在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸的製作方法

2023-12-10 06:11:12 2

專利名稱：：在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物
技術領域：
。更具體地講，本發明涉及編碼可用於在含油酵母中生產長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)的酶的核酸片段的合成。
背景技術：
：很久以來就已經認識到，某些多不飽和脂肪酸，或PUFAs，是健康細胞的重要的生物學成分。例如，這樣的PUFAs被認為是·「必需"脂肪酸，它不能夠在哺乳動物體內從頭合成，相反，必須從飲食中獲得或者通過亞油酸(LA)或α-亞麻酸(ALA)的進一步去飽和及延伸產生；·細胞質膜的成分，其中，它們能夠以諸如磷脂或甘油三酯的形式存在；·為正常發育所必需，特別是為嬰兒腦發育和組織形成和修復所必需；和，·在哺乳動物體內起著重要作用的若干種生物學活性類二十烷酸的前體，包括前列環素，類二十烷酸，白三烯和前列腺素。在二十世紀70年代，發現格陵蘭島愛斯基摩人的心臟病的低發病率和大量攝入長鏈o-3PUFAs相關(Dyerberg，J.等，Amer.J.ClinNutr.28958-966(1975)；Dyerberg,J.等，Lancet2(8081)117-119(July15，1978))。更近一些的研究業已證實了ω-3PUFAs的心血管保護作用(Shimokawa，H.，WorldRevNutrDiet,88100-108(2001)；vonSchacky，C.，和Dyerberg，J.，WorldRevNutrDiet，88:90_99(2001))。另外，業已發現，某些病症對用ω-3脂肪酸治療有反應，如在血管成形術之後的再狹窄率，炎症症狀和類風溼性關節炎，哮喘，牛皮癬和溼疹。業已證實Y-亞麻酸(GLA，一種(0-6PUFA)能降低與應激相關的血壓升高，並且改善算術測驗的表現。業已證實GLA和二高-γ-亞麻酸(DGLA，另一種ω-ePUFA)能抑制血小板聚集，導致血管舒張，降低膽固醇含量，並且抑制血管壁平滑肌和纖維組織的增殖(Brenner等，Adv.Exp.Med.Viol.83:85_101(1976))。施用單獨的或者與二十碳五烯酸(EPA，(0-3PUFA)組合的GLA或DGLA，業已表現出能減輕或防止胃腸出血，和由非甾體類抗炎藥物導致的其他副作用(U.S.4，666，701)。另外，業已證實GLA和DGLA能預防或治療子宮內膜異位和經前症候群(U.S.4，758，592)，並且治療肌痛性腦脊髓炎和在病毒感染之後的慢性疲勞(U.S.5，116，871)。其他證據表明，PUFAs可能與鈣代謝的調控有關，表明了它們可用於治療或預防骨質疏鬆症和腎或尿道結石。最後，PUFAs可用於治療癌症和糖尿病(U.S.4，826，877；Horrobin等，Am.J.Clin.Nutr.57(Suppl.)732S-737S(1993))。PUFAs通常被劃分成兩種主要類型(由ω-6和ω-3脂肪酸組成)，它們是分別通過必需脂肪酸，LA和ALA的去飽和和延伸產生的。儘管具有從「必需」脂肪酸的這種常見的衍生，越來越明確飲食中ω-6與ω-3的比例對維持良好的健康狀態很重要。由於人類飲食習慣的改變，目前ω-6與ω-3的比例是大約101，而優選的比例是2l(Kris-Etherton,P.M.etal.,Am.J.Olin.Nutr.71(ISuppI.)179S-88S(2000)；Simopoulos,A.P.etal.,Ann.Nutr.Metab.43127-130(1999)；Krauss,R.M.etal.AHACirculation1022284-2299(2000)).ω-6脂肪酸的主要來源是含有大量LA的植物油(如玉米油、大豆油)。GLA存在於許多植物的種子，包括月見草(Oenotherabiennis)，，琉璃苣(Boragoofficinalis)和黑醋慄(Ribesnigrum)。被孢黴屬(絲狀真菌)的微生物、Entomophthora、腐酶屬和Porphyridium(紅藻)可以用於ω-6脂肪酸花生四烯酸(ARA)的商業生產。例如，用一種真菌高山被孢黴生產含ARA的油，而U.S.5，658，767(MartekCorporation)教導了生產含ARA的油的方法，包括在含有碳和氮源的培養基中培養Pythiuminsidiuosum。重要的(0-3PUFAS包括EPA和二十二碳六烯酸(DHA)，兩者都存在於不同類型的魚油和海洋浮遊生物中。U.S.5，244，921(MartekCorporation)描述了用於生產含EPA的可食用油的方法，包括在發酵罐中培養異養硅藻，具體是Cyclotellasp.和Nitzschiasp。DHA可以獲自冷水海洋魚類、蛋黃部分，以及通過培養Dinophyceae綱的某些異養微藻類，具體是Crypthecodiniumsp.，如C.cohnii(U.S.5，492，938和U.S.5，407，957)。十八碳四烯酸(STA)，即EPA和DHA的一種前體，可以存在於海洋油類和植物種子中；其商業來源包括在Trichodesma和Echium屬中的生產。ω-3酸的其它來源存在於亞麻籽油和胡桃油，它們均含有佔絕對優勢的ALA。儘管PUFAs的多種商業來源來自於天然來源，但是存在與所述生產方法相關的若干缺陷。首先，諸如魚和植物的天然來源傾向於具有高度的不一致的油類組成。因此，從這些來源獲得的油，可能需要高度純化，以便分離或者富集一種或多種需要的PUFAs。魚油通常具有不佳的味道和氣味，這可能不能與需要的產物經濟地分開，並且可導致所述產物不能被接受為食物補充物。不佳的味道和氣味可以導致基於攝入高劑量的醫學方案不被接受，並且可能降低患者的依從性。此外，魚類可能積累環境汙染物，並且攝入魚油膠囊作為飲食補充物可能導致攝入不良的汙染物。天然來源同樣會出現可利用性的無法控制的波動(例如，由於天氣，疾病，或者對於魚類資源來說的過度捕撈)；和產生PUFAs的作物通常在經濟上無法與為了食物生產而培育的雜交作物競爭。能天然產生PUFAs的某些生物(例如，Porphyridium，被孢黴)的大規模發酵同樣可能是昂貴的，和/或難以以商業化規模培養。上述限制的結果是，為了達到以下目的必須進行大量的研究1.)開發便於商業化生產的PUFAs的重組資源；和2.)修飾脂肪酸生物合成途徑，以便能夠生產需要的PUFAs0在過去若干年中在從各種生物中分離，克隆並且操作脂肪酸去飽和酶和延伸酶基因方面取得了進展。對這些基因序列的了解，提供了在不能天然產生PUFAs的新的宿主生物中生產需要的脂肪酸和/或脂肪酸組合物的前景。以下文獻披露了在釀酒酵母中的多種例子，如1.Domergue,F.，etal.(Eur.J.Biochem.269:4105_4113(2002))，其中海洋硅藻三角褐指藻來源的兩種去飽和酶被克隆進釀酒酵母內，導致生成了EPA；2.BeaudoinF.,etal.(Prοc.Na11.Acad.Sci.U.S.A.97(12)6421-6426(2000))，其中利用了秀麗新杆線蟲來源的基因在釀酒酵母內重構了ω-3和co-6PUFA生物合成途徑；3.Dyer,J.Μ.etal.(Appl.Eniv.Microbiol.，59:224_230(2002))，其中在釀酒酵母內表達了植物脂肪酸去飽和酶(FAD2和FAD3)，導致生成了ALA；以及4.U.S.6,136,574(Knutzonetal.,AbbottLaboratories)，其中將甘藍型油菜來源的一種去飽和酶和真菌高山被孢黴來源的兩種去飽和酶克隆進釀酒酵母內，導致生成了LA、GLA、ALA禾口STA0不過，仍然需要合適的微生物系統，其中，上述類型的基因可以表達，以便提供商業化數量的一種或多種PUFAs的經濟生產。另外，需要富集了特殊PUFAs，特別是EPA和DHA的油。許多微生物(包括藻類、細菌、黴菌和真菌)能夠在細胞代謝的普通過程中合成油類。因此，油生產包括在合適的培養基中培養微生物以合成油，然後從發酵培養基分離微生物，並且進行處理以回收細胞內的油。已經進行了多種嘗試以便通過發酵手段優化脂肪酸的生產，所述手段包括改變如使用的微生物、允許油生產的培養基和條件等參數。但是，已經證明這些努力在改進油產率或控制產生的油組合物的特徵方面非常不成功。以前尚未作為PUFAs的生產平臺檢驗的一種類型的微生物是含油酵母。這種微生物能夠積累最多佔它們的幹細胞重量80%的油類。業已完善了用於生長具有高油含量的含油酵母的技術(例如，參見EP0005277Bl；Ratledge,C.，Prog.Ind.Microbiol.16119-206(1982))，並且可以提供與生產ω-3或ω-6PUFAs的商業化微藻發酵相比的成本優勢。完整的酵母細胞可能還體現了對ω-3或《-6PUFA-富集的油進行包囊以便用於功能性食品和動物飼料添加劑的方便途徑。儘管具有上述優點，含油酵母天然上是ω-6和《-3PUFAS缺陷型的，因為在這種微生物中天然產生的PUFAs局限於182脂肪酸(以及更不常見的是183脂肪酸)。因此，要解決的問題是，開發能積累富含ω-3和/或ω-6脂肪酸的油類的含油酵母。為此，必須導入去飽和酶和延伸酶，這兩種酶能夠在含油酵母中合成和積累ω-3和/或ω-6脂肪酸。儘管在基因工程領域已經有了進展，但是這類技術沒有被開發用於含油酵母。因此，必須克服與將這些特定宿主生物用於生產PUFAs相關的問題。申請人:通過導入異源ω-3和/或ω-6生物合成途徑，證明了宿主解脂耶氏酵母(YarrowiaLipolytica)中PUFAs的生產，從而解決了上述問題。具體地，在此生產了ARA(代表ω-6脂肪酸)和EPA(代表ω-3脂肪酸)，以例證本發明的技術。
發明內容本發明提供了在含油酵母宿主中表達包括ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的酶，以便生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。因此，本發明提供了生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法，包括a)提供包括功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母；b)在可發酵碳源的存在下生長步驟(a)的酵母，從而生產ω-3或ω-6脂肪酸；並且c)任選回收ω-3或ω-6脂肪酸。在一種具體實施方案中，本發明提供生產亞油酸的方法，包括a)提供包括以下成分的含油酵母(i)編碼Δ12去飽和酶多肽的基因；和(ii)油酸的內源來源；b)在合適的可發酵碳源的存在下生長步驟(a)的酵母，其中表達編碼Δ12去飽和酶多肽的基因並且將油酸轉化為亞油酸；並且c)任選回收步驟(b)的亞油酸。在具體實施方案中，本發明提供了通過從頭生物合成或從合適的前體進行單步驟酶促反應而生產特殊ω-6脂肪酸，如亞油酸(LA)，Y-亞麻酸(GLA)，二高-Y-亞油酸(DGLA)，和花生四烯酸(ARA)的方法。類似地，本發明提供了通過單步驟酶促反應從合適的前體生產特殊ω-3脂肪酸，如α-亞油酸(ALA)，十八碳四烯酸(STA)，二十碳四烯酸(ETA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸的方法。圖1表示含油酵母內脂質積累生化機制的示意圖。圖2表示ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑。圖3表示用於在解脂耶氏酵母中進行基因表達的質粒載體ρΥ5的構建。圖4表示用於在解脂耶氏酵母中進行基因表達的質粒載體ΡΥ5-4和ρΥ5-13的構建。圖5表示中間載體pYZM5CHPPA的構建示意圖。圖6表示異絲水黴Δ17去飽和酶基因和密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成基因的DNA序列的比較。圖7表示在解脂耶氏酵母中位於翻譯起始密碼子'ATG'周圍的優選的共有序列。圖8表示體外合成密碼子優化的Δ17去飽和酶基因的方案。圖9表示用於在解脂耶氏酵母內表達合成的密碼子優化的Δ17去飽和酶基因和野生型Δ17去飽和酶基因的質粒。圖IOA和IOB所示為對在分別經過野生型Δ17去飽和酶基因和合成的密碼子優化的△17去飽和酶基因轉化的解脂耶氏酵母內生成的脂肪酸進行氣相色譜分析的結果。圖11所示為中間載體ρΥ24-4的構建示意圖。圖12所示為中間載體PYZV16的構建示意圖。圖13所示為整合載體PYZM5EL6的構建示意圖。圖14所示為整合載體pYZV5EL6和pYZV5EL6/17的構建示意圖。圖15是說明由工程改造的解脂耶氏酵母生產ARA的色譜圖。圖16是說明由工程改造的解脂耶氏酵母生產EPA的色譜圖。通過以下的詳細說明和所附的序列說明能夠更全面地理解本發明，這些內容構成了本發明的一部分。下列序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(「對含有核苷酸序列和/或胺基酸序列公開內容的專利申請的要求---序列規則」)，並符合世界智慧財產權組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列列表要求(管理細則的規則5.2和49.5(a-bis)，以及第208節和附錄C)。應用於核苷酸和胺基酸序列信息的符號和格式遵循37C.F.R.§1.822所述規則。SEQIDNO1表示高山被孢黴Δ6去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO2表示高山被孢黴Δ6去飽和酶的胺基酸序列。SEQIDNO3表示高山被孢黴Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO:4表示高山被孢黴△5去飽和酶的相應的胺基酸序列。SEQIDNO5表示異絲水黴Δ17去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO6表示異絲水黴Δ17去飽和酶的相應的胺基酸序列。SEQIDNO:7表示高山被孢黴高親和力延伸酶基因的DNA序列，而SEQIDNO8表示高山被孢黴高親和力延伸酶的胺基酸序列。SEQIDNO:9表示密碼子優化以便在解脂耶氏酵母中表達的合成的Δ17去飽和酶基因的DNA序列。SEQIDNOs:10_31相當於11對寡核苷酸，它們共同組成了異絲水黴Δ17去飽和酶基因的完整的密碼子優化的編碼區(例如，分別為D17-1A，D17-1B,D17-2A，D17-2B，D17-3A,D17-3B,D17-4A，D17-4B，D17-5A，D17-5B，D17-6A，D17-6B，D17-7A，D17-7B，D17-8A，D17-8B,D17-9A,D17—9B，D17-10A，D17—10B，D17-11A和D17-11B)。SEQIDNOs:32_37分別相當於引物D17-1，D17-4R，D17-5，D17-8D，D17-8U和D17-11，用於在合成密碼子優化的△17去飽和酶基因期間進行PCR擴增。SEQIDNOs:38和39分別相當於用於分離TEF啟動子的引物TEF5'和TEF3'。SEQIDNOs:40和41分別相當於用於分離XPR2轉錄終止子的引物XPR5『禾口XPR3'。SEQIDNOs42和43相當於引物YL21A和YL22，用於從質粒pRSP19擴增異絲水黴的野生型Δ17去飽和酶基因。SEQIDNOs:44和45分別相當於引物YL53和YL54，用於定點誘變，以便產生PYSD17M。SEQIDNO:46和47分別對應於引物KTO和KU3，被用於擴增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kBDNA片段(SEQIDNO48；胺基酸序列如SEQIDNO49所示)。SEQIDNO:50和51分別對應於引物KI5和KI3，被用於擴增含有Impatientbalsama的接合酶基因的1.IkBDNA片段(SEQIDNO52；胺基酸序列如SEQIDNO:53所示)°SEQIDNO54和55分別對應於引物KTI5和KTI3，被用於擴增含有TEF:接合酶XPR嵌合基因的1.7kBDNA片段(SEQIDNO56；胺基酸序列如SEQIDNO:57所示)。SEQIDNO58和59分別對應於引物KH5和KH3，被用於擴增含有大腸桿菌潮黴素抗性基因的IkBDNA片段(SEQIDNO60；胺基酸序列如SEQIDNO61所示)。SEQIDNO62和63分別對應於引物KTH5和KTH3，被用於擴增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kBDNA片段(SEQIDNO64；胺基酸序列如SEQIDNO65所示)。SEQIDNO66和67分別對應於解脂耶氏酵母URA3基因中401bp的5，-序列和568bp的3』-序列，被用於將表達盒直接整合進耶氏酵母基因組的Ura位點。SEQIDNO:68_71分別對應於引物YL63、YL64、YL65和YL66，被用於定點誘變，以生成pY24-4。SEQIDNO:72和73分別對應於引物YLll和YL12，被用於擴增高山被孢黴Δ5去飽和酶。SEQIDNO:74_77分別對應於引物YL81、YL82、YL83和YL84，被用於定點誘變，以生成pYZM5CH。SEQIDNO:78和79分別對應於引物YL105和YL106，被用於定點誘變，以生成PYZM5CHPP。SEQIDNO:80和81分別對應於引物YL119和YL120，被用於定點誘變，以生成PYZM5CHPPA。SEQIDNO:82和83分別對應於引物YL121和YL122，被用於擴增解脂耶氏酵母URA3基因上遊440bp的5，-非編碼DNA序列(SEQIDNO84)。SEQIDNO:85和86分別對應於引物YL114和YL115，被用於定點誘變，以生成pYZV5禾口pYZV5P。SEQIDNO:87對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和表達Δ5去飽和酶基因的5.2kBDNA片段。SEQIDNO:88_91分別對應於引物YL61、YL62、YL69和YL70，被用於定點誘變，以生成pY58BH。SEQIDNO:92_95分別對應於引物YL77、YL78、YL79A和YL80A，被用於定點誘變，以生成pY54PC。SEQIDNO:96對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和同步表達Δ6去飽和酶、高山被孢黴延伸酶和高山被孢黴Δ5去飽和酶基因的8.9kBDNA片段。SEQIDNO:97_100分別對應於引物YL101、YL102、YL103和YL104，被用於定點誘變，以生成PYSD17SPC。SEQIDNO101對應於適合在解脂耶氏酵母基因組內整合和同步表達Δ6去飽和酶、高山被孢黴延伸酶、高山被孢黴Δ5去飽和酶和密碼子優化的△17去飽和酶基因的10.3kBDNA片段。SEQIDNO:102_113分別對應於引物YL1、YL2、YL3、YL4、YL5、YL6、YL7、YL8、YL9、YL10、YL23和YL24，被用於構建質粒。SEQIDNO114表示異絲水黴Δ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO115表示異絲水黴△5去飽和酶的相應的胺基酸序列。SEQIDNO:116、117、120、121、124和125分別對應於引物YL13A、YL14A、YL19A、YL20、YL15和YL16B，用於克隆多種Δ5去飽和酶基因。SEQIDNO:118表示IsochrysisgalbanaΔ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO:119表示IsochrysisgalbanaΔ5去飽和酶的相應的胺基酸序列。SEQIDNO122表示ThraustochytriumaureumΔ5去飽和酶基因的DNA序列，而SEQIDNO119表示ThraustochytriumaureumΔ5去飽和酶的相應的胺基酸序列。SEQIDNO126對應於最適合在耶氏酵母種內表達的基因的密碼子優化翻譯起始位點。具體實施例方式根據本發明，申請人提供了在含油酵母中生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。具體地，申請人提供了生產亞油酸、Y-亞麻酸、二高-Y-亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的方法。這是通過將由賦予Δ17去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ4去飽和酶和延伸酶活性的基因編碼的功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑導入含油宿主酵母中以便進行重組表達而實現的。因此，本公開內容證明了可以對含油酵母進行工程改造，以便能夠生產任何所需的PUFA組合物。本發明具有多種用途。通過本文所披露的方法製備的PUFAs，或它的衍生物可被用作飲食代用品，或補充物，特別是嬰兒配方，用於靜脈內餵飼的患者或用於預防或治療營養不良。另外，可以將純化的PUFAs(或它的衍生物)摻入烹飪油，脂肪，或配製的人造奶油中，以便在正常使用時，受體能接受到所需數量的飲食補充。還可將PUFAs摻入嬰兒配方，營養補充物或其他食品中，並且可以用作抗炎劑或降膽固醇劑。可任選將所述組合物用於藥物學用途(人或獸醫)。在這種場合下，PUFAs通常是口服的，不過，可以通過能夠成功地吸收它們的任何途徑施用，例如，腸胃外(例如皮下，肌內或靜脈內)，直腸內，陰道內或局部(例如，作為皮膚油膏或洗液)。給人或動物補充通過重組方法生產的PUFAs，可以導致水平增加的添加的PUFAs，以及它們的代謝產物。例如，用花生四烯酸(ARA)治療，不僅能夠產生水平增加的ARA，而且還能產生ARA的下遊產物，如前列腺素。複雜的調控機制，可能需要組合各種PUFAs，或者添加PUFAs的不同的綴合物，以便預防，控制或克服這樣的機制，以便在個體內獲得理想水平的特定的PUFAs。^X在本說明書中，使用了多種術語和縮寫。提供了以下定義。「開放讀框〃被縮寫為0RF。『『聚合酶鏈反應〃被縮寫為PCR。「美國典型培養物保藏中心〃被縮寫為ATCC。「多不飽和脂肪酸〃被縮寫為PUFA(S)。術語"脂肪酸"表示具有各種鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，從大約C12-C22(不過已知可以採用更長和更短鏈長的酸)。主要的鏈長為C16至C22。脂肪酸的結構是通過簡單的符號系統"χ:γ"表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的總數，而Y是雙鍵的數量。一般，脂肪酸被劃分成飽和的或不飽和的。術語"飽和脂肪酸"表示在它們的碳主鏈之間沒有"雙鍵"的脂肪酸。相反，「不飽和脂肪酸"是沿它們的碳主鏈具有"雙鍵"的順式異構體。「單不飽和脂肪酸"沿碳主鏈只有一個"雙鍵"(例如，對於棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)來說通常位於第9和第10個碳原子之間)，而"多不飽和脂肪酸"(或"PUFAs")沿碳主鏈具有至少兩個雙鍵(例如，對於亞油酸(18:2)來說位於第9和第10和第12和第13個碳原子之間；對於α-亞麻酸(18:3)來說位於第9和第10，第12和第13，和第15和第16個碳原子之間)。「PUFAs"可以劃分成兩種主要類型(根據最靠近脂肪酸碳鏈的甲基末端的第一個雙鍵的位置(η))。因此，「ω-6脂肪酸"(ω-6或η-6)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω(甲基)末端六個碳原子，並且一共還具有兩個或兩個以上雙鍵，每一個隨後的不飽和出現在朝向該分子羧基末端的三個額外的碳原子。相反，「ω-3脂肪酸"(ω-3或η-3)的第一不飽和的雙鍵距離該分子的ω末端三個碳原子，並且一共還具有三個或三個以上雙鍵，每一個隨後的不飽和出現在朝向該分子羧基末端的三個額外的碳原子。在本說明書中，將利用ω-參考系統表示碳原子的編號，雙鍵的編號，和最接近ω碳原子的雙鍵的位置，從ω碳原子開始計數(它是用於這種目的的第1號)。在下面的表1中示出了這種命名方法，表示在標題為"簡化符號"的欄目中。該表的其餘部分歸納了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在說明書中將要使用的縮寫，以及每一種化合物的化學名稱。表1多不飽和脂肪酸的侖名tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12術語"必需脂肪酸"表示個體為了生存必須攝入的PUFA，因為所述個體不能從頭合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳動物不能合成必需脂肪酸亞油酸(18:2，ω-6)。其他必需脂肪酸包括GLA(ω-6)，DGLA(ω-6)，ARA(ω-6)，EPA(ω-3)和DHA(ω-3)。術語"脂肪"表示脂類物質，它在25°C下是固體，並且通常是飽和的。術語〃油〃表示在25°C下是液體並且通常是多不飽和的脂類。PUFAs存在於某些藻類，含油酵母和絲狀真菌的油中。「微生物油"或"單細胞油"是由微生物在它們的生命過程中天然產生的油類。這種油類可能包括長鏈PUFAs。術語〃PUFA生物合成途徑酶〃表示與PUFA的生物合成相關的以下任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。術語"ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑"表示一組基因，當它們在合適的條件下表達時，編碼能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生產的酶。通常，與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關的基因編碼某些或所有以下的酶Δ12去飽和酶，Δ6去飽和酶，延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ9去飽和酶和Δ4去飽和酶。在圖2中示出了典型的途徑，證實了如何由普通來源生產ω-3和ω-6脂肪酸。本文所用與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑相關的術語「功能性」指該途徑中的所有基因或其中一部分可表達活性酶。應當理解的是，「ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑」或「功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑」並不意味著該節所列的所有基因均是必需的，因為許多脂肪酸產物僅需該途徑中部分基因的表達。術語"去飽和酶"表示能夠對一種或多種脂肪酸去飽和以便產生單-或多不飽和脂肪酸或感興趣的前體的多種酶複合物的多肽成分。儘管在本說明書中ω-參考系統被用於表示特殊的脂肪酸，更常見的是，利用系統從底物的羧基末端開始計數以表示去飽和酶的活性。本發明特別感興趣的是1.)Δ17去飽和酶，它能使脂肪酸的位於從該分子的羧基末端開始計數的第17和第18個碳原子之間去飽和，並且，例如，催化ARA轉化成EPA和/或DGLA轉化成ETA；2.)Δ6去飽和酶，它能催化LA轉化成GLA和/或ALA轉化成STA；3.)Δ5去飽和酶，它能催化DGLA轉化成ARA和/或ETA轉化成EPA；4.)Δ4去飽和酶，它能催化DPA轉化成DHA;5.)Δ12去飽和酶，它能催化油酸轉化成LA；6.)Δ15去飽和酶，它能催化LA轉化成ALA;和7.)Δ9去飽和酶，它能催化棕櫚酸酯或鹽轉化成棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸酯或鹽轉化成油酸(18:1)。術語"延伸酶"表示能夠延伸脂肪酸碳鏈，以便產生比延伸酶作用的脂肪酸底物長2個碳原子的單或多不飽和脂肪酸的多酶複合物的多肽成分。這種延伸過程是通過與脂肪酸合成酶相關的多步驟機制發生的，其中，CoA是醯基載體(Lassner等，ThePlantCell8:281-292(1996))。簡單地講，丙二醯-CoA與長鏈醯基-CoA縮合，以便產生CO2和β-酮醯基-CoA(其中，醯基部分業已延長了兩個碳原子)。隨後的反應包括還原成羥醯基-CoA，脫水形成烯醯基-CoA，並且第二次還原，以便產生延長的醯基-CoA。由延伸酶催化的反應的例子是將GLA轉化成DGLA，STA轉化成ETA和將EPA轉化成DPA。因此，延伸酶可以具有不同的特異性(例如，C16/18延伸酶優選C16底物，C8/2(1延伸酶優選C18底物，而C2(1/22延伸酶優選C2tl底物)。術語"高親和力延伸酶"表示它的底物特異性優選GLA的延伸酶(DGLA是延伸酶反應的產物)。在WO00/12720中披露了一種這樣的延伸酶。術語"轉化效率"和"底物轉化百分比"表示特定的酶(例如，去飽和酶或延伸酶)可以將底物轉化成產物的效率。轉化效率是按照以下公式計算的([產物]/[底物+產物])^100，其中'產物'包括產生它的途徑上的中間產物和所有產物。術語"含油的"表示傾向於以脂類形式儲存它們的能源的生物(Weete，InFungalLipidBiochemistry,2nded.，Plenum，1980)。一般，所述微生物的細胞PUFA含量遵循S形曲線，其中，脂類的濃度增加，直到在後對數期或早期靜止生長期的最大值，然後在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(YongmanitchaiandWard，Appl.Environ，Microbiol.57:419_25(1991))。術語"含油酵母"表示被分類為酵母的微生物，它們能夠積累佔幹細胞重量至少25%的油。含油酵母的例子包括，但不局限於以下屬耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。術語"可發酵的碳源"表示微生物能夠代謝以便產生能量的碳源。本發明的典型的碳源包括，但不局限於單糖，寡糖，多糖，鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸鹽或酯以及含碳的胺。在本文中，「分離的核酸片段"是單鏈或雙鏈RNA或DNA，它任選包括合成的，非天然的或改變了的核酸鹼基。DNA聚合物形式的分離的多核酸片段可能由一個或多個cDNA,基因組DNA或合成DNA的片段組成。胺基酸或核苷酸序列的"主要部分"是包括多肽的一定數目的胺基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，所述數目足夠通過本領域技術人員對所述序列進行的人工評估，或通過計算機自動化的序列比較，以及使用諸如BLAST的算法的鑑定(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul，S.F.，等，J.Mol.Biol.215:403_410(1993)而推測性地鑑定該多肽或基因。一般，核苷酸序列的"主要部分"包括足夠的序列(例如，20-30個連續的核苷酸)，以便特異性地鑑定和/或分離包括所述序列的核酸片段。本說明書披露了編碼一種或多種特定蛋白的部分或全部核苷酸序列。技術人員利用本文所提供的序列，可以將所披露序列的全部或主要部分用於本領域技術人員所公知的目的。因此，本發明包括在所附序列表中所提供的完整的序列，以及如上文所定義的這些序列的主要部分。術語"互補的"被用於表示能夠彼此雜交的核苷酸鹼基之間的相互關係。例如，對於DNA來說，腺嘌呤互補於胸腺嘧啶，而胞嘧啶互補於鳥嘌呤。因此，本發明還包括分離的核酸片段，它互補於在所附序列表中提供的完整序列，以及基本上類似的核酸序列。「密碼子簡併性"表示遺傳密碼的性質，它允許改變核苷酸序列，而又不影響所編碼的多肽的胺基酸序列。技術人員在用核苷酸密碼子表示特定胺基酸時充分理解由特定宿主細胞所表現出來的"密碼子偏倚"。因此，在合成用於改善在宿主細胞中的表達的基因時，需要設計所述基因，以便它的密碼子選擇的頻率接近宿主細胞的優選密碼子選擇的頻率。表示DNA序列的"化學合成的"表示組成核苷酸是在體外組裝的。DNA的人工化學合成，可以通過使用業已建立的方法完成；或可以利用多種商業化儀器中的一種進行自動化的化學合成。「合成基因"可以由寡核苷酸基本單位組裝，它們是利用本領域技術人員所公知的方法化學合成的。將這些基本單位連接在一起並且退火，以便形成基因片段，然後酶促組裝，以便構建完整的基因。因此，可以對基因進行修飾，以便根據核苷酸序列的優化優化基因表達，以便體現宿主細胞的密碼子偏倚。如果密碼子選擇偏向宿主優選的密碼子，技術人員可以理解成功的基因表達的可能性。優選密碼子的確定可以根據對來自宿主細胞的基因的檢查，其中，可以獲得序列信息。「基因"表示能表達特定蛋白的核酸片段，包括位於編碼序列前面(5'非編碼序列)和後面(3'非編碼序列)的調控序列。「天然基因"表示天然與它自身的調控序列一起出現的基因"嵌合基因"表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的調控和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來自不同來源的調控序列和編碼序列，或來自相同的來源，但是以不同於天然存在的方式排列的調控序列和編碼序列。「內源基因"表示存在於生物基因組上的天然位置上的天然基因。「外源"基因表示正常情況下不存在於宿主生物中，而是通過基因轉移導入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。「轉基因"是業已通過轉化方法導入所述基因組的基因。「密碼子優化的基因"是具有經過設計以便模擬宿主細胞的優選的密碼子選擇頻率的密碼子選擇頻率的基因。「編碼序列"表示編碼特定胺基酸序列的DNA序列。「合適的調控序列"表示位於編碼序列上遊(5'非編碼序列)，序列內，或下遊(3『非編碼序列)的核苷酸序列，並且，它能影響相關編碼序列的轉錄，RNA加工或穩定性，或翻譯。調控序列可以包括啟動子，翻譯前導序列，內含子，聚腺苷酸化識別序列，RNA加工位點，效應物結合位點和莖_環結構。「啟動子「表示能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般，編碼序列位於啟動子序列的3'側。啟動子可能完全來自天然基因，或者由來自天然存在的不同啟動子的不同元件組成，或者甚至包括合成的DNA片段。本領域技術人員可以理解的是，不同的啟動子能夠指導基因在不同的組織或細胞類型中的表達，或者在發育的不同階段的表達，或者對不同的環境或生理學條件作出反應的表達。能導致基因在大多數細胞類型中在大多數時間表達的啟動子通常被稱作"組成型啟動子"。還應當理解的是，由於在大多數場合下，調控序列的確切邊界未能完全確定，不同長度的DNA片段可能具有相同的啟動子活性。術語"3'非編碼序列"或"轉錄終止子"表示位於編碼序列下遊的DNA序列。它包括聚腺苷酸化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達的調控信號的其他序列。聚腺苷酸化信號通常以影響聚腺苷酸添加在mRNA前體的3'末端為特徵。所述3'區能夠影響相關編碼序列的轉錄，RNA加工或穩定性，或翻譯。「RNA轉錄物「表示由RNA聚合酶催化的DNA序列轉錄而得到的產物。當RNA轉錄物是所述DNA序列的完整的互補拷貝時，它被稱作初級轉錄物，或者它可以是來自初級轉錄物的轉錄後加工的RNA序列，並且被稱作成熟的RNA。"信使RNA"或"mRNA"表示沒有內含子，並且能夠由細胞翻譯成蛋白的RNA。「cDNA"表示雙鏈DNA，它是互補於mRNA並且由mRNA衍生的。「有義「RNA表示包括mRNA，並能夠由細胞翻譯成蛋白的RNA轉錄物。「反義"RNA表示互補於靶初級轉錄物或mRNA的全部或部分的RNA，並且它能抑制靶基因的表達(U.S.5，107，065；WO99/28508)。反義RNA的互補性可以是與特定基因轉錄物的任何部分，即，位於5'非編碼序列，3'非編碼序列，或編碼序列互補的。「功能性RNA"表示反義RNA，核酶RNA，或不能翻譯，但仍然能影響細胞加工的其他RNA。術語"可操作地連接的"表示核酸序列締合在一個核酸片段上，以便其中一個的功能受到另一個的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達時，它就是與該編碼序列可操作地連接的(即，所述編碼序列受所述啟動子的轉錄控制)。編碼序列能夠沿有義或反義方向可操作地與調控序列連接。在本文中，術語"表達"表示來自本發明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉錄和穩定積累。表達還可以表示mRNA翻譯成多肽。「轉化"表示將核酸分子轉入宿主生物，導致了遺傳學穩定的遺傳性。例如，核酸分子可以是能自主複製的質粒；或者它可以整合到宿主生物的基因組中。包括轉化的核酸片段的宿主生物被稱作"轉基因"或"重組"或"轉化過的"生物。術語"質粒"，「載體"和"盒"表示染色體外元件，它通常攜帶有不是細胞的中央代謝部分的基因，並且通常是環狀雙鏈DNA片段形式的。所述基因可以是自主複製的序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線性或環狀的單或雙鏈DNA或RNA，可以來自任何來源，其中，多個核苷酸序列業已連接或重組成獨特的結構，它能夠將啟動子片段和選定的基因產物的DNA序列，以及合適的3'非翻譯序列導入細胞。「轉化盒"表示包括外源基因，並且除了外源基因之外還具有能促進在特定宿主細胞中轉化的元件的特定載體。「表達盒"表示包括外源基因，並且除了外源基因之外，還具有能夠增強基因在外源宿主中表達的元件的特定載體。術語「序列分析軟體「表示可用於分析核苷酸或胺基酸序列的任何計算機算法或軟體程序。「序列分析軟體"可以是通過商業渠道獲得的或者獨立開發的。典型的序列分析軟體包括，但不局限於1.)GCG程序組(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI)；2.)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR,Inc.，Madison,WI)；和4.)採用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.,[Proc.Int.Symp.](1994)，MeetingDate1992，111—20.Editor(s)=Suhai,Sandor.Plenum:NewYork,NY)。在本申請的範圍內應當理解的是，在將序列分析軟體用於分析時，分析的結果是基於有關程序的"預設值"的，除非另有說明。在本文中，「預設值"表示任何組的值或參數，它是在初次初始化時最初隨所述軟體加載的。本發明所使用的標準重組DNA和分子克隆技術是本領域眾所周知的，並且披露於以下文獻中Sambrook,J.，Fritsch,E.F.禾口Maniatis，Τ.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，2nded.，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1989)(此後稱作〃Maniatis");Silhavy，Τ·J.，Bennan，Μ·L和Enquist，LW.，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryColdSpringHarbor,NY(1984)；以及Ausubel,F.M.等，CurrentProtocolsinMolecularBioloqy,由GreenePublishingAssoc.andffiley-Interscience(1987)出版。脂肪酸的微牛物牛物合成一般，在含油微生物中的脂類的積累是反應於存在於生長培養基中的總的碳與氮的比例引發的(圖1)。當細胞耗盡了可利用的氮源時(例如，當碳與氮的比例超過大約40時)，細胞一磷酸腺苷(AMP)的消耗，導致了線粒體中AMP-依賴型異檸檬酸脫氫酶活性的終止和檸檬酸的積累，並且將檸檬酸轉移到細胞質，並且隨後通過ATP-檸檬酸裂解酶裂解，產生乙醯-CoA。乙醯-CoA是脂肪酸從頭合成的主要基本單位。儘管任何能夠有效代謝產生乙醯-CoA的化合物都可用作脂肪酸的前體，葡萄糖是這種類型反應中的主要碳源(圖1)。通過糖酵解將葡萄糖轉化成丙酮酸，並且然後將丙酮酸轉入線粒體，在這裡，它能夠通過丙酮酸脫氫酶轉化成乙醯_CoA(」PD」)。由於乙醯-CoA不能直接通過線粒體膜轉入細胞質，乙醯-CoA上的兩個碳與草醯乙酸縮合，以便產生檸檬酸(通過檸檬酸合酶催化)。檸檬酸被直接轉入細胞質，在這裡，它被ATP-檸檬酸酶裂解，以便再生乙醯-CoA和草醯乙酸。草醯乙酸通過轉化成蘋果酸重新進入三羧酸循環。丙二醯-CoA的合成是脂肪酸生物合成的第一個關鍵步驟，它是在細胞質中進行的。丙二醯-CoA是通過乙醯-CoA羧化酶催化由乙醯-CoA的羧化產生的。脂肪酸合成是通過多種酶脂肪酸合酶複合物(「FAS")催化的，並且通過八種二碳片段(來自乙醯-CoA的乙醯基團)的縮合進行，以便形成16-碳飽和脂肪酸棕櫚酸。更具體地講，FAS催化一系列的7個反應，該系列包括以下反應(Smith,S.FASEBJ,8(15)1248-59(1994))1.乙醯-CoA和丙二醯-CoA被轉移到FAS的醯基載體肽(ACP)上。所述乙醯基團然後被轉移到丙二醯基團上，形成β_酮丁醯基-ACP，並且釋放C02。2.所述β-酮丁醯基-ACP發生還原(通過β_酮醯基還原酶)和脫水(通過β-羥醯基脫水酶)，以便形成反式_單不飽和的脂肪醯基。3.通過NADPH還原雙鍵，產生比最初的基團長兩個碳原子的飽和脂肪醯基。然後再生了丁醯基_基團與新的丙二醯基團縮合，並且重複所述延伸過程的能力。4.當脂肪醯基變成16個碳原子長時，硫酯酶活性水解它，釋放游離的棕櫚酸。棕櫚酸(16:0)是長鏈飽和和不飽和脂肪酸(例如，硬脂酸(18:0)，棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1))的前體，通過存在於內質網膜中的延伸酶和去飽和酶的作用產生棕櫚酸。通過△9去飽和酶的作用分別將棕櫚酸和硬脂酸轉化成它們的不飽和衍生物，即棕櫚油酸(16:1)和油酸(18:1)。三醯基甘油(脂肪酸的主要儲存單位)是通過將兩個分子的醯基-CoA酯化成甘油-3-磷酸產生1，2_磷酸二醯基甘油的(通常被稱為磷脂酸)。然後通過磷脂酸磷酸酶除去磷酸，以便得到1，2-二醯基甘油。三醯基甘油是通過二醯基甘油-醯基轉移酶的作用添加第三個脂肪酸形成的。Ω3和Ω6脂肪酸的生物合成簡單地講，將LA轉化成GLA，DGLA和ARA(ω-6途徑)和ALA轉化成STA，ETA，EPA，DPA和DHA(ω-3途徑)的代謝過程涉及通過添加碳原子延長碳鏈，和通過添加雙鍵使分子去飽和(圖2)。這需要存在於內質網膜中的一系列特殊去飽和和延伸酶。ω-6脂肪酸通過Δ12去飽和酶的作用將油酸轉化成LA(18:2)，它是ω-6脂肪酸的第一個。按以下方法產生後續的ω-6脂肪酸1.)通過Δ6去飽和酶的活性將LA轉化成GLA；2.)通過延伸酶的作用將GLA轉化成DGLA；和3.)通過Δ5去飽和酶的作用將DGLA轉化成ARA。ω-3脂肪酸通過Δ15去飽和酶的作用將亞油酸(LA)轉化成ALA，即ω-3脂肪酸的第一個。通過一系列類似於ω-6脂肪酸的步驟產生後續的ω-3脂肪酸。具體地講1.)通過Δ6去飽和酶的活性將ALA轉化成STA；2.)通過延伸酶的活性將STA轉化成ETA；和3.)通過Δ5去飽和酶的活性將ETA轉化成ΕΡΑ。另外，ETA和EPA可以通過Δ17去飽和酶的活性分別由DGLA和ARA產生。還可以通過延伸酶和Δ4去飽和酶的活性進一步將EPA轉化成DHA。與Ω脂肪酸牛產相關的基因很多微生物，包括藻類，細菌，黴菌和酵母都可以通過正常細胞代謝過程合成PUFAs和ω脂肪酸。進行過充分研究的是包括Schizochytriumaggregatm，破囊壺菌屬的種和高山被孢菌在內的真菌。很多溝鞭藻類(Dinophyceaae)都能天然產生高濃度的PUFAs。因此，業已通過遺傳學方法鑑定了與油類產生相關的多個基因，並且某些基因的DNA序列可以公開獲得(非限定性例子如下面的表2所示)彪H匕πτ姊體帖PUFA爐職白句細tableseeoriginaldocumentpage17tableseeoriginaldocumentpage18GenBank描述登錄號AF110509,高山被孢黴Δ12脂肪酸去飽和酶mRNAAB020033AAL13300高山被孢黴Δ12脂肪酸去飽和酶GenBank描述登錄號AF417244高山被孢黴ATCC16266Δ12脂肪酸去飽和酶基因AF161219魯克氏毛黴Δ12去飽和酶mRNAX86736SpirulineplatensisΔ12去飽和酶AF240777秀麗新杆線蟲Δ12去飽和酶ΑΒ007640ChlamydomonasreinhardtiiΔ12去飽禾口醇ΑΒ075526普通小球藻Δ12去飽和酶ΑΡ002063擬南芥微粒體Δ12去飽和酶NP_441622,Synechocystissp.PCC6803Δ15去飽和酶ΒΑΑ18302,ΒΑΑ02924AAL36934PerillafrutescensΔ15去飽和酶AF338466AchetadomesticusΔ93mRNAAF438199Piceaglauca去飽和酶A9(Des9)mRNAE11368AnabaenaΔ9去飽和酶Ε11367SynechocystisΔ9去飽和酶D83185PichiaangustaΔ9脂肪酸去飽和酶的DNAtableseeoriginaldocumentpage20另外，專利文獻提供了與PUFA生產相關的很多其他基因的DNA序列(和/或與上述若干基因相關的細節以及它們的分離方法)。例如，參見u.S.5，968，809(Δ6去飽和酶)；U.S.2003/0196217Α1(Δ17去飽和酶)；U.S.5，972，664和U.S.6，075，183(Δ5去飽和酶)；WO91/13972和U.S.5,057，419(Δ9去飽和酶)；WO93/11245(Δ15去飽和酶)；WO94/11516，U.S.5，443，974和WO03/099216(Δ12去飽和酶)；WO02/090493(Δ4去飽和酶)；和WO00/12720和U.S.2002/0139974Α1(延伸酶)。上述每一份專利和專利申請都以它們的全文形式收作本文參考。正如本領域技術人員所了解的，導入用於生產特定的PUFA最終產物的宿主生物所需要的特殊功能，取決於宿主細胞(以及它的天然PUFA譜和/或去飽和酶譜)，底物的可利用性和需要的最終產物。如圖2中所示出的，LA,GLA,DGLA,ARA,ALA,STA,ETA,EPA,DPA和DHA都可以在含油酵母中生產，這是通過導入以下PUFA酶功能的各種組合Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶。根據可公開獲得的文獻(例如，GenBank)，專利文獻，以及對具有生產PUFAs的能力的微生物進行的實驗分析，本領域技術人員能夠鑑定編碼上述每一種酶的各種候選基因。所述序列可來自任何來源，例如，從天然來源中分離(從細菌，藻類，真菌，植物，動物等中分離)，通過半合成途徑生產，或從頭合成。在一些實施方案中，宿主內源基因的操作是優選的；對於其它目的，必須導入異源基因。儘管導入宿主的去飽和酶和延伸酶基因的特定來源並不重要，選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮因素包括1.)所述多肽的底物特異性；2.)所述多肽或它的成分是否是限速酶；3.)所述去飽和酶或延伸酶是否是合成需要的PUFA所必需的；和/或4.)所述多肽所需要的輔助因子。所表達的多肽優選具有與它在宿主細胞中的部位的生物化學環境相容的參數。例如，所述多肽可能必須與宿主細胞中的其他酶競爭底物。因此，在確定特定多肽修飾PUFA在特定宿主細胞中的生產的合適性時，需要考慮Km和所述多肽比活性的分析。用於特定宿主細胞中的多肽是這樣的多肽，它能在存在於預期宿主細胞中的生物化學條件下起作用，但原本可以是具有能夠修飾需要的PUFA的具有去飽和酶或延伸酶活性的任何多肽。內源PUFA基因在某些情況下，需要用來生產PUFAs的宿主生物將具有編碼某些PUFA生物合成途徑酶的內源基因。例如，含油酵母一般可以生產18:2脂肪酸(某些具有合成18:3脂肪酸的額外能力)；因此，含油酵母一般具有天然的Δ12去飽和酶活性，並且可能也具有Δ15去飽和酶活性。因此，在某些實施方案中，天然去飽和酶的表達相對於異源(或「外源」)酶是優選的，因為1.)天然酶最適合與細胞內其它酶和蛋白相互作用；且2.)異源基因不太可能與宿主生物共有相同的密碼子優先。此外，已知天然基因序列時的優勢在於，易於通過定向破壞將內源基因破壞。異源PUFA基因在很多情況下，合適的去飽和酶和延伸酶不存在於選擇用來生產需要的PUFA產物的宿主生物中。因此，必須導入異源基因。為了此處描述的本發明的目的，需要證明將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導入含油宿主生物的例子；因此，高山被孢黴Δ5去飽和酶、高山被孢黴Δ6去飽和酶、異絲水黴Δ17去飽和酶、和高山被孢黴延伸酶被導入解脂耶氏酵母。但是，將特定的酶(和編碼這些酶的基因)導入宿主生物和產生的特定PUFAs並不是對本發明進行限制。如此處所證明的，如果需要產生ΕΡΑ，本領域技術人員將明白，來源於不同來源的許多其它基因將適於將Δ5去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ17去飽和酶、和延伸酶活性導入優選的微生物宿主。因此，在本發明的一個實施方案中，也可以將與高山被孢黴Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶以及異絲水黴Δ17去飽和酶基本等同的其它DNA用於在含油酵母中生產ω-6和/或ω-3脂肪酸(如EPA)。「基本等同的」是指與選定的多肽或編碼胺基酸序列的核酸序列具有至少80%、90%或95%同源性的序列。對於多肽，比較序列的長度通常為至少16個胺基酸，優選至少20個胺基酸或最優選35個胺基酸。對於核酸，比較序列通常為至少50個核苷酸，優選至少60個核苷酸，更優選至少75個核苷酸，最優選110個核苷酸。通常採用序列分析軟體測量同源性，其中"序列分析軟體"表示可用於分析核苷酸或胺基酸序列的任何計算機算法或軟體程序。「序列分析軟體"可以是通過商業渠道獲得的或者獨立開發的。典型的序列分析軟體包括，但不局限於1.)GCG程序組(WisconsinPackageVersion9.0,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI)；2.)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.215:403_410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.,Madison,WI)；和4.)採用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994),MeetingDate1992,111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.Plenum=NewYork,NY)。在本申請的範圍內應當理解的是，在將序列分析軟體用於分析時，分析的結果是基於有關程序的"預設值"的，除非另有說明。在本文中，「預設值"表示任何組的值或參數，它是在初次初始化時最初隨所述軟體加載的。概言之，所述計算機軟體通過給多種取代、缺失和其它修飾分配同源性程度而匹配相似的序列。此外，本領域技術人員應當理解，多肽可以具有胺基酸保守取代，其取代方式使得多肽的功能沒有改變或受損。具有此處描述的去飽和酶和延伸酶活性並且具有所述保守取代的多肽包括在本發明的範圍內。保守取代一般包括下列各組內的取代1.)甘氨酸和丙氨酸；2.)纈氨酸、異亮氨酸和賴氨酸；3.)天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺和穀氨醯胺4.)絲氨酸和蘇氨酸；5.)賴氨酸和精氨酸；和6.)苯丙氨酸和酪氨酸。也可以在保守的疏水性或親水性基礎上進行取代(KyteandDoolittle,J.Mol.Biol.157105-132(1982))，或在假定相似多肽二級結構的能力的基礎上進行取代(ChouandFasman,Adv.Enzymo1.4745-148(1978))。在本發明的備選實施方案中，其它儘管不基本等同於高山被孢黴Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶以及異絲水黴Δ17去飽和酶的DNA也可以用於此處的目的(如，用於生產0-3和/或co-6PUFAs，如ARA和ΕΡΑ)。例如，用於根據本發明的教導導入含油酵母的編碼Δ6去飽和酶多肽的DNA序列可以獲自具有生產GLA或STA的能力的微生物。所述微生物包括，例如，屬於被孢黴屬、耳黴屬、腐黴屬、疫黴屬、青黴屬、Porphyridium,Coidosporium、毛黴屬、鐮孢屬、麴黴屬、紅酵母屬和蟲黴屬的那些。在Porphyridium屬內，特別感興趣的是P.Cruentum。在被孢黴屬內，特別感興趣的是長形被孢黴、微小被孢黴、喜溼被孢黴、M.ramannianavar.angulispora和高山被孢黴。在毛黴屬中，特別感興趣的是卷枝毛黴和爪哇毛黴。或者，不與高山被孢黴Δ6去飽和酶基本等同，但可以在脂肪酸分子的羧基末端開始的第6個碳對脂肪酸分子去飽和的相關去飽和酶也可以在本發明中用作Δ6去飽和酶，假定該去飽和酶仍然可以有效將LA轉化為GLA和/或將ALA轉化為STA。因此，可以通過基本與此處公開的去飽和酶和延伸酶起相同作用的能力而鑑定相關的去飽和酶和延伸酶。總之，可以從多種來源分離適於此處目的的編碼PUFA生物合成途徑酶的基因。用於此處目的的去飽和酶的特徵在於以下能力1.)使脂肪酸的位於從該分子的羧基末端開始計數的第17和第18個碳原子之間去飽和，並且，催化ARA轉化成EPA和DGLA轉化成ETA(Δ17去飽和酶)；2·)催化LA轉化成GLA和/或ALA轉化成STA(Δ6去飽和酶)；3·)催化DGLA轉化成ARA和/或ETA轉化成EPA(Δ5去飽和酶)；4.)催化DPA轉化成DHA(Δ4去飽和酶);5·)催化油酸轉化成LA(△12去飽和酶)；6.)催化LA轉化成ALA(Δ15去飽和酶)；和7.)催化棕櫚酸酯或鹽轉化成棕櫚油酸和/或硬脂酸酯或鹽轉化成油酸。以相似的方式，用於此處目的的合適的延伸酶不限於來源於特定來源的那些；而是，用於此處目的的酶的特徵在於它們具有使得脂肪酸碳鏈相對於延伸酶作用的底物能夠延長2個碳，從而產生單或多不飽和脂肪酸的能力。對Ω脂肪酸基因進行優化以便在特定生物中表達儘管PUFA去飽和酶或延伸酶的特定來源在本發明中不是關鍵的，本領域技術人員將理解，異源基因將在備選的宿主以多種效率進行表達。因此，ω-3和/或ω-ePUFA生產可以通過選擇特定去飽和酶或延伸酶而進行優化，所述去飽和酶或延伸酶在異源宿主中的表達水平相對於備選去飽和酶或延伸酶在感興趣的宿主生物中的表達而言是優選的。此夕卜，可能需要根據感興趣的特定PUFA產物組成，修飾特定PUFA生物合成途徑酶的表達，以達到每一種的最佳轉化效力。多種基因工程技術可以用於優化特定酶的表達。兩種這樣的技術包括密碼子優化和基因突變，如下文所描述。例如，通過這兩種方法中的任意一種產生的具有去飽和酶和/或延伸酶活性的基因可以用於本發明中合成ω-3和/或ω-6脂肪酸。密碼子優化正如本領域技術人員所理解的，通常修飾在外源宿主中表達的編碼特定多肽的密碼子的一部分，使得修飾的多肽使用替代的宿主優選的密碼子。使用宿主優選的密碼子能夠顯著增強編碼多肽的外源基因的表達。一般，可以在特定的感興趣的宿主物種中確定宿主優選的密碼子，包括檢查蛋白中的密碼子選擇(優選大量表達的蛋白)，並且確定哪些密碼子是以最高頻率使用的。然後，可以使用在所述宿主物種中優選的密碼子完全或部分合成具有去飽和酶或延伸酶活性的感興趣的多肽的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)，以便除去可能出現在轉錄的mRNA上的任何去穩定化序列或二級結構區。還可以合成所述DNA的全部(或部分)，以便改變將鹼基組成改變成在需要的宿主細胞中更優選形式。對於本發明來說，需要修飾編碼具有Δ17去飽和酶活性的多肽的密碼子的一部分，以便增強基因在解脂耶氏酵母中的表達。修飾了天然基因(如異絲水黴△17去飽和酶)的核酸序列，以便使用宿主優選的密碼子。技術人員了可以理解的是，該優化方法同樣可應用於ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的其他基因(例如，參見共同未決的美國臨時申請NO.60/468718，在此全文收作本文參考)。此外，對異絲水黴Δ17去飽和酶的調節僅僅是示例的。基因突變用於合成序列並且將這些序列組合在一起的方法在文獻中業已完善。例如，體外誘變和選擇，定點誘變，易錯PCR(Melnikov等，NucleicAcidsResearch,27(4)1056-1062(February15，1999))，「基因改組〃或其他方法可用於獲得天然存在的或密碼子優化的去飽和酶或延伸酶基因的突變。這樣使得能夠生產去飽和酶或延伸酶多肽，它們分別具有，例如更長的半衰期或需要的PUFA在體內生產的更高速度。如果需要，對酶促活性重要的感興趣多肽(即去飽和酶或延伸酶)的區可以通過常規誘變，所得到的突變多肽的表達以及確定它們的活性而確定。突變體可以包括缺失，插入或點突變，或它們的組合。典型的功能性分析始於缺失誘變，以便確定功能所需要的蛋白的N-末端和C-末端限制，然後進行內部缺失，進行插入或點突變，以便進一步確定功能所需要的區。還可以使用其他技術，如盒誘變或完全合成。例如，缺失誘變是通過使用核酸外切酶依次去掉5'或3'編碼區實現的。可以獲得用於這種技術的試劑盒。在缺失之後，在5'或3'缺失之後通過將包括起始或終止密碼子的寡核苷酸分別連接在缺失的編碼區上獲得所述編碼區。另外，通過各種方法將編碼起始或終止密碼子的寡核苷酸插入所述編碼區，包括定點誘變，誘變PCR或通過連接到在現有限制位點上消化過的DNA上。內部缺失同樣可以通過多種方法實現，包括使用DNA上的現有限制位點，通過使用誘變引物進行定點誘變或誘變PCR。插入是通過諸如接頭_掃描誘變，定點誘變或誘變PCR的方法完成的。點突變是通過諸如定點誘變或誘變PCR的技術完成的。還可將化學誘變用於鑑定對活性重要的去飽和酶或延伸酶多肽區。表達突變的構建體，並且測定所得到的改變了的蛋白作為去飽和酶或延伸酶的能力。這種結構-功能分析，可以確定哪些區可以缺失，哪些區能夠承受插入，以及哪些點突變使得突變的蛋白能夠以基本上與天然的去飽和酶或天然的延伸酶相同的方式起作用。所有這樣的突變蛋白及其來源於本文所述密碼子優化的基因的編碼核苷酸序列均屬於本發明範疇。對於本發明來說，需要修飾編碼具有Δ17去飽和酶活性的多肽的密碼子的一部分，以便增強基因在解脂耶氏酵母中的表達。修飾了天然基因(如異絲水黴△17去飽和酶)的核酸序列，以便使用宿主優選的密碼子。技術人員了可以理解的是，該優化方法同樣可應用於ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的其他基因(例如，參見共同未決的美國臨時申請NO.60/468718，在此全文收作本文參考)。此外，對異絲水黴Δ17去飽和酶的調節僅僅是示例的。ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物生產與從諸如魚或植物的天然來源中純化相比具有若干優點。例如1.)已知與高等生物相比，很多微生物具有大大簡化了的油類組成，使得對需要成分的純化更容易；2.)微生物生產不容易出現由外部因素導致的波動，如天氣和食物供應；3.)微生物生產的油基本上不會受到環境汙染物的汙染；4.)微生物能夠以可能具有特殊用途的特定形式提供PUFAs；和，5.)微生物油類生產可以通過控制培養條件操縱，特別是通過提供用於微生物表達的酶的特定底物，或通過添加化合物或通過遺傳工程手段抑制不希望的生物化學途徑。除了上述優點之外，用重組微生物生產ω-3和/或ω-6脂肪酸，提供了通過在宿主中提供新的生物合成途徑或通過抑制不希望的途徑而改變天然存在的微生物脂肪酸特性的能力，從而提高需要的PUFAs，或它的綴合形式的水平，以及降低不需要的PUFAs的水平。例如，可以改變所生產的ω-3與ω-6脂肪酸的比例，專門生產ω-3或ω-6脂肪酸，同時消除其他ω脂肪酸的生產，或工程生產特定PUFA，而又沒有其他PUFA下遊或上遊產物的大量積累。表汰系統,盒和載體本發明所披露的序列的密碼子優化的基因和基因產物可以在異源微生物宿主細胞中生產，特別是在含油酵母(例如，解脂耶氏酵母)的細胞中生產。在重組微生物宿主中的表達，可用於生產各種PUFA途徑中間產物，或用於調控業已存在於宿主中的PUFA途徑，以便利用所述宿主合成迄今為止不可能的新的產物。包括能指導外源蛋白高水平表達的調控序列的微生物表達系統和表達載體是本領域技術人員所熟知的。它們都可用於構建嵌合基因，以便生產本發明密碼子優化的序列的任何基因產物。然後可以通過轉化將所述嵌合基因導入合適的微生物，以便提供所編碼酶的高水平表達。因此，預計導入受合適啟動子控制的編碼PUFA生物合成途徑(例如，本文所披露的Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ17去飽和酶，和延伸酶)的嵌合基因，會導致ω-3和/或ω-6脂肪酸產量的增加。預計，可將它用於在宿主微生物中表達本發明密碼子優化的基因的各種組合。預計可以用其在宿主微生物中一起表達這些PUFA去飽和酶和延伸酶基因的多種組合。本領域技術人員顯而易見的是，包括在特定表達盒內的特定基因將取決於宿主細胞，其採用天然去飽和酶和延伸酶合成PUFAs的能力、底物和所需終產物的可獲得性。例如，可能需要構建的表達盒包括編碼下列一種或多種酶促活性的基因Δ4去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ6去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶和/或延伸酶這樣，本發明涉及生產PUFAs的方法，包括讓脂肪酸底物與本文所披露的PUFA酶接觸，以便將所述底物轉化成需要的脂肪酸產物。因此，可以將本文所披露的每一種PUFAs基因和相應的酶產物(如具有合適的去飽和酶或延伸酶活性的野生型、密碼子優化的、合成的和/或突變的酶)直接或間接用於生產PUFAs。PUFAs的直接生產是這樣進行的，將脂肪酸底物直接轉化成需要的脂肪酸產物，而沒有任何中間步驟或中間途徑。例如，ARA生產能夠在能產生或提供了DLGA的宿主細胞中進行，包括向所述細胞中添加或導入能提供Δ5去飽和酶活性的表達盒。相反，編碼PUFA生物合成途徑的多個基因可以組合使用，以便發生一系列反應，以便產生需要的PUFA。例如，編碼延伸酶，Δ5去飽和酶，Δ17去飽和酶和Δ4去飽和酶活性的表達盒使得宿主細胞天然產生GLA，而不是產生DHA(以便通過延伸酶將GLA轉化成DGLA；然後可以通過Δ5去飽和酶將DGLA轉化成ARA；然後通過Δ17去飽和酶將ARA轉化成ΕΡΑ，再通過延伸酶將後者轉化成DPA；和通過Δ4去飽和酶將DPA轉化成DHA)。在優選實施方案中，其中，宿主細胞是含油酵母，編碼PUFA生物合成所必需的每一種酶的表達盒都需要導入所述生物，因為在這些生物中天然產生的PUFAs局限於18:2脂肪酸(即，LA)，並且更不常見的是18:3脂肪酸(即，ALA)。另外，可能需要底物補給。用於轉化合適的宿主細胞的載體或DNA盒為本領域所公知。存在於所述構建體中的序列的具體選擇取決於需要的表達產物(同上)、宿主細胞的性質以及推薦的分離轉化細胞與未轉化細胞的方式。不過，通常，所述載體或盒包括指導相關基因轉錄和翻譯的序列，選擇標記，和使得它能夠自主複製或染色體整合的序列。合適的載體包括所述基因的5'區，它控制轉錄起始，和DNA片段的3'區，它控制轉錄終止。最優選的是，當兩個控制區都來自轉化過的宿主細胞的基因時是最優選的，不過，可以理解的是，所述控制區不一定來自被選擇用作生產宿主的特定物種的天然基因。可用於在需要的宿主細胞中驅動去飽和酶和/或延伸酶ORFs表達的起始控制區或啟動子是多種多樣的，並且為本領域技術人員所熟知。實際上，能夠指導這些基因在選定的宿主細胞中表達的任何啟動子都適合本發明。在宿主細胞中的表達能夠以瞬時或穩定的方式進行。瞬時表達可以通過誘導可操作地連接在感興趣的基因上的可調控啟動子的活性而實現。穩定表達可以通過使用可操作地與感興趣的基因連接的組成型啟動子而實現。例如，當宿主細胞是酵母時，提供能夠在酵母細胞中起作用的轉錄和翻譯區，特別是來自宿主物種的那些。例如，轉錄起始調控區可以從以下渠道獲得1.)糖酵解途徑上的基因，如醇脫氫酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(參見美國專利申請號60/482263)，磷酸甘油變位酶(參見美國專利申請號60/482263)，果糖二磷酸醛縮酶(參見美國專利申請號60/519971)，磷酸葡萄糖異構酶，磷酸甘油酸激酶等；或2.)可調控的基因，如酸性磷酸酶，乳糖酶，金屬硫蛋白，葡糖澱粉酶，翻譯延伸因子EFl-α(TEF)蛋白(U.S.6，265，185)，核糖體蛋白S7(U.S.6，265，185)等。可以使用多種調控序列中的任意一種，這取決於是需要組成型轉錄還是誘導型轉錄，啟動子在表達感興趣的ORF方面的效率，以及構建的方便性等。通過修飾外源基因的翻譯起始密碼子'ATG'周圍的核苷酸序列，以便它們包括有效的酵母翻譯起始序列可以在酵母中獲得最佳基因表達。具體地講，可以通過定點誘變增加低效表達的基因的表達，其中，所述低效表達的基因與內源酵母基因框內融合，優選與高表達的基因融合。另外，正如本發明中在解脂耶氏酵母中所證實的，可以確定宿主中的共有翻譯起始序列，並且通過工程手段將該序列結合到異源基因上，以便它們在感興趣的宿主中實現最佳表達。終止區可源於所述基因的3'區，所述起始區是從該基因上獲得的或者從不同的基因上獲得的。大量終止區是已知的，並且能在多種宿主中發揮令人滿意的作用(當在與產生它們的相同和不同的屬和種中使用時)。終止區通常在更大程度上是根據方便性選擇的，而不是因為任何特殊特性。優選的是，終止區源於酵母基因，特別是糖酵母屬，裂殖酵母屬，假絲酵母屬，耶氏酵母屬或克羅維酵母屬。同樣已知編碼Y-幹擾素和α-2幹擾素的哺乳動物基因的3'_區在酵母中起作用。終止控制區還可以來自優選宿主天然具有的各種基因。終止位點可以任選是必需的；不過，如果具有，它是最優選的。正如技術人員所了解的，僅僅將基因插入克隆載體，不能確保它能夠在需要的水平上成功地表達。根據對高表達速度的需要，業已通過操縱多種不同的遺傳因子產生了多種特化的表達載體，這些遺傳因子能控制來自宿主細胞的轉錄，翻譯，蛋白穩定性，含氧極限，以及從宿主的分泌。更具體地講，業已對某些分子特徵進行了操作，以便控制基因表達，包括1.)相關轉錄啟動子和終止子序列的性質；2.)克隆基因的拷貝數量以及所述基因是質粒攜帶的或者是整合到宿主細胞的基因組上的；3.)合成的外源蛋白的最終細胞定位；4.)宿主生物的翻譯效率；和5.)克隆的基因蛋白在宿主細胞中的內在穩定性。上述每一種類型的修飾包括在本發明中，作為進一步優化密碼子優化的PUFA生物合成途徑酶表達的手段。微生物宿主的轉化一旦獲得了適合在含油酵母中表達的編碼密碼子優化的去飽和酶或延伸酶多肽的DNA，將它放入能夠在宿主細胞中自主複製的質粒載體上，或者將它直接整合到宿主細胞的基因組上。表達盒的整合可以在宿主基因組中隨機地進行，或者可以通過使用含有與宿主基因組具有足夠同源性以靶定宿主基因座內的重組的區域的構建體靶定。當所述構建體被靶定於內源基因座時，轉錄和翻譯調控區的全部或某些可以通過內源基因座提供。當兩個或兩個以上的基因由獨立的複製載體表達時，希望每一個載體具有不同的選擇方式，並且應當缺少與其他構建體的同源性，以便保持穩定表達，並且防止構建體之間的元件的重新分類。對調控區，選擇方式和導入的構建體的繁殖方法的明智的選擇，可以通過實驗確定，以便所有導入的基因在需要的水平上表達，以便提供需要產物的合成。可以通過任何標準技術將包括感興趣的基因的構建體導入宿主細胞。所述技術包括轉化(例如，乙酸鋰轉化[MethodsinEnzymology，194186-187(1991)])，原生質體融合，bolistic衝擊，電穿孔，顯微注射，或能夠將感興趣的基因導入宿主細胞的任何其他方法。可用於含油酵母(即，解脂耶氏酵母)的更具體的技術包括美國專利號4，880，741和5，071，764和Chen，D.C.等(ApplMicrobiolBiotechnol.48(2):232_235(1997))。為了方便起見，業已通過任何方法操作以攝入DNA序列(例如，表達盒)的宿主細胞在本文中被稱作"轉化過的"或"重組的"。轉化過的宿主具有至少一個拷貝的表達構建體，並且可以具有兩個或兩個以上拷貝，這取決於所述基因是整合在所述基因組上，擴增的，或者存在於具有多個拷貝的染色體外元件上。轉化過的宿主細胞可以通過選擇包含在導入的構建體上的標記而鑑定。另外，可以將獨立的標記構建體與需要的構建體共同轉化，因為很多轉化技術能將很多DNA分子導入宿主細胞。通常，選擇轉化過的宿主在選擇性培養基上生長的能力。選擇性培養基可以摻入抗生素或缺少未轉化的宿主生長所需要的因子，如養分或生長因子。導入的標記基因可以產生抗生素抗性，或者編碼必須的生長因子或酶，以便當它在轉化過的宿主中表達時能夠在選擇培養基上生長。當所表達的標記蛋白可以直接或間接檢測時，還可以進行轉化宿主的選擇。所述標記蛋白可以單獨表達，或者作為與另一種蛋白的融合體形式表達。標記蛋白可以通過以下方法檢測1.)它的酶促活性(例如，β-半乳糖苷酶可以將底物X-gal[5-溴-4-氯-3-吲哚基一D-半乳吡喃糖苷]轉化成有顏色的產物；螢光素酶可以將螢光素轉化成發光產物)；或2.)它的產生光或修飾特徵(例如，Aequoreavictoria的綠色螢光蛋白在用蘭色光線照射時會發出螢光)。另外，例如，可將抗生素用於檢測存在於感興趣的蛋白上的標記蛋白或分子量標記。例如，能表達標記蛋白或標記的細胞可以肉眼篩選，或者通過諸如FACS的技術或使用抗生素淘選。為了選擇酵母轉化體，可以使用能夠在酵母中起作用的任何標記。理想的是，對卡那黴素，潮黴素和氨基糖苷G418的抗性是感興趣的，以及在缺少尿嘧啶或亮氨酸的培養基上生產的能力。在轉化之後，將適合本發明的密碼子優化的序列的基因產物(並且任選包括在宿主細胞中表達的其他PUFA酶)可以由所述宿主天然地或轉基因地生產，或者它們可以外源提供。ω-3和/或ω-6脂肪酸在微生物中的生物合成的代謝工程對本發明基因的密碼子優化的序列以及優化其他PUFA基因以便在含油酵母中表達的方法的了解，可用於操作在含油酵母中的ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成；特別是在解脂耶氏酵母中。這可能需要在PUFA生物合成途徑上的直接的代謝工程或途徑的其他操作，這些操作可以將碳貢獻給PUFA生物合成途徑。可用於操作生物化學途徑的方法為本領域技術人員所公知。在PUFA生物合成途徑內操作的情況下，可能需要增加LA的生產，以便增加ω-3和/或ω-6脂肪酸的生產。這可以通過導入和/或擴增編碼八9和/或Δ12去飽和酶的基因而實現。為了使ω-6不飽和脂肪酸，如ARA的生產最大化，本領域技術人員公知，該生產在基本上不含ALA的宿主微生物中是有利的。因此，優選地，宿主是通過去除或抑制使得LA轉化為ALA的Δ15或ω-3型去飽和酶活性而選擇或獲得的。可以通過以下方法減少或消除內源去飽和酶活性，例如1)提供用於將反義序列轉錄到△15去飽和酶轉錄產物的盒；2)通過插入、取代和/或缺失全部或部分靶基因而破壞Δ15去飽和酶基因；或3)使用天然具有或經過突變而具有低△15去飽和酶活性或無△15去飽和酶基因的宿主細胞。對不需要的去飽和酶途徑的抑制也可以通過使用如U.S.4，778，630中描述的特定去飽和酶抑制劑而實現。或者，可能需要使ω-3脂肪酸的生產最大化(並且使ω-6脂肪酸的合成最小化)。因此，可以利用宿主微生物，其中利用上述任何一種方法(也參見，例如，共同未決的美國臨時申請No.60/484209，在此全文引入作為參考)去除或抑制了將油酸轉化為LA的Δ12去飽和酶活性。隨後，可以將合適的表達盒與合適的底物(如ALA)—起導入宿主，用於轉化為ALA的ω-3脂肪酸衍生物(如STA,ETA,EPA,DPA,DHA)。除了目前的PUFA生物合成途徑，預期操作導致前體脂肪酸生物合成的一些其它酶促途徑，可以導致特定PUFAs的總體淨生物合成。這些相關途徑的鑑定和途徑在將來是有用的。上調需要的牛物合成塗徑的技術可以將額外拷貝的去飽和酶和延伸酶基因導入宿主，以便提高ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑的產量。去飽和酶或延伸酶基因的表達還可以通過使用較強的啟動子(調控型的或組成型的)而在轉錄水平上加強，以便導致增強了的表達，包括從mRNA或編碼的蛋白上去掉/缺失去穩定化序列，或者向mRNA增加穩定化序列(U.S.4，910，141)。正如本發明所證實的，增強去飽和酶或延伸酶基因表達的另一個途徑是提高所編碼的mRNAs的翻譯效率，包括用能在選定的宿主中優化基因表達的密碼子取代天然基因上的密碼子。下調不希望的生物合成途徑的技術相反，可以通過基因破壞消除或通過其他方式(例如，反義mRNA)下調與ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑競爭能量或碳的生物化學途徑，或幹擾特定PUFA最終產物產生的天然PUFA生物合成途徑酶。為了進行基因破壞，將外源DNA片段(通常是選擇標記基因)插入要破壞的結構基因，以便破壞它的編碼序列，並因此功能性滅活所述基因。將所述破壞盒轉化入宿主細胞，導致了非通過同源重組用無功能的破壞的基因替代功能性天然基因(例如，參見=Hamilton等J.Bacteriol.1714617-4622(1989)；Balbas等Gene136:211-213(1993)；Gueldener等NucleicAcidsRes.242519-2524(1996)；和Smith等MethodsMol.Cell.Biol.5:270_277(1996))。當靶基因的序列已知時，反義是下調基因的另一種方法。為了實現這一目的，克隆了來自所需基因的核酸片段，並且可操作地與啟動子連接，以便RNA的反義鏈能夠轉錄。然後將該構建體導入宿主細胞，並且生產RNA的反義鏈。反義RNA能通過抑制編碼感興趣的蛋白的mRNA的積累，抑制基因表達。本領域技術人員可以理解的是，特殊考慮與使用反義技術相關，以便減弱特定基因的表達。例如，反義基因的適當水平的表達可能需要使用不同的嵌合基因，其中採用本領域技術人員所公知的不同的調控元件。儘管當序列已知時，定向基因破壞和反義技術提供了下調基因的有效方法，業已開發了不是基於序列的其他特異性更低的方法，例如，細胞可以暴露於UV輻射，然後篩選需要的表型。用化學試劑進行的誘變同樣能有效產生突變體，並且通常使用的物質包括能影響非複製DNA的化學物質(例如，HNO2和NH2OH)，以及能影響複製DNA的試劑(例如，吖啶染料，特別是導致移碼突變)。使用輻射或化學試劑產生突變體的特定方法在現有技術有大量報導。例如，參見ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded.(1989)SinauerAssociates:Sunderland,MA；或Deshpande,MukundV.,App1.Biochem.Biotechnol.,36227(1992)。基因破壞的另一種非特異性方法是使用可轉座元件或轉座子。轉座子是遺傳元件，它能隨機地插入DNA，但是隨後可以根據序列回收，以便確定是否發生了插入。體內和體外轉座轉座方法是公知的。這兩種方法涉及組合使用可轉座元件和轉座酶。當可轉座元件或轉座子在存在轉座酶的條件下與核酸片段接觸時，可轉座元件能隨機地插入所述核酸片段。這種技術可用於隨機誘變，並且用於基因分離，因為受到破壞的基因可以根據可轉座元件的序列鑑定。用於體外轉座的試劑盒可以通過商業渠道獲得[例如，參見1.)ThePrimerIslandTranspositionKit,可以從PerkinElmerAppliedBiosystems獲得，Branchburg,NJ，基於酵母Tyl元件；2.)TheGenomePrimingSystem，可以從NewEnglandBiolabs獲得，Beverly,MA，基於細菌轉座子Tn7；和3.)ΕΖ:ΤΝ轉座子插入系統，可以從EpicentreTechnologies獲得，Madison,WI，基於Tn5細菌轉座因子]。在本發明的範圍內，可以通過上述另一種方法將它用於調控脂肪酸生物合成途徑的表達。例如，本發明提供了將編碼生物合成途徑上的關鍵酶的基因導入含油酵母以生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。這些基因編碼以下一種或多種Δ6去飽和酶，Δ5去飽和酶，Δ12去飽和酶，Δ15去飽和酶，Δ4去飽和酶，Δ17去飽和酶，Δ9去飽和酶，和PUFA延伸酶。特別適用於在含油酵母中表達這些基因，所述酵母天然不具有ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途徑，並且調控這些和其他PUFA生物合成基因的表達，以便使用各種方法使優選的PUFA產物的產量最大化，用於宿主生物的代謝工程。用於重組生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的優選的微生物宿主用於生產ω脂肪酸的宿主細胞可以包括包括在大範圍的溫度和ρΗ值下，在多種飼料上生長的微生物宿主，所述飼料包括簡單的或複雜的碳水化合物，有機酸和醇，和/或烴。但是，優選的微生物宿主是含油酵母。這些生物可天然地進行油類合成和積累，所述油包括超過大約25%的細胞乾重，更優選超過大約30%的細胞乾重，最優選超過大約40%的細胞乾重。通常被確定為含油酵母的屬包括，但不局限於耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，典型的油類合成酵母包括類酵母紅冬孢，斯達氏油脂酵母，產油油脂酵母，拉可夫氏假絲酵母，鐵紅假絲酵母，熱帶假絲酵母，產朊假絲酵母，茁芽絲孢酵母，皮狀絲孢酵母，膠粘紅酵母，禾木科紅酵母，和解脂耶氏酵母(以前被劃分為解脂假絲酵母)。最優選的是含油酵母解脂耶氏酵母；而在其他實施方案中，最優選的是解脂耶氏酵母菌株，被命名為ATCC#20362，ATCC#8862,ATCC#18944,ATCC#76982和/或LGAMS(7)KPapanikolaouS.，和AggelisG.,Bioresour.Technol.82(1):43_9(2002))。過去，已經用解脂耶氏酵母的多種菌株製備和生產異檸檬酸裂合酶(DD259637)；脂酶(SU1454852，W02001083773，DD279267)；多羥基鏈燒酸(W02001088144)；檸檬酸(RU2096461，RU2090611,DD285372,DD285370,DD275480,DD227448,PL160027)；赤蘚糖醇(EP770683)；2-氧戊二酸(DD267999)；Y-癸內酯(U.S.6,451,565,FR2734843)；Y-十二內酯(EP578388)和丙酮酸(JP09252790)。PUFA牛產的發酵方法轉化過的微生物宿主細胞是在能優化去飽和酶和延伸酶的活性並且產生最大的和最經濟的優選PUFAs的產量的條件下生長的。一般，可以優化的培養基條件包括碳源的類型和用量，氮源的類型和用量，碳-氮的比例，氧氣含量，生長溫度，PH，生物量生產期的長度，油積累期的長度，以及細胞收穫時間。感興趣的微生物，如含油酵母在複雜培養基(例如，酵母提取物-蛋白腖-葡萄糖培養液(YPD))或缺少生長所必需的成分，以便強制選擇需要的表達盒的特定基本培養基)(例如，YeastNitrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI))中生長。本發明的發酵培養基必須包括合適的碳源。合適的碳源包括，但不局限於單糖(例如，葡萄糖，果糖)，二糖(例如，乳糖，蔗糖)，寡糖，多糖(例如，澱粉，纖維素或它們的混合物)，糖醇(例如，甘油)或可更新飼料的混合物(例如，乾酪乳清滲透物，玉米漿，甜菜糖漿，大麥芽)。另外，碳源可以包括鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油單酯，甘油二酯，甘油三酯，磷脂，和脂肪酸的各種商業來源，包括植物油(例如，大豆油)和動物脂肪。另外，碳源可以包括一-碳源(例如，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸和含碳胺)，業已證實了其轉化成關鍵生物化學中間產物的代謝轉化。因此，預計，用於本發明的碳源包括可以包括多種含碳源，並且僅僅局限於宿主生物的選擇。儘管上述所有碳源及其混合物預計都適合本發明，優選的碳源是糖和/或脂肪酸。最優選的是葡萄糖和/或含有10-22個碳的脂肪酸。氮可以由無機(例如，(NH4)2SO4)或有機來源(例如，尿素或穀氨酸)提供。除了合適的碳和氮源之外，發酵培養基必須還包括合適的礦物質，鹽，輔因子，緩衝液，維生素，和本領域技術人員已知的適合微生物生長，並且促進PUFA生產所需要的酶促途徑的其他成分。特別關注若干金屬離子(例如，Mn+2，Co+2，Zn+2，Mg+2)，它們能促進脂類和PUFAs的合成(Nakahara,T.等，Ind.Appl.SingleCellOils,D.J.KyleandR.Colin,eds.pp61-97(1992))。本發明的優選的生長培養基是常見的商業製備的培養基，如酵母MtrogenBase(DIFCOLaboratories,Detroit,MI)。其他確定的或合成的生長培養基也可以使用，並且適合特定微生物生長的培養基是微生物學或發酵科學領域的技術人員所公知的。用於發酵的合適的PH範圍通常為大約pH4.0-pH8.0，其中pH5.5-pH7.O是起始生長條件的優選範圍。發酵可以在需氧或厭氧條件下進行，其中，微需氧條件是優選的。通常，高水平PUFAs在含油酵母細胞中的積累，需要兩個階段的過程，因為在脂肪的生長和合成/儲存之間的代謝狀態必須是"平衡的"。因此，最優選的是，需要兩個階段的發酵過程在含油酵母中生產PUFAs。在該方法中，發酵的第一階段被用於製備和積累細胞物質，並且以快速細胞生長和細胞分裂為特徵。在發酵的第二階段，優選在培養物中建立氮剝奪條件，以便促進高水平的脂類積累。這種氮剝奪的作用是降低細胞中AMP的有效濃度，以便減弱線粒體的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶的活性。當出現這種情況時，將積累檸檬酸，因此在細胞質中形成了乙醯-CoA的豐富的資源，並且啟動了脂肪酸合成。因此，這一階段以細胞分裂終止，隨後是脂肪酸的合成和油的積累為特徵。儘管細胞通常是在大約30°C下生長的，某些研究業已在較低溫度下增加了不飽和月旨肪酸的合成(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.57:419_25(1991))。根據工藝的經濟學，這種溫度偏移可能在兩個階段的發酵的第一階段之後發生，此時，業已出現了大量的微生物生長。預計，可以採用多種發酵工藝設計，其中，使用本發明的密碼子優化的基因商業化生產ω脂肪酸是理想的。例如，用重組微生物宿主商業生產PUFAs，可以通過分批發酵，補料_分批發酵活連續發酵工藝生產。分批發酵工藝是封閉的系統，其中，培養基組成是在工藝開始時確定的，並且不再進行超出在工藝過程中維持PH和氧氣含量需要的進一步補充。因此，在培養過程開始時，用需要的微生物接種所述培養基，並且可以在不向培養基中添加其他來源(即，碳和氮源)條件下具有生長或代謝活性。在分批發酵工藝中，該系統的代謝物和生物量組成經常地改變，直到培養終止。在典型的分批發酵工藝中，細胞從停滯階段發展到高速生長的對數期，並最終達到靜止期，在這裡，生長速度減弱或終止。在不處理的條件下，靜止階段的細胞會最終死亡。標準的分批發酵工藝的變化是補料-分批發酵工藝，其中，在發酵過程中將碳源連續地添加到發酵罐中。補料-分批發酵工藝同樣適用於本發明。當代謝物抑制傾向於抑制細胞代謝或希望在任何時間在培養基中具有有限數量的來源時，補料_分批工藝是有用的。測定補料-分批系統中的碳源是困難的，因此，可以根據可測定因子的變化估算，如PH，溶解氧和廢氣(例如，CO2)的分壓。分批和補料-分批培養方法是本領域技術人員所公知的和熟悉的，並且其例子可以參見以下文獻ThomasD.Brock,Biotechnology=ATextbookofIndustrialMicrobiology.2nded.,(1989)SinauerAssociates:Sunderland,MA；gJcDeshpande，MukundV.，Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)，在此收作本文參考。利用本發明的密碼子優化的基因商業化生產ω脂肪酸的方法還可以通過連續發酵工藝實現，其中，將確定成分的培養基連續添加到生物反應器中，同時取出等量的培養物體積，用於產物回收。連續培養通常將細胞保持在恆定細胞密度的對數生長期。連續或半連續培養方法能夠調節會影響細胞生長或最終產物濃度的一種因素或多種因素中的任意一種。例如，一種方法可以限制碳源，並且允許所有其他參數適當地代謝。在其他系統中，可以連續地改變影響生長的多種因素，同時保持通過培養基濁度測定的細胞濃度恆定。連續系統試圖保持穩態生長，因此，細胞生長速度必須與由於將培養基從培養物中排出而導致的細胞減少。調節連續培養工藝的營養成分和生長因子的方法，以及用於增加生產形成速度的技術為工業微生物學領域所熟知，並且上文提到的Brock詳細披露了多種方法。PUFAs的純化PUFAs可以作為游離脂肪酸形式出現在宿主微生物中，或者以諸如醯基甘油，磷脂，硫脂或醣脂的脂化形式出現，並且可以通過本領域所熟知的多種方法從宿主細胞中提取。酵母脂類的提取技術，品質分析和可接受性標準的一種概述是以下文獻Z.Jacobs(CriticalReviewsinBiotechnology12(5/6):463_491(1992))。有關下遊加工的簡單概述還可以參見A.Singh和0.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45:271_312(1997))。一般，純化PUFAs的方法可以包括用有機溶劑萃取，超聲波處理，超臨界流體萃取(例如，使用二氧化碳)，皂化和物理方法，如壓力，或它們的組合。特別感興趣的是用甲醇和氯仿在存在水的條件下萃取(E.G.，Bligh&W.J.Dyer,Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))。如果需要，可以將含水層酸化，以便使帶負電荷的部分質子化，並因此增加了想得到的產物向有機層中的分配。在萃取之後，可以通過在氮氣流下蒸發除去有機溶齊U。當以綴合形式分離時，可以對所述產物進行酶促或化學裂解，以便釋放游離的脂肪酸或感興趣的更低複雜性的綴合物，並且然後可以進行進一步的操作，以便生產需要的最終產物。理想的是，用氫氧化鉀裂解脂肪酸的綴合形式。如果需要進一步純化，可以採用標準方法。所述方法可以包括萃取，用尿素處理，分級結晶化，HPLC，分級蒸餾，矽膠層析，高速離心或蒸餾，或這些技術的組合。對諸如酸或烯基的活性基團的保護，可以在任何步驟通過已知技術(例如，烷基化，離子化)完成。所使用的方法包括脂肪酸甲基化，以便產生甲酯。類似地，可以在任何步驟除去保護基團。理想的是，純化含有GLA，STA,ARA,DHA和EPA的級份可以通過用尿素處理和/或分級蒸餾實現。優詵實施方案的說明本發明證明了將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導入含油酵母以生產PUFAs的可行性。為此，選擇ARA(代表ω-6脂肪酸)和EPA(代表ω-3脂肪酸)作為在含油酵母-解脂耶氏酵母中生產的需要的產物。因此，ARA的合成需要將編碼Δ6去飽和酶、延伸酶和Δ5去飽和酶活性的基因導入耶氏酵母，而EPA的合成需要將編碼Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶活性的基因導入耶氏酵母。在解脂耶氏酵母中表達來自多種生物的多種公共可獲得的，具有將DGAL轉化為ARA和將ETA轉化為EPA的能力的Δ5去飽和酶，並且篩選其活性，以便鑑定在替代的宿主中顯示最高水平活性的基因。在此基礎上，選擇高山被孢黴Δ5去飽和酶(SEQIDNO4)作為在含油酵母中表達的優選基因，這是基於其將底物補料試驗中大約30%細胞內DGLA轉化為ARA的能力而選擇的。進行了其它底物補料試驗，以證明由以下基因編碼的酶活性高山被孢黴Δ6去飽和酶(SEQIDNO2)將LA轉化為GLA，並且將ALA轉化為STA(其中解脂耶氏酵母中LA至GLA的底物轉化百分比為約30%)；異絲水黴Δ17去飽和酶(SEQIDNO6)將DGLA轉化為ΕΤΑ，並且將ARA轉化為EPA(其中解脂耶氏酵母中ARA至EPA的底物轉化百分比為約23%)；高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶(SEQIDNO8)將GLA轉化為DGLA，將STA轉化為ΕΤΑ，並且將EPA轉化為DPA(其中解脂耶氏酵母中GLA至DGLA的底物轉化百分比為約30%)。根據異絲水黴Δ17去飽和酶更低的底物轉化百分比(相對於Δ5和Δ6去飽和酶和延伸酶)，對該特定基因進行密碼子優化以便增強其在耶氏酵母屬中的表達。這是通過確定解脂耶氏酵母中的密碼子選擇和結構基因標誌，指定密碼子優化的△17去飽和酶基因，然後體外合成該基因，並且使其在替代的宿主中的效率增加(相對於野生型基因)而實現的。為了合成ARA或ΕΡΑ(由此證明含油宿主經過工程改造以生產ω-6和ω-3脂肪酸(即ARA和EPA)的能力)，隨後製備了兩種不同的DNA表達構建體1)第一種含Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶；和2)第二種構建體含Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、高親和力PUFA延伸酶和密碼子優化的Δ17去飽和酶。將兩種構建體分別轉化到解脂耶氏酵母中，並且整合到編碼乳清苷-5'_磷酸脫羧酶的染色體URA3基因中(EC4.1.1.23)。用合適的底物補料的宿主細胞的GC分析檢測到了ARA(實施例5)和EPA(實施例6)的產生。因此，這是第一次證實了含油酵母中的PUFA生物合成，從而將ω-3和/或ω-6生物合成途徑導入了含油酵母中。根據此處描述的教導和結果，預計本領域技術人員將認識到通過採用含油酵母作為合成多種ω-3和/或ω-ePUFA的生產平臺而建立的可行性和商業用途。實施例本發明還確定了以下實施例。應當理解的是，在這些實施方案中，儘管指明了是本發明的優選實施方案，但是，是以說明形式提供的。通過上述討論和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的實質性特徵，並且，在不超出本發明的構思和範圍的前提下，可以對本發明進行各種改變和改進，以便適應各種用途和條件。一般方法用於實施例中的標準重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知的，並且披露於以下文獻中1.)Sambrook，J.，Fritsch，Ε.F.andManiatis，Τ.MolecularCloning:ALaboratoryManual；ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)Τ.J.Silhavy,Μ.L.Bennan,andL.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions；ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1984)；禾口3.)Ausubel,F.Μ.等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-interscience(1987)。適合微生物培養物維持和生長的材料和方法為本領域所公知。適合在以下實施例中使用的技術可以參見以下文獻ManualofMethodsforGeneralBacteriology(PhillippGerhardt,R.G.Ε.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.KriegandG.BriggsPhilips，Eds)，AmericanSocietyforMicrobiology:Washington,D.C.(1994))；或參見ThomasD.BrockinBiotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,2nded·，SinauerAssociatesSunderland,MA(1989)。用於生長和保持微生物細胞的所有試劑，限制酶和材料都是JAAldrichChemicals(Milwaukee,WI)，DIFCOLaboratories(Detroit,MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或SigmaChemicalCompany(St.Louis,MO)獲得的，除非另有說明。大腸桿菌(XLl-Blue)感受態細胞是從Stratagene公司(SanDiego,CA)購買的。大腸桿菌菌株通常是在37°C下在LuriaBertani(LB)平板上生長的。按照標準方法(Sambrook等，同上)進行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring,TX)合成的。用Stratagene'sQuickChange定點誘變試劑盒進行定點誘變，按照生產商的說明進行。當聚合酶鏈反應(PCR)或定點誘變與亞克隆相關時，對所述構建體進行測序，以便證實沒有將誤差導入所述序列。將PCR產物克隆到Promega'spGEM-T-easy載體(Madison，WI)上。DNA序列是利用染料終止技術(U.S.5，366，860;EP272，007)和載體與插入片段特異性引物的組合在ABI自動測序儀上生成的。序列編輯在SequencheHGeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)中進行。所有序列在兩個方向上均表現了至少兩次的覆蓋。遺傳序列的比較是利用DNASTAR軟體(DNAStar,Inc.)實現的。或者，遺傳序列的操作是使用可以從GeneticsComputerGroupInc.(ffisconsinPackageVersion9.O,GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)獲得的程序組進行的。使用了所述GCG程序〃Pileup"，空位形成預設值為12，空位延伸預設值為4。使用了GCG〃Gap「或"Bestfit"程序，預設的空位形成罰分為50，預設的空位延伸罰分為3。除非另有說明，在所有其他場合下，都使用GCG程序的預設參數。縮寫的含義如下「sec"表示秒，「min"表示分鐘，「h〃表示小時，「d〃表示天，「PL"表示微升，「mL〃表示毫升，「L"表示升，丨『μΜ〃表示微摩爾，「mM"表示毫摩爾，「M〃表示摩爾，「mmol"毫摩爾，「ymole"表示微摩爾，「g〃表示克，「Pg"表示微克，「ng"表示納克，「U"表示單位，「bp"表示鹼基對，而〃kB〃表示千鹼基。解脂耶氏酵母的培養解脂耶氏酵母菌株ATCC#76982和ATCC#90812購自美國典型培養物保藏中心(Rockville,MD)0解脂耶氏酵母菌株通常在28°C條件下生長在YPD瓊脂(1%酵母提取物、2%細菌用蛋白腖、2%葡萄糖、2%瓊脂)上。為選擇轉化體，採用的是基本培養基(不含硫酸銨或胺基酸的0.17%酵母氮源(NIFC01^130儀切1^68，06廿0^，]\0)、2%葡萄糖、0.脯氨酸、pH6.1)。作為補充的腺嘌呤、亮氨酸、賴氨酸和/或尿嘧啶是被適當地加入直至終濃度0.01%。解脂耶氏酵母的脂肪酸分析為了分析脂肪酸，先通過離心收集細胞，並如Bligh，E.G.&Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))所述方法提取脂質。脂肪酸甲酯是通過下述方法製備的，即用甲氧基鈉使脂質提取物轉酯(Roughan，G.和NishidaI.ArchBiochemBiophys.276(1)38-46(1990)),並接著用裝配有30_mX0·25讓(內徑)HP-INNOffAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC對其進行分析。烘箱溫度以3.5°C/分鐘的速度從170°C(保持25分鐘)上升至185°C。為了直接進行鹼基轉酯，先收穫耶氏酵母培養物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，並在Speed-Vac內的真空條件下乾燥5-10分鐘。向樣品中加入甲氧基鈉(100μ1，1%)，接著渦旋並振搖樣品20分鐘。加入3滴IMNaCl和400μ1己烷後，渦旋並離心樣品。移出上層並如上所述通過GC對其進行分析。實施例1豐勾建i舌合在解H旨耶氏酵母Φ表達原基因的Jli來立構建了質粒ρΥ5,即ρΙΝΑ532(由Dr.ClaudeGaillardin饋贈，InsitutNationalAgronomics,CentredebiotechnologieAgro—Industrielle,laboratoiredeGenetiqueMoleculaireetCellularielNRA—CNRS，F—78850Thiverval-Grignon,France)行生物，用於在解脂耶氏酵母中表達異源基因，如圖2所示。首先，將包括ρΙΝΑ532的ARS18序列和LEU2基因的部分消化的3598bpEcoRl片段亞克隆到pBluescript(Strategene，SanDiego,CA)的EcoRl位點上，以便製備pY2。通過PCR擴增來自解脂耶氏酵母基因組DNA的TEF啟動子(MullerS.，等，Yeast，141267-1283(1998))，用TEF5'(SEQIDNO:38)禾口TEF3『(SEQIDN0:39)作引物。PCR擴增是在50μ1的總體積中進行的，它包括IOOng耶氏酵母屬基因組DNA，含有IOmMKCl的PCR緩衝液，IOmM(NH4)2S04,20mMTris-HCl(pH8.75),2mMMgSO4,0.1%TritonX-100，100μg/mLBSA(最終濃度)，200μM每一種脫氧核糖核苷三磷酸，10皮摩爾每一種引物和1μ1的PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，SanDiego,CA)。擴增是按以下方法進行的首先在95°C下變性3分鐘，然後進行35輪以下循環95°C1分鐘，56°C30秒，72°C1分鐘。在72°C下進行了10分鐘的最終延伸，然後在4°C下終止反應。將418的PCR產物連接到pCR-Blunt上，以便製備pIP-tef。將pIP-tef的BamHI/EcoRV片段亞克隆到pY2的BamHI/Smal位點上，以便製備ρΥ4。使用ρΙΝΑ532作模板，用XPR5'(SEQIDNO40)和XPR3'(SEQIDNO41)作弓丨物，通過PCR擴增XPR2轉錄終止子。PCR擴增是在50μ1的總體積中進行的，使用上述成分和條件。用SacII消化179bp的PCR產物，然後連接到pY4的SacII位點上，以便製備ρΥ5。因此，ρΥ5(參見圖3和4)可用作耶氏酵母屬_大腸桿菌穿梭質粒，它包括1.)耶氏酵母屬自主複製序列(ARS18)；2.)ColEl質粒複製起點；3.)氨苄青黴素-抗性基因(AmpK)，用於在大腸桿菌中選擇；4.)耶氏酵母屬LEU2基因(E.C.4.2.1.33，編碼異丙基蘋果酸異構酶，用於在耶氏酵母屬中選擇)；5.)翻譯延伸啟動子(TEFP)，用於在耶氏酵母屬中表達異源基因；和6.)細胞外蛋白酶基因終止子(XPR2)，用於在耶氏酵母屬中表達的異源基因的轉錄終止。作為pY5的衍生物構建了ρΥ5_13(圖4)，以便促進在解脂耶氏酵母中的亞克隆和異源基因表達。用ΡΥ5作模板，通過6輪定點誘變構建ρΥ5-13。通過用寡核苷酸YL5和YL6(SEQIDNOs106和107)進行定點誘變將SaII和ClaI位點從ρΥ5上消除，以便製備ΡΥ5-5。通過用寡核苷酸YL9和YLlO(SEQIDN0s:110和111)進行定點誘變將SaII位點導入ρΥ5-5的LEU2基因和TEF啟動子之間，以便製備ρΥ5_6。用寡核苷酸YL7和YL8(SEQIDNOs108和109)將PacI位點導入ρΥ5_6的LEU2基因和ARS18之間，以便製備ρΥ5_8。使用寡核苷酸YL3和YL4(SEQIDNOs104和105)將NcoI位點導入pY5_8的TEF啟動子的翻譯起始密碼子周圍，以便製備ΡΥ5-9。使用YLl和YL2寡核苷酸(SEQIDN0s:102和103)將pY5-9的LEU2基因的NcoI位點消除，以便製備pY5_12。最後，用寡核苷酸YL61和YL62(SEQIDNOs88和89)將BsiffI位點導入ρΥ5_12的ColEl和XPR2區之間，以便製備ΡΥ5-13。為了促進亞克隆，構建了質粒ρΥ5的第二種衍生物。具體地講，用ρΥ5作模板，通過三輪定點誘變構建了ρΥ5-4(圖4)。用寡核苷酸YLl和YL2(SEQIDNOs102和103)將位於Leu2報導基因上的NcoI位點位點從pY5除去，以便製備ρΥ5_1。通過用寡核苷酸YL3和YL4(SEQIDNOs104和105)進行定點誘變將NcoI位點導入ρΥ5_1的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，以便製備ΡΥ5-2。然後使用寡核苷酸YL23和YL24(SEQIDN0s:112和113)將PacI位點導入pY5-2的TEF啟動子和XPR2轉錄終止子之間，以便製備pY5_4。實施例2對用幹在解脂耶氏酵母內表汰的A17去飽,和_和高親和力PUFA延伸酶基因的詵擇將編碼ω-3和/或ω-6生物合成途徑的特異性基因導入含有已破壞的Δ12去飽和酶的解脂耶氏酵母內之前，有必要證實在耶氏酵母屬中表達的異源Δ6去飽和酶、延伸酶、Δ5去飽和酶和Δ17去飽和酶基因的功能性。這是通過測定各野生型蛋白在可選宿主內的轉化效率而得以實現的。具體而言，即分別表達高山被孢黴Δ5去飽和酶、高山被孢黴Δ6去飽和酶、異絲水黴Δ17去飽和酶和高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶，並在底物補料試驗中進行活性篩選。根據這些結果，選擇高山被孢黴基因與Δ6和△17去飽和酶以及高親和力PUFA延伸酶組合。表汰質粒的構建通常是通過限制酶切消化分離野生型去飽和酶或延伸酶基因，或通過PCR擴增，並將其插入合適的載體中進行表達。各PCR擴增均在總體積為50μ1並包括PCR緩衝液的反應混合物中進行，所述PCR緩衝液含有IOng模板、IOmMKCl、IOmM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(ρΗ8·75)、2mMMgSO4^O.1%TritonX-100U00μg/mLBSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為IOpmole的各種引物和1μ1PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene,SanDiego,CA)。擴增步驟如下(除非另外指明)95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1分鐘、56°C30秒、72°C1分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。野生型高山被孢黴(登錄號#AF465281)Δ6去飽和酶將包括高山被孢黴Δ6去飽和酶基因(SEQIDNO1)的1384bp的pCGR5的NcoI/NotI片段(U.S.5，968，809)插入pY5_2的NcoI/NotI位點(實施例1)上，以便製備pY54。野生型高山被孢黴(登錄號#AF067654)A5去飽和酶通過以寡核苷酸YLll和YL12(SEQIDNOs:72和73)為引物、以質粒pCGR-4(U.S.6，075，183)為模板進行PCR擴增高山被孢黴Δ5去飽和酶基因(SEQIDNO:3)。PCR擴增步驟如上所述，但延伸步驟延長至1.5分鐘(對循環1-35而言)。用Ncol/Notl消化1357bp的PCR產物，並與Ncol/Notl消化的pY5-13(如實施例1所述)連接生成pYMA5bp(圖5)。野生型異絲水黴(ATCC#56851)Δ5去飽和酶通過PCR，用寡核苷酸YL13A和YL14(SEQIDNOs:116和117)作引物，用質粒pRSP3(W002/081668)作模板，擴增異絲水黴Δ5去飽和酶基因(SEQIDNO:114)。PCR擴增步驟如上所述，但延伸步驟延長至1.5分鐘(對循環1-35而言)。用NcoI/PacI消化1.4kB的PCR產物，然後連接到NcoI/PacI-消化過的pY5_4上(圖4；參見實施例1)，以便製備pYSD5。野生型IsochrysisRalbanaCCMP1323Δ5去飽和酶通過PCR，用寡核苷酸YL19A和YL20(SEQIDNOs120和121)作引物，用質粒pRIG-l(W002/081668)作模板，擴增I.galbanaΔ5去飽和酶基因(SEQIDN0:118)。PCR擴增步驟如上所述，但延伸步驟延長至1.5分鐘(對循環1-35而言)。用BamHI/PacII消化1.4kB的PCR產物，然後連接到BamHI/PacII-消化過的pY5_4上(圖4；參見實施例1)，以便製備PYIG5。野牛型Thraustochytriumaureum(ATCC#34304)Δ5去飽和酶通過PCR，用寡核苷酸YL15和YL16B(SEQIDNOs124和125)作引物，用質粒pRTA4(W002/081668)作模板，擴增Τ.aureumΔ5去飽和酶基因(SEQIDNO:122)。PCR擴增步驟如上所述，但延伸步驟延長至1.5分鐘(對循環1-35而言)。用Ncol/Ncol消化1.4kB的PCR產物，然後連接到Ncol/Ncol-消化過的pY5_2上(圖4；參見實施例1)，以便製備ΡΥΤΑ5。野牛型異絲水黴(ATCC#56851)A17去飽和酶通過PCR，用寡核苷酸YL21A(SEQIDNO42)和YL22(SEQIDNO43)作引物，由質粒pRSP19(US2003/0196217Al)擴增異絲水黴的野生型Δ17去飽和酶基因。用NcoI/PacI消化PCR產物，然後連接到NcoI/PacI-消化過的pY5_4上(圖4；參見實施例1)，以便製備PYSD17。野牛型高山被孢黴(登錄號#ΑΧ464731)高親和力延伸酶將包括高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶基因的編碼區(SEQIDNO7)的pRPB2的973bp的NotI片段(W000/12720)插入pY5的NotI位點(實施例1；圖3和4)，以便製備ρΥ58。解脂耶氏酵母的轉化按照Chen，D.C.等(ApplMicrobiolBiotechnol.48(2):232-235_(1997))的方法將質粒pY54，pYMA5pb,pYSD5，pYIG5，PYTA5，pYSD17和pY58分別轉化到解脂耶氏酵母ATCC#76982中。簡單地講，將耶氏酵母屬的亮氨酸營養缺陷型在YPD平板上劃線，並且在30°C下生長大約18小時。將幾個大環的細胞從平板上刮下來，並且重新懸浮在ImL的轉化緩衝液中，該緩衝液包括·2.25mL的50%PEG,平均分子量3350；·0.125mL的2M乙酸鋰，pH6.O；·0.125mL的2MDTT；禾口·50μg的剪切的鮭魚精子DNA。在100μ1的重新懸浮的細胞中溫育大約500ng的質粒DNA，並且在39°C下保持1小時，以15分鐘的間隔進行渦旋混合。將細胞鋪平板到缺少亮氨酸的基本培養基平板上，並且在30°C下保持2-3天。底物轉化百分比的測定含有pY54，pYMA5pb,pYSD5,pYIG5,PYTA5,pYSD17或pY58的轉化解脂耶氏酵母的單個菌落分別在3mL基本培養基(20g/L葡萄糖，1.7g/L酵母氮基質，不含胺基酸，lg/LL-脯氨酸，0.lg/LL-腺嘌呤，0.lg/LL-賴氨酸，pH6.1)中，在30°C下生長到OD6c大約為1.0。為了進行底物補料，將100μ1的細胞放在含有10μg底物的3mL基本培養基中在30°C下繼代培養大約24小時。然後通過離心收集細胞，並提取脂類。脂肪酸甲酯是通過轉酯製備的，隨後進行GC分析(如一般方法中的描述)。底物轉化百分比按以下公式測定([產物]/[底物+產物])*100)。野生型高山被孢黴△6去飽和酶的底物轉化百分比高山被孢黴Δ6去飽和酶能將LA轉化成GLA和/或將ALA轉化成STA。含有ρΥ54的解脂耶氏酵母菌株按上述方法生長(不需要補充底物)，並且分析脂類。結果表明，具有PY54的耶氏酵母屬菌株能將大約30%LA轉化成GLA。高山被孢黴、異絲水黴、I.galbana和T.aureumA5去飽和酶的底物轉化百分比高山被孢黴、異絲水黴、I.galbana和T.aureum的Δ5去飽和酶都將DGLA轉化為ARA,並且將ETA轉化為ΕΡΑ。分別從單個菌落生長含pYMA5pb，pYSD5，pYIG5或pYTA5的解脂耶氏酵母菌株，在含有10μg的ARA的基本培養基中繼代培養，並且按上述方法進行脂類分析。含有pYMA5pb(高山被孢黴)的耶氏酵母菌株將大約30%的細胞內DGLA轉化為ARA，含有pYSD5(異絲水黴)的耶氏酵母菌轉化大約12%，含有pYIG5(I.galbana)的耶氏酵母菌轉化大約7%，含有pYTA5(T.Aureum)耶氏酵母菌轉化大約23%的細胞內DGLA轉化為ARA。野牛型異絲水黴Δ17去飽和酶的底物轉化百分比異絲水黴Δ17去飽和酶能將ARA轉化成EPA和/或將DGLA轉化成ΕΤΑ。含有PYSD17的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長的，在含有10μg的ARA的基本培養基中繼代培養，並且按上述方法進行脂類分析。ARA補料實驗的結果表明具有pYSD17的耶氏酵母屬菌株能將大約23%的細胞內ARA轉化成EPA。裡予娜胃LL·膽絲禾口±延遍白_勿規絲bK高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶能將GLA轉化成DGLA，將STA轉化成ETA和/或將EPA轉化成DPA。包括pY58的解脂耶氏酵母菌株是從單菌落生長的，在含有10μg的GLA基本培養基中繼代培養，並且按上述方法進行脂類分析。GLA補料實驗的結果表明，具有pY58的耶氏酵母屬菌株能將大約30%的細胞內GLA轉化成DGLA。實施例3密碼子優化△17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母內的合成和表達基於實施例2的結果，可利用的基因是編碼Δ6去飽和酶、延伸酶和Δ5去飽和酶活性的基因，因為這些基因在解脂耶氏酵母內均能夠實現約30%的底物轉化百分率。但異絲水黴來源的Δ17去飽和酶的最大轉化效率僅為23%。因此，根據耶氏酵母屬的密碼子選擇模式、ATG翻譯起始密碼子周圍的共有序列和RNA穩定性的普遍規律，並基於異絲水黴DNA序列(SEQIDNO5)設計了密碼子優化Δ17去飽和酶基因(Guhaniyogi，G.和J.Brewer,Gene265(1-2)11-23(2001))。除了對翻譯起始位點的修飾外，還對1077bp編碼區中的127bp片段(包括了117個密碼子)進行了密碼子優化。該密碼子優化DNA序列(SEQIDNO9)與異絲水黴Δ17去飽和酶基因DNA序列(SEQIDNO:5)之間的比較如圖6所示，其中粗體所示核苷酸對應於密碼子優化基因中被改動的核苷酸。該密碼子優化基因中的所有變更均未改變編碼蛋白的胺基酸序列(SEQIDNO:6)。在解H旨耶氏酵母中測丨定優,誅調密碼子誅僱在NationalCenterforBiotechnologyInformation公共資料庫中發現了大約100個解脂耶氏酵母的基因。通過DNAStar的Editseq程序將包括121，167bp的這些基因的編碼區翻譯成相應的40，389個胺基酸，並且製成表格，以便確定由表4所示的解脂耶氏酵母密碼子選擇譜。標題為"No."的欄表示編碼特定胺基酸的特定密碼子在40，389個胺基酸的樣品中出現的次數。標題為"的欄表示編碼特定胺基酸的特定胺基酸的頻率。用粗體字符表示的代碼表示解脂耶氏酵母中優選的密碼子。表3解脂耶氏酵母的密碼子詵擇tableseeoriginaldocumentpage39為了進一步優化在解脂耶氏酵母中的基因表達，檢查了79個基因的'ATG'起始密碼子周圍的共有序列。在圖7中，加下劃線的ATG翻譯起始密碼子的第一個'A'被設為+1。分析過的基因的77%在-3號位置上出現〃A"，表明了〃A"在該位置上的強烈偏好。還存在'A'或'C'在_4，-2和-1號位置上的偏好，『A'，『C'或'T'在+5號位置上的偏好，以及'G'或'C'在+6號位置上的偏好。因此，用於基因在解脂耶氏酵母中優化表達的密碼子優化的翻譯起始位點的優選的共有序列是'MAMMATGNHS'(SEQIDNO126)，其中使用了如下的核酸簡併性密碼=M=A/C；S=C/G；H=A/C/T；和N=A/C/G/T。密碼子優化基因的體外合成被用於合成密碼子優化Δ17去飽和酶基因的方法如圖8所示。首先，設計11對寡核苷酸，以延伸異絲水黴Δ17去飽和酶基因的密碼子優化編碼區的全長(例如D17-1A、D17-1B、D17-2A、D17-2B、D17-3A、D17-3B、D17-4A、D17-4B、D17-5A、D17-5B、D17-6A、D17-6B、D17-7A、D17-7B、D17-8A、D17-8B、D17-9A、D17-9B、D17-10A、D17-10B、D17-1IA和D17-11B,對應於SEQIDNOs:10-31)。每一對有義(A)和反義(B)寡核苷酸除5』-末端具有4bp突出端外，其它部分均互補。此外，引物D17-1A、D17-4B、D17-5A、D17-8A和D17-8B還分別導入了用於後續亞克隆的Ncol、Bglll和Sail限制位點。於371、體積為2(^1並含有50mMTris-HCl(pH7.5)、IOmMMgCl2、IOmMDTT、0.5mM亞精胺、0.5mMATP和IOUT4多核苷酸激酶的混合液中，使均為IOOng的各種寡核苷酸磷酸化。將各有義和反義寡核苷酸對混合，並在採用下列參數的熱循環儀中退火95°C(2分鐘)>850C(2分鐘),650C(15分鐘),37°C(15分鐘),24°C(15分鐘)和4°C(15分鐘)。因此，D17-1A(SEQIDNO10)退火至D17-1B(SEQIDNO:11)可生成雙鏈產物「D17-1AB，，。同樣，D17-2A(SEQIDNO12)退火至D17-2B(SEQIDNO13)可生成雙鏈產物「D17-2AB，，，依次類推。接著將退火雙鏈寡核苷酸分別混合所獲得的三個集合連接在一起，如下所示集合1包括D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB；集合2包括D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB；禾口集合3包括D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB。將各退火寡核苷酸集合混合在體積為20μ1並含有IOUT4DNA連接酶的混合物中，並於16°C溫育過夜。接著通過PCR擴增各連接反應的產物。具體而言，是通過以連接的「集合1」混合物(即D17-1AB、D17-2AB、D17-3AB和D17-4AB)為模板，以寡核苷酸D17-1(SEQIDNO32)和D17-4R(SEQIDNO33)為引物進行PCR，擴增密碼子優化Δ17去飽和酶基因的第一個部分。該PCR擴增是在總體積為50μ1並包括PCR緩衝液的混合物中進行，其中的PCR緩衝液含有IOmMKCl、10mM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.75)、2mMMgS04、0.1%TritonX-100、100μg/mLBSA(終濃度)、均為200μM的各種脫氧核苷三磷酸、均為lOpmole的各種引物和1μ1PfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，SanDiego,CA)擴增步驟如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1分鐘、56°C30秒、72°C40秒。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。將430bpPCR片段亞克隆進pGEM-Teasy載體(Promega)中，可生成pT17(1-4)。同樣，通過以連接的「集合2」混合物(即D17-5AB、D17-6AB、D17-7AB和D17-8AB)為模板，以寡核苷酸D17-5(SEQIDNO:34)和D17-8D(SEQIDNO:35)為引物進行PCR，擴增密碼子優化Δ17去飽和酶基因的第二個部分，並將其克隆進pGEM-T-eaSy載體中，可生成pT17(5-8)。最後，同樣通過以「集合3」連接混合物(即D17-9AB、D17-10AB和D17-11AB)為模板，以寡核苷酸D17-8U(SEQIDNO36)和D17_11(SEQIDNO37)為引物進行PCR，擴增密碼子優化Δ17去飽和酶基因的第三個部分，並將其克隆進pGEM-T-easy載體中，可生成pT17(9-ll)。分別用ρΤ17(1-4)、ρΤ17(5_8)和ρΤ17(9_11)轉化大腸桿菌，並從氨苄青黴素抗性轉化體中分離質粒DNA。純化質粒DNA，並用合適的限制性內切核酸酶消化，以釋放出ρΤ17(1-4)的420bpNcol/Bglll片段、pT17(5-8)的400bpBglll/Sall片段和pT17(9-11)的300bpSall/Notl片段。接著將這些片段組合、連接在一起作為模板，並以D17-1(SEQIDNO32)和D17-11(SEQIDNO37)為引物擴增完整的合成密碼子優化Δ17去飽和酶基因。對Δ17去飽和酶基因的每一個部分均採用上述條件，在總體積為50μ1的混合物中進行PCR擴增，熱循環程序如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括950C1分鐘、56°C30秒、72°C1.1分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。生成1。IkBPCR產物。含密碼子優化的Δ17^mmmmmmpysdi7S的構律用Ncol/Notl消化包括完整合成Δ17去飽和酶的上述1.IkBPCR產物，並將其亞克隆進Ncol/Notl消化的pY5-13(實施例1)中，可生成pYSD17S(圖9A)。為比較野生型和合成基因在耶氏酵母屬內的效率，另一個「對照」是通過以YL53(SEQIDNO44)和YL54(SEQIDNO45)為引物進行定點誘變，消除pYSD17(包括所述野生型基因；如實施例2所述)中富含AT的Pacl位點，可生成pYSD17M(圖9B)。用密碼子優化的△17去飽和酶基因對解脂耶氏酵母的轉化根據實施例2所述方法，分別將含有野生型和密碼子優化△17去飽和酶的質粒轉化進解脂耶氏酵母ATCC#76982中。利用該技術，獲得含有下述質粒的轉化體M4轉化體耶氏酵母中的質粒一覽表"^l[IslPYSD17野生型Δ17去飽和酶PYSD17M野生型Δ17去飽和酶，無富含AT的Pacl位點~PYSD17S密碼子優化Δ17去飽和酶胃石好優麗A17拂·_細白_勿樹拉僻Δ17去飽和酶可將ARA轉化為ΕΡΑ(參見圖2)。野生型和密碼子優化Δ17去飽和酶基因的底物轉化百分率([產物]/[底物+產物]*100)是通過利用一般方法中所述方法，在含有各可選質粒構建體的解脂耶氏酵母中測定的。ARA補料試驗結果顯示具有對照質粒pYSD17或pYSD17M的耶氏酵母菌株可將大約23%的胞內ARA轉化為EPA(圖10A)，而含有pYSD17S中的密碼子優化Δ17去飽和酶基因的菌株則可將大約45%的胞內ARA轉化為EPA(圖10B)。因此，含有密碼子優化A17去飽和酶的耶氏酵母可轉化比含有野生型異絲水黴基因的菌株多大約2倍的ARA。適合解脂耶氏酵母內多種(0脂肪酸牛物合成基因同步表汰的質粒的構津本實施例描述了需要合成多種表達質粒，以便構建1)適合於被整合進解脂耶氏酵母屬基因組內以表達八6去飽和酶1皿4延伸酶、和A5去飽和酶(用於生產ARA)的DNA片段；和2)適合於被整合進解脂耶氏酵母屬基因組內以表達A6去飽和酶、PUFA延伸酶、A5去飽和酶和A17去飽和酶(用於生產EPA)的DNA片段。質粒DY24的構建質粒pY24(圖11)是用於構建適合被整合進解脂耶氏酵母基因組內的表達盒的親本載體。pY24的構建方法如下以寡核苷酸KTO和KU3(SEQIDNOs:46和47)為引物，以耶氏酵母基因組DNA為模板，通過PCR擴增含有耶氏酵母URA3基因的1.7kBDNA片段(SEQIDNO48)。該PCR擴增是在總體積為50yl的混合物中進行，該混合物包括100ng耶氏酵母基因組DNA和含有10mMKCl、10mM(NH4)2S04、20mMTris-HCl(pH8.75)、2mMMgS04,0.1%TritonX-100、100ug/mLBSA(終濃度)、均為200uM的各種脫氧核苷三磷酸、均為lOpmole的各種引物禾口1illPfuTurboDNA聚合酶(Stratagene，SanDiego,CA)的PCR緩衝液。擴增步驟如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1分鐘、56°C30秒、72°C2分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。將該PCR產物插入pGEM-Teasy載體(Promega，Madison，WI)中，可生成pGYUM。利用寡核苷酸KI5和KI3(SEQIDNOs50和51)進行PCR,擴增含有ImpatientsbalsamaW^^BISS(^「impH8")(cloneids.pkOOOl.h8；E.I.duPontdeNemoursandCompany,Inc.，Wilmington，DE)的1.lkBDNA片段(SEQIDNO52)。該PCR擴增是利用上述組成進行，但所用模板是ids.pkOOOl.h8的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1.5分鐘、56°C30秒、72°C1.2分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。用Notl消化該PCR產物，並接著將其插入pY5(圖3)的Notl位點，可生成pY9。利用寡核苷酸KTI5和KTI3(SEQIDNOs54和55)進行PCR，擴增含有pY9的TEF::IMPH8::XPR嵌合基因的1.7kBDNA片段(SEQIDNO:56)。如上所述進行該PCR擴增，但所用模板是pGYUM的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1分鐘、56°C30秒、72°C2分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。將該PCR產物插入PCR-Script(Stratagene)中，可生成pY9R。用pGYUM的Xhol/EcoRV片段置換pY9R的1.7kBXhol/EcoRV片段，可生成pY21.以寡核苷酸KH5和KH3(SEQIDNOs58和59)為引物，以KS65的基因組DNA為模板進行PCR，擴增含有大腸桿菌潮黴素抗性基因("HPT";Kaster,K.R.,etal.,NucleicAcidsRes.11:6895_6911(1983))的lkBDNA片段(SEQIDNO:60)。該PCR擴增是利用上述組分在總體積為50u1的混合物中進行，但所用模板是ids.pkOOOl.h8的10ng質粒DNA。擴增步驟如下於95°C初始變性3分鐘，接著進行35個循環，每個循環包括95°C1分鐘、56°C30秒、72°C1.2分鐘。最終延伸循環於72°C進行10分鐘，接著於4°C終止反應。用Notl消化該PCR產物，並接著將其插入pY5的Notl位點(圖3)，可生成pTHPT_l。42以寡核苷酸KTH5和KTH3(SEQIDNOs62和63)為引物，以pTHPT_l質粒DNA為模板，如上所述擴增含有TEF::HPT::XPR融合基因的1.6kBDNA片段(SEQIDNO64)。用Bglll消化該PCR產物，並接著將其插入pY21中，可生成pY24。PY24-4的構津質粒pY24(圖11)被用於構建適合被整合進解脂耶氏酵母基因組的表達盒。利用pY24質粒中解脂耶氏酵母URA3基因的401bp5，序列(SEQIDNO66)和568bp3，-序列(SEQIDNO67)將表達盒直接整合進耶氏酵母基因組的Ura位點。通過BamHI消化，首先從pY24中移出兩個嵌合基因(TEF::HPT:和TEF::IMPH8::XPR)，使它們自連接生成PY24-1。通過分別利用YL63和YL64(SEQIDNOs68和69)和YL65和YL66(SEQIDNOs70和71)引物對進行定點誘變，將Pad和BsiffI位點導入pY24-l中，可生成pY24_4。將pYMA5pb的4261bpPacl/BsiWI片段(包括高山被孢黴A5去飽和酶基因；如實施例2所述)連接進pY24-4(圖11)的Pacl/BsiWI位點，可生成pYZM5(圖5)。通過分別利用引物對YL81和YL82(SEQIDN0s:74和75)和YL83和YL84(SEQIDN0s:76和77)進行定點誘變，將Hindlll和Clal位點導入pYZM5，可生成pYZM5CH。通過以YL105和YL106(SEQIDN0:78和79)為引物進行定點誘變，將Pmel位點導入pYZM5CH，可生成pYZM5CHPP。通過以YL119和YL120(SEQIDNO:80和81)為引物進行定點誘變，將Ascl位點導入pYZM5CHPP，可生成pYZM5CHPPA(圖5)。為優化該整合載體，以YL121和YL122(SEQIDNOs82和83)為引物進行PCR，擴增解脂耶氏酵母URA3基因(SEQIDNO84)上遊的440bp5，非編碼DNA序列。用Ascl和BsiffI消化該PCR產物，並接著用pYZM5CHPPA的Ascl/BsiffI片段置換(圖5和12)，可生成pYZM5UPA(圖12)。通過利用寡核苷酸YL114和YL115(SEQIDNOs:85和86)進行定點誘變，將Asc1位點導入pYZM5UPA，可生成pYZV5。為了減小pYZV5中URA3基因的3』非編碼區的大小，通過利用寡核苷酸YL114和YL115(如上所述)進行的定點誘變，將第二個Pacl位點導入該區域的中部，可生成PYZV5P。通過Pacl消化切除pYZV5P的Pacl片段，再次連接後生成pYZV16(圖12)。用Ascl消化pYZV16，可釋放適用於A5去飽和酶基因(「MAD5」)在解脂耶氏酵母基因組內的整合和表達的5.2kBDNA片段(SEQIDNO:87)。適合高親和力延伸酶和△5去飽和酶的表達的整合載體的構建通過分別利用引物對YL61和YL62(SEQIDNOs88和89)和YL69和YL70(SEQIDNOs90和91)進行定點誘變，將BsiffI和Hindlll位點導入pY58(含有高山被孢黴高親和力PUFA延伸酶的編碼區；如實施例2所述)，可生成pY58BH(圖13；延伸酶基因被標記為「EL」)。將pY58BH中含有TEF::EL::XPR嵌合基因的1.7kBBsiffI/Hindlll片段連接進pYZM5CHPP(構建方法如圖5所示)的Bsiffl/Hindlll位點，可生成pYZM5EL(圖13)。該質粒適用於高山被孢黴△5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母中的整合和同步表達。適合△6去飽和酶、高親和力延伸酶和△5去飽和酶的表達的整合載體的構建通過分別利用引物對YL77和YL78(SEQIDNOs92和93)和YL79A和YL80A(SEQIDNOs94和95)進行的定點誘變，將Pacl和Clal位點導入pY54(含有高山被孢黴A6去飽和酶；如實施例2所述)，可生成pY54PC(圖13；A6去飽和酶基因被標記為「MAD6」)。將pY54PC中含有TEF::MAD6::XPR嵌合基因的2kBClal/PaclDNA片段連接進pYZM5EL的Clal/Pacl位點，可生成pYZM5EL6(圖13)。該質粒適用於高山被孢黴A6去飽和酶、A5去飽和酶和高親和力PUFA延伸酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達。適合被整合講入耶氏酵母基因組、適合A6去飽和酶、PUFA延伸酶和A5去飽和酶表汰的DNA片段的構津採用質粒pYZV16(構建方法如圖12所示)構建含有多種表達盒的質粒。首先，將pYZV16的3.5kBBsiffl/Pacl片段與pYZM5EL6(構建方法如圖13所示)的7.9kBBsiffl/Pacl片段連接，可生成pYZV5EL6(圖14)。用Ascl消化pYZV5EL6，可釋放適合A6去飽和酶、PUFA延伸酶和A5去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達的8.9kBDNA片段(SEQIDNO96)。適合被整合講耶氏酵母基因組、適合A6去飽和酶、PUFA延伸酶、A5去飽和酶和A17去飽和酶表汰的DNA片段的構津如實施例3的描述，將合成的異絲水黴A17去飽和酶基因插入PY5-13的Ncol/Notl位點，可生成pYSD17S(圖9A)。通過分別利用引物對YL101和YL102(SEQIDNOs97和98)和YL103和YL104(SEQIDNOs99和100)進行定點誘變，將Clal和Pmel位點導入PYSD17S中，可生成pYSD17SPC(圖14)。用來源於pYSD17SPC並含有A17去飽和酶表達盒的1760bpClal/Pmel片段置換pYZV5EL6(圖14)的347bpClal/Pmel片段，可生成pYZV5E6/17。用Ascl消化pYZV5E6/17，可釋放適合A6去飽和酶、PUFA延伸酶、A5去飽和酶和A17去飽和酶基因在解脂耶氏酵母基因組內的整合和同步表達的10.3kBDNA片段(SEQIDN0:101)。實施例5解脂耶氏酵母轉化體中w-脂肪酸的生物合成用Ascl限制性內切核酸酶消化pYZV5EL6(來自實施例4，含有A6去飽和酶、PUFA延伸酶和△5去飽和酶基因)並且根據實施例2中描述的方法轉化到解脂耶氏酵母中。在缺乏亮氨酸的基本培養基中選擇的52種轉化體中，34種不能在也缺乏尿嘧啶的培養基上生長，表明65%的轉化體含有整合到靶定的解脂耶氏酵母URA3基因座中的8.9kB的多基因表達盒。將來自單個菌落的轉化體接種到缺乏亮氨酸的基本培養基中，在30°C下溫育最多48小時。通過離心收集細胞，提取脂質，通過轉酯製備脂肪酸甲酯，隨後用Hewlett-Packard6890GC進行分析(根據一般方法中描述的方法)。GC分析表明在含有3種嵌合基因的轉化體中存在花生四烯酸(ARA)(圖15)，但在野生型耶氏酵母對照菌株中不存在。工程改造解脂耶氏酵母，使其生產ARA，即一種(0-6脂肪酸。實施例6解脂耶氏酵母轉化體中w-脂肪酸的生物合成按照與實施例5相似的方式，用Ascl限制性內切核酸酶消化PYZV5E6/17(來自實施例4，含有A6去飽和酶、PUFA延伸酶、A5去飽和酶和A17去飽和酶基因)並且轉化到解脂耶氏酵母(ATCC#76982)中。在缺乏亮氨酸的基本培養基中選擇的133種轉化體中，89種不能在也缺乏尿嘧啶的培養基上生長，表明67%的轉化體含有整合到靶定的解脂耶氏酵母URA3基因座中的10.3kB的多基因表達盒。GC分析(根據一般方法中描述的方法)表明在含有4種嵌合基因的轉化體中存在二十碳五烯酸(EPA)(圖16)，但在野生型耶氏酵母對照菌株中不存在。這些數據表明經過工程改造解脂耶氏酵母，生產了EPA，即一種《-3脂肪酸。序列表E.I.duPontdeNemoursandCompany,Inc.在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸CL2233PCTUS60/4686772003-05-07126PatentInversion3.211374DNA高山被孢黴AF4652811atggctgctgctcccagtgtgaggacgtttactcgggccgaggttttgaatgccgaggct60ctgaatgagggcaagaaggatgccgaggcacccttcttgatgatcatcgacaacaaggtg120tacgatgtccgcgagttcgtccctgatcatcccggtggaagtgtgattctcacgcacgtt180ggcaaggacggcactgacgtctttgacacttttcaccccgaggctgcttgggagactctt240gccaacttttacgttggtgatattgacgagagcgaccgcgatatcaagaatgatgacttt300gcggccgaggtccgcaagctgcgtaccttgttccagtctcttggttactacgattcttcc360aaggcatactacgccttcaaggtctcgttcaacctctgcatctggggtttgtcgacggtc420attgtggccaagtggggccagacctcgaccctcgccaacgtgctctcggctgcgcttttg480ggtctgttctggcagcagtgcggatggttggctcacgactttttgcatcaccaggtcttc540caggaccgtttctggggtgatcttttcggcgccttcttgggaggtgtctgccagggcttc600tcgtcctcgtggtggaaggacaagcacaacactcaccacgccgcccccaacgtccacggc660gaggatcccgacattgacacccaccctctgttgacctggagtgagcatgcgttggagatg720ttctcggatgtcccagatgaggagctgacccgcatgtggtcgcgtttcatggtcctgaac780cagacctggttttacttccccattctctcgtttgcccgtctctcctggtgcctccagtcc840attctctttgtgctgcctaacggtcaggcccacaagccctcgggcgcgcgtgtgcccatc900tcgttggtcgagcagctgtcgcttgcgatgcactggacctggtacctcgccaccatgttc960ctgttcatcaaggatcccgtcaacatgctggtgtactttttggtgtcgcaggcggtgtgc1020ggaaacttgttggcgatcgtgttctcgctcaaccacaacggtatgcctgtgatctcgaag1080gaggaggcggtcgatatggatttcttcacgaagcagatcatcacgggtcgtgatgtccac1140ccgggtctatttgccaactggttcacgggtggattgaactatcagatcgagcaccacttg1200ttcccttcgatgcctcgccacaacttttcaaagatccagcctgctgtcgagaccctgtgc1260aaaaagtacaatgtccgataccacaccaccggtatgatcgagggaactgcagaggtcttt132045catcctggtggagtggacactctcctgctcggagctggccgagatgttactccggtcttt180gagatgtatcacgcgtttggggctgcagatgccattatgaagaagtactatgtcggtaca240ctggtctcgaatgagctgcccatcttcccggagccaacggtgttccacaaaaccatcaag300acgagagtcgagggctactttacggatcggaacattgatcccaagaatagaccagagatc360tggggacgatacgctcttatctttggatccttgatcgcttcctactacgcgcagctcttt420gtgcctttcgttgtcgaacgcacatggcttcaggtggtgtttgcaatcatcatgggattt480gcgtgcgcacaagtcggactcaaccctcttcatgatgcgtctcacttttcagtgacccac540aaccccactgtctggaagattctgggagccacgcacgactttttcaacggagcatcgtac600ctggtgtggatgtaccaacatatgctcggccatcacccctacaccaacattgctggagca660gatcccgacgtgtcgacgtctgagcccgatgttcgtcgtatcaagcccaaccaaaagtgg720tttgtcaacc3-C3.tC3-3.CC3.gcacatgtttgttcctttcctgtacggactgctggcgttc780aaggtgcgcattcaggacatcaacattttgtactttgtcaagaccaatgacgctattcgt840gtcaatcccatctcgacatggcacactgtgatgttctggggcggcaaggctttctttgtc900tggtatcgcctgattgttcccctgcagtatctgcccctgggcaaggtgctgctcttgttc960acggtcgcggacatggtgtcgtcttactggctggcgctgaccttccaggcgaaccacgtt1020gttgaggaagttcagtggccgttgcctgacgagaacgggatcatccaaaaggactgggca1080gctatgcaggtcgagactacgcaggattacgcacacgattcgcacctctggaccagcatc1140actggcagcttgaactaccaggctgtgcaccatctgttccccaacgtgtcgcagcaccat1200tatcccgatattctggccatcatcaagaacacctgcagcgagtacaaggttccatacctt1260gtcaaggatacgttttggcaagcatttgcttcacatttggagcacttgcgtgttcttgga1320ctccgtcccaaggaagagtag13414446PRT高山被孢黴AF0676544GlyThrAspGinGlyLysThrPheMet1HisAsnThrLys20Lys5AspAspLeuLeuAspValThr35GlyAlaGlyArgLeuAla65LeuLeu50PhePheLeuSerArg40ValLeu25HisThr10AlaGlyAlaAlaAsp70LeuAsp55AlaTrplieProGlyThrProVallieMetLysValSerAsnProliePheLysThrlieGlu85ThrArgValGluAspProGlyLys115LeuLys100AsnArgProGlulieAlaSerVal145Ser130GluArgThrTrpLeu150Tyr135Ginlie120TyrGly105TrpPro90TyrLys75GluPheArgGluArgGlyPhe60TyrGluLeuAlaAla15GlyArgValTyr30ValAspThrLeu45GluMetTyrHisAlaValValGlyGinLeuPheAla155TyrValGlyThr80ProThrValPheHis95ThrAspArgAsnlie110TyrAlaLeuliePhe125ValProPheValPhe140lielieMetGlyPhe16048AlaCysAlaGinValGlyLeuAsnProLeuHisAspAlaSerHisPhe165170175SerValThrHisAsnProThrValTrpLyslieLeuGlyAlaThrHis180185190AspPhePheAsnGlyAlaSerTyrLeuValTrpMetTyrGinHisMet195200205LeuGlyHisHisProTyrThrAsnlieAlaGlyAlaAspProAspVal210215220SerThrSerGluProAspValArgArglieLysProAsnGinLysTrp225230235240PheValAsnHislieAsnGinHisMetPheValProPheLeuTyrGly245250255LeuLeuAlaPheLysValArglieGinAsplieAsnlieLeuTyrPhe260265270ValLysThrAsnAspAlalieArgValAsnProlieSerThrTrpHis275280285ThrValMetPheTrpGlyGlyLysAlaPhePheValTrpTyrArgLeu290295300lieValProLeuGinTyrLeuProLeuGlyLysValLeuLeuLeuPhe305310315320ThrValAlaAspMetValSerSerTyrTrpLeuAlaLeuThrPheGin325330335AlaAsnHisValValGluGluValGinTrpProLeuProAspGluAsn340345350GlylielieGinLysAspTrpAlaAlaMetGinValGluThrThrGin355360365AspTyrAlaHisAspSerHisLeuTrpThrSerlieThrGlySerLeu370375380AsnTyrGinAlaValHisHisLeuPheProAsnValSerGinHisHis385390395400TyrProAsplieLeuAlalielieLysAsnThrCysSerGluTyrLys405410415ValProTyrLeuValLysAspThrPheTrpGinAlaPheAlaSerHis420425430LeuGluHisLeuArgValLeuGlyLeuArgProLysGluGlu43544044551077DNA異絲水黴(ATCC#56851)5atgactgaggataagacgaaggtcgagttcccgaacgcgtgctttgagtcgaacctcggcttcaacgcgtcggcctcggcggcgctgctcgataacgttctgctccacgcgctcgtttgcttctggggcttcttcacggtcggccacgacagcgtcaactttatcatcggctgcatcatgtggcgcgtgacgcaccgccaccaccacaagttttacccgcaccggtcggtcaaggacctcggcggtgcgtggtttgtctacttgaaggtcgacccgtgggacccgctcctccttcgccgctgggccgccttcttcgccgcgtacgcgtacggcctctactactatgcgccgctctttgtcttgcaccacaacgacgaagcgacgccgtggggcaacctctcgagcgtcgaccgctcgtacattggcacgcaccaggtccaccacttgttcgccaccaagcactttgcggccgcgtacccgatcacggccttcttcaagaccgcgcacctcgcgcagatcttcacgctcaaagagtcggcc6358PRT異絲水黴(ATCC#56851)6MetAlaGluAspLysThrLysVal15LysHisSerlieProAsnAlaCys20LeuTyrTyrThrAlaArgAlalie3540LeuLeuTyrAlaAlaArgSerThr5055LeuHisAlaLeuValCysAlaThr6570PheTrpGlyPhePheThrValGly85SerArgTyrHisSerValAs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源的存在下生長步驟(a)的酵母，其中表達編碼△17去飽和酶多肽的基因並且將花生四烯酸轉化為二十碳五烯酸；並且c)任選回收步驟(b)的二十碳五烯酸。9.權利要求1-8的任意一項的方法，其中去飽和酶或延伸酶底物來源對含油酵母來說是內源的。全文摘要本發明涉及在含油酵母中生產多不飽和脂肪酸。具體地，本發明涉及在含油酵母中生產ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法。因此，將能夠催化亞油酸(LA)轉化成γ-亞麻酸(GLA)；α-亞油酸(ALA)轉化成十八碳四烯酸(STA)；GLA轉化成二高-γ-亞油酸(DGLA)；STA轉化成二十碳四烯酸(ETA)；DGLA轉化成花生四烯酸(ARA)；ETA轉化成二十碳五烯酸(EPA)；DGLA轉化成ETA；EPA轉化成二十二碳五烯酸(DPA)；以及將ARA轉化成EPA的去飽和酶和延伸酶導入了耶氏酵母屬中，用於合成ARA和EPA。文檔編號C12N1/18GK101824441SQ20091026607公開日2010年9月8日申請日期2004年5月7日優先權日2003年5月7日發明者N·S·亞達夫,Q·Q·朱,S·K·皮卡塔吉奧申請人:納幕爾杜邦公司