抗褐飛蝨主基因Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法
2023-12-10 04:07:11 1
抗褐飛蝨主基因Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法
【專利摘要】本發明公開了抗褐飛蝨主基因Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法。本發明開發設計的Bph27緊密連鎖分子標記引物B471和B58，能夠在抗褐飛蝨供體親本Balamawee與感蟲秈稻品種擴增出差異片段。通過Bph27基因位點的分子標記實現了抗褐飛蝨基因Bph27的遺傳轉育，可準確而快速地導入所需要的片段，大大提高Bph27的選擇效率，並育成抗褐飛蝨秈稻新品系991RB。
【專利說明】抗褐飛蝨主基因 Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於分子遺傳學領域，涉及抗褐飛蝨主基因 Bph27轉育秈稻品種的分子標 記方法。
【背景技術】
[0002] 褐飛風（Nilaparvata lugens Stdl )又稱褐稻風，是一種世界著名的遷飛性害蟲， 是水稻的主要害蟲之一，嚴重影響水稻的產量及其品質。近年來，每年危害面積達2億畝以 上，2005年以來更是連年大發生。2005年，我國稻飛蝨危害面積達3. 86億畝，2006、2007年 發生面積達5億畝次。迄今，主要的防蟲措施是使用化學殺蟲劑，而長期大量使用化學殺蟲 劑不但使環境日趨惡化，嚴重危害人類健康，也促使害蟲對化學殺蟲劑產生抗性，從而危及 到生物多樣性，破壞生態平衡。因此，改變化學農藥為主的防蟲策略，尋求新的抗蟲途徑勢 在必行。抗蟲品種的應用通常被認為是最為經濟有效的防治措施。
[0003] 二十世紀六十年代以後，亞洲各稻區相繼暴發的褐飛蝨為害促使遺傳學家和育種 家著手篩選和利用抗褐飛蝨種質資源，進行抗褐飛蝨新基因的挖掘和利用，選育抗褐飛蝨 水稻品種。目前，已經鑑定出28個抗褐飛蝨主基因。目前發掘並定位的一些抗褐飛蝨基 因，大多數都來源於野生稻或一些農藝性狀相對較差的地方品種，直接利用比較困難，在一 定程度上限制了抗褐飛蝨基因的育種利用。所以，首先應當將野生稻或地方品種中的抗褐 飛蝨基因轉育到優良的栽培品種中，創造一些優異的抗褐飛蝨水稻種質，為抗褐飛蝨育種 提供中間材料，才能提高抗褐飛蝨育種的效率。
[0004] 雖然在過去的幾十年裡也相繼培育了一些抗褐飛蝨水稻品種，如IRRI推出了具 有Bphl基因的抗蟲品種IR26,含有bph2的IR36,具有Bph3的IR56等。但由於褐飛蝨對 抗蟲品種具有極強的適應能力，抗蟲品種推廣後，褐飛蝨很快就形成適應抗蟲品種的種群， 導致品種抗性喪失。褐飛蝨群體內存在高度的個體差異是褐飛蝨對抗蟲品種具有極強適 應性的關鍵所在，如將分布於菲律賓5個不同地理區域的褐飛蝨種群分別在具有不同抗蟲 基因的品種上飼養時發現，每個群體內均有一些個體能夠在抗蟲品種上存活和產卵。這意 味著當一個新育成的抗蟲品種在田間種植時，大多數褐飛蝨個體因不能適應而死亡，但有 少數個體能夠正常生存和繁殖下一代，由於後代與親本取食能力相似，群體的平均生存力 和繁殖力將隨著世代的增加而增加，最終形成能夠在抗蟲品種上快速繁殖的褐飛蝨種群。 1973年，具有Bphl基因的抗蟲品種IR26推出以後，在所有種植該品種的國家和地區，褐飛 蝨種群數量明顯下降，然而不到兩年的時間，該品種抗性退化，褐飛蝨種群又顯著上升，並 在IR26等具有Bphl抗性基因的品種上暴發；1976年，IRRI又推出了 IR36等具bph2抗性 基因的品種，又一次使褐飛蝨種群數量下降，但數年後在具bph2抗性基因的品種上又暴發 了褐飛蝨危害。因而迫切需要培育新的抗蟲品種。褐飛蝨生物型的變異性和抗蟲性鑑定的 複雜性導致常規育種手段效率較低，抗蟲育種進展緩慢。為此，利用與目標基因緊密連鎖的 分子標記聚合抗蟲基因並結合常規育種手段，選育持久抗性品種將成為抗褐飛蝨育種的趨 勢。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是：提供了抗褐飛蝨主基因 Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法， 屬於分子遺傳學領域。本發明開發設計的Bph27緊密連鎖分子標記引物B471和B58,能夠 在抗褐飛蝨供體親本Balamawee與感蟲秈稻品種擴增出差異片段。通過Bph27基因位點的 分子標記實現了抗褐飛蝨基因 Bph27的遺傳轉育，可準確而快速地導入所需要的片段，大 大提高Bph27的選擇效率，促進Bph27在的利用。
[0006] 本發明的目的可通過以下技術方案實現：
[0007] 抗褐飛蝨主基因 Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法，用分子標記引物B471或者 分子標記引物B58對抗褐飛蝨位點Bph27進行分子標記：用分子標記引物B471擴增抗褐飛 風水稻品種Balamawee及其轉育的抗褐飛風材料的DNA，獲得Bph27位點標記片段大小約為 130bp ;擴增感蟲秈稻品種DNA，獲得標記片段大小約為120bp ;用分子標記引物B58擴增抗 褐飛風水稻品種Balamawee及其轉育的抗褐飛風材料的DNA，獲得Bph27位點標記片段大小 約為88bp ;擴增感蟲秈稻品種DNA，獲得標記片段大小約為118bp ;其中分子標記引物B471 左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子標記引物B58 左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0008] 用於標記抗褐飛蝨主基因 Bph27的分子標記引物，選自分子標記引物B471或分子 標記引物B58中的任意一種，分子標記引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端 引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子標記引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端 引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0009] 本發明所述的分子標記引物在培育抗褐飛蝨的新品系中的應用。
[0010] 所述的應用優選包括以下步驟：
[0011] 用抗褐飛風地方品種Balamawee與秈稻品種9311雜交，得到雜交F1，以雜種F 1作 母本，用9311作輪迴親本，得到回交群體BC1F1，從BC 1F1開始在苗期就用權利要求2所述的 引物對Bph27位點的標記B471和B58進行檢測，BC 1F1含有Bph27位點的株系，在開花期就 作母本與背景親本9311雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC 5F1世代，自交獲得 BC5F2群體，通過分子標記方法，獲得B471和B58位點純合的單株，由該單株自交得到一個 穩定的秈稻新品系，進一步通過苗期及全生育期的褐飛蝨抗性鑑定，獲得攜帶抗褐飛蝨基 因 Bph27並穩定抗褐飛風的新品系。
[0012] 所述的應用還優選包括：將獲得攜帶抗褐飛蝨基因 Bph27並穩定抗褐飛蝨的新品 系與秈稻、粳稻以及育種上正在利用的常規品種配製雜交種及選育常規品種的應用方法。
[0013] 有益效果
[0014] (1)通過本發明獲得與來源於秈稻品種Balamawee抗褐飛風位點Bph27緊密連鎖 的分子標記。並通過大量標記的開發與篩選，獲得了 Balamawee與9311等秈稻品種間具有 多態性的分子標記B471和B58。
[0015] (2)通過本發明可對Bph27抗褐飛蝨位點進行秈稻品種的分子標記轉育，選擇的 片段位置明確，鑑定方便，準確可靠。該方法檢測方便快速，不受環境影響。
[0016] (3)本發明開發設計的Bph27緊密連鎖分子標記引物B471和B58,能夠在抗褐飛 蝨供體親本Balamawee與感蟲秈稻品種擴增出差異片段。通過Bph27基因位點的分子標 記實現了抗褐飛蝨基因 Bph27的遺傳轉育，可準確而快速地導入所需要的片段，大大提高 Bph27的選擇效率，促進Bph27在的利用。
[0017] (4)輔助育種選擇目標明確，節約成本。在抗褐飛蝨傳統育種方法中，首先要種植 較大的次級分離群體，需要投入大量的人力，物力和財力。其次，育種的周期長，一個常規品 種的選育需要8-10年。再次，褐飛蝨抗性鑑定的工作量大，可靠性差。而通過早期的育性 位點的分子標記選擇，可以在較小的分離群體中，通過緊密連鎖分子標記的檢測，在苗期就 能鑑定出攜帶抗褐飛蝨基因的的單株，淘汰其它植株，不僅節約生產成本而且大大提高選 擇效率。通過此方法，抗褐飛蝨秈稻品系991RB只用了 4年時間就被選育出來了，較常規的 育種方法提前4年時間。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1利用Bph27位點緊密連鎖分子標記B471進行單株選擇。M為Marker ;1 :抗蟲 親本Balamawee ;2,感蟲受體親本9311 ;3-12,感褐飛蝨單株；13-24 :抗褐飛蝨單株。
[0019] 圖2利用Bph27位點緊密連鎖分子標記B58進行單株選擇。M為Marker ;1 :抗蟲 親本Balamawee ;2,感蟲受體親本9311 ;3-12,感褐飛蝨單株；13-24 :抗褐飛蝨單株。
[0020] 圖3抗褐飛蝨秈稻品系991RB的苗期褐飛蝨抗性鑑定。
[0021] 圖4抗褐飛蝨秈稻品系991RB的全生育期褐飛蝨抗性鑑定。
【具體實施方式】
[0022] 材料與方法：
[0023] ( -）材料及群體構建
[0024] 抗褐飛蝨品種Balamawee與02428雜交獲得的F1，自交獲得一個包含135個單株 的F 2初級分離群體，以及每個F2單株通過自交獲得的相應的F2:3家系。進一步擴大遺傳群 體，利用一個包含有18308個單株的Balamawee/02428的F 2分離群體進行Bph27的精細定 位。
[0025] (二）表型鑑定
[0026] 蟲源最初採自南京近郊的水稻田，並已在臺中本地1號（TNl)上飼養了 10代以 上。在本研究中，褐飛蝨在TNl上繁殖，以提供鑑定所需蟲源。飼養在南京農業大學的溫室 內。注意防天敵和螞蟻。
[0027] 採用苗期集團測定法進行BalamaweejZAZSJi單株和135個F2:3家系的抗蟲性測 定。為確保各家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系分別播種於一 個直徑8cm、高8cm，盛滿實驗用土的營養缽中（營養缽底部有一小孔，便於滲透吸水）。每 28個營養缽（包括親本、抗蟲對照和感蟲對照各一缽）置於一個65cmX44cmX 14cm的塑料 箱內（箱內保持水層2cm左右）。每個營養缽播種35粒發芽種子。7天左右間苗，淘汰病弱 苗，保留30株整齊劃一的水稻苗。每個家系種植兩個重複。待苗長到兩葉一心時，按8-10 頭/苗的比例接入2?3齡褐飛蝨若蟲。當感蟲親本TNl全部枯死時，參照IRRI(1988)和 Athwal et al. (1971)的方法，對每個單株進行0-9級評級。通過加權平均計算各家系（品 種）抗蟲指數。
[0028](二）分子標記分析及連鎖分析
[0029] DNA樣品的製備參照Dellaporta等（1983)的方法。提取的DNA溶解在TE緩衝液 裡（IOmM Tris base, 0· ImM EDTA)，用 MBA 2000UV/VIS 分光光度計（Perkin Elemer Co.) 進行DNA質量和濃度檢測。每份DNA均用dd H20稀釋成20ng/ μ 1的濃度，作為PCR分析 的模板。
[0030] SSR分析參照 Chen et al (1997)的程序。10 μ 1 反應體系包括：IOmM Tris-HCl pH 8·3,50mMKCl，l·5mMMgC12,50μMdNTPs，0·2μM引物，0·5UTaqpolymerase(TaKaRa，大 連）和 20ng DNA模板。擴增反應在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR儀上進行：94°C 4min ; 94°C lmin, 55°C lmin，72°C I. 5min，35 個循環；72°C 7min。擴增產物用 8% 的非變性 PAGE 膠分離，通過銀染顯色。
[0031] 利用本實驗室現有的均勻分布於水稻12條染色體上的SSR標記對親本Balamawee 和02428進行多態性檢測，然後用在親本間具有多態性差異的標記對F2群體進行初步連 鎖分析，初篩得到的連鎖標記進一步利用F 2定位群體進行分子標記基因型的分析，並對所 得數據利用MAPMAKER/3. 0分析軟體進行褐飛蝨抗性與SSR標記的分離分析（Lander et al. 1987)。並將Kosambi函數轉換為遺傳距離（cM)，繪製連鎖圖譜。根據重組單株的信息 將基因定位在位置固定的分子標記之間，實現基因的染色體的初步定位。
[0032] (三）Bph27的分子標記輔助選擇利用
[0033] 用抗褐飛蝨地方品種Balamawee與秈稻品種9311雜交，得到雜交Fl，以雜種Fl作 母本，用9311作輪迴親本，得到回交群體BC 1F1，從BC1F1開始在苗期就用Bph27位點的標記 B471和B58進行檢測，BC1F1含有Bph27位點的株系，在開花期就作母本與背景親本9311雜 交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC5F1世代，自交獲得BC 5F2群體，通過分子標記 方法，獲得B471和B58位點純合的單株，由該單株衍生得到一個穩定的秈稻新品系，進一步 通過苗期及全生育期的褐飛蝨抗性鑑定。
[0034] 結果與分析：
[0035] 苗期集團測定顯示Balamawee和02428的危害級別分別為0和8. 3,這表明 Balamawee極抗褐飛蝨而02428感褐飛蝨。F1植株的危害級別為0. 7,對褐飛蝨表現高抗。 這表明Balamawee的抗蟲性由顯性基因控制。
[0036] 135個F2:3家系進行抗褐飛蝨表型鑑定，危害級別頻率分布呈連續分布，最小為0， 最大為9,危害級別〈3為高抗，>7為高感，大於等於3小於等於7為中抗。135個F 2:3家系 表現型可以根據其對褐飛蝨的危害級別分為抗蟲、抗感分離和感蟲三種類型，而相應的F2 單株的基因型則由相應F2:3家系的表型值推測得到，分別為記為RR(純合抗蟲）、Rr (雜合 抗蟲）和rr (純合感蟲）三種。135個F2:3家系的抗感分離為32:67:36。卡方測驗表明,F2 群體對褐飛風的抗感分離符合1:2:1的比例（X2atl5 = 0. 249 < 5. 99)。這表明Balamawee 的抗褐飛蝨的表型是由一個顯性單基因控制的。
[0037] 連鎖分析發現位於第四染色體長臂上的SSR標記B5742與褐飛蝨抗性表型顯著相 關。進一步選用位於B5742周圍且在親本間具有多態的其他SSR標記進行連鎖分析，構建連 鎖圖譜。將Balamawee中的抗褐飛蝨基因定位在B471和B5742之間，分別與之相距18. 2cM 和 4. 7cM。
[0038] 進一步在初定位區間根據Nipponbare和93-11的序列自行開發了一些基於PCR 的InDel標記共有13個。先利用1172個F2單株在B471和B5742SSR標記間篩選到了 46 個交換單株，結合表型數據和重組數據進一步將該基因鎖定在j20690和B13之間。利用這 兩個標記對17136個&群體進行PCR分析，得到了 117株重組個體。利用這117株重組個 體，結合表型數據和重組數據該基因鎖定在B52和B20之間，兩側分別有4和7株交換。根 據Nipponbare的序列，該區間物理距離約63Kb。
[0039] 為了利用分子標記輔助選擇將Bph27轉入秈稻品種9311，首選對自行開發的20對 與Bph27緊密連鎖的分子標記進行Balamawee與9311間的多態性篩選，其中位於Bph27兩 側的精密連鎖標記B471與B58在Balamawee與9311間的具有明顯的多態性（圖1，圖2)。 隨後確定利用B471與B58開展Bph27在秈稻中的分子標記輔助選擇應用。同時利用抗褐 飛蝨地方品種Balamawee與秈稻品種9311雜交，得到雜交F 1，以雜種F1作母本，用9311作 輪迴親本，得到回交群體BC1F 1，從BC1F1開始在苗期就用Bph27位點的標記B471和B58進行 檢測，BC 1F1含有Bph27位點的株系，在開花期就作母本與背景親本9311雜交，在每一個世代 都用同樣的方法，一直到BC 5F1世代，自交獲得BC5F2群體，通過分子標記方法，獲得B471和 B58位點純合的單株，由該單株衍生得到一個穩定的秈稻新品系，進一步通過苗期及全生育 期的褐飛蝨抗性鑑定，表明該品系無論苗期還是全生育期均具有較高的褐飛蝨的抗性（圖 3,圖4)，將該品系暫定名為991RB。
【權利要求】
1. 抗褐飛蝨主基因Bph27轉育秈稻品種的分子標記方法，其特徵在於，用分子標記引 物B471或者分子標記引物B58對抗褐飛風位點Bph27進行分子標記：用分子標記引物B471 擴增抗褐飛風水稻品種Balamawee及其轉育的抗褐飛風材料的DNA，獲得Bph27位點標記片 段大小約為130bp ;擴增感蟲秈稻品種DNA，獲得標記片段大小約為120bp ;用分子標記引物 B58擴增抗褐飛蝨水稻品種Balamawee及其轉育的抗褐飛蝨材料的DNA，獲得Bph27位點標 記片段大小約為88bp ;擴增感蟲秈稻品種DNA，獲得標記片段大小約為118bp ;其中分子標 記引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子 標記引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 用於標記抗褐飛蝨主基因Bph27的分子標記引物，其特徵在於選自分子標記引物 B471或分子標記引物B58中的任意一種，分子標記引物B471左端引物序列如SEQ ID NO. 1 所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 2所示；分子標記引物B58左端引物序列如SEQ ID NO. 3 所示，右端引物序列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 權利要求2所述的分子標記引物在培育抗褐飛蝨的新品系中的應用。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特徵在於包括： 用抗褐飛蝨地方品種Balamawee與秈稻品種9311雜交，得到雜交Fi，以雜種Fi作母本， 用9311作輪迴親本，得到回交群體BCR，從BC^開始在苗期就用權利要求2所述的引物 對Bph27位點的標記B471和B58進行檢測，BC^含有Bph27位點的株系，在開花期就作母 本與背景親本9311雜交，在每一個世代都用同樣的方法，一直到BC^世代，自交獲得BC5F2群體，通過分子標記方法，獲得B471和B58位點純合的單株，由該單株自交得到一個穩定的 秈稻新品系，進一步通過苗期及全生育期的褐飛蝨抗性鑑定，獲得攜帶抗褐飛蝨基因Bph27 並穩定抗褐飛蝨的新品系。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於還包括：將獲得攜帶抗褐飛蝨基因Bph27 並穩定抗褐飛蝨的新品系與秈稻、粳稻以及育種上正在利用的常規品種配製雜交種及選育 常規品種的應用方法。
【文檔編號】C12N15/11GK104388576SQ201410759318
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】萬建民, 劉裕強, 陳亮明, 江玲, 何俊, 劉豔玲, 仇澤宇, 趙志剛, 王益華, 劉喜, 劉世家, 田雲錄 申請人:南京農業大學