乙型腦炎病毒疫苗及其製備方法
2023-12-08 12:42:01 2
專利名稱：乙型腦炎病毒疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種經人二倍體細胞培養製備的乙型腦炎病毒疫苗。具體而言，本發明涉及一種將乙型腦炎病毒接種於人二倍體細胞進行培養，經過馴化、適應和擴增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內大量繁殖，再經濃縮、純化配製成一種乙型腦炎病毒疫苗。這種病毒疫苗可以預防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。本發明還涉及這種病毒疫苗的製備方法。
背景技術：
乙型腦炎是中樞神經系統急性病毒感染的傳染性疾病，在流行地區年發病率高達10～100/10萬，近30億人口生活在乙型腦炎流行區，該地區每年新生兒就超過7,000萬。在亞洲的病毒性腦炎中，乙型腦炎是最嚴重的疾病。每年至少引起50,000臨床病例和10,000例病死，絕大多數發生於兒童中。在最近幾十年中，乙型腦炎的數起暴發流行越來越向曾經是非流行的地區擴大，同時伴隨很高的病死率和嚴重的持久性神經系統後遺症，因而在亞洲很多國家和地區，乙型腦炎成為嚴重地公共健康問題。
流行性乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)簡稱乙腦病毒，病毒顆粒呈二十面體對稱結構，直徑45-50nm，病毒顆粒由核心、包膜和刺突組成，屬黃病毒的一種。基因為正鏈單股RNA，RNA包被於多肽的衣殼C中，組成病毒顆粒的核心。其包膜中有糖基化蛋白E和非糖基化蛋白prM/M。
在乙型腦炎傳染途徑中蚊子是乙腦病毒的主要傳播媒介，豬是主要中間宿主，人因被帶毒的蚊蟲叮咬而感染。目前還沒有治療乙型腦炎疾病的特效藥物，從環境方面控制其傳播的效果不理想。乙型腦炎疫苗的免疫接種是控制乙型腦炎疾病最為經濟有效的措施。
乙型腦炎疫苗有3類在大規模應用，經鼠腦組織培養製備的滅活疫苗、地鼠腎原代細胞或Vero細胞培養製備的滅活疫苗和地鼠腎原代細胞培養製備的減毒活疫苗。
由於乙型腦炎疫苗基礎免疫始於6月齡的健康嬰幼兒，這就要求疫苗首先必須要保證有足夠的安全為前提條件。上述乙型腦炎疫苗無論採用何種培養體系，均是經動物源性的組織或動物細胞培養製成。這些疫苗的缺點在於首先，無法徹底去除動物源性外源因子的汙染。其次，無法進一步增加抗原含量從而在人體中產生更高的免疫應答反應、提供更高、更久的免疫保護。其原因為如進一步增加病毒抗原含量時，伴隨的動物源性物質如雜蛋白、核酸及脂質等也隨之增加，引起嚴重的超敏反應，因此疫苗副反應就加大。例如，經鼠腦組織培養的滅活疫苗以疼痛、發紅、腫脹的局部副反應約為20％，包括頭疼、發熱、肌痛、不適和胃腸道症狀的全身性反應為10～30％。1989年和1990年在丹麥及澳大利亞還分別發現31例和7例蕁麻疹和血管性水腫的嚴重變態反應。經地鼠腎原代細胞培養的滅活疫苗超過38℃的發熱高達12％，在減少了牛血清殘留量後，超過38℃的發熱減至6％(Tsai，Theodore F，Japanese encephalitis vaccines，http://www.cdc.gov.publication date01/01/1990)。而減毒活疫苗是用非清潔級地鼠腎原代細胞作為疫苗培養基質，這難以避免鼠源的外源因子的汙染，這種可能造成的汙染又是難以用現行生物學方法檢出。因此，不能為世界衛生組織疫苗製造檢定規程所接納(迮文遠，計劃免疫學，上海科學技術文獻出版社，2001年，484頁)。雖然用Vero細胞培養製備的滅活疫苗的安全性有了顯著性提高，但Vero細胞超過232代次後在裸鼠體內有致瘤現象(Levenbook IS，etal，Tumorigenicity of vero cells.J Biol Stand 1984 Oct；12(4)391-8)。因此，美國FDA要求用Vero細胞生產的疫苗，生產過程中要有去除細胞的工藝，必須要保證成品中無殘餘的細胞(FDA letterto vaccine manufacturers concerning the use of Vero cells.http://www.fda.gov/cber/letters.htm)。
鑑於上述原因，需要對現有乙型腦炎病毒疫苗細胞系進行革命性地改造，尋找新的病毒培養細胞系，避免上述鼠腦組織、地鼠腎原代細胞和Vero細胞系存在的安全隱患，製備出能滿足始於嬰幼兒接種的乙型腦炎疫苗。
已證實，源於人的二倍體細胞由於其來源是相當清楚，包括捐獻者的年齡、性別、種族、地域、體能及健康狀況、細胞直接來源的組織或器官、細胞世代數等。人二倍體細胞系經過數十年的研究，其生長特性、遺傳穩定的特性、外源因子(細菌、真菌、支原體及病毒)汙染檢查、致腫瘤陰性等特性被充分驗證。更為重要的是人二倍體細胞本身是源於人體的細胞，當用於疫苗製造時人二倍體細胞的殘餘成分不會成為超敏反應原，基本不會引起接種者超敏反應。因此，從質量控制的角度看，相比較於上述鼠腦組織、地鼠腎原代細胞和Vero細胞系，人二倍體細胞沒有潛在的不安全隱患，是製備疫苗理想的細胞系。
進一步證實，用人二倍體細胞系製備疫苗已經得到越來越多的應用，例如用MRC-5和/或WI-38細胞系製備的風疹病毒疫苗、用MRC-5細胞系製備的A肝病毒疫苗、用FrhL-2細胞系製備的輪狀病毒疫苗、用MRC-5細胞系製備的水痘病毒疫苗、國際上公認的金標準狂犬病疫苗也是人二倍體細胞培養疫苗。因此，用人二倍體細胞製備乙型腦炎病毒疫苗能顯著性地提高現行乙型腦炎病毒疫苗的質量。
本發明的核心內容是，採用人二倍體細胞系作為乙型腦炎病毒培養繁殖的細胞基質，同時將乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內進行馴化適應，並且病毒和細胞均有良好的穩定性，進而製備成乙型腦炎病毒疫苗。
綜上所述，本發明的乙型腦炎病毒疫苗重點解決了，用人二倍體細胞替代鼠腦組織、地鼠腎原代細胞和Vero細胞進行乙型腦炎病毒培養，再進一步製成疫苗。用人二倍體細胞製備的疫苗可顯著性地降低疫苗副反應尤其是過敏反應和動物源性病毒的危害，去除潛在的安全性隱患，保證了疫苗在兒童和青少年和非疫區的成人中使用的安全性。
為了克服現有技術的不足之處，本發明的目的在於提供一種新的乙型腦炎病毒疫苗及其製備方法。
發明內容
為了完成本發明的目的，本發明提供一種乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，該疫苗所含的乙型腦炎病毒抗原是乙型腦炎病毒經人二倍體細胞培養、繁殖、純化、提取獲得的。所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗，也包括減毒活疫苗、裂解疫苗和/或亞單位疫苗和與其它疫苗的聯合疫苗。
所述的乙型腦炎病毒疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株、Nakayama株和乙腦病毒的其它分離株中任一株製備的。
所述的人二倍體細胞是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細胞系中的任一株。
本發明還涉及一種將乙型腦炎病毒馴化、適應和擴增於人二倍體細胞的方法。
換言之，本發明提供了將乙型腦炎病毒接種於人二倍體細胞進行培養，經過馴化、適應和擴增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內大量繁殖，再經滅活、濃縮、純化配製成一種乙型腦炎病毒疫苗。本發明還提供了乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內馴化、適應和擴增的方法。這種用人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗可以分別預防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。
本發明中重點引入的概念和方法是對現行的乙型腦炎病毒疫苗進行改造和升級使之達到更好的安全性和免疫效果。本發明是將人二倍體細胞替代鼠腦組織、地鼠腎原代細胞和Vero細胞用於乙型腦炎病毒培養，收穫的病毒液經滅活、濃縮、純化後經配製成為乙型腦炎病毒疫苗。這種用人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗，除含有作為免疫原性的病毒抗原存在外，不含任何源於動物組織或動物細胞的殘餘成分，從根本上排除了引起超敏反應的動物蛋白、核酸及脂質等。由於安全性顯著性地提高，進一步使得疫苗可以提高免疫劑量，增加疫苗保護效力，從而能克服現行的乙型腦炎病毒商品疫苗具有的免疫局限性及接種後的不良反應。
本發明所用乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)毒種購買於中國藥品生物製品檢定所。毒種名稱為SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama。中國藥品生物製品檢定所負責製備和發放上述病毒毒種。
在本發明的一個實施方案中，乙型腦炎病毒培養可採用上述毒種SA14、SA14-14-2、P3、Nakayama中的任何一株。如果滿足需要，也可採用其它合適的毒種，此處給出的毒種僅僅是為了例示性說明本發明。
本發明的乙型腦炎病毒培養體系是人二倍體細胞2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細胞系中的任一株。如果滿足需要，也可採用其它合適的人二倍體細胞，此處給出的細胞僅僅是為了例示性說明本發明。
本發明提供了將乙型腦炎病毒馴化、適應和擴增於人二倍體細胞的方法。具體而言，乙腦病毒在人二倍體細胞內的病毒滴度逐漸提高，≥7.5lgPFU/ml，並趨向於穩定。
本發明的乙型腦炎病毒疫苗每劑量為含有病毒蛋白5～90μg。至於用量的上限，本領域的技術人員可以根據疫苗人體臨床試驗數據而最終確定。
本發明的人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，並且中和抗體滴度≥地鼠腎細胞和Vero細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗。
本發明的人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的保護效力，並且效力中和指數高於地鼠腎細胞和Vero細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗。
本發明的乙型腦炎病毒疫苗可以和A、C群腦膜炎球菌多糖與一蛋白載體偶聯形成的結合疫苗組成乙腦—流腦聯合疫苗。
本發明的乙型腦炎病毒疫苗還可進一步和其它疫苗組成聯合疫苗，如無細胞百白破疫苗—滅活脊髓灰質炎病毒疫苗—Hib疫苗—B型肝炎疫苗—腦膜炎球菌結合疫苗—乙型腦炎病毒疫苗，麻疹—乙腦聯合疫苗、麻疹—風疹—腮腺炎—乙腦聯合疫苗、黃熱—乙腦聯合疫苗等。
本發明提供一種乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，該疫苗在製備過程中病毒培養所用的細胞系是人二倍體細胞。在本發明的方法中所述的人二倍體細胞系選自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細胞系中的任一株。而且所述的乙型腦炎病毒疫苗可以是滅活疫苗，而滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株製備的。所述的乙型腦炎病毒疫苗也可以是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
另外所述的乙型腦炎病毒疫苗還可以是與其它疫苗的聯合疫苗，包括麻疹—乙腦聯合疫苗、乙腦—流腦聯合疫苗、麻疹—風疹—腮腺炎—乙腦聯合疫苗、黃熱—乙腦聯合疫苗。
經過本發明的方法能夠製備出更高免疫原性和效力、更安全、更易被接種者接受的一種乙型腦炎病毒疫苗。
具體實施例方式
下面結合實施例描述本發明，將乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內進行馴化、適應和擴增，將收穫的病毒液進行濃縮和純化，再經適當配製成乙型腦炎病毒疫苗。用二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗經動物試驗和實驗室檢定證實該種疫苗具有可靠的安全性和優良的免疫原性及卓越的保護效力。
實施例1
人二倍體細胞的製備
人二倍體細胞的製備以MRC-5為例細胞培養液為DMEM(也可用其它適宜的細胞營養液如MEM、199培養基、1640培養基等)，加入4～10％的胎牛血清(無外源因子汙染)和濃度100～200U/ml的卡那黴素(或慶大黴素)，調pH至7.0～8.0之間。細胞用柯氏瓶或轉瓶培養於35～37℃，4～8天後培養成緻密的單層細胞後，以1∶2的比例擴增，直到擴增生產批用量時，經過3～5天培養，細胞長成緻密的單層細胞，棄去細胞培養液。並用pH7.0～8.0的磷酸鹽緩衝液淋洗細胞表面，洗掉殘留的牛血清。準備用於病毒的接種。
實施例2
乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內馴化、適應和擴增
以人二倍體細胞以MRC-5為例由於乙腦病毒在人二倍體細胞內的病毒繁殖滴度較低，因此必須將乙腦病毒逐漸在人二倍體細胞內馴化、適應。將乙腦病毒P3株(或SA14等其它病毒株)接種於已長滿單層的人二倍體細胞內，於30～37℃繼續培養。當細胞病變達到50～70％時收穫細胞上清液，即為在人二倍體細胞內生長繁殖的乙腦病毒液。依次進行一代一代適應。當收穫的乙腦病毒液中的乙腦病毒滴度達到7.5lgPFU/ml以上時即作為用於乙腦疫苗生產用的種子病毒。按《中國生物製品規程》(化學工業出版社，2000年)要求經各項試驗檢測合格後即可用於疫苗的生產製備。
實施例3
乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內傳代穩定性
按實施例2的試驗步驟依次進行，可觀察到乙腦病毒在人二倍體細胞內的病毒滴度逐漸提高，≥7.5lgPFU/ml，並趨向於穩定，各代次的病毒滴度見表1。
表1.乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內傳代穩定性
實施例4
乙型腦炎病毒滅活疫苗製備
按實施例1製備人二倍體細胞，依實施例3製備疫苗生產用的病毒種子。依實施例3選擇病毒滴度達到疫苗生產要求的代次為疫苗生產用工作種子。將用磷酸鹽緩衝液淋洗過的細胞以MOI為0.1～0.00001的比例接種乙腦病毒於人二倍體細胞中。細胞維持液為含0.1～0.5％的人血白蛋白的DMEM細胞營養液，pH7.0～8.0之間。30～37℃培養，3天後收穫病毒上清液。(如用微載體培養可連續收穫)收穫後的病毒液病毒滴度達到7.5lgpfu/ml以上，無菌試驗檢測陰性，可將收穫後的病毒液做適當合併。合併後的液體為疫苗原液。加入適當滅活劑1∶2000的甲醛溶液(或1∶4000的β-丙內酯，或其它適宜的滅活劑，此處僅為示例)。滅活病毒後得到粗製疫苗。再用截留量10～30萬分子量的超濾器濃縮疫苗10～50倍，進行離子交換柱(DEAE-SepharoseFF)和凝膠過濾柱(Sepharose 4FF)經二步柱層析，得到純化疫苗。加入人白保護劑，稀釋後即可製成疫苗。
實施例5
乙型腦炎病毒疫苗的安全性試驗
對人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗的安全性進行考核，分別採用小鼠、豚鼠異常毒性試驗考核其安全性。選用體重250～350g的清潔級豚鼠，每種疫苗用2隻豚鼠，每隻腹腔注射5.0ml的乙型腦炎病毒疫苗，分別於注射前、注射後7天稱體重，並隨時觀察疫苗接種後反應。選用體重18～20g的清潔級小鼠，用5隻小鼠，每隻腹腔注射0.5ml的乙型腦炎病毒疫苗，分別於注射前、注射後7天稱體重，並隨時觀察疫苗接種後反應。試驗結果列於表2。
表2.乙型腦炎病毒疫苗安全性試驗
動物安全性試驗表明，用人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗中沒有不安全急性毒性因素，可以保證人體使用的安全。
實施例6
乙型腦炎病毒疫苗的免疫原性試驗比較
每種疫苗選12～14g小鼠20隻，每隻腹腔免疫0.5ml，免疫兩次，間隔7天。初免15天採血，2～8℃過夜。次日分離血清，56℃30分鐘滅活。用蝕斑減少中和實驗測定中和抗體滴度。乙型腦炎中和病毒株為SA14和P3株。試驗結果見表3。
表3.乙型腦炎病毒疫苗中和抗體滴度試驗
中和抗體滴度試驗表明人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的免疫原性，並且中和抗體滴度≥地鼠腎細胞和Vero細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗。
實施例6
乙型腦炎病毒疫苗的保護效力試驗比較
採用免疫小白鼠中和抗體測定法。中和抗體測定採用蝕斑減少試驗。參考疫苗(RA和RB)及中和試驗陽性血清購自中國藥品生物製品檢定所。將待測疫苗和參考疫苗(R)均分別稀釋1∶32，分別腹腔免疫體重12～14g小鼠10隻，每隻0.5ml，免疫2次，間隔7天。第2次免疫後7天採血，分離血清，同組小鼠血清等量混合，於56℃滅活30分鐘，稀釋血清、分別與稀釋好的病毒(約200PFU/0.4ml)等量混合。同時將稀釋好的病毒再1∶2稀釋，作為病毒對照，置37℃水浴作用90分鐘，接種6孔板BHK21細胞，每孔0.4ml，37℃培養90分鐘，加入甲基纖維素的培養基覆蓋物，於CO2孵箱中培養5天，染色，蝕斑計數，計算蝕斑減少率。病毒對照組的蝕斑平均數應在50～150之間，合格判定標準為T≥(RA+RB)/2-0.33，試驗結果見表4。
表4.乙型腦炎病毒疫苗保護效力試驗
效力試驗表明人二倍體細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗具有良好的保護效力，並且效力中和指數高於地鼠腎細胞和Vero細胞製備的乙型腦炎病毒疫苗。
權利要求
1、一種經人二倍體細胞培養製備的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，該疫苗在製備過程中病毒培養所用的細胞系是人二倍體細胞。
2、根據權利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗在製備過程中病毒培養所用的人二倍體細胞系是2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細胞系中的任一株。
3、根據權利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗。
4、根據權利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗還可是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
5、根據權利要求1所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗還可和與其它疫苗的聯合疫苗，例如麻疹—乙腦聯合疫苗、乙腦—流腦聯合疫苗、麻疹—風疹—腮腺炎—乙腦聯合疫苗、黃熱—乙腦聯合疫苗等。
6、根據權利要求3所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株製備的。
7、一種乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，其特徵在於，該疫苗在製備過程中病毒培養所用的細胞系是人二倍體細胞。
8、根據權利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的人二倍體細胞系選自2BS、MRC-5、KMB-17、WI-38或HL細胞系中的任一株。
9、根據權利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗是滅活疫苗。
10、根據權利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗是減毒活疫苗、純化疫苗、裂解疫苗/或亞單位疫苗。
11、根據權利要求7所述的乙型腦炎病毒疫苗的製備方法，其特徵在於，所述的乙型腦炎病毒疫苗是與其它疫苗的聯合疫苗，包括麻疹—乙腦聯合疫苗、乙腦—流腦聯合疫苗、麻疹—風疹—腮腺炎—乙腦聯合疫苗、黃熱—乙腦聯合疫苗。
12、根據權利要求9所述的乙型腦炎病毒疫苗，其特徵在於，所述的滅活疫苗是由乙型腦炎病毒SA14株、SA14-14-2株、P3株或Nakayama株或其它分離的乙型腦炎病毒株中任一株製備的。
全文摘要
本發明涉及一種乙型腦炎病毒疫苗及其製備方法，包括將乙型腦炎病毒接種於人二倍體細胞進行培養，經過馴化、適應和擴增工藝處理，乙型腦炎病毒在人二倍體細胞內大量繁殖，再經濃縮、純化配製成一種乙型腦炎病毒疫苗。這種乙型腦炎病毒疫苗可以預防嬰幼兒、兒童、青少年及成人因乙型腦炎病毒感染引起的乙型腦炎疾病。
文檔編號A61K39/12GK1695736SQ200410037948
公開日2005年11月16日 申請日期2004年5月14日 優先權日2004年5月14日
發明者薛平 申請人:薛平