胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品及其製備方法與流程
2023-12-09 01:39:51 1
本發明涉及一種檢測用質控品及其配製方法，特別涉及胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品及其製備方法。
背景技術：
遺傳代謝病是指由於基因突變使合成的酶、受體、載體等蛋白功能缺陷，導致體內生化物質在合成、代謝、轉運和儲存等方面出現各種異常。它屬於單基因遺傳病的一部分，絕大多數屬常染色體隱性遺傳，少數為常染色體顯性遺傳、x連鎖伴性遺傳，或者線粒體遺傳；遺傳代謝病病種繁多，常見500-600種，總數可能達數千餘種；單病發病率低，但總體發病率較高，有報導患病率在0.5％以上。
新生兒疾病篩查是預防出生缺陷行之有效的三級預防措施，對提高出生人口素質有著重要的意義。串聯質譜檢測的遺傳代謝病項目在2分鐘內可檢測18種胺基酸和45種醯基肉鹼，上述遺傳代謝病可檢測超過45種遺傳代謝病，目前已廣泛應用於各種高端實驗室，可更有效、更早地檢出遺傳性代謝性疾病，為針對性治療提供有效依據。隨著該技術越來越多地應用於臨床的輔助診斷，體內胺基酸和醯基肉鹼測定的準確性顯得越來越重要。
質控品是專門用於室內質量控制的、穩定的、與待測樣品近似的材料，是保證準確測定的重要基礎，並可對方法穩定性進行一個長期有效的監控，隨著串聯質譜檢測越來越多地應用於臨床的輔助診斷，相關質控品的需求量也逐漸增大。
由於串聯質譜一次檢測的化合物種類繁多，一般而言，為保證其質控效果，其質控品中也需要添加多種組分，而因為各組分的特性不同，難以製備得到均一穩定的質控品。因此，目前，商品化胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控品來源少，且產品價格昂貴，到貨周期長，同一批號無穩定性來源。因此，研發穩定性、均一性都符合要求的質控品製備方法具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種成份相對簡單、穩定性、均一性均符合要求的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品及其製備方法。
本發明所採取的技術方案是：
一種胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品，主要由胺基酸標準品、醯基肉鹼標準品和紅細胞幹固於載體上形成，其中，胺基酸標準品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種胺基酸。
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，醯基肉鹼標準品包括游離肉鹼、乙醯肉鹼、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼、己醯肉鹼、辛醯肉鹼、葵醯肉鹼、月桂醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、十八碳醯肉鹼、3-羥基異戊醯肉鹼、戊二醯肉鹼、丙二醯肉鹼共15種醯基肉鹼。
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，質控品中各胺基酸按照以下述終摩爾比配合：
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，質控品中各醯基肉鹼按下述終摩爾比配合：
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，載體為濾紙。濾紙可以是國際903濾紙片等本領域常用的濾紙。
一種上述的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的製備方法，包括如下步驟：
1)製備紅細胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細胞，用生理鹽水調整紅細胞比容至預定值，得到紅細胞液，並測定其中各胺基酸和醯基肉鹼本底值；
2)製備標準溶液：使用水性溶劑將胺基酸和/或水溶性醯基肉鹼溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性醯基肉鹼，得到胺基酸標準溶液和/或醯基肉鹼標準溶液；
3)製備血斑質控品：在上述紅細胞液中添加胺基酸標準溶液和/或醯基肉鹼標準溶液至設定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，乾燥得到胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品。
作為上述製備方法的進一步改進，水性溶劑為生理鹽水，所述胺基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性醯基肉鹼為：游離肉鹼、乙醯肉鹼、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼、己醯肉鹼、辛醯肉鹼、葵醯肉鹼、3-羥基異戊醯肉鹼、戊二醯肉鹼和丙二醯肉鹼；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性醯基肉鹼為：月桂醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、十八碳醯肉鹼。
作為上述製備方法的進一步改進，製備紅細胞液步驟中，紅細胞比容的預定值為45～55％。
作為上述製備方法的進一步改進，工作液中，各胺基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各醯基肉鹼的濃度分別為：游離肉鹼30～70μm、乙醯肉鹼20～40μm、丙醯肉鹼5～12μm、丁醯肉鹼1～3.5μm、異戊醯肉鹼0.5～2.0μm、己醯肉鹼0.4～1.2μm、辛醯肉鹼0.4～1.2μm、葵醯肉鹼0.4～1.2μm、月桂醯肉鹼0.3～1.0μm、肉豆蔻醯肉鹼0.4～1.4μm、棕櫚醯肉鹼4.0～12.0μm、十八碳醯肉鹼1.5～6.0μm、3-羥基異戊醯肉鹼0.4～1.2μm、戊二醯肉鹼1.0～3.0μm、丙二醯肉鹼0.2～1.0μm。
作為上述製備方法的進一步改進，製備血斑質控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。
本發明的有益效果是：
本發明的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品，通過精心設計組份，綜合考慮檢測方法的特點和18種胺基酸與45種醯基肉鹼檢測指標的重要性之後選出，最具代表性，在大幅減少標準品使用的情況下，獲得了穩定性、均一性都符合要求的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品。
並且，該質控指標的濃度也是非常關鍵的，同樣是綜合考慮檢測方法的特點和各檢測指標的特點之後選出，具有最佳的代表性和穩定性。
該質控品製備方法成本低，操作簡單，能夠較大量的進行配製，使用周期較長，不需頻繁更換質控批號，方便日常質控分析，從而滿足臨床和日常檢測對質控品的需求。
採用本發明提供的製備方法製得的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品在-20℃的條件下可保存4個月以上，從-20℃條件取出恢復常溫後的均一性、穩定性都能符合質控品要求。
具體實施方式
一種胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品，主要由胺基酸標準品、醯基肉鹼標準品和紅細胞幹固於載體上形成，其中，胺基酸標準品包括丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、酪氨酸共8種胺基酸。
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，醯基肉鹼標準品包括游離肉鹼、乙醯肉鹼、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼、己醯肉鹼、辛醯肉鹼、葵醯肉鹼、月桂醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、十八碳醯肉鹼、3-羥基異戊醯肉鹼、戊二醯肉鹼、丙二醯肉鹼共15種醯基肉鹼。
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，質控品中各胺基酸按照以下述終摩爾比配合：
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，質控品中各醯基肉鹼按下述終摩爾比配合：
作為上述胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的進一步改進，載體為濾紙。濾紙可以是國際903濾紙片等本領域常用的濾紙。
一種上述的胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品的製備方法，包括如下步驟：
1)製備紅細胞液：收集健康人源全血，分離得到紅細胞，用生理鹽水調整紅細胞比容至預定值，得到紅細胞液，並測定其中各胺基酸和醯基肉鹼本底值；
2)製備標準溶液：使用水性溶劑將胺基酸和/或水溶性醯基肉鹼溶解；使用醇類溶劑溶解脂溶性醯基肉鹼，得到胺基酸標準溶液和/或醯基肉鹼標準溶液；
3)製備血斑質控品：在上述紅細胞液中添加胺基酸標準溶液和/或醯基肉鹼標準溶液至設定值，得到工作液；取上述工作液滴加在載體上，乾燥得到胺基酸與醯基肉鹼幹血斑質控品。
作為上述製備方法的進一步改進，水性溶劑為生理鹽水，所述胺基酸為：丙氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、瓜氨酸、精氨酸、亮氨酸和酪氨酸；所述水溶性醯基肉鹼為：游離肉鹼、乙醯肉鹼、丙醯肉鹼、丁醯肉鹼、異戊醯肉鹼、己醯肉鹼、辛醯肉鹼、葵醯肉鹼、3-羥基異戊醯肉鹼、戊二醯肉鹼和丙二醯肉鹼；醇類溶劑為甲醇，所述脂溶性醯基肉鹼為：月桂醯肉鹼、肉豆蔻醯肉鹼、棕櫚醯肉鹼、十八碳醯肉鹼。
醇類溶劑也包括醇的水溶液。
作為上述製備方法的進一步改進，製備紅細胞液步驟中，紅細胞比容的預定值為45～55％。
作為上述製備方法的進一步改進，工作液中，各胺基酸的濃度分別為：丙氨酸350～650μm、苯丙氨酸120～300μm、亮氨酸150～450μm、甲硫氨酸50～170μm、纈氨酸200～400μm、瓜氨酸40～150μm、精氨酸60～200μm、酪氨酸180～370μm；各醯基肉鹼的濃度分別為：游離肉鹼30～70μm、乙醯肉鹼20～40μm、丙醯肉鹼5～12μm、丁醯肉鹼1～3.5μm、異戊醯肉鹼0.5～2.0μm、己醯肉鹼0.4～1.2μm、辛醯肉鹼0.4～1.2μm、葵醯肉鹼0.4～1.2μm、月桂醯肉鹼0.3～1.0μm、肉豆蔻醯肉鹼0.4～1.4μm、棕櫚醯肉鹼4.0～12.0μm、十八碳醯肉鹼1.5～6.0μm、3-羥基異戊醯肉鹼0.4～1.2μm、戊二醯肉鹼1.0～3.0μm、丙二醯肉鹼0.2～1.0μm。
作為上述製備方法的進一步改進，製備血斑質控品步驟中，取70～100μl工作液滴加在載體上。
胺基酸、醯基肉鹼既可以單獨溶解配置成為相應的標準品溶液，也可以根據需要將多種標準品一併溶解，或分成多組溶解。優選的，根據不同胺基酸、醯基肉鹼的溶解特性差異進行分組溶解，這樣可以大大減少標準品溶液的配製量，降低配製的難度。
配製時，可以參考美國cdc質控品濃度、實驗室臨床參考值和紅細胞液中的目標胺基酸及醯基肉鹼本底濃度，加入目標胺基酸及醯基肉鹼標準品，將濃度調節至目標濃度，具體如下：
計算所需配製濃度質控品所需標準品用量
n(理論物質的量)＝c(需要加強的濃度)×v(配製的質控總體積)
m(實際稱取量)＝n(理論物質的量)*m(相對分子質量)
計算所需加入標準物質溶液的總體積，計算所需加入生理鹽水體積，即得50％紅細胞比容質控基質；
v(生理鹽水體積)＝v1(紅細胞體積)-v2(加入標準物質溶液總體積)。
本領域技術人員也可以使用其他為本領域技術人員熟知的手段進行配製。
濃度單位μm指μmol/l。
下面結合實施例，進一步說明本發明的技術方案。
實施例1
1)紅細胞的分離：
收集健康人源肝素抗凝全血，要求無明顯溶血、黃疸、脂肪或汙染，以3000r/min的速度離心5min，離心後分出上清液及白膜，加入約紅細胞量等量的生理鹽水，使用混勻器充分混勻5-7min，3000r/min離心5min後分出上清液及白膜，重複此步驟3次，即得紅細胞。使用生理鹽水調整紅細胞比容為50％，得到紅細胞液，測定紅細胞液中胺基酸及醯基肉鹼本底濃度。
2)胺基酸和醯基肉鹼的配製：
使用生理鹽水溶解丙氨酸ala、苯丙氨酸phe、亮氨酸lue、甲硫氨酸met、纈氨酸val、瓜氨酸cit、精氨酸arg、酪氨酸tyr共8種胺基酸標準品，得到胺基酸溶液；
使用生理鹽水溶解游離肉鹼c0、乙醯肉鹼c2、丙醯肉鹼c3、丁醯肉鹼c4、異戊醯肉鹼c5、己醯肉鹼c6、辛醯肉鹼c8、葵醯肉鹼c10、3-羥基異戊醯肉鹼c5-oh、戊二醯肉鹼c5dc、丙二醯肉鹼c3dc，得到水溶性醯基肉鹼溶液；
使用40v/v％甲醇水溶解月桂醯肉鹼c12、肉豆蔻醯肉鹼c14、棕櫚醯肉鹼c16、十八碳醯肉鹼c18，得到脂溶性醯基肉鹼溶液。
將胺基酸溶液和水溶性醯基肉鹼溶液與紅細胞液混合，之後滴加脂溶性醯基肉鹼溶液，充分混勻，得到混合液。根據紅細胞液中胺基酸及醯基肉鹼本底濃度，通過調節胺基酸溶液和醯基肉鹼溶液的添加量以及生理鹽水的添加量，控制胺基酸和醯基肉鹼溶液在混合液中的終濃度如表1所示：
表1、目標胺基酸與肉鹼配置濃度範圍
3)幹血斑質控品的製備
使用移液器吸取上一步驟中的混合液85μl，滴加於國際903#濾紙片上，室溫下過夜晾乾，得到胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控品。
胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控品使用自封袋密封，置於-20℃以下，溼度30rh％以下的條件下保存。
下面結合實驗，進一步展示本發明方法製得的胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控品的優勢。
胺基酸和醯基肉鹼質控幹血斑均一性評估
隨機抽取胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控各20個血斑，按照日常檢測流程處理樣品，使用lc-ms/ms進行測定，計算rsd。實驗結果如表2～表5所示：
表2胺基酸幹血斑質控(low)均一性評估數據
表3胺基酸幹血斑質控(high)均一性評估數據
表4醯基肉鹼幹血斑質控(low)均一性評估數據
表5醯基肉鹼幹血斑質控(high)均一性評估數據
實驗數據表明：質控品中胺基酸的rsd均在4.00％～15.00％之間，醯基肉鹼的rsd均在5.00％～20.00％之間，說明質控基質均勻，均一性良好。
胺基酸和醯基肉鹼質控幹血斑穩定性評估
血斑晾乾保存後，每次實驗採用3天的結果，每天檢測4組質控，每隔60天，重複此操作，計算其均值、rsd，並進行趨勢性分析，以初始3天均值為初始值，計算回收率。結果如表6～9所示：
表6、胺基酸幹血斑質控(low)穩定性評估數據
表7、胺基酸幹血斑質控(high)穩定性評估數據
表8、醯基肉鹼幹血斑質控(low)穩定性評估數據
表9、醯基肉鹼幹血斑質控(high)穩定性評估數據
使用lc-ms/ms對胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控長期穩定性進行驗證，其中胺基酸回收率均在80％～110％之間，醯基肉鹼回收率均在80％～120之間，胺基酸和醯基肉鹼幹血斑質控品在-20℃以下，溼度30rh％以下的條件下，可穩定保存4個月。
以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限於這些說明。對於本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬於本發明的保護範圍。