乾燥活性羊膜的製備方法
2023-11-07 10:47:07 1
專利名稱:乾燥活性羊膜的製備方法
所屬技術領域：
本發明涉及醫用羊膜製品，尤其是一種可長期保存的脫細胞乾燥活性羊膜的製備方法。
背景技術：
羊膜是從細胞滋養層演化而來，是人類兩層胎膜的內層，是人體中最厚的基底膜。羊膜自身無血管和神經、淋巴管，其抗原性較低(主要源於其中的細胞成分)。羊膜的應用最早始於1910年，Divis首次把胎膜(羊膜+絨毛膜)用於移植取得成功。而後，羊膜作為燒傷皮膚移植片、人造陰道黏膜鞘等被廣泛用於各種手術，直到1995年Kim和Tseng在化學燒傷模形的角膜表面進行羊膜移植，羊膜移植逐漸引起眼科醫師的重視。1997年，Ma等從分子生物學角度對羊膜移植的可行性進行了研究，羊膜的作用機制主要為①基底膜作用，為幹細胞提供「肥沃的土壤」，提供光滑面以利於細胞生長；②其中各種蛋白成份能促進上皮分化、增生；③增強蛋白粘附性，促進上皮增生修復；④羊膜含有的蛋白酶抑制蛋白酶而發揮其抑炎作用；⑤羊膜含有抑制細胞因子表達和細胞調亡的成份；⑥可避免炎症細胞因子誘發的角膜基質細胞和膠原纖維的過度增生，從而抑制局部炎症，促進表面癒合而不留瘢痕。
近年來，隨著人們對羊膜研究的不斷發展，羊膜移植被更廣泛應用於治療眼科疾病。羊膜覆蓋術、羊膜移植術、羊膜填充、植入術等提高了包括眼表疾病、青光眼、鞏膜病等眼病的治療成功率。
目前臨床上使用的羊膜多為新鮮羊膜或深低溫保存羊膜，難以做到隨用隨取、方便保存。專利公開號為CN1522568A的生物羊膜製品雖然為可常溫保存的凍幹羊膜，但其未脫去羊膜的細胞，給臨床應用帶來困難，且不能用作組織工程學材料進行上皮、內皮培養移植。
發明內容
本發明的目的在於針對上述問題，提供一種可長期保存、隨用隨取的可更廣泛應用於臨床的乾燥活性羊膜製品的製備方法。
具體的技術方案如下乾燥活性羊膜的製備方法為選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用刀片或載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成適當大小。再在0.05～0.5％胰蛋白酶和0.01～0.1％EDTA的混合液或0.05～0.5％胰蛋白酶或0.01～0.1％EDTA液中37℃孵育1/2-4小時，用細胞刮子或棉棒脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。置入凍幹機，真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。每批產品抽樣進行菌培養。
以上方法製備的羊膜如竹紙樣，半透明，厚度約20微米，復水後抗張力及線切力性能佳，透明性較乾燥時增加。
本發明的乾燥活性羊膜的製備方法，脫去了羊膜內的細胞，極大降低了羊膜的抗原性，同時保留了其有效的基質活性成分，可更廣範的用於眼科中羊膜覆蓋術、羊膜移植術、羊膜填充、植入術等手術中，且可作為新型的組織工程學材料用以上皮、內皮的培養移植。冷凍乾燥後，使羊膜的保存條件為常溫(乾燥陰涼處)，有效期可達到一年，做到了隨用隨取、方便保存。無菌操縱及γ射線照射滅菌克服了新鮮或低溫保存羊膜被汙染的可能。本發明的羊膜製品與硝酸纖維紙一同凍幹保存，使用時剪取方便。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明進行詳細說明，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成6cm×2.5cm大小。再在0.02％EDTA液中37℃孵育3小時，用細胞刮子脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
實施例2選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成6cm×2.5cm大小。再在0.25％胰蛋白酶液中37℃孵育2小時，用細胞刮子幫助脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
實施例3選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成4cm×2.5cm大小。再在0.05％EDTA液中37℃孵育3小時，用細胞刮子幫助脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
實施例4選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成6cm×2.5cm大小。再在0.25％胰蛋白酶和0.02％ EDTA混合液中37℃孵育1小時，用細胞刮子幫助脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
實施例5選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成6cm×2.5cm大小。再在0.2％胰蛋白酶和0.05％EDTA混合液中37℃孵育1小時，用細胞刮子幫助脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
實施例6選用健康剖宮產產婦的胎盤組織，產前血清學檢查按照國家相關標準排除B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)巨細胞病毒、梅毒螺旋體及免疫缺陷病毒(HIV)感染。從剖腹產或順產無菌接生獲得胎盤後即在無菌下操作，作如下滅菌處理用生理鹽水衝洗乾淨胎盤表面的血跡；用含抗生素的無菌生理鹽水浸泡胎盤5～10分鐘(抗生素混合液的濃度為含50ug/ml青黴素、50ug/ml鏈黴素、100ug/ml新黴素和2.5ug/ml二性黴素B)。
將羊膜從絨毛膜分離出來，用載玻片側面儘量刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上(Bio-Tissue公司提供)，然後將有羊膜的紙片剪成6cm×2.5cm大小。再在0.2％胰蛋白酶液中37℃孵育2.5小時，用細胞刮子幫助脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞。真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下行真空包裝。最後γ射線照射。
以上方法製備的羊膜進行免疫組化實驗表明在冷凍乾燥羊膜中全層存在I型、III型、IV型和V型膠原和纖維粘連素，而VII型膠原和層粘連蛋白-5存在於基底膜側。與新鮮羊膜中活性成分的位置、數量相近。
選取5隻12～14周齡體重在1.5～2.5kg的紐西蘭大耳白兔(雌雄不限)，15g/L巴比妥鈉靜注全麻，於角膜緣內3.0mm處切口，做板層口袋，植入上方法製備的羊膜製品於兔角膜基質內，不做縫合，術後紅黴素眼膏常規塗術眼。一個月時，裂隙燈觀察見植入羊膜相容性良好，透明，未見局部細胞浸潤、角膜水腫及新生血管長入；病理學檢查可見角膜基質細胞向植入羊膜內長入。證實了該乾燥活性羊膜良好的生物相容性。
權利要求
1.一種乾燥活性羊膜的製備方法，其特徵在於選用健康胎盤組織，進行滅菌處理，將羊膜從絨毛膜分離出來，刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上，然後將有羊膜的紙片剪成適當大小；再在0.05～0.5％胰蛋白酶和0.01～0.1％EDTA的混合液或0.05～0.5％胰蛋白酶或0.01～0.1％EDTA液中37℃孵育1/2-4小時，用細胞刮子或棉棒脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞；置入凍幹機，真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下進行真空包裝；最後γ射線照射。
專利摘要
一種乾燥活性羊膜的製備方法，選用健康胎盤組織，進行滅菌處理，將羊膜從絨毛膜分離出來，刮去海綿層，然後上皮面朝上平鋪並固定於硝酸纖維紙上，然後將有羊膜的紙片剪成適當大小；再在0.05～0.5％胰蛋白酶和0.01～0.1％EDTA的混合液或0.05～0.5％胰蛋白酶或0.01～0.1％EDTA液中37℃呼育1/2－4小時，用細胞刮子或棉棒脫去上皮細胞，反覆生理鹽水衝洗，顯微鏡下證實上皮面無細胞；置入凍幹機，真空條件下連同硝酸纖維紙凍幹，在室溫下進行真空包裝最後γ射線照射。本發明脫去了羊膜內的細胞，同時保留了其有效的基質活性成分，可更廣泛的用於眼科中羊膜覆蓋術、羊膜移植術及羊膜填充、植入術等手術中，且可作為新型的組織工程學材料用以上皮、內皮的培養移植。
文檔編號A01N1/02GKCN1757717SQ200510046856
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月12日
發明者何偉 申請人:何偉導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan