含有熱穩定防凍蛋白的冷凍食品的製作方法

2023-12-08 08:31:46

專利名稱：含有熱穩定防凍蛋白的冷凍食品的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於分離防凍蛋白(AFP)的方法和涉及含有AFP的冷凍食品。
本發明背景長期以來人們建議採用各種防凍蛋白(AFP)來改進食品對冷凍的忍受能力。
出於本發明的原因，術語「AFP」具有本領域所熟知的含義，即那些表現出抑制冰晶體生長的活性的蛋白質。參見美國專利第5,118,792號。
WO90/13571公開了通過化學或重組DNA技術製得的防凍肽。這些AFP可適用於食物中。其實施例3B顯示，如果將水-冰混合物與0.01％(重量)的AFP一起冷凍進薄膜(film)中便改變了冰晶體的形狀。
WO92/22581公開了來自植物的、可用來控制冰淇淋中冰晶體形狀的AFP。該文獻也描述了一種用於通過將植物葉子滲入萃取介質中而無須使植物破碎從植物的細胞外空隙中萃取多肽組分的方法。
WO94/03617公開了從酵母中製備AFP及其在冰淇淋中的應用。WO96/11586描述了通過微生物製備魚的AFP。
有一些文獻段落也提及用於低溫保護的植物蛋白的分離和/或用途。低溫保護蛋白在保護植物膜不受凍壞方面起了一定作用。然而這些蛋白沒有抑制再結晶的性能，因此不包括在術語AFP的範圍內。
Hincha在Journal of Plant Physiology(1992年，140,236-240)中描述了從甘藍中分離出低溫保護蛋白。
Volger在《Biochimica et Biiophysica Acta》(412,1975年，335-349)中描述了從菠菜中分離出低溫保護葉蛋白。
Boothe在《PlantPhysiol》((1995年)，108:759-803)中描述了從蔓青中分離出蛋白。同樣，人們相信這些蛋白是低溫保護蛋白而不是AFP。
Neven在《Plant Molecular Biology》(21:291-305,1993)中描述了菠菜低溫保護蛋白的DNA特徵。
Salzman在《Am.J.Enol.Vitic.》(第44卷，第4期，1993年)的「第18屆ASEV年會/東部的概括和回顧」中描述了在葡萄屬的芽中存在蒸煮穩定的多肽。雖然該蛋白類同於魚的防凍肽，但它們是低溫保護蛋白而不是AFP。
Lin在《Biochemical and Biophysical Research Communication》，第183卷，第3期，1992年，第1103-1108頁)中以及Lin在《PlantPhysiology》((1992年)，99:519-525)中描述了來自Arabidopsis Hakaira的15kDa低溫保護多肽。
Houde在《The Plant Journal》((1995年)，8(4)，第583-593頁中)提及來自小麥的低溫保護蛋白。
此外-如實施例Ⅷ所示-加熱後甘藍、菠菜、蔓青和擬南芥屬的浸出液沒有再結晶抑制蛋白。
然而迄今AFP還未應用於市售食品中。其一個原因是獲得AFP的成本高及過程複雜。另一個原因是直到現在才有人建議將其用於冷凍食品中的AFP不能結合進標準配方混合物中，因在處理過程中、尤其是在巴氏滅菌步驟過程中它們容易失穩。這種失穩相信是由於AFP的變性所引起，這是一個通常可從肽和蛋白中觀察得到的眾所周知的結果。
本發明的目的在於提供這些問題的解決方法。
我們驚奇地發現，通過一種新的較為簡單的方法可將AFP從天然來源如冷凍馴化的植物中分離出來。該方法第一次使得可以鑑別在進行巴氏滅菌之前可方便結合進位備冷凍食品的混合物中的AFP。
因此，在第一方面本發明涉及從天然來源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來；b)將天然來源或含有AFP的汁液在至少為60℃的溫度下進行熱處理；c)除去不溶的部分。
上述方法的步驟c通常在步驟a和b之後進行。步驟a和b可以以任何所需的順序進行，如步驟a在前步驟b在後(在這種情況中將加熱富含AFP的汁液)或步驟b在前步驟a在後(在這種情況中將加熱天然來源)或步驟a和b同時進行。
我們驚奇地發現本發明的分離方法具有許多優點。
首先，通過使用此方法可以不必再如在根據WO92/22581的方法中所要求的那樣需要避免天然來源如植物的破碎。這就馬上顯著增加了本方法的商業應用價值(如與WO92/22581相比)，因為不再需要用於特殊加工的高的投資費用。
同時，通過使用高溫似乎可以從存在於天然來源的大量肽中提取出一種新的相當活性的AFP(從天然材料中)，所述AFP包括相當活性的w.r.t.冰再結晶抑制性能的肽。
第三，使用高溫出乎意料之外地不會使所有的蛋白質的變性，但只是使一些蛋白質變性，而剩下的AFP溫度穩定性得到增加。這就使得在組合物中可以包括需要經受較高溫度，如巴氏滅菌步驟的分離出來的AFP。這是特別令人驚奇的，因為例如來自WO92/22581的AFP在加熱條件下是不穩定的(參見實施例Ⅵ)。
本發明的方法包括在步驟b中將天然來源或富含AFP的汁液加熱至高於60℃的溫度。優選此溫度為60-110℃、最優選為80-105℃。加熱步驟可在分離富含蛋白的汁液(步驟a)之後進行或在分離富含蛋白的汁液之前進行。可用任何適宜的方法來加熱汁液，如常規加熱或微波加熱，任選添加提取介質加熱、蒸汽等。
如果使用提取介質，則最好其使用的體積較小以避免AFP組分發生不必要的稀釋。雖然特別優選使用水，但可以使用任何適宜的提取介質。如需要，可在水用作提取介質之前將各種添加劑加入其中。然而最優選的是使用基本上不含各種添加劑的水。
本發明方法可以應用於任何熱穩定的AFP的天然來源。包括在此範圍內的是植物、魚、昆蟲和微生物。天然存在的種類或通過遺傳修飾獲得的種類都可以使用。例如可使微生物或植物經基因修飾後表達AFP，然後根據本發明可將此AFP分離出來。因此可獲得與直接從天然來源中獲得的AFP至少80％、更優選大於95％、最優選100％同源的AFP。出於本發明的原因，擁有如此高同源水平的蛋白也包括在術語AFP的範圍內。同時這些可以表達編碼AFP的基因轉化的微生物或植物也包括在本發明的範疇內。
可使用遺傳操作技術來生產述於本發明中的熱穩定的AFP。通過用編碼所需熱穩定多肽的基因構成物可使合適的宿主細胞或有機體發生轉化。可將編碼熱穩定多肽的核苷酸順序插入到含有為轉錄作用和轉譯作用所需元件的適宜表達載體中，並且以一種在合適的條件下(如以適當的定向及正確的讀框且具有合適的目標和表達序列)可將其表達出來的方式進行。構成這些表達載體所需的各種方法對於本領域技術人員是眾所周知的。
可以採用許多表達體系來表達熱穩定多肽的編碼序列。這些體系包括(但不限於此)細菌、酵母昆蟲細胞體系、植物細胞培養體系和具有用合適表達載體轉化的植物。
採用在熱穩定提取液中分離出來的多肽核酸構成物可以轉變很多種植物和植物細胞體系。優選的實施方案包括(但不限於此)玉米、西紅柿、菸草、胡蘿蔔、草莓、油菜籽和製糖甜菜。
優選AFP衍生自植物(這指的是AFP直接從作為天然來源的植物中獲得，或與這些AFP具有高度同源的AFP在其它有機體中經轉基因得到)。可採用任何含有熱穩定AFP的植物，然而優選在寒冷的條件下仍可生長(因其含有AFP)的天然存在的植物(或其基因修飾的變種)。特別優選使用冬黑麥、多年生牧草和苔草。其它適宜的植物可以是例如木質植物、冬穀類等。
特別優選熱穩定AFP衍生自槭樹屬saccharoides(Acersaccharoides)、竹、醉魚草屬、園枝貓尾蘚、樹花屬farinaceae(Ramalinafarinacea)、松蘿屬subfloridana(Usnea subfloridana)、連翹屬、酢漿草屬、早熟禾屬Trivialis(Poa Trivialis)、毒麥屬Perenne(Loium Perenne)、絨毛草、雀麥屬Sterilis(Bromus Sterili)、Parodiochloa flabellata、發草屬antartica(Deschampsia antartica)、苔草屬aquatilis(Carex aquatilis)、Colobanthus quintensis和翦股穎屬tenuis(Agrostis tenuis)、羊茅屬contracta(Festuca contracta)和早熟禾。
通過任何方便的方法如壓濾、過濾、均化、萃取等可將富含AFP的汁液從其來源中分離出來。在通過例如過濾收集富含蛋白部分之前，優選將AFP的天然來源如植物材料切成小塊或製成淤漿。可通過任何適宜的方法如在摻合機中進行浸漬作用。將植物材料分成這種小塊的形式使得更容易收集富含AFP汁液將完全是本領域技術人員力所能及的事。
在蛋白部分收集和加熱(以所需的順序進行)後，為了除去不溶部分並保留富含AFP液體部分，可通過方便的方法處理所得含有AFP的樣品。不溶部分可通過如過濾、沉澱等方法除去。然後最好進一步處理富含AFP液體以濃縮或分離AFP，並將其做成適合於進一步使用的形式。適宜方法的例子是乾燥以獲得粉末或糊狀物，進一步濃縮以獲得AFP濃縮液，色譜法將AFP從提取介質中分離出來等。確定得到適當分離的所需的適宜方法和條件同樣也是本領域技術人員力所能及的事。
對於一些天然來源而言，通過上述方法獲得的AFP可由兩種或多種不同的AFP的混合物所組成。如需要，通過任何常規方法如色譜法或其它基於物理/化學性質如分子量的不同可分離這些AFP。
同樣如需要，可確定分離出來的AFP的胺基酸組成及其序列。可以採用任何適宜的確定方法。適宜方法的例子述於實施例中。同樣如需要，可確定為編碼AFP的核酸序列。含有能夠編碼胺基酸的核酸序列的載體也包括在本發明的範疇內。
基於以上資料，也可以對其它天然來源進行基因修飾使得它們生產出如上所述的有利的AFP。適宜AFP的例子見述於實施例中。
我們發現，通過上述方法獲得的AFP承受熱處理的能力提高了。我們相信這些AFP以前從未被分離過。如上所述，這種增強了的耐熱性特別適用於必須經受一個加熱步驟如巴氏滅菌的食品。
因此本發明的另一個方面涉及由在80℃熱處理1小時、或在100℃熱處理10分鐘後，其再結晶抑制性能仍未有明顯減少證明了其熱穩定性的AFP。一種適用於確定冰再結晶抑制性能的實驗述於實施例中，它包括快速冷凍至-40℃，然後在-6℃下貯存1小時。優選經過熱處理後經受此實驗的AFP得到的冰晶體顆粒比起具有相同AFP但未經熱處理的樣品的冰晶體顆粒來不大於5μm。優選其差值不大於3μm、最優選不大於1μm。
優選選擇具有顯著冰晶體再結晶抑制性能的那些AFP。一種確定再結晶抑制性能的適宜實驗示於實施例Ⅵ中。優選根據本發明的AFP能提供依據冰再結晶抑制測定(如示於實施例中)的冰顆粒大小為不大於15μm、更優選為5-5μm。
可方便地將AFP用於食品中，優選用於冷凍或即將冷凍的食品中。特別優選的是AFP用於冷凍前需通過例如巴氏滅菌或消毒加熱的食品中。特別優選用於冷凍糖食中。
這些食品的例子是冷凍糖食混合物如冷凍前需進行巴氏滅菌的冰淇淋混合物和凍果子露混合物。這些混合物通常貯存於室溫下。適宜的食品形式是例如包裝於例如袋中或小香包中的粉末混合物。在添加水及任選的其它成分和進行充氣(任選)後，所述混合物可以形成冷凍食品的基礎。
適宜混合物的另一個例子可以是液體混合物(任選進行充氣)，如需要，在添加其它成分及任選的進一步充氣後可將其冷凍。
上述混合物很明顯的優點是AFP成分的存在使得混合物可以在靜止的條件下如在商店或家用冷凍機中進行冷凍而不會形成不可接受的冰晶體形狀，因此而獲得與通常經靜止冷凍所得到的產品不一樣的結構。
可以很方便地將這些混合物包裝於密閉容器中(如紙板箱、袋子、盒子、塑料容器等)。對於單份包裝的大小一般為10-1000克。對於多份包裝的大小可多至500千克。通常包裝大小為10-5000克。
如上所述，其中使用AFP的優選食品是冷凍糖食如冰淇淋或凍果子露。基於最終食品的重量計，優選AFP的含量為0.0001-0.5％(重量)。如果使用幹混合物或濃縮物，則為了確保在最終冷凍食品中其含量能在上述範圍內，其濃度可高些。
我們驚奇地發現，本發明的組合物可以含很低量的AFP，但其質量仍然良好。
我們驚奇地發現AFP的含量可以低至0.1-50ppm而在冷凍的糖食中仍能提供足夠的再結晶性能和溫度忍受能力。雖然本申請人決不希望受縛於任何理論，但其原因可能是冷凍糖食固體與AFP之間的相互作用為抑制晶體生長提供了一個極好的機制。AFP最常見的含量為1-40ppm、特別優選為2-10ppm。
出於本發明的原因，術語「冷凍糖食」包括含有冷凍糖食如冰淇淋的牛奶、冷凍保加利亞奶酒、冷凍果汁水、果汁冰水、牛奶凍和冷凍乳蛋糕、凍果子露、粗粒冰糕(granitas)和冷凍水果泥。對於一些應用則不太優選AFP用在冷凍發酵食品中。
優選固體在冷凍糖食(如糖、脂肪、香料等)中的含量大於4％(重量)，例如優選大於30％(重量)、更優選為40-70％(重量)。
根據本發明的冷凍糖食可以通過任何適用於生產冷凍糖食的方法進行生產。然而特別優選在巴氏滅菌及冷凍過程開始前使配方中的所有成分充分混合。冷凍過程可包括如在不大於華氏-30度的溫度下進行的一個硬化步驟。
實施例Ⅰ首先通過收集汁液，然後進行熱處理並分離AFP來分離AFP。
在一月份(該月份的平均溫度為3.5℃，確保植物得到適當的低溫馴化作用)收割冬黑麥(Halo變種)。將其組織迅速送至實驗室以便進一步處理，並用水徹底清洗以除去汙垢。
在室溫下、於Waring摻合機中，用800克水將400克冬黑麥剪下物攪勻直至葉組織完全得到碎裂。通過4層軟棉布過濾來收集富含AFP的汁液。
然後通過將汁液煮沸10分鐘來使富含AFP的汁液經歷溫度處理。這使得蛋白質發生沉澱，而用於本發明中的AFP則保持在溶液中。通過在15,000g下離心20分鐘或通過進一步經軟棉布過濾使上清液從沉澱物中分離出來。
通過冷凍乾燥可以使AFP從上清液中分離出來。
為了對照，可如下獲得冬黑麥的質外體的浸出液(細胞外浸出液)將經過30天冷馴化的黑麥植物葉切成3釐米長，並在蒸餾水中徹底清洗以除去任何的細胞內含物。將葉片在紙巾上拍幹，然後全部浸入5mM EDTA、10mM抗壞血酸、2mM己酸、2mM苄脒和1mM苯基甲基磺酸氟(PMSF)的提取介質中。在瓷燒瓶中將其進行真空滲透60分鐘，然後取出葉子並完全拍幹。將其排列。縱長(lengthways)被截留於塑料注射針筒中，和緩地以2000Xg離心30分鐘。將質外體的浸出液收集在注射器下面的微量離心管中。
實施例Ⅱ首先通過加熱天然來源的物質，然後分離富含AFP的汁液並分離AFP來進行AFP的分離。
在一月份(該月份的平均溫度為3.5℃，確保植物得到適當的低溫馴化作用)收割混合牧草組織(早熟禾屬Trivialis、毒麥屬Perenne、絨毛草、雀麥屬Sterilis)。將牧草組織迅速送至實驗室以便進一步處理，並用水徹底清洗以除去汙垢。
將500克的牧草剪下物放置於650瓦微波爐中，並以全功率加熱5分鐘，藉此溫度升高至85-100℃。然後將牧草剪下物冷卻至室溫。
或者將牧草剪下物與500克沸水混合，將此混合物重新加熱至100℃，在攪拌下煮沸10分鐘，然後冷卻至60℃。
加熱步驟後，通過過濾使富含AFP的汁液從剪下物中分離出來。在等體積水的存在下將其連續攪拌5分鐘，然後通過3層軟棉布進行壓榨。
可將上清液進行冷凍乾燥以除去水，然後貯存。或者可將上清液冷凍貯存。
實施例Ⅲ通過混合以下成分得到用於製備冰淇淋的液體預混合物成分 ％(重量)脫脂奶粉 11.390蔗糖 3.410麥芽糖糊精(MD40) 4.000刺槐豆膠 0.072玉米糖漿63DE 20.705瓜爾豆膠 0.048Genulacta L100 0.020奶油 9.015微晶纖維素RC581 0.240明膠 0.140單酸甘油酯(棕櫚酸酯) 0.450香草醛 0.010AFP(實施例Ⅰ*) 0.100或0(對照)水餘量*注AFP作為濃縮的AFP溶液(使用一些添加的水作為稀釋劑)添加，百分數指的是AFP的量。
可方便地在85℃使該混合物進行巴氏滅菌15秒，然後冷凍貯存在容器中。
通過採用常規家用混合器攪打至膨脹量約為100％，接著在家用冷凍機中進行靜止冷凍，這些混合物可用於製備冰淇淋。根據本發明的組合物的結構明顯好於對照樣品。
通過使用實施例Ⅱ的AFP代替實施例Ⅰ的AFP可獲得相當好的結果。
實施例Ⅳ通過混合以下成分得到用於製備冰淇淋的液體預混合物成分％(重量)脫脂奶粉10.00蔗糖13.00麥芽糖糊精(MD40) 4.00刺槐豆膠 0.14熔融奶油 8.00單酸甘油酯(棕櫚酸酯) 0.30香草醛 0.01AFP(實施例Ⅰ*) 0.01或0(對照)水餘量*注AFP作為在一些水中的濃縮AFP液添加，百分數指的是AFP的量。
以上所有成分在室溫下混合，然後在89℃下進行巴氏滅菌60秒。將混合物無菌裝入到500毫升的包裝袋中、密封並在室溫下貯存。
通過採用常規家用混合器攪打至膨脹量約為70％，接著在家用冷凍機中進行靜止冷凍，以上混合物可用於製備冰淇淋。
貯存兩個月後，根據本發明的組合物的結構明顯好於對照樣品。
通過使用實施例Ⅱ的AFP代替實施例Ⅰ的AFP可獲得相當好的結果。
實施例Ⅴ重複實施例Ⅳ，不同的是在無菌包裝和密封之前將冰淇淋混合物預先充氣至70％的膨脹量。
所得產品可在室溫下貯存，通過將混合物放置到家用冷凍機中並在靜止條件下進行冷凍可製得冰淇淋。
實施例Ⅵ可如下測定AFP的冰再結晶抑制性能將含有AFP的產品的樣品調節到蔗糖含量為30％(重量)(如果樣品的起始含量大於30％，則通過稀釋來調節，如果起始含量較低，則加入蔗糖至達到30％的含量)。
將3μL的一滴樣品置於22毫米寬的條狀蓋玻片上。然後將直徑為16毫米的蓋玻片放置於其上，在樣品上加上200克的重物以確保載玻片厚度均勻。蓋玻片的邊緣用純的指甲清漆密封。
將載玻片放置於Linkham THM 600的溫控顯微鏡載物臺上。使載物臺迅速冷卻(50℃/分)到-40℃以得到大量的小晶體。然後將載物臺的溫度迅速升高(50℃/分)到-6℃並保持在該溫度下。
使用Leica Aristoplan顯微鏡觀察在-6℃時的冰相。使用偏振光條件及λ板來增強冰晶體的對比度。通過35毫米的照相顯微鏡記錄冰相在T=0和T=1小時的狀態。
通常該實驗可以適用於任何適宜的含有AFP和水的組合物。通常AFP在這種實驗組合物中的含量不是很關鍵的，它可以為例如0.0001-0.5％(重量)、更優選為0.0005-0.1％(重量)、最優選為0.001-0.05％(重量)，例如為0.01％(重量)。
任何含有AFP和水的適宜組合物都可以用來進行此實驗。然而一般不需要得到純化的AFP。對實際應用而言，通常製備液體浸出液或天然材料的汁液已經足夠，其中可對此浸出液或汁液進行實驗。
該方法可應用於例如由實施例Ⅰ或Ⅱ(有或沒有濃縮步驟)獲得的含AFP的浸出液。
測量了幾個樣品的再結晶抑制性能。這些樣品是由一年中不同時間收穫的黑麥所得。如上測量根據實施例Ⅰ經浸漬和加熱後所得的AFP汁液的再結晶性能。作為對比，使用在溫室中(在通常不誘發AFP形成的溫度下)生長的黑麥。
測量到以下冰晶體的大小。
樣品 1小時後的冰晶體大小(μm)對照 2512月樣品 171月樣品102月樣品153月樣品184月樣品185月樣品25這些測量結果表明，為了獲得良好的AFP活性，應在冬季月份如12月-4月收割植物。特別優選的是能提供冰晶體大小小於15μm或更小的樣品。在以上情況中可通過在1月或2月收割植物來達到這個目的。
對進行過熱處理(在60℃下1小時)的1月AFP樣品進行相同的測量。在再結晶性能方面沒有觀察到顯著的減少。
作為對比，使用實施例Ⅰ的質外體的浸出液。1小時後得到最終的冰晶體大小為11.1μm；經熱處理後(在100℃下煮沸10分鐘)1小時後實驗結果的冰晶體的大小為16.8μm。該實施例顯示來自冬黑麥的質外體的浸出液不是熱穩定性的。
實施例Ⅶ從Silsoe(UK)處獲得1月收割的牧草的未經熱處理過的牧草浸出液。將浸出液離心1小時以除去汙垢和不溶碎屑，離心機SorvallRC3C，轉子H6000A，溫度+5℃，轉速5000轉/分(7268g)。
將浸出液的樣品冷凍乾燥以確定其總固含量。經測定此值為11.48毫克/毫升。然後使乾燥的浸出物用30％的蔗糖溶液再水化至其初始總固體濃度。按需要通過用30％的蔗糖溶液稀釋浸出液來製備幾種溶液。
採用實施例Ⅵ的測定方法來測量防凍活性。
在T=0和T=1小時處的再結晶抑制測定圖具有其通過Zeiss TGA10分析器所測量的平均冰晶體大小。所得結果示於下表中。<

>這些結果表明，對於牧草浸出液不同的稀釋濃度，在-6℃下1小時內最終的晶體大小不同，冰晶體的大小也有變化。可以看出在牧草浸出液中的固體含量可以有很大的變化，而仍可獲得良好的再結晶抑制性能。優選選擇這些濃度使得1小時後冰晶體的大小不大於15微米。
用經過熱處理後(在100℃下10分鐘)的牧草浸出液進行類似的實驗。看不到再結晶抑制性能的顯著變壞。
另外再採用相同的再結晶抑制實驗來測試實施例Ⅱ的牧草浸出液。得到如下結果
熱處理晶體大小(μm)T=0 T=160℃,1小時9.6 11.1煮沸10分鐘9.8 11.3這些結果表明，即使是加熱後經冷馴化的牧草的浸出液仍保持其抑制冰晶體生長的能力。
實施例Ⅷ在1月收割幾種含有AFP的植物。通過在等體積保持於冰中的緩衝劑A(10mM EDTA、20mM抗壞血酸，用Tris緩衝至pH=7.4)中，用研杵和研缽(冷卻至4℃)研磨新鮮組織如根部、杆莖、芽或葉得到浸出液。將組織均漿通過一層或多層軟棉布過濾，在進一步使用前將其保存於冰中。
使浸出液進行實施例Ⅵ的再結晶抑制性能實驗(在60℃下加熱1小時和煮沸10分鐘後)。
由於維持再結晶抑制性能而被證實含有熱穩定AFP的有以下植物槭樹屬saccharoides、竹、醉魚草屬、園枝貓尾蘚、樹花屬farinaceae、松蘿屬subfloridana、連翹屬、酢漿草屬、早熟禾屬Trivialis、毒麥屬Perenne、絨毛草、雀麥屬Sterilis、Parodiochloaflabellata、發草屬antartica、苔草屬aquatilis、Colobanthus quintensis和翦股穎屬tenuis、羊茅屬contracta和早熟禾。
以下植物不合熱穩定AFP甘藍、菠菜、蔓青和擬南芥屬。
實施例Ⅸ可如下測試AFP的熱滯後活性將1毫升樣品放置在熱水浴中的微量離心管，並在60℃下加熱1小時。然後如下測量樣品的熱滯後性能將熔融的樣品放置於顯微載玻片(Camlab Cambridge，光程長度為0.1毫米)。顯微載玻片的末端用礦脂密封。
使用氣溶膠冷凍噴塗將冰引入到樣品中。然後將載玻片浸入-0.1℃乙醇溫度調節浴中。平衡5分鐘後檢查樣品。如果冰完全熔化，則平衡後浴的溫度將以0.1℃逐步降低。重複這些步驟直至溫度達到少量冰晶體存在於樣品中的溫度為止。於此溫度平衡後，浴溫以0.01℃/分逐步降低。當冰開始從平衡的晶體中蔓延時記錄此時樣品冰點的溫度。
然後通過使溫度從冰點開始以0.01℃/分逐步升高直至所有冰晶體熔化來測定樣品的熔融溫度。此溫度是樣品的熔融溫度。
樣品的熱滯後是熔融溫度與凝固溫度之差。
對第一樣品(熱處理之前)和第二樣品(熱處理之後)上進行這個測試程序，然後進行冷卻。
類似地，通過上述測試可以測定熱穩定性(其中樣品在水中煮沸30秒)，然後測定熱滯後性能。測定幾個樣品的熱滯後性能。
樣品是由一年中從不同時間收穫的冬黑麥所得。如在實施例Ⅵ中測量根據實施例Ⅰ經浸漬和加熱後所得的AFP汁液的熱滯後性能。作為對比，使用在溫室中(在通常不誘發AFP形成的溫度下)生長的冬黑麥。
以下是所測得的熱滯後性能樣品 熱滯後(℃)對照0.0412月樣品0.181月樣品 0.212月樣品 0.173月樣品 0.154月樣品 0.125月樣品 0.05這些測量結果表明，為了獲得良好的AFP活性，應在冬季月份如12月-3月收割植物。
對進行過熱處理(在60℃下1小時)的1月AFP樣品進行相同的測量。在熱滯後性能方面沒有觀察到顯著的減少。
實施例Ⅹ測定AFP的胺基酸序列。
使用具有10kDa截留值膜的Amicon超濾室對實施例Ⅱ的熱穩定牧草浸出液進行約10次的濃縮。將所得的濃縮液上於一個MonoQ(Pharmacia)HR 5/5 FPLC陰離子交換柱中。結合到柱上的是在50mMTris/HCl緩衝液(pH=8.5)中，用NaCl至在相同pH=8.5 Tris緩衝液中0.5M的最終濃度線性梯度洗脫RI活性部分。以1毫升/分的流速進行層析，收集1毫升部分並測定再結晶抑制活性(如實施例Ⅸ)。
將活性部分匯合在一起，並在Sorvall SS 34轉子(8×50毫升)將以10,000轉/分離心的centricon PM10離心濃縮器(Amicon)中離心10分鐘，濃縮至0.05毫升的體積。將濃縮液上於到以SMART微分離體系(Pharmacia)運轉的Superdex 75 PC 3.2/30凝膠過濾柱上。該柱以0.05毫升/分的流速用50mM Tris/HCl緩衝液(pH=8.5)洗脫。上入總體積為3.5毫升的樣品後收集0.05毫升組分。用組分測定再結晶抑制活性(如實施例Ⅸ)，最具活性的組分在進行N-末端測序前先在SDS PAGE凝膠上進行分離及電印跡。
將活性的Superdex 75組分溶於凝膠上樣緩衝液(50mMTris/HCl,pH=6.8,10％甘油，10mM二硫蘇糖醇，2％SDS)中，然後根據Laemmli法在10％的聚丙烯醯胺凝膠上進行分離。電泳後，使凝膠夾緊一張甲醇潤溼的蛋白印跡膜(Perkin Elmer)，並在含有10％甲醇的10mM的3(環己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)緩衝液(pH=11.0)中、在20伏下、進行電印跡16小時。印跡後用甲醇、然後再用MilliQ(Millipore)水簡單洗滌該膜，用考馬斯亮藍的0.1％(w/v)溶液進行結合蛋白的顯色。
通過考馬斯染色可顯色出表觀分子量為25kDa和35kDa的兩條蛋白帶。35kDa蛋白似乎特別與最活性的RI組分密切相關。將這兩條譜帶用解剖刀片切下並進行測序。對與表觀分子量為65-75kDa相對應的膜的未染色部位也進行測序，因最活性組分的凝膠銀染已經表明在該分子量中有一個蛋白譜帶。
通過將膜的所有三個切下的部位放進印跡測序筒(cartridge)進行測序，按生產商(Perkin-E1mer)所述使用反應和轉化周期確定其序列。以下給出N-末端序列表。
25kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列ALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR35kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列ALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO65-75kDa的AFP含有N-末端基本上與下述同源的序列X-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR在每個次序中X指可以在植物蛋白中發現的任何胺基酸的未知胺基酸。出於本發明的目的，術語「基本上與…同源」意指在胺基酸中至少80％、更優選大於90％、最優選95-100％重疊。
權利要求
1．從天然來源中回收AFP的方法，所述方法包括以下步驟a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來；b)以至少60℃的溫度將天然來源或含AFP的汁液熱處理；c)除去不溶部分。
2．根據權利要求1的方法，其中步驟a和b(順序可換)在步驟c之前進行。
3．具有熱穩定性的AFP，通過在60℃下熱處理1小時、在80℃下熱處理1小時或在100℃下熱處理10分鐘後，冰再結晶抑制性能沒有顯著的減少而得到證實。
4．根據權利要求3的AFP，其中在水中經熱處理過的AFP的組合物在快速冷凍至-40℃、然後在-6℃下貯存1小時後的冰晶體的大小比未經熱處理過的相同AFP的冰晶體的大小不大於5μm。
5．根據權利要求3或4的AFP，其中在水中的AFP的組合物在快速冷凍至-40℃、然後在-6℃下貯存1小時後的冰晶體的大小為不大於15μm。
6．根據權利要求3或4的AFP，它含有一種或多種分子量為25kDa、35kDa和65-75kDa的蛋白。
7．根據權利要求6的AFP，它具有與下述基本上同源的N-末端序列25kDa的AFPALA-THR-ILE-THR-ALA-VAL-ALA-VAL-LEU-LYS-X-THR-VAL-GLU-VAL-X-ILE-VAL-PRO-THR35kDa的AFPALA-GLN-PHE-THR-ILE-THR-ASN-LYS-CYS-GLN-PHE-THR-VAL-TRP-ALA-ALA-X-VAL-PRO65-75kDa的AFPX-GLU-GLN-PRO-ASN-THR-ILE-X-GLY-THR
8．含有可以編碼權利要求7的至少一種AFP的核酸序列的載體。
9．可以表達權利要求7的至少一種AFP的轉化有機體。
10．含有0.0001-0.5％(重量)根據權利要求3的AFP的冷凍糖食。
11．適用於生產含有權利要求3的AFP的根據權利要求10的冷凍糖食的預混合物。
12．用於製備冷凍糖食的方法，該方法包括製備含有0.0001-0.5％(重量)AFP的配方混合物，所述AFP具有熱穩定性，這通過在60℃下熱處理1小時、在80℃下熱處理1小時或在100℃下熱處理10分鐘後冰再結晶抑制性能仍沒有顯著的減少而得到證實，然後在靜止條件下使混合物冷凍。
全文摘要
用於從天然來源中回收AFP的方法,所述方法包括以下步驟:a)將含有AFP的汁液從天然來源中分離出來;b)在溫度至少為60℃下將天然來源或含有AFP的汁液熱處理;c)將不溶部分除去。
文檔編號C12N15/82GK1226284SQ97196682
公開日1999年8月18日 申請日期1997年7月4日 優先權日1996年7月26日
發明者P·J·利爾福特, A·J·麥克阿瑟, C·M·賽德博頓, P·維爾丁 申請人:尤尼利弗公司