一種提高蠶絲產量的轉基因方法

2023-12-10 01:43:56 4

專利名稱：一種提高蠶絲產量的轉基因方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明涉及一種提高蠶絲產量的轉基因方法。
背景技術：
家蠶是一種重要的經濟昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物。在過去幾千年中，家蠶的蠶絲產量的提高主要通過傳統育種的方法來實現，存在著育種周期長，操作複雜，性狀保持不穩定，優良性狀難以整合等問題。隨著家蠶基因組框架圖O004)及精細圖譜Q008)繪製工作的陸續完成，標誌人類對家蠶的研究和認識開始進入後基因組時代，利用高效穩定的遺傳操作技術從基因組水平對家蠶的經濟性狀進行改良成為一種可能。在現代生物學研究中，轉基因技術發揮著日益重要的作用，它通過將人工分離或修飾過的基因有效導入生物體基因組中，實現同源的基因過表達或失活，異源基因的過表達，是一種強有力的遺傳操作工具。以往的轉基因技術中對外源基因的表達凋節主要有兩種方法第一種是將靶基因接入到特異性啟動子的下遊來調控靶基因的表達，可對靶基因信號轉導通路中的具體功能進行系統研究；第二種是利用熱休克蛋白啟動子(Heat Shock Promotor, Hsp)調節靶基因的表達，可通過調節熱休克時間和溫度來控制調節靶基因表達的時間和表達水平。這兩種方法已得到廣泛的應用，但由於在這兩種系統中都是啟動子直接調節靶基因表達，因此存在一定的局限性。前者的靶基因表達水平只能通過插入點的位置效應和改變基因拷貝數來進行調節，操作上比較困難。此外，如果靶基因是致死基因，這種轉基因系則無法建立。而熱休克蛋白由於在生物體中普遍存在，可導致後者表達缺乏特異性，另外在表達量上也存在不足。來源於鱗翅目昆蟲細胞系的杆狀病毒的轉座子PiggyBac由於其較廣的寄主範圍及較高的轉座效率自2000年開始被利用為轉基因載體進行家蠶的轉基因研究。通過國內外科學家的不懈努力，家蠶轉基因技術日趨成熟穩定，並在基礎科學及應用研究等方面發揮較大的作用。鑑於目前大部分家蠶生產性品種為滯育性品種，而針對滯育性品種的家蠶轉基因技術也已建立(家蠶滯育品種的轉基因方法，申請號200910103397. 6)。儘管目前通過轉基因技術來改造家蠶以獲得改良的品種在理論上完全可以實現， 然而仍然缺乏可切實有效地通過轉基因技術來獲得高產蠶絲的家蠶的技術。因此，本領域還需要繼續進行深入研究，以開發出方便有效的提高家蠶蠶絲產量的產品和方法。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提高蠶絲產量的轉基因方法。在本發明的第一方面，提供一種製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶的方法，在家蠶後絲腺表達促細胞生長基因。在一個優選例中，所述的方法是轉基因方法。在另一優選例中，所述的促細胞生長基因促家蠶後絲腺增大。
在另一優選例中，所述的促細胞生長基因選自(但不限於)GTP結合蛋白Rasl基因，PII基因(胰島素信號通路相關基因)，InR基因(胰島素信號通路相關基因)，Akt基因(胰島素信號通路相關基因)，Yorkie基因(Hippo信號通路相關基因)。較佳地，採用選用家蠶本身的GTP結合蛋白Rasl基因。更佳地，採用Rasl基因點突變後形成具持久活性的Rasla，編碼Raslv12。在另一優選例中，所述蠶絲產量高、蠶絲性能改善包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長，蠶絲強度增強或蠶絲韌性增加。在另一優選例中，所述方法包括(1)提供一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代1 ；(2)提供一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )下遊激活序列(UAQ，促進細胞生長的基因；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代2 ；和(3)將家蠶轉基因後代1和家蠶轉基因後代2進行雜交，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。在另一優選例中，所述方法包括提供一種構建物，含有構建物1和構建物2 ；所述的構建物1依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件 (GAL4)；所述的構建物2依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一3』)下遊激活序列 (UAS)，促進細胞生長的基因；將所述構建物轉化家蠶，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。在另一優選例中，所述方法包括(Si)提供一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』)家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)；(S2)提供一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』)下遊激活序列(UAS)，促進細胞生長的基因；(S3)將(Si)和(S》的構建物轉化家蠶，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。在另一優選例中，構建物1中，還含有表達報告基因1的表達盒1 ；構建物2中， 還含有表達報告基因2的表達盒2 ；且所述的報告基因1不同於報告基因2 ；選擇同時呈現報告基因1相應表型和報告基因2相應表型的家蠶，該家蠶是後絲腺變大、蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶。在另一優選例中，所述的報告基因1和報告基因2選自(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)基因，增強的綠色螢光蛋白(EGFP)基因，紅色螢光蛋白(DsRec^)基因。在另一優選例中，所述的表達盒1依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』) 3XP3啟動子，報告基因1，終止子(較佳地，所述終止子是SV40終止子)；或所述的表達盒2依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ) :3XP3啟動子，報告基因2，終止子(較佳地，所述終止子是SV40終止子)。在另一優選例中，所述的家蠶後絲腺特異性表達啟動子選自(但不限於)絲心蛋白輕鏈啟動子(Fil)，絲心蛋白重鏈啟動子(Fih)，p25啟動子。
在另一優選例中，構建物1中，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)下遊還包括一終止子(較佳地，所述終止子是HSP70終止子)；或構建物2中，促細胞生長基因下遊還包括一終止子(較佳地，所述終止子是SV40 終止子)。在另一優選例中，所述的構建物是以轉座子作為骨架的轉基因表達載體。在另一優選例中，所述的表達載體是基於鱗翅目昆蟲細胞系的杆狀病毒的轉座子PiggyBac的轉基因載體。在另一優選例中，所述的家蠶後絲腺重增加(或後絲腺增大)；後絲腺中GTP結合蛋白Rasl表達水平增加；後絲腺中bHLH( —種與產絲量正相關的轉錄因子)表達水平增加；後絲腺中Ras-GTP表達水平增加；或後絲腺中磷酸化MAPK (與細胞生長有關)、Akt (胰島素信號傳導下遊重要調節因子)、S6K或4EBP (TOR信號途徑中調控蛋白合成的重要因子)的含量增加。在另一優選例中，所述的構建物中，各元件之間直接相連，或者，各元件之間還含有其它核苷酸序列。另一方面，提供一種由所述的方法製備獲得的家蠶，該家蠶是蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶。另一方面，提供一種用於製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1) 一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ):家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)；(2) 一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ):下遊激活序列 (UAS)，促細胞生長基因。在一個優選例中，所述的試劑盒中還含有家蠶(如一種野生型家蠶，如大造)的卵。另一方面，提供一種促細胞生長基因或其編碼的蛋白的用途，用於製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶。在一個優選例中，所述的促細胞生長基因或其編碼的蛋白還用於增加家蠶後絲腺中bHLH表達水平；增加家蠶後絲腺中Ras-GTP表達水平；或增加家蠶後絲腺中磷酸化 MAPK, Akt、S6K 或 4EBP 的含量。在一個優選例中，所述的促細胞生長基因選自GTP結合蛋白Rasl基因，PII基因，InR基因，Yorkie基因。較佳地，所述的促細胞生長基因是GTP結合蛋白Rasl基因。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1顯示了構建的轉基因載體的示意圖，其中圖IA為載體Fil-GAL4/3XP3-DsRed 的基本結構，圖IB為轉基因載體UAS-Raslvl73XP3-EGFP的基本結構。
圖2顯示了兩種轉基因家蠶雜交試驗獲得的子代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(-) D⑴，E⑴D⑴)幼蟲基因型的示意圖。圖3A顯示了兩種轉基因家蠶的雜交後代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E(+) D(+))的後絲腺(左)，蠶繭(中)和蛹(右)的表型觀察。在比較時，將四種基因型分為兩組進行比較，其中一組為E-D-E+D-和E-D+，另一組為E+D+，這兩組分別取一平均水平進行比較。圖:3B顯示了兩種轉基因家蠶的雜交後代(E(-)D(-)，E(+)D(-)，E(-)D (+)，E(+) D(+))的後絲腺、總絲腺、總蟲重及之間比例的生物學統計。圖3C顯示了兩種轉基因家蠶的雜交後代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E(+) D (+))的後絲腺中的Rasl表達水平，以及bHLH表達水平的比較。圖4顯示了兩種轉基因家蠶的雜交後代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E㈠D(+)，E(+) D(+))的Ras-GTP的表達水平檢測和比較。圖5顯示了兩種轉基因家蠶的雜交後代(E(-)D(-)，E(+)D(_)，E(_)D(+)，E⑴ D (+))的絲腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量比較。圖6顯示了 Olympus倒置螢光顯微鏡下觀察家蠶後絲腺情況。a和b圖為100倍視野下野生型與雙陽性家蠶後絲腺的橫切面比較。c和d圖是在200倍視野下野生型與雙陽性家蠶後絲腺的橫切面比較。圖7上圖顯示了掃描電子顯微鏡下觀察細胞核核區染色質。圖7下圖顯示了掃描電子顯微鏡下觀察細胞核四周粗面內質網、囊泡和線粒體的數量和分布。
具體實施例方式本發明人經過深入的研究，意外地發現增大家蠶後絲腺可以提高蠶絲產量，可通過在家蠶後絲腺中特異性高表達促細胞生長基因或促後絲腺增大基因，獲得後絲腺增大 (包括重量和體積增加)的家蠶，所述的家蠶高產蠶絲、且蠶絲性能改善。本發明人還找到了較佳的促後絲腺生長的基因——GTP結合蛋白Rasl (後文簡稱Rasl)。本發明人還設計了合適的在家蠶後絲腺中特異性高表達促細胞生長基因的表達系統。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，所述的「啟動子」或「啟動子區(域)」是指一種核酸序列，其通常存在於目的基因編碼序列的上遊(5』端)，能夠引導核酸序列轉錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區提供RNA聚合酶和正確起始轉錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調控區域，進行隨機或定點突變等來獲得。組織或器官特異型啟動子調控下的基因轉錄一般只發生在某些特定器官或組織中。如本文所用，所述的「可操作(性)地連接」或「操作性連接」是指兩個或多個核酸區域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區被置於相對於目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區域的引導，從而，啟動子區域被「可操作地連接」到該核酸序列上。如本文所用，「外源的」或「異源的」是指來自不同來源的兩條或多條核酸或蛋白質序列之間的關係。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在的，則啟動子對於該目的基因來說是外源的。特定序列對於其所插入的細胞或生物體來說是「外源的」。如本文所用，術語「特異性表達」是指目的基因在特定的時間和/或特定的組織表達。「組織特異性」又稱「器官特異性」，在一些調控元件的調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，並表現出其相關的發育調節的特性。本發明中，所述的「後絲腺特異性表達」是指在家蠶後絲腺中特異表達。通常，如果在家蠶後絲腺中mRNA以比在其它組織或器官中高至少5倍，優選至少高10倍，更優選至少高100倍，最優選至少高1000倍水平被表達，則認為相關基因的表達是家蠶後絲腺特異性的。如本文所用，所述的「蠶絲產量高的家蠶」是指一種轉基因家蠶的後代，其在同樣的生長條件下比野生型家蠶的蠶絲產量高10 %或更高(較佳地高20 %或更高；更佳地高 40%或更高；如高 50%，60%，80%，100%，200%或更高)。如本文所用，所述的「後絲腺增大的家蠶」是指一種轉基因家蠶的後代，其在同樣的生長條件下比野生型家蠶的後絲腺大10%或更大(較佳地大20%或更高；更佳地大 40%或更高；如大50%，60%，80%，100%，200%或更大)；或後絲腺重量增加10%或更多 (較佳地增加20%或更多；更佳地增加40%或更多；如增加50%,60%,80%,100%,200% 或更多)。如本文所用，術語「含有」、「包括」或「具有」包括了「包含」、「主要由……構成」、「基本上由……構成」、和「由……構成」。如本文所用，所述「蠶絲產量高、蠶絲性能改善」包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長，蠶絲強度增強或蠶絲韌性增加等。蠶絲屬於天然高分子材料，分子與分子間是比較弱的範德華力，但因為含氫鍵，並且分子鏈間相互絞合，這種力還是很大的，所以具有一定的強度。強度與韌性是做為蠶絲纖維經濟性狀的重要衡量指標，強度與韌性的增強可擴大蠶絲的運用範圍。促細胞生長基因為了提高蠶絲的產量，本發明人經過廣泛研究，結果發現通過增大家蠶的後絲腺 (即促進家蠶的後絲腺生長)可以非常有效地提高蠶絲產量。後絲腺增大的家蠶其體重增加，且產生的蠶繭也明顯增大。本發明人還意外地發現，促細胞生長基因可增大家蠶後絲腺，增加蠶絲產量，提高蠶絲品質。因此，一類促細胞生長基因或後絲腺增大基因均包括在本發明中，作為對於提高蠶絲的產量有用的物質。所述的促細胞生長基因或後絲腺增大基因包括(但不限於)促進細胞生長、增殖或分裂的基因，如和營養代謝相關的胰島素信號通路重要基因 PI3K、InR、Akt (參考文獻 Regulation of tissue growth throughnutrient sensing. Hietakangas V, Cohen SM. Annu Rev Genet. 2009 ；43 :389-410)以及參與細胞增長的 Hippo ff ^ ^ W Yorkie S @ ( Yorkie ；Regulation ofOrgan Size Jnsights From theDrosophila Hippo Signaling Pathway 2009 MadhuriKango-Singhl and Amit Singh2,3DEVEL0PMENTAL DYNAMICS 238 :1627-1637 Elucidation of a universal size-control mechanism in Drosophila andmammals. Dong J,Feldmann G,Huang J,Wu S, Zhang N,Comerford SA,GayyedMF,Anders RA,Maitra A,Pan D. Cell. 2007Sep 21 ；130(6) 1120-33)。這些促細胞生長基因的變體也可用於本發明的方法。本發明人還找到了較佳的促後絲腺生長的基因Rasl，其對於家蠶的後絲腺的增大具有明顯的促進作用，該基因在後絲腺中過表達後，家蠶的體重、後絲腺重均有明顯增加，產生的蠶繭和蠶蛹也明顯增大；也即過表達Rasl基因使得家蠶的蠶絲產量有明顯的提高。因此，作為本發明的優選方式，所述的促細胞生長基因或後絲腺增大基因是Rasl基因(參考文獻 Ras Activity in theDrosophila Prothoracic Gland Regulates Body Size and Developmental Rate viaEcdysone Release Philip E. Caldwell, Magdalena ffalkiewicz,and Michael Stem2005 Current Biology 15 1785-179 。Rasl 基因編碼一種小GTP結合蛋白，具有控制細胞增殖的重要作用，它主要是通過調節下遊MAPK及PI3K/ AKT信號通路來行使功能。其活性形式的體現是通過與GTP (三磷酸鳥苷)結合來激活下遊通路，失活時則改為結合⑶P ( 二磷酸鳥苷)並無法激活下遊通路。所述的Rasl基因編碼具有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列(NCBI登錄號 BAD13777. 1)的蛋白或其衍生蛋白。所述的衍生蛋白是將SEQ ID NO :2胺基酸序列經過一個或多個(如1-20個；較佳地1-10 ；更佳地1-5個)胺基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，該衍生蛋白也具有促進細胞生長或增大家蠶後絲腺功能。較佳地，所述的Rasl基因具有SEQ ID N0:l(Abl76555核苷酸序列中第212-790位)所示的核苷酸序列。本發明還涉及嚴格條件下能夠與Rasl基因的核苷酸序列雜交且編碼的蛋白也具有促進細胞生長或增大家蠶後絲腺功能的核酸。多核苷酸的雜交是本領域技術人員熟知的技術，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發明還涉及與所述Rasl基因或其突變體(如Raslvl2)的核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少80%，較佳地至少90%，更佳地至少95%相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。「嚴格條件」是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0. 2X SSC, 0. 1% SDS, 600C ；或(2)雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲醯胺，0. 小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選60%以上、65%以上、 70%以上、75%以上、80%以上、85 %以上或90 %以上，更優選是95%以上時才發生雜交。 並且，可雜交的多核苷酸編碼的Rasl蛋白或其衍生蛋白也具有促進細胞生長或增大家蠶後絲腺的功能。較佳地，本發明採用一種突變形式的Rasl基因(RaslGA，編碼Raslvl2蛋白)，其可保持持續活性表達形式。所述的突變形式的Rasl基因編碼的蛋白的第12位胺基酸甘氨酸 (Glycine，縮寫G)突變為纈氨酸(Valine，縮寫V)，其可持續性結合GTP，從而一直激活其下遊信號通路。而在正常情況下Rasl與GTP或⑶P的結合是由細胞根據需要維持在一個動態平衡的狀態。本發明還包括與本發明的Rasl基因序列具有80%以上，更優選90%以上，最優選 95%以上相同性的核酸，所述核酸編碼的蛋白也具有促進細胞生長或增大家蠶後絲腺的功能。「相同性」是指按照位置相同的百分比，兩條或多條核酸之間的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。所述的Rasl基因還用於增加家蠶後絲腺中bHLH表達水平；增加家蠶後絲腺中 Ras-GTP表達水平；或增加家蠶後絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量。提高蠶絲產量的方法在得知了所述的促細胞生長基因的用途後，可以採用本領域人員熟知的多種方法來調節所述的促細胞生長基因的表達。比如，可通過本領域人員已知的途徑將攜帶促細胞生長基因的表達單位(比如表達載體或病毒等)遞送到靶點(特別是家蠶後絲腺)上，並使之表達活性的促細胞生長蛋白。例如可設計含有促細胞生長基因的表達盒，使該表達盒在家蠶(特別是家蠶後絲腺)中表達，從而使家蠶(特別是家蠶後絲腺)表達(或過表達) 促細胞生長蛋白。所述的含有促細胞生長基因的表達盒通常含有促細胞生長基因以及與之操作性相連的其它元件，這些元件包括但不限於啟動子、增強子、終止子等。所述的啟動子可以是組織或器官特異性的；當需要在家蠶後絲腺中特異性表達時，所述的啟動子是後絲腺特異表達啟動子。所述的表達盒通常可包含在表達載體中用於轉化動物。為了通過轉基因方法提高蠶絲的產量，本發明人長期以來作過多方面的嘗試，最終發現利用GAL4/UAS轉基因系統在家蠶後絲腺中過表達Rasl對於提高家蠶蠶絲的產量是非常高效的。GAL4 (Galactose-Regulated Upstream Promoter Element 4，GAL4)是半乳糖調節上遊啟動子元件，是酵母中類似於原核生物乳糖操縱子的一個轉錄激活子。下遊激活序列UAS(upstream active sequence，UAQ是酵母中另一種類似高等真核生物增強子的序列。GAL4通過與UAS相結合，調節與半乳糖代謝相關基因的表達。GAL4/UAS系統的基本原理在於GAL4-組織特異性啟動子和UAS驅動靶基因分別存在於兩個轉基因系中。GAL4轉基因系中有轉錄激活子，但沒有靶基因；在UAS-靶基因系中，轉錄激活子不存在，因而靶基因處於沉默狀態，只有將GAL4轉基因系與UAS-靶基因系進行雜交，才可能產生表達靶基因的後代。因此，本發明提供一種製備蠶絲產量高的家蠶的方法，所述方法包括(1)提供一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代1 ；(2)提供一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )下遊激活序列(UAQ，促細胞生長基因；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代2 ；和(3)將家蠶轉基因後代1和家蠶轉基因後代2進行雜交，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。參照以上方法，還可以進行合理的變通，這是本領域人員在參考了以上方法後易於做到的。例如也可以將兩個構建物(較佳地還包括輔助質粒)一起轉入到家蠶中，直接篩選陽性後代；以及將兩個構建物直接接入到一個載體中，轉入(較佳地還同時轉入輔助質粒)到家蠶中，篩選陽性後代。所述的家蠶後絲腺特異性表達啟動子可以是任何特異性指導基因在家蠶後絲腺表達的基因。例如可選自(但不限於)絲心蛋白輕鏈啟動子(Fil)，絲心蛋白重鏈啟動子 (Fih)或p25啟動子。啟動子的變體也包括在本發明中，例如與所述啟動子在嚴格條件下可雜交；或與所述啟動子具有80%以上相同性，較佳地90% (更佳地95%以上，如98%， 99%)以上序列相同性的變體。作為本發明的優選方式，所述的家蠶後絲腺特異性表達啟動子是絲心蛋白輕鏈啟動子，其核苷酸序列如GenBank登錄號gi J89362中第378-1078位所示。在該片段內進行l_30bp(較佳地l-20bp;更佳地I-IObp)內核苷酸缺失或突變，不會影響該序列啟動子活性。該啟動子特別適合於與GAL4共同作用，驅動促細胞生長基因的表達。通過比較分析發現，絲心蛋白輕鏈啟動子的非常適合於本發明的方法。蠶繭主要由在後絲腺分泌絲心蛋白和中絲腺分泌的絲膠蛋白兩部分組成，其中絲心蛋白在蠶繭中比例達到70-80%。作為絲素蛋白的重要組成部分絲心蛋白輕鏈(Fibroin light chain)，其啟動子具有很高的活性，且不同家蠶品種的絲心蛋白輕鏈同源性很高，核苷酸序列同源性可達到95. 6%。較佳地，步驟(1)的構建物中，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)下遊還包括一終止子；較佳地，所述終止子是HSP70終止子。步驟O)的構建物中，促細胞生長基因下遊還包括一終止子；較佳地，所述終止子是SV40終止子。從效果來看，分別採用不同的終止子 (HSP70終止子和SV40終止子)優於都用SV40終止子這一情況。為了便於雜交後代的篩選，作為本發明的優選方式，可以在兩種構建物中分別插入報告基因。當兩種構建物分別被轉入家蠶後，獲得的轉基因後代可顯示出各自體內存在的報告基因的相關特性或表型。當分別攜帶各自的報告基因的轉基因家蠶進行雜交獲得雜交後代後，可通過鑑定報告基因的表達情況，從而選擇到同時攜帶兩種報告基因的雜交後代。對於報告基因的選擇沒有特別的限制，只要其能夠呈現出一種獨特的、便於選擇的特性或表型。所述的報告基因例如可選自(但不限於)綠色螢光蛋白(GFP)基因，增強的綠色螢光蛋白(EGFP)基因，紅色螢光蛋白(DsRec^)基因，β-半乳糖苷酶(IacZ)基因。 如本文所用，「綠色螢光蛋白，，是指一種標記蛋白，其內源螢光基團在受到紫外光或藍光激發時可高效發射清晰可見的綠光，且見光不易淬滅。綠色螢光蛋白的高解析度晶體結構為了解和研究蛋白質結構和光譜學功能關係提供了一個極好的機會。「增強的綠色螢光蛋白」 為對綠色螢光蛋白進行改進後的蛋白，例如，可克隆自質粒PEGFP-Nl (購自Clontech)。如本文所用，「DsRed2」是指來源於珊瑚蟲紅色螢光蛋白，其內源螢光基團在受到黃光激發時高效發射清晰可見的紅光，波長範圍廣且不易淬滅，經常與其它螢光蛋白配合使用進行多禾中標記。本發明所述的報告基因的表達盒是指一套可表達報告基因的基因系統，通常在5』 至3』方向上包括了元件啟動子、報告基因和終止子。以上構建物中，各元件之間直接相連，或者，各元件之間還含有其它核苷酸序列， 所述其它核苷酸序列的長度在l_500bp，較佳地l-200bp，更佳地l-50bp，更佳地l_30bp，更佳地l-15bpm^p，10bp。當然，其它長度(如更長)的間隔序列也是可以存在的，只要其存在不影響上述各元件之間的操作性相連，不抑制基因的轉錄和表達。作為本發明的優選方式，所述的構建物是表達載體。「表達載體」指本領域熟知的細菌質粒、酵母質粒或其他載體。只要能在宿主體內複製和穩定，任何質粒和載體都是可用的。表達載體的一個重要特徵是通常含有複製起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件，優選地還包含一個或多個選擇性標記基因。本領域的技術人員熟知的方法能用於構建含本發明的多核苷酸序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的重組表達載體。較佳地，所述的表達載體是以轉座子作為骨架的轉基因載體。多種轉基因都是可用的，例如 PiggyBac轉基因載體或Minos轉基因載體(參考文獻Uchino K等；2008. Construction of a piggyBac-basedenhancer trap system for the analysis of gene function in silkworm Bombyx mori. Insect Biochem Mol Biol.38,1165—1173)。
較佳地，所述的表達載體是基於鱗翅目昆蟲細胞系的杆狀病毒的轉座子PiggyBac 的轉基因載體。在基於PiggyBac的轉化方法中，可以分別將兩個構建物連同輔助質粒轉入到家蠶中，篩選到陽性後代再進行雜交；也可以將兩個構建物與輔助質粒一起轉入到家蠶中，直接篩選陽性後代；以及將兩個構建物直接接入到一個載體中，和輔助質粒轉入到家蠶中。將構建物轉入家蠶的轉化方法除顯微注射法外，不排除用其他方法進行家蠶轉基因，如精子介導法，參考文獻郭秀洋，周澤揚，馮麗春，汪琳，魯成，向仲懷；2001 ；利用精子介導法向蠶卵導入外源基因的研究；生物化學與生物物理進展；28 03)423-425。在本發明的較佳實施方式中，利用在後絲腺特異性表達的絲心蛋白輕鏈啟動子驅動的GAL4系(Fil-GAL4)，而靶基因選用在多種模式動物進行廣泛及深入研究的可有效促進細胞生長及增殖的GTP結合蛋白Rasl，將其突變為持續活性表達形式Raslv12連入到UAS 後(UAS-Raslvi2)，通過PiggyBac轉基因載體以二化性生產品種大造為材料顯微注射獲得兩種質粒的轉基因家蠶後代後，進行雜交得到雙陽性後代，發現其個體大小，後絲腺體積以及蠶繭大小與野生型或單陽性後代相比都有顯著的提高，隨後用表型觀察，生物學統計，分子生物學方法進行了驗證。本發明還包括利用上述方法獲得的體重增加、後絲腺增大、蠶絲產量高的轉基因家蠶的後代。此外，相對於野生型家蠶，本發明的方法獲得的家蠶還具有以下特性後絲腺中GTP結合蛋白Rasl表達水平增加；後絲腺中bHLH表達水平增加；後絲腺中Ras-GTP表達水平增加；或後絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。本發明還包括利用上述方法獲得的各種家蠶轉基因後代，或者是它們的卵。試劑盒基於本發明人的新發現，本發明還提供了一種用於製備蠶絲產量高的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1) 一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ):家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件(GAL4)；(2) 一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ):下遊激活序列 (UAS)，促細胞生長基因。較佳地，每一構建物中還分別含有一報告基因。上述的構建物1和構建物2可以存在於一個總的構建物中，用於轉化家蠶；也可分別轉化家蠶。所述的試劑盒中還可含有家蠶(如一種野生型家蠶)卵。以便於人們將之作為轉基因的受體。所述的試劑盒中還可含有轉基因操作中有用的試劑和材料，以便於人們進行轉基因操作。例如含有PBS注射緩衝液，注射用輔助質粒(含有PiggyBac轉座酶的編碼基因)， 顯微注射針等。此外，所述的試劑盒中還可含有使用說明書。本發明的主要優點在於1.與家蠶傳統育種相比，首次直接在產絲的主要器官後絲腺表達(過表達)促細胞生長基因，從而促使後絲腺體積和重量增長，進而在產絲量上有了較為明顯的提高。為家蠶品種的產絲性狀改良提供一個新的手段和方法。2.作為一種優選方法，本發明以GAL4/UAS雙螢光轉基因家蠶系統為平臺，在家蠶後絲腺特異性過表達促細胞生長基因或促後絲腺生長的基因(Raslvl2)，發現雙陽性後代的後絲腺體積和重量與野生型相比增加近1倍，上蔟吐絲形成的蠶繭與野生型相比也有明顯的增大，並且在個體總重量上與野生型相比也有一定的增加。為提高特定品種家蠶的產絲經濟性狀提供了有力的途徑。3.利用本發明的方法針對生產性品種進行蠶絲性狀的改良，可以直接將生產品種作為遺傳操作材料，避免煩瑣而漫長的育種周期，直接利用轉基因技術創造出高蠶絲產量的品種，大大縮短育種周期，也節省大量的人力和物力。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1、構建轉基因載體Fil-GAL4/3XP3-DsRed 見圖 1A。UAS-Ras 1V12/3XP3_EGFP 見圖 IB。上述兩種載體均以Piggybac轉座子為轉基因基本骨架，其中GAL4系選用在後絲腺特異性表達的絲心蛋白輕鏈作為啟動子，篩選標記選用在眼和神經節特異性表達的人工啟動子3XP3驅動的紅色螢光DsRed2。UAS系攜帶持續活性形式的Raslvl2,篩選標記改為綠色螢光EGFP。Fil-GAL4/3XP3-Dslted 載體構建過程，其中原始載體為 pBacA3-GAL4/3XP3_DsIted (獲自日本國立農業科學研究院，參考文獻AnjangTan，Hiromasa Tanaka，Toshiki Tamura, Takahiro Shiotsuki 2005. Precociousmetamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase. Proc Natl Acad Sci. 102 11751-11756), 該載體A3啟動子兩端分別具有AscI與SacII位點，將Fil啟動子利用引物上遊 5，-attGGCGCGCCtgc atattggaca tcc_3，(大寫為 AscI 限制性酶切位點)，下遊 5，-attCC GCGGtaggcttcattttagtggtctgt-3，(大寫為^icII限制性酶切位點)將Fil基因組序列上遊692bp包含了 TATA box的啟動子序列用PCR方法從家蠶基因組中擴增出來連入T載體測序確認後，利用AscI酶與SacII酶將該片段與pBacA3-GAL4/3XP3-DSRed進行酶切連接， 得到 pBacFil-GAL4/3XP3-DsRed 載體。UAS-Ras 1V12/3XP3-EGFP 載體構建利用 pUAS-EGFP-m 載體(獲自 clontec 公司； 目錄號6085-1)。將Rasl蛋白(GenBank登錄號abl76555)編碼序列克隆入T載體，利用Overlapping PCR方法將Rasl蛋白第12位胺基酸對應的密碼子GGA突變為GTA(甘氨酸一纈氨酸)，將突變後的Raslvl2利用引物上遊5，-cgcGAATTCatgaccgag tacaaattgg tggt-3，(大寫為 EcoRI 限制性酶切位點)，下遊 5，-taaGCGGCCGCttaaaaaagggtgcaatcttt aat-3』 (大寫為NotI限制性酶切位點)從包含該片段的T載體擴增出後，用EcoRI與NotI 分別將Raslvl2與pUAS-EGFP-Nl進行酶切連接，得到UAS-Raslvi2片段，再次利用該片段兩端的NheI和AflII酶切位點進行酶切連入到包含同樣位點的pBac3XP3-EGFP(獲自南方模式動物研究中心，參考文獻 Dai H，Jiang R，Wang J，Xu G，Cao M，Wang Z，Fei J. 2007. Development of a heat shock inducible and inheritabIeRNAi system in silkworm. Biomol Eng. 24,625-630)中得到 pBacUAS-Raslvl2/3XP3-EGFP。實施例2、轉基因蠶獲得及雜交後代的實驗分析在二化性品種大造(獲自西南大學)上通過顯微注射方法分別獲得以上兩種質粒的轉基因家蠶。具體方法待蠶蛹羽化後收集同時化蛾的雌雄蠶蛾，在25°C弱光下交配4 小時候拆對，將雌蛾投放於上漿的蠶連紙上，在黑暗的環境中產卵，每隔半小時收集一次蠶卵，並將收集的蠶卵置於25°C環境中保護。並在產卵3小時內用Eppendorf顯微注射儀，將 10-15nl，總濃度 400ng/ul 的 Fil-GAL4/3XP3_DsRed 或 UAS-Ras 1V12/3XP3_EGFP 攜同輔助載體(pigA4，獲自西南大學)，注射到蠶卵中，用無毒膠水封住注射口，經35%的甲醛蒸汽消毒5分鐘後，置於25°C，相對溼度85%的環境中孵化，將孵化出的GO代蟻蠶用人工飼料飼養至化蛾，獲得的GO代蠶蛾，通過自交或回交得到Gl代蠶卵，用Olympus螢光顯微鏡篩選， 分別得到綠色螢光及紅色螢光陽性的蛾圈。將前述分別轉入兩種質粒的轉基因家蠶進行雜交試驗，對獲得的子代幼蟲基因型進行螢光鑑定(共四種，1.無任何螢光E(-)D(-)，2.只有綠色螢光E(+)D(-)，3.只有紅色螢光E(-)D(+)，4.既有紅色螢光又有綠色螢光E(+)D(+))。待發育至5齡末期(從卵中孵化出後經4次蛻皮的家蠶)上蔟後，將蠶分別從總體重、總絲腺重、後絲腺重三方面進行稱量並取出後絲腺進行後續試驗，對上蔟後吐絲結成的蠶繭以及化蛹情況進行了初步觀察。兩種轉基因家蠶雜交試驗獲得的子代幼蟲基因型鑑定結果見圖2。A.後絲腺，蠶繭和蛹的表型觀察在對四種基因型的家蠶後絲腺，蠶繭及蛹進行表型觀察時發現，GAL4/UAS雙色螢光陽性後代與單陽性及野生型後代相比均有較顯著的增大，見圖3A。初步證實，在後絲腺中過表達Raslvl2可從後絲腺，蟲重及蠶繭大小上對家蠶帶來正面的增強效應。蠶繭變大也即表明蠶絲的產量增加。進行比較時將四種不同基因型(包括雙陽性單陽性及野生型)分成兩大組，雙陽性為一組，單陽性及野生型為一組，進行得組間比較。B.後絲腺、總絲腺、總蟲重及之間比例的生物學統計通過對四種不同基因型家蠶的總體重，後絲腺重，以及後絲腺與總絲腺，後絲腺與總體重比例進行統計分析，結果見圖3B，可發現GAL4/UAS雙陽性蠶(E(+)D(+))的這四項指標與其它三種基因型相比具有顯著的提高。重要的是，後絲腺的重量，尤其是後絲腺與總體重的比值的增幅達到近一倍，證明利用GAL4/UAS轉基因系統確實能提高家蠶蠶絲的產量。C.從分子生物學水平進行的相關驗證利用定時實量PCR(即RealtimePCR方法，試劑選用日本東洋紡公司的STOR Green Realtime PCR Master mix，儀器選用Biorad公司IQ5實時定量PCR儀，Rasl引物為rasl-s ggacgaatacgatcccacgat ；rasl-a :gacggcgaataccagcaaga。內參基因選用Bmrp49引物為Rp49-s 5， -CGTCACCAGTCGGATCGTTAT-3，；Rp49-a 5， -AGCATGTGACGGGTCTTCTTA-3，。
反應體系為模板1. 0μ 1 ；Realtime Master Mix 10 μ 1 ；
引物1 QO μ Μ)0. 5μ 1 ；引物2 QO μ Μ)0. 5μ 1 ；(MH2O至 20 μ 1。反應條件選用三三步法條件為95°c預變性lmin，95°C變性k，55°C退火1 ，2°C延
伸15s，40個循環。以內參基因的循環數為標準，計算目的基因相對內參基因表達水平的變化，將最低相對值設為1，其它值分別與最低值進行比較即可。檢測Rasl在四種基因型後絲腺的轉錄水平變化，發現雙陽性後代的後絲腺中的 Rasl表達水平最高，可達到單陽性及野生型後代的9-10倍，圖3C。檢測在高產絲家蠶品種高表達的轉錄因子bHLH基因轉錄水平，引物為W!lh3s gacgactccaaccacgat ；bhlh3a :tccaagtggcgaatgtaa0也發現該基因在雙陽性的後絲腺的表達水平比其它三種基因型的要高2-3倍。實施例3、Rasl-GTP的表達水平檢測利用Rasl活性檢測試劑盒(購自Millipore公司，目錄號17-218)檢測轉基因家蠶雜交後代中活性形式的Ras即Ras-GTP的表達水平變化，分別將四種基因型蠶後絲腺稱取50mg，利用試劑盒提供的MLB裂解液裂解後離心吸取上清，每0. 5ml細胞提取液加入 IOul含有活性形式Rasl結合底物Raf-I RBD瓊脂糖。在4°C孵育45分鐘後，快速短暫離心，吸去上清，用MLB洗滌液洗三次，將瓊脂糖重懸到40ul 2 X Laemmli還原型上樣緩衝液中，沸水煮5分鐘，短暫離心取上清20ul進行SDS蛋白質電泳，將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST進行封閉，按順序上Rasl —抗比例1 1000，4°C搖床過夜， 洗滌，加入Hrp標記的二抗，比例1 2000室溫2小時，洗滌後用ECL發光檢測試劑盒檢測活性形式Ras的蛋白質表達水平。結果見圖4。結果發現，與單陽性及野生型後代相比，GAL4/UAS雙色螢光陽性後代(E(+)D(+))的Rasl-GTP表達水平顯著提高，證實Raslv12的過表達可以促進活性形式的 Ras-GTP表達量提高，進而可對Ras下遊的信號通路產生影響。實施例4、家蠶後絲腺中的磷酸化MAPK、Akt、S6K和4EBP含量分析以Rasl/MAPK信號通路下遊的MAPK磷酸化水平作為指標，用^festernblot的方法檢測四種基因型的後絲腺中的磷酸化MAHi含量。分別取四種基因型家蠶後絲腺組織，用碧雲天公司的RIPA強裂解液抽提總蛋白，經BCA法測定蛋白量後，分別取20ug蛋白與5X 蛋白上樣緩衝液混合進行蛋白質電泳。其中磷酸化MAPK的兔源一抗購自Cell Signaling 公司，內參Tublin鼠源一抗購自碧雲天公司，抗鼠，抗兔二抗均購自Santa Cruz公司。 ECLplus化學發光檢測試劑盒購自美國GE公司。結果見圖5，發現GAL4/UAS雙色螢光陽性後代(E(+)D(+))的磷酸化 MAPK(P-MAPK)水平顯著升高，說明Ras/MAH(信號通路得到激活。而該信號通路直接參與調控細胞的生長增殖，證明過表達的Rasl放大了下遊的Ras/MAPK信號通路，促進了細胞的生長。另外，就與營養調節相關的Rasl/PII信號通路下遊重要因子Akt及S6K，4EBP磷酸化水平進行檢測。其中磷酸化MAPK、AKT、S6K、4EBP的兔源一抗均購自Cell Signaling 公司。結果見圖5，發現在GAL4/UAS雙色螢光陽性後代(E (+) D (+))中，磷酸化Akt、4EBP 及S6K(P-Akt，P-4EBP，P-S6K)的顯著上升。說明該通路也得到激活，蛋白質合成增強，促進細胞產物的增加。實施例5、顯微鏡觀察不同基因型家蠶後絲腺的情況對不同基因型家蠶後絲腺的橫切面進行比較。取出各基因型家蠶的後絲腺後用石蠟切片，蘇木精染色，在Olympus倒置螢光顯微鏡下觀察，結果見圖6。a和b圖為100倍視野下野生型與雙陽性家蠶後絲腺的橫切面比較，可看出雙陽性轉基因家蠶後絲腺的橫截面粗明顯於野生型家蠶，後絲腺為管腔狀分泌器官，中間為分泌腔，外周為後絲腺分泌細胞，其中後絲腺分泌細胞在雙陽性家蠶中的徑寬是在野生型中的 1.5倍以上。c和d圖是在200倍視野下野生型與雙陽性家蠶後絲腺的橫切面比較，由圖中可看出雙陽性轉基因家蠶後絲腺分泌細胞的細胞核(藍色箭頭所指)在區域分布和分枝數上均高於野生型，後絲腺分泌細胞在家蠶整個生長周期中只存在染色體組的多次複製和細胞體積的增大，其DNA含量與分泌蛋白的能力密切相關，細胞核核區的體積增大，分枝數增多， 說明其DNA含量增多，提示其細胞活力增強，代謝旺盛，分泌蛋白能力增強。實施例6、顯微鏡觀察不同基因型家蠶細胞器結構(1)細胞核核區染色質數量的比較取出各基因型家蠶的後絲腺，按照常規的電鏡切片標準步驟處理後，置於掃描電子顯微鏡下，觀察細胞核核區染色質，結果見圖7上圖。由圖中可看出雙陽性家蠶後絲腺分泌細胞核區的區域(黑色箭頭所指)面積明顯大於野生型，核區內染色質(黑色小點)多倍化程度也大大提高，說明其DNA含量的增高， 這與其分泌絲心蛋白的水平為正相關的。(2)細胞核四周粗面內質網、囊泡和線粒體的數量和分布取出各基因型家蠶的後絲腺，按照常規的電鏡切片標準步驟處理後，置於掃描電子顯微鏡下，觀察細胞核四周粗面內質網、囊泡和線粒體的數量和分布。結果見圖7下圖。由圖中可看出，在核區(黑色箭頭所指)附近，雙陽性家蠶後絲腺分泌細胞中線粒體(紅色箭頭所指)數量顯著多於野生型，說明其細胞代謝相當的活躍。而在粗面內質網(綠色箭頭所指)分布上，雙陽性家蠶後絲腺分泌細胞的粗面內質網分布密度上也多於野生型。 粗面內質網是細胞內分泌蛋白的主要細胞器，與細胞蛋白合成水平正相關。在囊泡大小和分布量上，雙陽性家蠶後絲腺分泌細胞也顯著多於野生型。細胞中蛋白的運輸主要由從內質網中脫離出的囊泡來完成，其大小和分布量與蛋白合成和分布量正相關。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶的方法，其特徵在於，在家蠶後絲腺表達促細胞生長基因。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的促細胞生長基因促家蠶後絲腺增大。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的促細胞生長基因選自GTP結合蛋白 Rasl基因，PI3K基因，Akt基因，InR基因，Yorkie基因。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蠶絲產量高、蠶絲性能改善包括蠶繭體積增大，蠶繭重量增加，蠶絲增長，蠶絲強度增強或蠶絲韌性增加。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括(1)提供一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代1 ；(2)提供一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一3』)下遊激活序列， 促進細胞生長的基因；將所述構建物轉化家蠶，獲得家蠶轉基因後代2 ；和(3)將家蠶轉基因後代1和家蠶轉基因後代2進行雜交，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括提供一種構建物，含有構建物1和構建物2 ；所述的構建物1依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件；所述的構建物2依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』)下遊激活序列，促進細胞生長的基因；將所述構建物轉化家蠶，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括(51)提供一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一3』)家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件；(52)提供一種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』 )下遊激活序列，促進細胞生長的基因；(53)將(Si)和(S》的構建物轉化家蠶，得到後絲腺表達促細胞生長基因的家蠶。
8.如權利要求5-7任一所述的方法，其特徵在於，構建物1中，還含有表達報告基因1 的表達盒1 ；構建物2中，還含有表達報告基因2的表達盒2 ；且所述的報告基因1不同於報告基因2 ；選擇同時呈現報告基因1相應表型和報告基因2相應表型的家蠶，該家蠶是後絲腺變大、蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的報告基因1和報告基因2選自綠色螢光蛋白基因，增強的綠色螢光蛋白基因，紅色螢光蛋白基因。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述的表達盒1依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 ) :3XP3啟動子，報告基因1，終止子；或所述的表達盒2依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一3』 ) :3XP3啟動子，報告基因2，終止子。
11.如權利要求5-7任一所述的方法，其特徵在於，所述的家蠶後絲腺特異性表達啟動子選自絲心蛋白輕鏈啟動子，絲心蛋白重鏈啟動子，P25啟動子。
12.如權利要求5-7任一所述的方法，其特徵在於，構建物1中，半乳糖調節上遊啟動子元件下遊還包括一終止子；或構建物2中，促細胞生長基因下遊還包括一終止子。
13.如權利要求5-7任一所述的方法，其特徵在於，所述的構建物是以轉座子作為骨架的轉基因表達載體。
14.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的家蠶後絲腺重增加；後絲腺中GTP結合蛋白Rasl表達水平增加；後絲腺中bHLH表達水平增加；後絲腺中Ras-GTP表達水平增加；或後絲腺中磷酸化MAPK、Akt、S6K或4EBP的含量增加。
15.一種用於製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶的試劑盒，所述試劑盒中含有(1)一種構建物1，依次含有以下可操作性相連的元件(5』 一 3』 )家蠶後絲腺特異性表達啟動子，半乳糖調節上遊啟動子元件；(2)—種構建物2，依次含有以下可操作性相連的元件(5』一 3』)下遊激活序列，促細胞生長基因。
16.一種促細胞生長基因或其編碼的蛋白的用途，用於製備蠶絲產量高、蠶絲性能改善的家蠶。
17.如權利要求16所述的用途，其特徵在於，所述的促細胞生長基因選自GTP結合蛋白Rasl基因，PI3K基因，Akt基因，hR基因，Yorkie基因。
全文摘要
本發明涉及一種提高蠶絲產量的轉基因方法，可通過在家蠶後絲腺中特異性表達促細胞生長基因，獲得後絲腺增大的家蠶，所述的家蠶高產蠶絲。本發明提供了促後絲腺生長的基因，還提供了適合的在家蠶後絲腺中特異性高表達促後絲腺生長的基因的表達系統。本發明為家蠶品種的產絲性狀改良提供新的手段和方法。
文檔編號C12N15/12GK102187845SQ20101011807
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月5日 優先權日2010年3月5日
發明者夏慶友, 徐漢福, 李勝, 馬俐 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 西南大學