含腙的嘧啶類衍生物及其用途的製作方法

2023-12-10 06:08:02 7

本發明涉及含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，它們的製備方法以及含有所述化合物的藥物組合物。本發明還涉及所述化合物較強的alk和ros1激酶抑制作用，並且還涉及該類化合物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽在製備用於治療和/或預防由於alk和ros1異常表達所引起疾病的藥物中的應用，特別是在製備治療和/或預防癌症的藥物中的用途。

背景技術：

激酶靶點藥物的研究已成為當今抗腫瘤藥物研究開發的重要方向。目前發現的激酶靶點藥物中蛋白激酶類是已知研究最多的一類。蛋白激酶由於突變或重排，可引起信號轉導過程障礙或出現異常，導致細胞生長、分化、代謝和生物學行為異常，因而可誘發多種腫瘤。

蛋白激酶(proteinkinases,pks)，是一種通過atp的末端磷酸酯轉移催化蛋白質的酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基上的羥基磷酸化的酶，主要包括蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptk)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threoninekinase,stk)。通過信號轉導途徑，這些酶調節細胞生長、分化和增殖等。ptk通過和生長因子配體結合，使生長因子受體轉變為活化形式，後者與細胞膜內表面的蛋白相互作用。這導致受體和其他蛋白的酪氨酸殘基磷酸化並且導致與多種細胞質信號分子的複合物在細胞內形成，從而影響諸如細胞分裂(增殖)、細胞分化、細胞生長、代謝作用等多種細胞反應。

alk，即間變性淋巴激酶(anaplasticlymphomakinase)，於1994年首次發現於間變性大細胞淋巴瘤ams3細胞中，是一個由1620個胺基酸組成的單鏈跨膜蛋白，一種酪氨酸激酶，屬於胰島素受體家族成員之一。它在胚胎發育時期呈高表達水平，隨後表達水平逐漸下降，成年時期少量表達。該蛋白由膜外部分、跨膜區域以及膜內催化區域組成，下遊信號通路為ras-erk、jak3-stat3，以及pi3-k/akt等，這些通路與細胞增殖、存活、遷移密切相關。

1994年morri等人發現，2號染色體上alk基因與5號染色體上的核仁磷酸蛋白npm(nucleophosmin)基因錯位融合，該重排突變基因nmp-alk具有致癌性。2007年日本科學家soda等人首次在肺腺癌組織中發現了alk基因突變：2號染色體短臂內發生倒置突變，使得棘皮動物微管相關蛋白4(eml4)基因的1～13號外顯子與alk基因的20～29號外顯子融合形eml4-alk融合基因轉染了eml4-alk融合基因的nih-3t3成纖維細胞具有惡性轉化能力。約有3％～7％的nsclc患者中存在eml4-alk融合基因。此外，研究還表明alk基因突變參與了多種腫瘤包括漸變性大細胞淋巴瘤、炎性肌纖維母細胞瘤、神經母細胞瘤的發病。

因此，靶向alk的抑制劑，可以通過抑制alk下遊相關信號而達到抗腫瘤的目的。

與alk類似，原癌基因蛋白酪氨酸激酶ros(ros1)也是一個單體型受體酪氨酸激酶。ros1基因的融合、過度表達和突變均會導致ros1蛋白的失調。異常的ros1蛋白激酶將會激活下遊多條致癌信號通路，控制細胞增殖、存活和細胞周期的通路。

ros1和alk的激酶域有49％的胺基酸同源序列，多種alk抑制劑在體外均可抑制ros1的活性。最近，麻省總醫院腫瘤中心的一項研究顯示，以ros1為驅動基因的腫瘤可予以克唑替尼治療，並詳細描述了克唑替尼對一位患者的顯著療效。因此，開發ros1和alk雙靶點抑制劑是一種科學有效的藥物設計策略。

文獻報導的色瑞替尼屬於嘧啶類化合物，是一種口服的alk激酶抑制劑，已於2015年在美國上市。臨床研究表明，色瑞替尼對ros1也有很好的抑制活性。

本發明人在參考文獻的基礎上，設計併合成了一系列含腙的嘧啶類衍生物。經體外活性篩選，表明該類化合物具有抗腫瘤活性。

技術實現要素：

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為o、s、nh、nch3；

r1為羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基；

r2為1-2個選自滷素、三滷甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:

r3為h、(c1-c6)烷基；

ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個選自n、o或s的雜原子，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自氫、羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其中，

x為nh、nch3；

r1為羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基；

r2為1-2個選自滷素、三滷甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:

r3為h、(c1-c6)烷基；

ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個選自n、o或s的雜原子，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自氫、羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為nh、nch3；

r1為(c1-c6)烷基磺醯基；

r2為1-2個選自滷素、三滷甲基、羥基、氰基、氨基、硝基:

r3為h、(c1-c6)烷基；

ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個選自n、o或s的雜原子，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為nh、nch3；

r1為(c1-c6)烷基磺醯基；

r2為任選1-2個以下取代基：滷素、三滷甲基、甲基、氰基、硝基；

r3為h、(c1-c3)烷基；

ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個選自n、o或s的雜原子，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為nh；

r1為異丙基磺醯基；

r2為任選1-2個以下取代基：滷素、三滷甲基、甲基、氰基、硝基；

r3為h、(c1-c3)烷基；

ar為(c6-c10)芳基、5-10元雜芳基，其中，所述雜芳基含有1-3個選自n、o或s的雜原子，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為nh；

r1為異丙基磺醯基；

r2為f、cl；

r3為h、ch3；

ar為苯基、萘基、喹啉基、異喹啉基、喹唑啉基、吲哚基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、嘧啶基，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為1-4個選自羥基、滷素、硝基、氨基、氰基、(c1-c6)烷基、(c2-c6)烯基、(c2-c6)炔基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基硫基、任選被羥基、氨基或滷代的(c1-c6)烷基或(c1-c6)烷氧基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基、(c1-c6)烷基醯胺基、游離的、成鹽的、酯化的和醯胺化的羧基、(c1-c6)烷基亞磺醯基、(c1-c6)烷基磺醯基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷基醯基、氨基甲醯基、被1-2個(c1-c6)烷基取代的氨基甲醯基、(c1-c3)亞烷基二氧基、烯丙基。

本發明涉及通式ⅰ所示的含腙的嘧啶類衍生物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，

其中，

x為nh；

r1為異丙基磺醯基；

r2為f、cl；

r3為h、ch3；

ar為苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基，並且ar任選1-3個相同或不同的r4取代；

r4為氫、滷素、羥基、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、甲氧基、甲硫基、二甲氨基、甲磺醯基。

本發明化合物及其光學異構體、藥學上可接受的鹽、溶劑化物或前藥優選以下化合物，但這些化合物並不意味著對本發明的任何限制：

(e)-2-(2-苯基亞甲基肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(吡啶-4-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(吡啶-3-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(噻吩-2-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(呋喃-2-基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(4-氟苯基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-2-(2-(4-溴苯基亞甲基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-硝基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-甲基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-氰基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-(甲硫基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(2-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(2-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(2,4-二氟苯亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3,4,5-三甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(1-(4-甲氧基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(1-(4-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(1-(2,4-二氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-2-(2-(1-(2-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(1-(4-甲基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺

(e)-2-(2-(1-(4-溴苯基)亞乙基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺。

而且，按照本發明所屬領域的一些通常方法，本發明中通式ⅰ的含腙的嘧啶類衍生物可以與酸生成藥學上可接受的鹽。可藥用加成鹽包括無機酸和有機酸加成鹽，與下列酸加成的鹽是特別優選的：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。

此外，本發明還包括本發明衍生物的前藥。本發明衍生物的前藥是通式ⅰ的含腙的嘧啶類衍生物，它們自身可能具有較弱的活性甚至沒有活性，但是在給藥後，在生理條件下(例如通過代謝、溶劑分解或另外的方式)被轉化成相應的生物活性形式。

本發明中「滷素」是指氟、氯、溴或碘代；「烷基」是指直鏈或支鏈的烷基；「亞烷基」是指直鏈或支鏈的亞烷基；「芳基」是指無取代基或連有取代基的苯基或萘基；「雜芳基」是指含有一個或多個選自n、o、s雜原子的單環或多環的環狀體系，環狀體系是芳香性的，如咪唑基、吡啶基、吡唑基、(1,2,3)-和(1,2,4)-三唑基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、噻唑基、苯並噻唑基、噁唑基、異噁唑基、喹啉基、異喹啉基、苯並咪唑基和苯並噁唑基等。

本發明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗增生性藥物單獨使用，或者可以與現已上市的抗增生性藥物聯合使用，用於治療和/或預防增生性疾病，如牛皮癬、良性前列腺肥大、動脈粥樣硬化和再狹窄。

我們已發現本發明化合物體外具有抑制腫瘤細胞生長活性，因此，它可以用作製備治療和/或預防癌症的藥物，如乳腺、肺、肝臟、腎臟、結腸、直腸、胃、前列腺、膀胱、子宮、胰腺、骨髓、睪丸、卵巢、淋巴、軟組織、頭頸、甲狀腺、食道的癌和白血病、成神經細胞瘤等。

通過體外抑制結肺癌細胞hcc78、淋巴細胞瘤karpas299、肺腺癌細胞a549、肺癌細胞h460和腸癌細胞ht-29活性試驗，本發明化合物對肺癌細胞、淋巴瘤細胞具有顯著抑制作用，特別用於製備治療和/或預防肺癌和淋巴癌的藥物。

通過對alk和ros1酶活性測試發現，本發明化合物具有顯著的抑制alk和ros1激酶活性，對alk和ros1高表達的肺癌細胞、淋巴瘤等具有較強的抑制作用，特別用於製備治療和/或預防肺癌的藥物。

本發明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗腫瘤藥物單獨使用，或者可以與現已上市的抗腫瘤藥物(如鉑類藥物順鉑、喜樹鹼類藥物伊立替康、長春鹼類藥物諾維本等)聯合使用。聯合治療通過將各個治療組分同時、順序或隔開給藥來實現。

下文中提供的實施例和製備例進一步闡明和舉例說明本發明化合物及其製備方法。應當理解，下述實施例和製備例的範圍並不足以任何方式限制本發明的範圍。

下面的合成路線概括並描述了本發明的式ⅰ衍生物的製備，所有的原料都是通過這些路線中描述的方式、通過有機化學領域普通技術人員熟知的方法製備的或者可商購。本發明的全部最終衍生物都是通過這些路線中描述的方法或通過與其類似的方法製備的，這些方法是有機化學領域普通技術人員熟知的。這些路線中應用的全部可變因數如下文的定義或如權利要求中的定義。

按照本發明的式ⅰ衍生物，都可按照路線1的方法由中間體m和相應的醛或酮在醇類溶劑如乙醇中，通過縮合反應製得。其中，化合物中的x、r1、r2、r3和ar如權利要求中所定義。

中間體m可按照路線2由中間體iv與取代的二氯嘧啶縮合，再經水合肼肼解得到。其中，化合物中的x、r1、r2如權利要求中所定義。

當x為nh，r1為異丙磺醯基，化合物m-1的製備方法如路線3，其他取代基如權利要求中所定義。

具體實施方式：

實施例旨在闡述而不是限制本發明的範圍。化合物的核磁共振氫譜用brukerarx-400測定，質譜用agilent1100lc/msd測定；所用試劑均為分析純或化學純。

實施例1：

步驟a異丙基(2-硝基苯基)硫醚(ⅱ)

將509.1g(3.61mol)鄰氟硝基苯和698.0g(5.06mol)無水碳酸鉀加入至2500ml乾燥的n,n-二甲基甲醯胺(dmf)中，緩慢滴入301.8g(3.97mol)異丙硫醇，滴畢，升溫至110℃反應10h。冷卻至室溫，將反應液倒入大量水中，用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉乾燥，蒸乾溶劑，得黃色液體604.6g，收率85.0％。

步驟b1-異丙磺醯基-2-硝基苯(ⅲ)

將197.1g(1.00mol)異丙基(2-硝基苯基)硫醚加入至1500ml冰醋酸中，緩慢滴入583.0g(6.00mol)35％雙氧水,升溫至80℃，反應9h。冷卻至室溫，將反應液倒入大量水中，室溫攪拌30min，抽濾，餅乾燥後得黃色固體164.7g，收率85％。

步驟c2-異丙磺醯基苯胺(ⅳ)

將115.0g(0.50mol)中間體ⅲ加入至500ml乙醇中，加入0.6g(0.05mol)活性炭和8.1g(0.05mol)無水三氯化鐵，升溫至50℃，緩慢滴入417.2g(5.00mol)60％的水合肼，升溫至80℃，反應15h。趁熱抽濾，蒸去大部分溶劑，將剩餘物倒入水中，室溫攪拌30min，抽濾，濾餅乾燥後得淺黃色固體81.62g，收率82％。

步驟d2,5-二氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺(ⅴ)

將39.8g(0.20mol)中間體ⅳ加入至400ml乾燥的n,n-二甲基甲醯胺(dmf)中，冰浴下分批加入32.0g(0.80mol)60％氫鈉，冰浴下攪拌30min，緩慢滴入73.4g(0.40mol)2,4,5-三氯嘧啶，冰浴下反應10h。將反應液倒入大量氯化銨飽和溶液中，室溫攪拌30min，抽濾，得棕紅固體。乙腈重結晶得淺黃色固體27.6g，收率40.0％。

步驟e5-氯-2-肼基-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺341.07(ⅵ)

將17.3g(0.05mol)中間體ⅵ加入到200ml乙醇中，緩慢滴入16.7g(0.20mol)60％的水合肼，室溫反應7h。抽濾，濾餅乾燥得白色固體15.7g，收率92％。

步驟f(e)-2-(2-苯亞甲基肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺(實施例1)

將0.3g(0.88mmol)中間體ⅵ及0.11g(1.00mmol)苯甲醛加入到5ml乙醇中，回流反應5h。冷卻，抽濾，濾餅用少量乙醇淋洗，得白色固體0.24g，收率63.6％。

esi-ms[m+h](m/z):430.1；1hnmr(600mhz,dmso)δ11.38(s,1h),9.77(s,1h),9.30(s,1h),8.31(s,1h),8.14(s,1h),7.85(dd,j＝15.9,7.7hz,2h),7.72(d,j＝7.5hz,2h),7.48(t,j＝7.5hz,2h),7.39(t,j＝7.4hz,2h),3.56–3.47(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

按照實施例1的方法，以不同取代基中間體ⅵ為原料與相應的醛或酮進行縮合反應製備得到實施例2-25的化合物。

實施例2(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(吡啶-4-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):431.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.69(s,1h),9.80(s,1h),9.21(s,1h),8.36(s,1h),8.10(s,1h),7.88(t,j＝7.8hz,2h),7.64(d,j＝5.8hz,2h),7.40(t,j＝7.6hz,1h),3.58–3.45(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

實施例3(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(吡啶-3-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):431.1；

實施例4(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(噻吩基-2-基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):436.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.24(s,1h),9.68(s,1h),9.07(s,1h),8.27(s,1h),8.02(s,1h),7.84–7.77(m,3h),7.34(t,j＝7.6hz,1h),6.77(d,j＝3.1hz,1h),6.59(s,1h),3.47(dp,j＝13.7,6.9hz,1h),1.17(d,j＝6.7hz,6h).

實施例5(e)-5-氯-2-(2-(呋喃-2-基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):420.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.27(s,1h),9.71(s,1h),9.10(s,1h),8.29(s,1h),8.04(s,1h),7.83(dd,j＝18.9,7.9hz,3h),7.37(t,j＝7.6hz,1h),6.79(d,j＝3.1hz,1h),6.62(s,1h),3.50(dt,j＝13.5,6.7hz,1h),1.20(d,j＝6.7hz,6h).

實施例6(e)-5-氯-2-(2-(4-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):448.1；1hnmr(600mhz,dmso)δ11.35(s,1h),9.75(s,1h),9.26(s,1h),8.28(s,1h),8.11(s,1h),7.86–7.82(m,2h),7.74(dd,j＝8.2,5.8hz,2h),7.36(t,j＝7.4hz,1h),7.31(t,j＝8.6hz,2h),3.52–3.44(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).

實施例7(e)-2-(2-(4-溴苯基亞甲基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):508.0；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.44(s,1h),9.76(s,1h),9.23(s,1h),8.29(s,1h),8.08(s,1h),7.85(t,j＝7.8hz,2h),7.65(q,j＝8.7hz,4h),7.36(t,j＝7.7hz,1h),3.55–3.43(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).

實施例8(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-硝基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):475.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.71(s,1h),9.79(s,1h),9.20(s,1h),8.34(s,2h),8.32(s,1h),8.20(s,1h),7.93(d,j＝8.6hz,3h),7.85(d,j＝7.8hz,1h),7.39(t,j＝7.5hz,1h),3.56–3.43(m,1h),1.18(d,j＝6.8hz,6h).

實施例9(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-甲基苯亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):444.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.31(s,1h),9.77(s,1h),9.31(s,1h),8.10(s,1h),7.90–7.79(m,2h),7.61(d,j＝8.0hz,2h),7.39(t,j＝7.6hz,1h),7.29(d,j＝7.9hz,2h),3.56–3.44(m,1h),2.35(s,3h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

實施例10(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):498.1；

實施例11(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):460.1；hnmr(400mhz,dmso)δ11.21(s,1h),9.76(s,1h),9.29(s,1h),8.28(s,1h),8.09(s,1h),7.85(t,j＝7.9hz,2h),7.66(d,j＝8.7hz,2h),7.38(t,j＝7.6hz,1h),7.05(d,j＝8.7hz,2h),3.82(s,3h),3.56–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

實施例12(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-氰基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):455.1；

實施例13(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(4-(甲硫基)苯基亞甲基基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):476.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.33(s,1h),9.77(s,1h),9.29(s,1h),8.30(s,1h),8.09(s,1h),7.91–7.83(m,2h),7.65(d,j＝8.1hz,2h),7.38(dd,j＝14.8,7.8hz,3h),3.58–3.44(m,1h),2.53(s,3h),1.20(d,j＝6.7hz,6h).

實施例14(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(2-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):476.1；

實施例15(e)-5-氯-n-(2-異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3-甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):460.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.39(s,1h),9.76(s,1h),9.24(s,1h),8.31(s,1h),8.10(s,1h),7.92–7.74(m,2h),7.39(t,j＝7.0hz,2h),7.28(d,j＝7.7hz,2h),6.97(d,j＝7.2hz,1h),3.82(s,3h),3.57–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.6hz,6h).

實施例16(e)-5-氯-2-(2-(2-氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):460.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ11.52(s,1h),9.79(s,1h),9.24(s,1h),8.34(d,j＝7.8hz,2h),7.98(t,j＝7.2hz,1h),7.85(dd,j＝14.2,7.7hz,2h),7.40(qd,j＝13.3,6.8hz,3h),7.32–7.24(m,1h),3.59–3.44(m,1h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

實施例17(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3-(三氟甲基)苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):498.1；

實施例18(e)-5-氯-2-(2-(2,4-二氟苯基亞甲基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):466.1；

實施例19(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(3,4,5-三甲氧基苯基亞甲基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):520.1；

實施例20(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(1-(4-甲氧基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):459.1；1hnmr(400mhz,dmso)δ10.24(s,1h),9.80(s,1h),9.41(d,j＝8.4hz,1h),8.32(s,1h),7.90–7.83(m,3h),7.80(t,j＝8.5hz,1h),7.38(t,j＝7.6hz,1h),7.04(d,j＝8.8hz,2h),3.82(s,3h),3.50(dt,j＝13.5,6.8hz,1h),2.29(s,3h),1.20(d,j＝6.8hz,6h).

實施例21(e)-5-氯-2-(2-(1-(4-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):462.1；

實施例22(e)-5-氯-2-(2-(1-(2,4-二氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):480.1；

實施例23(e)-5-氯-2-(2-(1-(2-氟苯基)亞乙基)肼基)-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):480.1；

實施例24(e)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)-2-(2-(1-(4-甲基苯基)亞乙基)肼基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):458.1；

實施例25(e)-2-(2-(1-(4-溴苯基)亞乙基)肼基)-5-氯-n-(2-(異丙磺醯基)苯基)嘧啶-4-胺

esi-ms[m+h](m/z):522.0；

本發明產物的抗腫瘤活性研究

體外抗腫瘤細胞活性

對按照本發明的上式ⅰ的嘧啶類衍生物進行了體外結肺癌細胞hcc78、淋巴細胞瘤karpas299、肺腺癌細胞a549、肺癌細胞h460和腸癌細胞ht-29體外活性篩選。

(1)細胞復甦並傳代2-3次穩定後，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其從培養瓶底部消化下來。將細胞消化液倒入離心管中後，之後加入培養液以終止消化。將離心管在800r/min下離心10min，棄去上清液後加入5ml培養液，吹打混勻細胞，吸取10μl細胞混懸液加入細胞計數板中計數，調整細胞濃度為104個/孔。96孔板中除a1孔為空白孔不加細胞外，其餘皆加入100μl細胞混懸液。將96孔板放入培養箱中培養24h。

(2)用50μl二甲基亞碸溶解受試樣品，然後加入適量培養液，使樣品溶解成2mg/ml藥液，然後在24孔板中將樣品稀釋為20、4、0.8、0.16、0.032μg/ml。

每個濃度加入3孔，其中周圍兩行兩列細胞長勢受環境影響較大，只和為空白細胞孔使用。將96孔板放入培養箱中培養72h。

(3)將96孔板中帶藥培養液棄去，用磷酸緩衝溶液(pbs)將細胞衝洗兩遍，在每孔中加入mtt(0.5mg/ml)100μl放入培養箱中4h後，棄去mtt溶液，加入二甲基亞碸100μl。在磁力振蕩器上振蕩使存活細胞與mtt反應產物甲臢充分溶解，放入酶標儀中測定結果。通過bliss法可求出藥物ic50值。

化合物的抑制肺癌細胞hcc78、淋巴細胞瘤karpas299、肺腺癌細胞a549、肺癌細胞h460和腸癌細胞ht-29活性結果見表1。

表1

alk和ros1酶活性試驗

用於測量alk酶活性的試驗基於酶聯免疫吸附試驗。具體操作是：

室溫下，在0.25mg/mlpgt包被的板上，將實施例化合物、50pmalk和5umatp在試驗緩衝液中(25mmmops,ph7.4,1mmdtt,5mmmgcl2,1mmmncl2,0.1％nan3)溫育20min。通過衝洗除去反應混合液並用0.2ug/ml綴合辣根過氧化酶的磷酸酪氨酸特異性克隆抗體檢測磷酸聚合物底物。加入1m磷酸終止顯色後，於450nm處通過分光光度法定量顯色的底物顏色。

ros1酶活性的試驗操作同alk酶活性測試方法。

實施例化合物對alk和ros1的抑制數據見表2.

表2

本發明中通式ⅰ的化合物可單獨施用，但通常是和藥用載體混合物給予，所述藥用載體的選擇要根據所需用藥途徑和標準藥物實踐，下面分別用該類化合物的各種藥物劑型，例如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑和軟膏劑的製備方法，說明其在製藥領域中的新應用。

實施例26：片劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例12化合物為例)10g，按照藥劑學一般壓片法加輔料20g混勻後，壓製成100片，每片重300mg。

實施例27：膠囊劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例16化合物為例)10g，按照藥劑學膠囊劑的要求將輔料20g混勻後，裝入空心膠囊，每個膠囊重300mg。

實施例28：注射劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例1化合物為例)10g，按照藥劑學常規方法，進行活性炭吸附，經0.65μm微孔濾膜過濾後，填入氮氣罐製成水針製劑，每隻裝2ml，共灌裝100瓶。

實施例29：氣霧劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例22化合物為例)10g，用適量丙二醇溶解後，加入蒸餾水及其他輻料後，製成500ml的澄清溶液即得。

實施例30：栓劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例19化合物為例)10g，將之研細加入甘油適量，研勻後加入已熔化的甘油明膠，研磨均勻，傾入已塗潤滑劑的模型中，製得栓劑50顆

實施例31：膜劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例13化合物為例)10g，將聚乙烯醇、藥用甘油、水等攪拌膨脹後加熱溶解，80目篩網過濾，再將實施例18化合物加入到濾液中攪拌溶解，塗膜機制膜100片。

實施例32：滴丸劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例17化合物為例)10g，與明膠等基質50g加熱熔化混勻後，滴入低溫液體石蠟中，共製得滴丸1000丸。

實施例33：外用搽劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例8化合物為例)10g，按照常規藥劑學方法與乳化劑等輔料2.5g混合研磨，再加蒸餾水至200ml製得。

實施例34：軟膏劑

用含有權利要求1中化合物的化合物(以實施例7化合物為例)10g，研細後與凡士林等油性基質500g研勻製得。

儘管已經通過特定實施方案描述了本發明，但修改和等價變化對於精通此領域的技術人員而言是顯見的，且它們都包含在本發明範圍之內。