ccg agt aaa 768Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys245 250 255gtc gag atg aaa cgt ctg cag gag ctg gct aaa cgc att agc act gtg 816Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val260 265 270
ccg gac agc att gaa atg cag tct cgc gtg gcg aag att tat ggc gat 864Pro Asp Ser Ile Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp275 280 285cgc cag gcg atg gcc gcc ggc gag aag ctg ttc gac tgg ggg gcg gcg 912Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala290 295 300gaa aac ctg gct tac gcc acg ctg gtt gat gaa ggg att ccg att cgc 960Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg305 310 315 320ctg tcc ggt gaa gac tcc ggt cgc ggt acg ttc ttc cac cgc cat tcc 1008Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser325 330 335gtg att cat aac cag gtg aac ggt tcg acc tac acg ccg ctg cag cat 1056Val Ile His Asn Gln Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His340 345 350gtg cat aac ggc cag gag cat ttc aaa gtc tgg gac tcc gtg ctt tct 1104Val His Asn Gly Gln Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser355 360 365gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttc gaa tac ggc tac gcc act gcg gaa ccg 1152Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro370 375 380cgc acc ctg act atc tgg gaa gcg cag ttc ggt gac ttt gct aac ggc 1200Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly385 390 395 400gct caa gtg gtg atc gat cag ttc atc agc tcc ggc gag cag aag tgg 1248Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp405 410 415ggc cgg atg tgt ggc ctg gtc atg ctg ctg ccg cac ggc tac gaa ggc 1296Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly420 425 430cag ggc ccg gag cac tcc tcc gcg cgt ctg gaa cgc tat ctg cag ctg 1344Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu435 440 445tgt gct gaa cag aat atg cag gtt tgt gtg cca tcg act ccg gct cag 1392Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln450 455 460gtt tac cac atg ctg cgt cgt cag gcg ctg cgc ggt atg cgt cgt ccg 1440Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro465 470 475 480ctg gtg gtg atg tcg ccg aaa tct ctg ctg cgc cat ccg ctg gcg gtc 1488Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val485 490 495tcc agc ctg gac gag ctg gcg aac ggc acc ttc ctg ccg gcc atc ggt 1536Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly500 505 510gaa atc gat gac ctc gac ccg aaa gcg gtg aag cgt gtt gtc ctg tgc 1584Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Ala Val Lys Arg Val Val Leu Cys
515 520 525tct ggt aag gtt tat tac gat ctg ctg gaa caa cgc cgt aag aac gac 1632Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asp530 535 540caa aaa gat gtc gct atc gtg cgt ata gaa caa ctg tac ccg ttc cc 1679Gln Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe545 550 5652104211559212PRT213植生克雷伯氏菌4004Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser Asp Met Glu Thr Glu1 5 10 15Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn Pro Ser His Leu Glu20 25 30Ile Val Ser Pro Val Val Ile Gly Ser Val Arg Ala Arg Leu Asp Arg35 40 45Leu Asp Glu Pro Ser Ser Asn Lys Val Leu Pro Ile Thr Ile His Gly50 55 60Asp Ala Ala Val Thr Gly Gln Gly Val Val Gln Glu Thr Leu Asn Met65 70 75 80Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val Arg Ile Val Ile85 90 95Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu Asp Ala Arg Ser100 105 110Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln Ala Pro Ile Phe115 120 125His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe Val Thr Arg Leu130 135 140Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val Phe Ile Asp Leu145 150 155 160Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp Glu Pro Ser Ala165 170 175Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His Pro Thr Pro Argl80 185 190Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Asp Lys Val Ser Thr Leu Glu195 200 205Asp Ala Thr Glu Leu Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Asp Ala Gly210 215 220Glu Cys Val Val Glu Glu Trp Arg Pro Met Asn Leu His Ser Phe Thr225 230 235 240Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Ser Tyr Pro Ser Lys245 250 255Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg Ile Ser Thr Val260 265 270
Pro Asp Ser Ile Glu Met Gln Ser Arg Val Ala Lys Ile Tyr Gly Asp275 280 285Arg Gln Ala Met Ala Ala Gly Glu Lys Leu Phe Asp Trp Gly Ala Ala290 295 300Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu Gly Ile Pro Ile Arg305 310 315 320Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe Phe His Arg His Ser325 330 335Val Ile His Asn Gln Val Asn Gly Ser Thr Tyr Thr Pro Leu Gln His340 345 350Val His Asn Gly Gln Glu His Phe Lys Val Trp Asp Ser Val Leu Ser355 360 365Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Pro370 375 380Arg Thr Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp Phe Ala Asn Gly385 390 395 400Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser Gly Glu Gln Lys Trp405 410 4l5Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro His Gly Tyr Glu Gly420 425 430Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu Arg Tyr Leu Gln Leu435 440 445Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro Ser Thr Pro Ala Gln450 455 480Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg Gly Met Arg Arg Pro465 470 475 480Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg His Pro Leu Ala Val485 490 495Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Thr Phe Leu Pro Ala Ile Gly500 505 510Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Lys Ala Val Lys Arg Val Val Leu Cys515 520 525Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln Arg Arg Lys Asn Asp530 535 540Gln Lys Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln Leu Tyr Pro Phe545 550 555210521130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4005tactgggtca cctgacagct tatcatcgat 302106
21130212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4006cgttcggtga ccaccaaagc ggccatcgtg 30210721127212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4007ggggtaccca aataggcgta tcacgag 27210821126212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4008ggggtacccg cgatggatat gttctg 26
權利要求
1.生產L-穀氨酸的方法，包括在液體培養基中培養一種微生物，以便在培養基中產生和積累L-穀氨酸，並從培養基中收集L-穀氨酸，其中所述微生物屬於克雷伯氏菌屬，並且具有至少一種下述性質(a)所述微生物的一種選自檸檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和穀氨酸脫氫酶的酶活性增加；和(b)所述微生物的α-酮戊二酸脫氫酶活性降低或缺乏。
2.權利要求
1的方法，其中所述微生物屬於克雷伯氏菌屬，並且具有至少一種下述性質(a)所述微生物的檸檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和穀氨酸脫氫酶的活性全部增加；和(b)所述微生物的α-酮戊二酸脫氫酶活性降低或缺乏。
3.權利要求
1或2的方法，其中所述微生物是植生克雷伯氏菌。
專利摘要
生產L－穀氨酸的方法，包括在培養基中培養屬於克雷伯氏菌屬，歐文氏菌屬或泛菌屬並且具有生產L－穀氨酸能力的微生物，並且從該培養基中收集產生的L－穀氨酸。所使用的微生物菌株優選的是催化L－穀氨酸生物合成途徑的分支反應並且產生不是L－穀氨酸的化合物的酶的活性減少或缺乏，或催化L－穀氨酸生物合成反應的酶的活性增加的菌株。
文檔編號C12N9/88GKCN1626667SQ200410056668
公開日2005年6月15日 申請日期1999年3月18日
發明者守屋美加, 泉井裕, 小野榮治, 松井和彥, 伊藤久生, 原吉彥 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan