一種豬流行性腹瀉病毒抗體sIgA的ELISA檢測方法與流程
2023-12-09 01:03:46 2
本發明涉及一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，屬於動物抗體檢測
技術領域：
。
背景技術：
：豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)引起的豬的一種急性高度接觸性腸道傳染病，以嚴重的腸炎、嘔吐和水樣腹瀉為主要特徵，臨床變化和症狀與豬傳染性胃腸炎(tge)極為相似。pedv的傳播途徑主要是水平傳播，主要途徑為消化道，仔豬在採食或接觸被感染的飼料、糞便、飲水後引起發病，低溫、潮溼、衛生環境差時會加速該疾病的傳播。ped呈爆發性流行，多數地區一次爆發流行後，第二年原發豬群不再發生本病，也有個別地區和豬場的架子豬和斷奶豬，每年秋冬延續發病。各年齡的豬均易感，尤以2～7日齡仔豬最易感，表現為高發病率和高致死率，給養豬業造成了巨大的經濟損失。導致仔豬的大批死亡，生豬出欄率下降，造成市場豬肉供應不足，影響豬肉價格穩定。因2-7日齡的仔豬的自身免疫系統並不完善，若想抵禦pedv的侵染只能通過母乳來獲得被動免疫，母豬初乳中主要為分泌型免疫球蛋白a(siga)，siga不能通過胎盤屏障，新生仔豬可從母乳中獲得，保護其自身不受pedv感染。目前豬流行性腹瀉疫苗均進行母豬免疫，使仔豬獲得被動免疫，因此評價母乳中pedvsiga抗體的滴度是評價pedv疫苗的主要手段，而國內關於豬初乳siga的檢測方法存在空白。因此本發明建立了檢測母豬乳汁中pedvsiga抗體的elisa方法，希望能對母豬乳汁中pedvsiga抗體給出客觀的評價，以此評判pedv疫苗的免疫效果。技術實現要素：為了克服現有技術的不足，本發明的第一個目的在於提供一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，該檢測方法特異性及重複性好，能夠對pedv抗體siga給出準確的檢測結果，也有利於pedv疫苗免疫效果的評價。實現本發明的目的可以通過採取如下技術方案達到：一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標板，進行包被，然後用pbst洗去未結合的抗原及雜質；封閉：加入含bsa的pbs作為封閉液進行封閉，然後棄去封閉液，用pbst洗去殘餘的封閉液；加樣：加入待檢樣品，然後用pbst洗去未與抗原結合的成份；加入酶標抗體：加入酶標抗體hrp-兔抗豬siga，反應後用pbst洗去未結合的酶標抗體；顯色和測定：加入顯色劑，避光顯色後加入終止液，然後測定od450nm。進一步地，製備所述抗原pedvs1蛋白的方法包括：pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建步驟：以pedv為模板擴增b細胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位胺基酸序列，回收和純化目的片段，得到pcr產物；pcr產物與原核表達載體pgex4t1分別進行雙酶切，並對酶切產物進行回收和純化後，通過t4連接酶在16℃的條件下進行酶切產物的連接，得到重組表達載體pgex4t-s1；用重組表達載體轉化bl21(de3)感受態細胞，然後進行藍白斑篩選，挑取菌落進行重組質粒提取，並對重組質粒進行bamhi和sali雙酶切的鑑定，以檢測是否重組成功；重組質粒的誘導表達及檢測步驟：將含有重組質粒的bl21(de3)細胞接種於amp+lb液體培養基中，以轉化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，收集菌體重懸、破碎後，進行sds-page電泳鑑定和以蛋白質印跡法檢測重組s1蛋白的表達情況和反應原性。進一步地，pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建步驟中，所述pcr擴增b細胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位胺基酸序列的步驟包括：先進行rt-pcr擴增，10μl的rt-pcr擴增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然後進行pcr擴增，20μl的pcr擴增反應體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴增條件為：95℃預變性5min；進入循環：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環；72℃再延伸10min後，4℃保存，得到目的片段；其中，所用的特異性引物為：下劃線部分為酶切位點。進一步地，pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建步驟中，20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應3h。進一步地，pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建步驟中，10μl酶切產物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產物5μl，原核表達載體pgex4t1酶切產物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻後，離心，16℃條件下連接至少8h。進一步地，重組質粒的誘導表達及檢測步驟中，將含有重組質粒的bl21(de3)細胞接種於amp+lb液體培養基中，以轉化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，於37℃的條件下培養至od600nm為0.6時，於37℃的條件下加入終濃度為0.8mm的iptg，繼續培養4h。進一步地，製備hrp-兔抗豬siga的的方法包括：siga的分離純化步驟：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下離心，棄掉上層脂肪和下層沉澱，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph為3.2-5.6，則蛋白被沉於杯底；再於4℃的條件下離心，取上清液，將上清液調至ph＝7；將得到的上清液進行凝膠過濾層析純化，收集各吸收峰的洗脫液，對洗脫液進行sds-page電泳鑑定；將第二峰對應的洗脫液進行蛋白質電泳，然後通過轉膜儀將蛋白質轉至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質進行孵育，以蛋白質印跡法檢測分離結果，從檢測結果得出siga中iga重鏈的免疫印跡，則表明siga分離成功，得到siga；兔抗豬siga的製備及標記步驟：將經分離純化的siga免疫紐西蘭大耳兔，首免將siga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化後多點免疫兔子，兩周後取siga與等體積弗氏完全佐劑乳化後多點免疫兔子，二免後三周進行三免，頸背部多點注射；三免兩周後採血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標記試劑盒進行標記，得到hrp-兔抗豬siga。進一步地，加入抗原步驟中，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；在37℃的條件下1h，然後4℃的條件下包被至少8h。進一步地，封閉步驟中，加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然後棄去封閉液，並用pbst洗去殘餘的封閉液。進一步地，加樣步驟中，加入待檢樣品後37℃的條件下反應1h。進一步地，酶標抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:5000-23000，加入量為100μl。進一步地，加入酶標抗體步驟中，加入經稀釋的酶標抗體hrp-兔抗豬siga，在37℃的條件下反應30～45min後，用pbst洗去未結合的酶標抗體。進一步地，顯色和測定步驟中，加入顯色劑100μl，避光顯色10min後加入50μl終止液，然後測定od450nm。相比現有技術，本發明的有益效果在於：本發明旨在提供一種豬初乳siga的間接elisa檢測方法，該檢測方法特異性及重複性好，能夠對pedv抗體siga給出準確的檢測結果，也有利於pedv疫苗免疫效果的評價。附圖說明圖1為實施例1的層析純化峰圖；圖2為實施例1sds-page電泳圖；圖3為實施例1蛋白質印跡顯影圖；圖4為實施例2pcr和雙酶切電泳圖；圖5實施例2sds-page電泳圖；圖6為實施例2蛋白質印跡顯影圖。具體實施方式下面，結合附圖以及具體實施方式，對本發明做進一步描述：一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：一、加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標板，在37℃的條件下1h，然後4℃的條件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；然後用pbst洗去未結合的抗原及雜質；二、封閉：加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然後棄去封閉液，並用pbst洗去殘餘的封閉液；三、加樣：以待檢豬初乳樣品，用稀釋液稀釋後，於37℃的條件下反應1h，然後用pbst洗去未與抗原結合的成份；四、加入酶標抗體：加入酶標抗體hrp-兔抗豬siga，酶標抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:5000-23000，加入量為100μl；在37℃的條件下反應30～45min後，用pbst洗去未結合的酶標抗體；五、顯色和測定：加入顯色劑100μl，避光顯色10min後加入50μl終止液，然後測定od450nm。具體實施方式中，製備抗原pedvs1蛋白的方法包括：1、pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建步驟：以pedv為模板擴增b細胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位胺基酸序列，具體為：採用以下的引物作為特異性引物，上下遊引物分別引入限制性內切酶位點bamhi和sali(下劃線部分)，先進行rt-pcr擴增，10μl的rt-pcr擴增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然後進行pcr擴增，20μl的pcr擴增反應體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴增條件為：95℃預變性5min；進入循環：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環；72℃再延伸10min後，4℃保存，得到目的片段，回收和純化目的片段，得到pcr產物。pcr產物與原核表達載體pgex4t1分別進行雙酶切，20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應3h，對酶切產物進行回收和純化。通過t4連接酶在16℃的條件下進行酶切產物的連接，10μl酶切產物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產物5μl，原核表達載體pgex4t1酶切產物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻後，離心，金屬浴16℃條件下連接至少8h，得到重組表達載體pgex4t-s1。金屬浴是指：採用微電腦控制和半導體製冷技術製造的一款恆溫金屬浴儀器，儀器可配置多種模塊，可廣泛應用於樣品的保存、各種酶的保存和反應、核酸和蛋白質的變性處理、pcr反應、電泳的預變性和血清凝固等。用重組表達載體轉化bl21(de3)感受態細胞，然後進行藍白斑篩選，挑取菌落進行重組質粒提取，並對重組質粒進行bamhi和sali雙酶切的鑑定，以檢測是否重組成功。2、重組質粒的誘導表達及檢測步驟：將含有重組質粒的bl21(de3)細胞接種於amp+lb液體培養基中，以轉化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，於37℃的條件下培養至od600nm為0.6時，於37℃的條件下加入終濃度為0.8mm的iptg，繼續培養4h；取菌液，離心收集菌體，以pbs重懸，超聲破碎後，進行sds-page電泳鑑定；sds-page電泳鑑定後，以蛋白質印跡法檢測重組s1蛋白的表達情況和反應原性。具體實施方式中，製備hrp-兔抗豬siga的步驟包括：1、豬初乳中siga的分離純化步驟：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下離心，棄掉上層脂肪和下層沉澱，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入醋酸，使得乳清的ph為3.2-5.6，則蛋白被沉於杯底；再於4℃的條件下離心，取上清液，將上清液調至ph＝7；將得到的上清液進行凝膠過濾層析純化，收集各吸收峰的洗脫液，對洗脫液進行sds-page電泳鑑定；將第二峰對應的洗脫液進行蛋白質電泳，然後通過轉膜儀將蛋白質轉至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質進行孵育，以蛋白質印跡法檢測分離結果，從檢測結果得出siga中iga重鏈的免疫印跡，則表明siga分離成功，得到siga；2、兔抗豬siga的製備及標記步驟：將經分離純化的siga免疫紐西蘭大耳兔，首免將2mgsiga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化後多點免疫兔子，兩周後取4mgsiga與等體積弗氏完全佐劑乳化後多點免疫兔子，二免後三周進行三免，6mg/只，頸背部多點注射；三免兩周後採血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標記試劑盒進行標記，得到hrp-兔抗豬siga。實施例1：實施例1為製備hrp-兔抗豬siga的具體方法：1、siga的分離純化：收集母豬的初乳，在4～8℃的條件下，轉速11000r/min，離心25min，棄掉上層脂肪和下層沉澱，取中間層乳清；以滴加的方式往乳清中加入0.05-0.2m的醋酸並攪拌，使得乳清的最終ph為3.2-5.6，則蛋白被沉於杯底；再於4℃的條件下，轉速11000r/min，離心15min，取上清液，將上清液調至ph＝7；將得到的上清液進行凝膠過濾層析純化：先設定流速為0.5ml/min，柱壓報警設定為3mpa，先採用去離子水對整個管道及親和層析柱子進行洗滌，每次30ml，洗2次；再用pbs洗2次，每次洗滌體積為30ml；取0.6mlsiga粗品溶液，注入上樣環中，設置流速為0.22ml/min，收集各吸收峰的洗脫液，峰圖如圖1所示，第1-3峰分別為：igm、iga、igg；對洗脫液進行sds-page電泳鑑定；sds-page電泳的檢測結果如圖2所示，泳道1-6為不同時間收集的洗脫液，從中可以看出，第2泳道和第3泳道中均有明顯的80kd條帶，對該蛋白經質譜分析表明該蛋白為siga的分泌片蛋白，證實該蛋白為siga。將第2峰對應的洗脫液進行蛋白質電泳，然後通過轉膜儀將蛋白質轉至pvdf膜上，用稀釋1000倍的辣根過氧化物酶標記的羊抗豬iga的多克隆抗體對膜上的蛋白質進行孵育，用dab顯色，以蛋白質印跡法檢測分離結果，如圖3所示：泳道1為陽性對照，可明顯檢測出siga中的iga重鏈的免疫印跡，上述結果表明siga分離成功，純度較高。對以上蛋白質印跡法結果呈陽性的洗脫液送生物公司進行質譜分析，分析結果並與國際公布的iga的序列進行比對，比對結果具有較高的同源性，可以確定，現已成功從豬的初乳中獲得了較高純度的iga。由於現有技術中，未有對豬初乳中的siga進行分離純化的技術，本發明在現有技術基礎上進行了改進，針對豬初乳物質特性，研究出上述能夠高效穩定分離純化豬初乳中siga的方法。2、兔抗豬siga的製備及標記：將經分離純化的siga免疫紐西蘭大耳兔，首免將2mgsiga加入等體積的弗氏不完全佐劑乳化後多點免疫兔子，兩周後取4mgsiga與等體積弗氏完全佐劑乳化後多點免疫兔子，二免後三周進行三免，6mg/只，頸背部多點注射；三免兩周後採血分離血清，得到siga兔抗豬陽性血清；將血清用hrp標記試劑盒進行標記，得到hrp-兔抗豬siga。實施例2：實施例2為製備抗原pedvs1蛋白的具體方法：1、設計特異性引物：通過採用生物學軟體對pedv毒株進行了在線(www.expasy.org)分析，最終確定了pedvs1蛋白的435-789位胺基酸為該毒株的潛在b細胞抗原表位所在區域；再利用primer5.0軟體設計擴增截短s1基因435-789位胺基酸序列的特異性引物，上下遊引物分別引入限制性內切酶位點bamhi和sali(下劃線部分)，2、pedv截短s1基因的擴增和重組表達載體的構建：以pedv為模板擴增b細胞抗原表位所在的pedv截短s1基因的435-789位胺基酸序列，具體為：先進行rt-pcr擴增，10μl的rt-pcr擴增體系為：5×rt-buffer2μl，dntps2μl，引物s1-down1μl，rnaseinhibitor1μl，revertraace1μl，pedv核酸模板1μl，depcwater2μl，42℃作用50min，得到cdna；然後進行pcr擴增，20μl的pcr擴增反應體系為：10×kod-plus-neobuffer2μl，2mmdntps2μl，25mmmgso41.2μl，s1-up1μl，s1-down1μl，kod-plus-neo0.5μl，cdna1μl，d2h2o11.3μl；擴增條件為：95℃預變性5min；進入循環：94℃變性45sec，50-62℃退火45sec，72℃延伸1min，30次循環；72℃再延伸10min後，4℃保存，得到目的片段，經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1560bp左右出現了目的條帶，與預期結果相符；用dna凝膠回收試劑盒回收和純化目的片段，得到pcr產物。3、pcr產物與原核表達載體pgex4t1分別進行雙酶切：20μl雙酶切體系為：10×buffer-t3μl，bamhi1μl，sali1μl，pcr產物或pgex4t110μl，d2h2o5μl，37℃反應3h，對酶切產物進行回收和純化，酶切產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。4、連接：通過t4連接酶在16℃的條件下進行酶切產物的連接，10μl酶切產物的連接體系為：10×t4dna連接酶buffer1μl，s1基因pcr酶切產物5μl，原核表達載體pgex4t1酶切產物3μl，t4dna連接酶1μl；各組分混勻後，離心，金屬浴16℃條件下連接至少8h，得到重組表達載體pgex4t-s1。用重組表達載體轉化bl21(de3)感受態細胞，然後進行藍白斑篩選，挑取菌落進行重組質粒提取，並對重組質粒進行bamhi和sali雙酶切的鑑定，鑑定結果如圖4所示，在第1、2泳道出現5300bp、在第3泳道出現1560bp的特異性條帶，證明重組成功。5、重組質粒的誘導表達及檢測：將含有重組質粒的bl21(de3)細胞接種於amp+lb液體培養基中，以轉化pgex4t1空載體的大腸桿菌為陰性對照，於37℃的條件下培養至od600nm為0.6時，分別於30℃、37℃的條件下加入0.2-1.0mm範圍內梯度設置iptg的濃度，繼續培養4h；每隔1h取1ml菌液，離心收集菌體，以pbs重懸，超聲破碎後，測定蛋白的表達量，得出本步驟優選的實驗參數為：以0.8mm的iptg，在37℃條件下培養4h，可以得到最高的蛋白表達量。進行sds-page電泳鑑定，結果如圖5所示，第1、2泳道為重複，第3泳道為空載體誘導對照，第1、2泳道在74kd左右出現了一條明顯的目的條帶，分子量與預期大小一致。sds-page電泳鑑定後，將凝膠上的蛋白質轉印至硝酸纖維素膜上，用封閉液室溫封閉1h，加入用tbst按1:500稀釋的豬抗pedv陽性血清，於37℃下，與nc膜孵育1h後，用tbst洗滌3次；再加入用tbst1：10000倍稀釋的hrp標記的羊抗豬igg，於37℃下，與nc膜孵育1h，用tbst洗3次；加入dab顯色液於暗室顯色5-10min，終止顯影；蛋白質印跡法結果如圖6所示，第2泳道為空白對照，第1泳道在74kd處出現了一條特異性條帶，證明重組s1蛋白成功表達，且具有良好的反應原性。實施例3：實施例3為抗原最適包被濃度和乳汁稀釋度的確定取酶標板(8*12)，橫排將抗原pedvs1蛋白稀釋至50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml，每孔加入100μl，37℃1h後4℃包被至少8h。封閉好的elisa板取出後用pbst洗滌3次，每次1min；加入含體積百分比1％bsa的pbs封閉液，150μl每孔，在37℃的條件下封閉1.5h，然後棄去封閉液；用pbst洗滌3次，每次1min；豎排將陰陽性乳汁從1:10、1:20、1:40倍系列稀釋至1:1280，每孔100μl，然後37℃的條件下反應1h；用pbst洗滌3次，每次1min；每孔加入100μl1:10000倍稀釋的實施例1製備的hrp-兔抗豬siga，37℃的條件下反應30min；用pbst洗滌3次，每次1min；每孔加入100ul顯色劑，20℃避光顯色10min後，每孔加入50ul終止液，測定od450nm。最佳的抗原包被濃度和抗體稀釋度選擇標準是陽性乳汁od450nm值在1附近，且陽性od450nm值/陰性od450nm值(p/n)比值最大，od450nm值結果如表格1所示：表格1od值檢測結果從表格1得出，稀釋度為1:40時，p/n的比值為19.4(1.243/0.064)最大，確定抗原的最適包被濃度為12.5μg/ml、乳汁的最佳稀釋度為1:40。實施例4：實施例4為封閉液的選擇和封閉時間確定以12.5μg/ml為抗原pedvs1蛋白的濃度進行包被，進行間接elisa，分別以含5％新生牛血清、5％鴨血清、5％脫脂奶粉、1％bsa的pbs作為封閉液，37℃條件下反應1h，顯色10min後每孔加入50ul終止液，測定od450nm，結果如表格2所示，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，選擇p/n值最大作為最佳封閉液，確定最佳封閉液為1％。表格2不同封閉液的od值檢測結果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。以12.5μg/ml為抗原的濃度進行包被，進行間接elisa，用含1％bsa的pbs分別於37℃條件下封閉30min、60min、90min、120min後，進行elisa反應，測定od450nm，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，結果如表格3所示，選擇p/n值最大時的酶標抗體濃度，確定最佳封閉時間為1.5h。表格3不同封閉時間的od值檢測結果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。實施例5：實施例5為酶標抗體最佳稀釋濃度和反應時間的確定以12.5μg/ml為抗原的濃度進行包被，進行間接elisa，hrp-兔抗豬iga二抗分別作l:5000、l:10000、l:15000、1:20000稀釋，37℃條件下反應1h，顯色10min後每孔加入50ul終止液，測定od450nm。結果如表格4所示，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，選擇p/n值最大作為酶標抗體最佳濃度，確定最佳稀釋度為1:20000。表格4不同酶標抗體稀釋度的od值檢測結果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。將酶標抗體的反應條件分別設為37℃條件下30min、45min、60min、90min，比較陰性陽性乳汁的od450nm值和p/n值，結果如表格5所示，選擇p/n值最大作為最佳反應時間，確定最佳反應時間為45min。表格5酶標抗體不同反應時間的od值檢測結果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。實施例6：實施例6為一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法，包括以下步驟：一、加入抗原：將抗原pedvs1蛋白和包被液加入酶標板，在37℃的條件下1h，然後4℃的條件下包被至少8h，抗原pedvs1蛋白的濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；然後用pbst洗滌3次，每次1min；二、封閉：加入含體積百分比1％bsa的pbs作為封閉液，在37℃的條件下封閉1.5h，然後棄去封閉液，並用pbst洗滌3次，每次1min；三、加樣：加入待檢豬初乳樣品後37℃的條件下反應1h，然後用pbst洗滌3次，每次1min；待檢豬初乳樣品濃度為12.5μg/ml，加入量為100μl/每孔；四、加入酶標抗體：加入酶標抗體hrp-兔抗豬siga，酶標抗體hrp-兔抗豬siga的稀釋度為1:20000，加入量為100μl；在37℃的條件下反應45min後，用pbst洗滌3次，每次1min；五、顯色和測定：加入顯色劑100μl，避光顯色10min後加入50μl終止液，然後測定od450nm。以相同的方法對樣品進行重複檢測，測定od450nm如表格6所示：表格6重複檢測的od值檢測例1：檢測例1為重複性試驗取以實施例6的方式分別檢測3份陽性乳汁和2份陰性乳汁，結果如表格7所示：3份陽性乳汁的變異係數為3.05％、3.82％、2.09％，均小於10％，表明該方法的重複性好。表格7重複性試驗結果od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。檢測例2：檢測例2為特異性試驗以實施例6的elisa檢測方法分別檢測豬傳染性胃腸炎(tgev)、豬輪狀病毒(porv)、豬偽狂犬(prv)、豬瘟(hcv)、豬繁殖與呼吸症候群(prrsv)的陽性乳汁和pedv陽性乳汁，試驗結果如表格8所示：豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒、豬偽狂犬、豬瘟、豬繁殖與呼吸症候群的陽性乳汁elisa檢測結果均為陰性，證實該方法的特異性好。表格8特異性試驗結果陽性乳汁tgevporvprvhcvprrsvpedvod450nm0.130.160.200.180.211.65od450nm≥0.4為陽性，﹤0.4為陰性。對於本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬於本發明權利要求的保護範圍之內。sequencelisting廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司一種豬流行性腹瀉病毒抗體siga的elisa檢測方法20172patentinversion3.3128dna人工合成1aaggatccatgtgcactggttacgctgc28228dna人工合成2aagtcgacttaatggtagaagaaaccag28當前第1頁12