調節消化道蛋白表達的組合物和方法

2023-12-08 20:20:41 1

專利名稱：調節消化道蛋白表達的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及消化道蛋白的可調節產生，更具體地說，涉及消化道內分泌細胞營養調節型生產降低葡萄糖的因子。
背景技術：
肽和蛋白憑藉其構象多能性和功能特異性已用於治療許多疾病，包括糖尿病、血友病、癌症、心血管疾病、感染性疾病和關節炎(Russell C. S.& Clarke L.A.Clin Gent 55(6) :389(1999) ；Ryffel B. Biomedenviron Sci 10:65(1997) ；Koths K. Curr Opin Biotechnol 6:681(1995) ；Buckel P. Trends Pharmacol Sci 17:450(1996))。目前，已獲批准的生物工程藥物超過2/3是系統性蛋白藥物。隨著近來功能基因組學、蛋白質組學和基因工程領域的發展，越來越多的蛋白藥物正在進入生物製藥市場。最初，由動物組織或人血清純化蛋白藥物。基於蛋白的藥物通過若干發展階段進入了目前的臨床應用狀態。例如，生物製藥廠現在使用基因工程酵母和細菌生產重組人蛋白(Scopes R. K. BiotechnolAppl Biochem 23:197(1996))。這種開拓性技術克服了困擾第一代蛋白藥物的健康風險和缺點，並因此改善了蛋白的治療能力。但是，儘管具有這些優勢，蛋白質作為治療劑廣泛應用仍然受困於難以純化活性形式的重組蛋白和高成本的生產過程(Berthold W. & Walter J. Biologicals 22:135(1994) ；Scopes R. K. Biotechnol Appl Biochem 23:197(1996))。另外，蛋白藥物進入機體還面臨阻礙。在口服使用時，蛋白藥物易被胃腸道酶降解(Wang W. J Drug Target 4:195(1996) ；Woodley J. F. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 11 :61 (1994))。已探明的其它蛋白傳遞途徑包括輸液泵(Bremer等，PharmBiotechnol 10 239(1997))、經皮傳遞(Burkoth T. L. Crit Rev Ther DrugCarrier Syst 16:331(1999))、 微囊化(Cleland J. L. Pharma BiotechnollO :1 (1997))和吸入(Gonda I. J Pharm Sci 89 940(2000))。目前，用針注射皮下和靜脈給藥是傳遞蛋白治療劑的備選途徑。不幸的是，這種傳遞方式不理想，因為蛋白濃度經常不能保持在治療範圍內或者不能提供適宜的傳遞動力學。而且，蛋白藥物有效治療通常需要頻繁地用針注射，可能引起局部反應和不適，因此導致患者順應性差(Jorgensen J. T. J Pediatr Endocrinol7 :175(1994))。各種因素限制了許多藥物的治療應用，並最終妨礙了其商業化潛力。因此，鑑定新的蛋白治療劑傳遞方法是理所當然的。已使用將特異性治療蛋白編碼基因插入到機體細胞中的方法解決疾病治療中的前述傳遞問題。這種方法稱作基因治療，很有希望成為蛋白傳遞的新方向。採用這種方法可將機體細胞轉化為『生物反應器』，生產足夠量的治療蛋白，並因此解除了對頻繁用針注射的需要。目前，基因治療可以分類為兩個基本方法(Drew J.& MartinL-A，載於Lemoine N. R.(主編)Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag, New York,第 1 章1-10 頁 (1999))。第一種方法叫做體內基因治療，是以允許位於活體宿主中的細胞吸收的形式引入基因。例如，將一種治療基因包裝到病毒(如反轉錄病毒、腺伴隨病毒或腺病毒)基因組中。
4然後將含有所述治療基因的重組病毒引入到活體生物中，並使其感染生物體細胞。通過此感染過程，病毒將其含所述治療基因的基因組摻入到宿主細胞的基因組結構中。結果，感染細胞表達所述治療基因。第二種方法涉及將遺傳物質體外轉移到取自宿主生物的細胞。在基因成功摻入到細胞基因組後，將轉化細胞植回到宿主中。該基因轉移方法叫做活體外基因治療。體內和活體外基因治療都向醫師提供了加入或修飾治癒疾病的特定基因的手段 (Friedmann T.載於Friedmann T(主編)，人類基因治療的發展，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 第 1 章1_20 頁(1999))。正研究該技術對大範圍疾病的臨床應用，所述疾病包括癌症、心血管疾病、代謝疾病、神經退行性疾病、免疫疾病和其它遺傳或後天病(Friedmann T.，載於Friedmarm T (主編)，人類基因治療的發展， Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor :第 1 章1-20 頁(1999)； Drew J & Martin L A.,載於Lemoine N. R.(主編)Understanding Gene Therapy. Springer-Verlag,New York，第1章1-10頁(1999))。在將眾多蛋白編碼基因通過基因治療方法引入到細胞中後，已經獲得了穩定治療濃度的蛋白。但是，對於某些疾病，需要調節性傳遞治療蛋白。例如，用於糖尿病患者的胰島素替代療法實際上需要在進餐時給予適量胰島素。同樣，可通過膳食依賴性釋放達到食慾抑制劑的最佳效用。因此，為傳遞所述治療蛋白，優選由信號或刺激物(如膳食)觸發的釋放系統。非常適於定時傳遞的一種特別疾病是糖尿病，該病是一種胰腺β細胞產生的胰島素缺乏(1型)或不足(2型)引起的消耗性代謝疾病(Unger,R. H.等，Williams Textbook of Endocrinology Saunders，Philadelphia(1998))。β 細胞是特化的內分泌細胞,生產和儲存胰島素，用於在進食後釋放(Miodes等，J. Cell. Biol. 105 145 (1987))，而胰島素是一種促進葡萄糖由血液轉移至需要葡萄糖組織的激素。糖尿病患者必須經常監測血糖水平，許多患者需要每日多次注射胰島素才能生存。然而，這些患者幾乎不能通過胰島素注射獲得理想的血糖水平(Turner，R. C.等，JAMA 281 :2005(1999))。而且，長期胰島素水平升高可能產生有害的副作用，例如低血糖休克和機體胰島素反應脫敏。因此，糖尿病患者還會出現遠期併發症，例如心血管疾病、腎病、失明、神經損傷和傷口癒合失調(UK Prospective Diabetes Study (UKPDS)Group, Lancet 352,837(1998)) 基因治療提供了一種實現治療肽(例如治療糖尿病的胰島素)生理性傳遞的有前途的方法(Leibowitz, G. & Levinev, F. Diabetes Rev. 7 :124(1999))。代用細胞表達摻入的基因，加工和儲存編碼蛋白，並以可調節方式分泌胰島素，由此治療糖尿病。通過將胰島素生產和改變機體營養需求結合在一起控制血漿胰島素水平還減輕了與胰島素注射相關的副作用。因此，需要控制蛋白質釋放，以獲得對糖尿病和其它人類疾病的有效治療。本發明滿足了這種需要，並具有相關優勢。發明概述本發明部分基於產生轉化的消化道細胞，這些細胞在葡萄糖作用下產生胰島素。 存在於動物消化道中的轉化葡萄糖反應性細胞能夠分泌生理水平的胰島素，恢復糖尿病動物的正常葡萄糖穩態。因此，消化道內分泌細胞是活體外或體內治療性引入蛋白編碼核酸的合適靶位，動物在信號或刺激物(例如營養物)作用下產生所述蛋白有利於治療。本發明因此提供產生黏膜細胞和包括黏膜細胞的組合物的方法，所述黏膜細胞應答於營養物生產蛋白。在一個實施方案中，一種方法包括在允許黏膜細胞轉化的條件下使該黏膜細胞與含表達控制元件的多核苷酸接觸，該表達控制元件與蛋白編碼核酸有效連接；並鑑定以營養調節方式生產所述蛋白的細胞轉化體，由此獲得應答於營養物生產蛋白的黏膜細胞。在另一個實施方案中，一種組合物包括分離或培養的生產營養調節蛋白的黏膜細胞，其中包含與所述蛋白編碼核酸有效連接的表達控制元件的轉基因使所述蛋白表達。本發明因此還提供治療患病或有患病風險患者的方法，所述疾病可通過組織生產蛋白治療。在一個實施方案中，一種方法包括將一種或多種應答於營養物生產蛋白的黏膜細胞以疾病治療有效量植入組織中。代表性的可植入組織包括黏膜組織(例如胃腸道)和非黏膜組織(例如肝臟、胰腺或肌肉)。本發明包括的黏膜細胞包括營養反應性細胞，所述細胞增加所述蛋白的表達(例如通過營養調節表達控制元件)或分泌(例如在信號或刺激物(即「促分泌素」)作用下分泌合成蛋白。營養物包括天然和非天然的可攝食化合物，例如糖、脂肪、碳水化合物或澱粉、胺基酸或多肽、甘油三酯、維生素、礦物質或纖維素。營養調節元件包括消化道內分泌啟動子， 例如葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)啟動子。營養調節元件包括其功能變異體(例如點突變)或全長調節元件的功能亞序列(缺失序列)。與蛋白編碼核酸有效連接的表達控制元件還可包括一種載體(例如病毒載體)。本發明包括的黏膜細胞得自患者例如哺乳動物(例如人)、胃腸道組織或器官或衍生自消化道來源的培養細胞系。可獲得黏膜細胞的代表性組織包括胃腸道、大腸或小腸 (空腸、十二指腸)、胃、食道、口頰或口腔組織。黏膜細胞還包括那些可以或適於在黏膜部位(mucosum)中生長的細胞，即便時間很短。黏膜細胞色括內分泌細胞或非內分泌細胞、K 細胞、幹細胞、L細胞、S細胞、G細胞、I細胞、Mo細胞、Gr細胞和腸內分泌細胞。本發明組合物和方法包括治療性蛋白，如胰島素、瘦素、GLP-U GLP-2、縮膽囊素、 胰高血糖素拮抗劑、(ihre 1 in、生長激素、凝血因子或抗體。本發明因此還提供治療患病或有患病風險的患者的方法，所述疾病可通過在黏膜組織生產治療性蛋白治療。在一個實施方案中，一種方法包括將已用多核苷酸(例如與所述治療性蛋白編碼核酸有效連接的表達控制元件)轉化的患者黏膜細胞與誘導產生疾病治療有效量蛋白的營養物接觸。本發明方法和組合物可治療的疾病包括高血糖病(例如胰島素依賴性和非依賴性糖尿病或空腹血糖水平超過110mg/dl)、肥胖或體重過重。本發明因此還提供動物遺傳模型。在一個實施方案中，提供一種在黏膜組織產生治療性蛋白(例如胰島素)的非人轉基因動物。一方面，由黏膜組織中存在的轉基因使天生無此能力的動物黏膜組織生產治療性蛋白，所述轉基因包括含與所述蛋白編碼核酸有效連接的表達控制元件的多核苷酸，其中動物黏膜組織應答於營養物生產所述蛋白。一方面， 所述蛋白包括胰島素。因此，可使轉基因動物不易產生高血糖病。因此，可使患高血糖病或具有患高血糖病風險的轉基因動物葡萄糖減少或不大可能出現高血糖。另一方面，所述動物為小鼠(例如糖尿病或高血糖或肥胖小鼠)。再另一方面，賦予表達能力的表達控制元件包括營養調節元件、其功能變異體或其功能亞序列。再另一方面，所述表達控制元件包括葡萄糖誘導型啟動子，例如葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)啟動子。可使所述動物的胃腸道、腸道、胃表達蛋白。可分離應答於營養物生產胰島素的轉基因動物的細胞和組織。表達蛋白並還可以分離的細胞包括K細胞、幹細胞和內分泌細胞或非內分泌細胞。下文的附圖和說明描述了本發明一個或多個實施方案的細節。由說明書和附圖以及權利要求可清楚看出本發明的其它特徵、目的和優勢。


圖1顯示在腫瘤衍生的腸內分泌細胞STC-I中由GIP啟動子驅動的綠色螢光蛋白 (GFP)表達。左圖顯示樣品的亮光視野細胞。右圖藉助於可鑑定GFP表達細胞的螢光觀察同一視野。選擇螢光細胞簇並培養擴增，以產生K細胞系GTC-1。圖2是STC-I和GTC-I細胞的GIP mRNA代表性RNA印跡分析，顯示GTC-I是高度富集的生產GIP的K細胞。圖3是構建用於表達人胰島素的K細胞的GIP/Ins質粒的示意圖。它含有有效連接至GIP啟動子(約2. 51Λ的GIP基因5'調節序列)的人胰島素基因的基因組序列。3 個外顯子以實心框表示(El、2和3)。標示了用於RT-PCR檢測胰島素原mRNA的引物位置。 顯示了 HindIII(H)、PvuII(P)和XhoI (X)位點。標明了起始密碼子(ATG)和終止密碼子的位置。圖4顯示腫瘤衍生的K細胞表達人胰島素和胰島素原加工酶。上圖顯示人胰島 (H)和用GIP/Ins質粒轉染(T)或未轉染(UT)的GTC-I細胞的cDNA的RT-PCR分析。用 (+)或不用(_)反轉錄酶製備樣品。下圖顯示GTC-I細胞和β細胞系(INS-I)表達的蛋白質原轉化酶PC1/3和PC2的免疫印跡分析。箭頭表示PC1/3同種型(64和82kD)和PC2同種型(66和75kD)的預測產物大小。圖5顯示於培養基中檢測到的用GIP/Ins構建物轉染⑴或未轉染(UT)的GTC-I 細胞的人胰島素和C肽水平。胰島素和C肽分別用空心和實心條柱表示。圖6顯示葡萄糖對GIP/Ins質粒穩定轉染的GTC-I細胞分泌胰島素的刺激作用。圖7顯示在小鼠十二指腸切片中葡糖激酶(GK，紅色)和GIP(綠色)共表達。圖8顯示轉基因細胞系的基因組DNA印跡和PCR鑑定。小鼠編號標示於上方。圖9顯示在具有GIP/Ins構建物的轉基因小鼠中K細胞定向表達人胰島素。上圖顯示人胰島、對照十二指腸(小鼠)和轉基因小鼠組織中表達的人胰島素基因的代表性RNA 印跡分析。下圖顯示人胰島(H)、小鼠胰島(M)和兩種轉基因小鼠的十二指腸樣品(D)的 cDNA的RT-PCR分析，該分析使用人或小鼠特異性胰島素原引物。樣品在存在(+)或不存在反轉錄酶㈠下製備。0表示無DNA，而M表示標記物。圖10顯示轉基因小鼠胃(左圖)和十二指腸(中圖)切片的人胰島素免疫組織化學染色結果。箭頭表示人胰島素免疫反應細胞。右圖顯示在與胰島素(INS，綠色)和 GIP(紅色)特異性抗血清共染色後經免疫螢光顯微鏡檢查同一動物的十二指腸切片。圖IlA顯示膳食調節轉基因小鼠消化道K細胞產生人胰島素。圖1IB顯示轉基因小鼠消化道K細胞在混合膳食測試和口服葡萄糖刺激作用下的人胰島素釋放動力學。圖12顯示在口服葡萄糖(1. 5g葡萄糖/kg體重)後正常對照小鼠、鏈脲黴素(STZ)治療的對照小鼠和STZ治療的轉基因小鼠的血糖濃度變化。圖13是一組顯微照片，顯示對照和STZ治療的轉基因小鼠胰腺切片的小鼠胰島素免疫組織化學染色。箭頭表示胰島。圖14為大鼠GIP和小鼠嗜鉻粒蛋白A基因啟動子區的核苷酸序列。圖15為小鼠分泌粒蛋白II (登錄號AF037451)的啟動子和外顯子1以及小鼠葡糖激酶基因啟動子(登錄號U93275)的5'部分的核苷酸序列。圖16為小鼠葡糖激酶基因啟動子(登錄號U93275)的3'部分、人腺苷脫氨酶基因啟動子區(登錄號X02189)的核苷酸序列；以及人前胰島素原的胺基酸序列和60bp的前胰島素原5'區。圖17為餘下的人前胰島素原3'部分和人瘦素基因cDNA的5'部分的核苷酸序列。圖18為餘下的人瘦素3'部分的核苷酸序列、人CCK胺基酸和核苷酸序列以及 60bp的大鼠CCK啟動子。圖19為餘下的大鼠CCK啟動子3'部分的核苷酸序列以及人生長激素的胺基酸和核苷酸序列。圖20為大鼠GIP啟動子-1至_1894bp的序列。發明詳述本發明部分基於以足以提供治療的水平在動物組織定向生產蛋白。更具體地說， 本發明包括在患者胃腸道內分泌細胞定向表達任意目標蛋白以使所述蛋白以調節方式釋放到所述患者血流中的方法。可以使用包含表達控制元件(例如啟動子)的遺傳構建物，所述表達控制元件有效連接至治療性蛋白編碼核酸，將基因表達導向消化道內分泌細胞。當將基因構建物摻入到內分泌細胞中時，其以調節方式表達和分泌編碼蛋白。在進食一種增加蛋白產生的物質(例如營養物)時，表達目的核酸編碼蛋白的轉化內分泌細胞可分泌治療有效量的蛋白至患者血流中。包含有效連接至人胰島素基因的GIP啟動子的遺傳構建物在小鼠中的傳遞在轉基因後代的胃腸道K細胞中成功定向表達和分泌人胰島素。而且，所述轉基因動物生產人胰島素受膳食調節。所述細胞分泌的胰島素量足以保護轉基因小鼠在胰腺細胞損傷後免得糖尿病。產生的胰島素還足以提供正常的葡萄糖穩態。因此，通過體內或活體外方法 (例如將分泌胰島素的轉化細胞體外移植入動物體內)將編碼治療性蛋白(例如胰島素) 的基因引入動物消化道的膳食調節性內分泌細胞中，可用於治療通過生產蛋白可治療的疾病。按照本發明，提供獲得生產營養調節蛋白的黏膜細胞的方法。本發明方法包括在允許細胞轉化的條件下使黏膜細胞與含表達控制元件的多核苷酸接觸，該表達控制元件與蛋白編碼核酸有效連接；並鑑定以營養調節方式生產所述蛋白的轉化細胞。在一個實施方案中，黏膜細胞與多核苷酸體內接觸。在另一個實施方案中，黏膜細胞與多核苷酸體外接觸。在再另一個實施方案中，與多核苷酸體外接觸的黏膜細胞適於移植入動物體內。在其它的實施方案中，所述黏膜細胞為內分泌細胞(例如K細胞)或非內分泌細胞。在再另一個實施方案中，所述黏膜細胞為幹細胞或多能祖細胞。在另一個實施方案中，用於本發明的核酸表達構建物用來在胃腸道內分泌細胞中
8定向表達蛋白。所述構建物含有有效連接至目的核酸序列的表達控制元件。表達控制元件包括能夠使消化道內分泌細胞定向表達連接的目的核酸的啟動子。可用本領域眾所周知的常規方法(滲透壓休克(例如磷酸鈣)、電穿孔、病毒載體、囊泡或脂質載體(例如脂轉染)、 直接微注射等)將構建物引入靶細胞中。細胞轉化通常使用載體。術語「載體」是指例如質粒、病毒(如病毒載體)或其它本領域已知的載體，它們可通過插入或摻入多核苷酸進行遺傳操作(即「克隆載體」)，或可用於轉錄或翻譯插入的多核苷酸(即「表達載體」)。這樣的載體用於引入多核苷酸(包括與核酸有效連接的營養調節型表達控制元件)，並在體外或體內於細胞中表達轉錄的反義或編碼蛋白。載體通常含有至少一個用於在細胞中繁殖的複製起點。載體中存在的控制元件包括促進轉錄和翻譯的元件，包括本文提出的表達控制元件(例如營養調節型表達控制元件)。術語「控制元件」最低限度應包括一種或多種其存在可影響組分表達，並可包括非啟動子或增強子的組分或啟動子或增強子以外的組分，例如前導序列和融合配偶體序列、用於產生多基因的內部核糖體結合位點(IRES)元件或多順反子信息、用於內含子的保持基因正確讀框以使mRNA按讀框翻譯的剪接信號、使目的基因轉錄物正確聚腺苷酸化的多腺苷酸信號、終止密碼子等等。載體可以包含選擇標記。正如本領域所已知的一樣，「選擇標記」或同義詞是指允許選擇含有其的細胞的基因。「正選擇」是指一種在接觸正選擇條件時只有含正選擇標記的細胞才能存活或被標記的過程。例如，藥物抗性是常用的正選擇標記，含正選擇標記的細胞在含選擇藥物的培養基中生長，而那些不含所述抗性基因的細胞將死亡。合適的藥物抗性基因有賦予對G418抗性的neo基因或賦予對潮黴素抗性的hygr 基因或賦予對嘌呤黴素抗性的puro基因等。其它的正選擇標記基因包括允許分類或篩選細胞的基因。這些基因包括螢光蛋白基因、IacZ基因、鹼性磷酸酶基因和表面標記如CD8寸。本發明包括的載體可以包含負選擇標記。「負選擇」是指一種在接觸合適的殺死含負選擇標記細胞的負選擇條件時殺死含負選擇標記細胞的過程。例如，包含單純皰疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因的細胞對藥物丙氧鳥苷(GANC)敏感。同樣，gpt基因使細胞對6-硫代黃嘌呤敏感。本發明包括的載體基於病毒載體，例如能夠以染色體外因子複製的猿猴病毒 40(SV40)或牛乳頭瘤病毒(BPV) (Eukaryotic Viral Vector, Cold spring Harbor Laboratory，Gluzman 主編，1982 ；Sarver 等，Mol. Cell. Biol.，1 :486(1981))。病毒載體包括反轉錄病毒、腺相關病毒、腺病毒、呼腸孤病毒、慢病毒、輪狀病毒基因組等，對其進行修飾以引入黏膜細胞並控制其中的多核苷酸或轉基因表達(Cone等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6349(1984))。「表達控制元件」包括影響有效連接的核酸表達的多核苷酸，例如啟動子和增強子。表達控制元件和啟動子包括那些在特定組織或細胞類型中起作用的元件，本文稱為「組織特異性表達控制元件/啟動子」。組織特異性表達控制元件通常在特定的細胞或組織中起作用，因為它們可被特定細胞或組織類型獨有的轉錄激活蛋白或其它轉錄調節物識別。—類特別的組織特異性啟動子為「消化道內分泌細胞特異性啟動子」，其驅動有
9效連接的核酸在消化道內分泌細胞中表達。GIP啟動子是消化道內分泌細胞啟動子的一個具體實例。GIP啟動子包括能夠在胃腸道特異性表達的多調節序列(Tseng，C. C.等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 1992 (1993) ；Yeng, C. Μ.等，Mol. Cell. Endocrinol. 154 161(1999))。長度約2.5Kb (-1至約-2500bp)大小的啟動子使胃和十二指腸定向表達轉基因(圖9和10)。較短的GIP啟動子(-1至約-1200bp)能使胃表達轉基因，但不能使十二指腸表達轉基因，並且不能使胰腺定向表達轉基因(Yeng，C. Μ.等，Mol. Cell. Endocrinol. 154 :161 (1999))。因此，-1200至_2500bp的調節序列對於腸GIP生產細胞定向表達轉基因似乎是必需的。GIP啟動子轉錄元件的特徵鑑定顯示有兩個TATA盒(-27至-23和-115至-111) 和兩個CCAAT樣盒(-158至-154和-170至-167)、潛在的AP-1和AP-2位點、cAMP效應元件(CRE)以及位於推定的轉錄起始位點上遊的潛在胰島素效應元件(TRE)。還在GIP啟動子中鑑定出兩個推定的GATA結合基序(-178至-172 (近側的GATA)的CAGATAC和-190 至-184 (遠側的GATA)的CAGATAA)，它們符合保守GATA結合基序序列(A/T) GATA (A/G)。根據螢光素酶報告基因表達的評價，GIP啟動子遠側和近側GATA基序的特異性突變分別導致 GIP 啟動子活性降低約 90%和 35% (Boylan 等，J. Biol. Chem. 273 17438 (1997))。但是， 具有兩個GATA基序突變的GIP啟動子與僅有遠側GATA基序改變的啟動子表現相同。因此，含一個或多個前述核苷酸序列的GIP啟動子或變異體是可保持有效連接的核酸葡萄糖調節性或組織特異性(消化道)表達的亞序列實例。這種亞序列和變異體可用於使有效連接的核酸在體外或體內葡萄糖調節性或細胞特異性表達。組織特異性控制元件的另一個實例是胰高血糖素原基因啟動子。與GIP啟動子類似，胰高血糖素原啟動子具有能在胃腸道或大腦和胰腺表達的多控制序列(Lee，Y.C.等， J. Biol. Chem. 267 10705 (1992) ；Gajic 和 Drucker，Endocrinol. 132 1055 (1993))。大鼠胰高血糖素原啟動子序列上遊的1300bp部分使轉基因在大腦和胰腺定向表達，但不在胃腸道中表達(Efrat S.等，Neuron 1 :605(1988))。較長的胰高血糖素原基因啟動子(_1 至-2000bp)控制轉基因除了在大腦和胰腺表達之外還在腸中表達(Lee，Y.C.等，J. Biol. Chem. 267 :10705 (1992)) 0因此，能夠在消化道中表達的部分出現在位於胰高血糖素原基因上遊1300和2000bp之間的700bp的啟動子區內。可用於使目的核酸在消化道內分泌細胞中定向表達的其它組織特異性表達控制元件列於表1。其中許多也是營養調節元件。例如，GIP啟動子包括能使有效連接的核酸應答於營養物表達的多調節序列。該列表無意列舉出所有可能用於驅動基因在消化道內分泌細胞表達的表達控制元件，僅僅是舉例而已。儘管組織特異性表達控制元件在其它組織中可能有活性，例如消化道特異性表達控制元件可能在非消化道組織中有活性，但表達明顯低於在消化道組織中的表達(例如非消化道組織比消化道組織低6-10倍)。載體向消化道組織的定向傳遞可限制在機體其它地方(例如在非靶組織)表達的可能性。因此，本文包括的組織特異性元件不需要具有絕對的組織表達特異性。表 1\ 使消化道內分泌細胞定向表達蛋白的典型啟動子和增強子葡糖激酶_________
嗜鉻粒蛋白A和B 縮膽嚢素
葡萄糖依賴性促胰島素肽肢高血糖素原腺苷脫氨酶促胰液素胃泌素
促生長素抑制素促胃動素 Ghrelin其它的表達控制元件可使表達以可調節方式進行，即信號或刺激物增加或降低有效連接的核酸表達。在信號或刺激物作用下增加有效連接的核酸表達的調節元件也叫做 「誘導型元件」(即受信號例如營養物誘導)。在信號或刺激物作用下降低有效連接的核酸表達的調節元件叫做「抑制型元件」(即信號降低表達，使得在信號去除或不存在時表達增加)。通常，所述元件能夠增加或降低的量與存在的信號或刺激物的量成比例；信號或刺激物的量越大，表達的增加或降低就越大。調節型表達控制元件的一個具體實例是應答於營養物或在取消營養物時增加或降低有效連接的核酸表達的元件，在此情況下該元件叫做「營養調節元件」。營養誘導型或抑制型元件通常提供基礎水平的轉錄(即不存在刺激物或信號時的表達水平)。通常，抑制型元件的基礎轉錄水平大於誘導型元件。本文使用的術語「營養物」是指任何可攝入或可消耗的物質，例如食物或飲料中存在的物質。因為在食物或飲料中存在許多(可能有幾十億種)不同的有機物和無機物，所以本文使用的術語含義廣闊。營養物的特定實例包括糖(例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露糖等)、碳水化合物、澱粉、脂肪(飽和或不飽和脂肪)、脂質、脂肪酸、甘油三酯、多肽、胺基酸、纖維素、激素、維生素和礦物質。營養物還可以調節蛋白的翻譯或穩定性。因此，「營養調節」包括營養物調節轉錄、 轉錄物翻譯為蛋白或蛋白穩定性並由此增加或降低轉錄物或蛋白的量的各種情況。表達控制元件可以是「組成型」，使有效連接的核酸在不存在信號或刺激物的情況下發生轉錄。另外，表達控制元件還包括能在細胞周期或分化的特定階段表達的元件。因此，本發明還包括能夠組成型、調節性(例如營養調節性)、組織特異性、細胞周期特異性和分化期特異性表達的表達控制元件。表達控制元件包括全長序列(如天然啟動子和增強子元件)以及保留全部或部分全長或非變異體功能(例如保留一定量的營養調節性或細胞特異性表達)的亞序列或多核苷酸變異體。本文使用的術語「功能」及其各種語法變化在應用於核酸或多肽序列、亞序列或片段或核苷酸或胺基酸序列變異體時，是指該序列具有天然核酸或多肽序列(例如非變
11異體或未修飾的序列)的一種或多種功能。本文使用的術語「變異體」是指序列(核苷酸或胺基酸)取代(例如點突變)、缺失(內部或外部)或添加(例如嵌合多肽)或其它的點突變修飾(例如化學衍生物，如抗蛋白酶或核酸酶的修飾形式)。通常，胺基酸變異體具有幾個或若干胺基酸變化(例如1-10、10-20、20-50)，例如一個或幾個保守胺基酸取代，或對希望變異體保留的功能很關鍵的結構域之外的非保守胺基酸取代。表達控制元件，例如營養調節元件，還包括功能變異體或亞序列。例如，約2. 5Kb 的葡萄糖調節性GIP啟動予的亞序列(例如2Kb,1Kb,0. 5Kb,0. 25Kb,0. 20Kb、IOObp或更小)可保留有效連接核酸的葡萄糖調節性或組織特異性(消化道或胰腺或大腦)表達。特性已知的各種啟動子的功能結構域可使有效連接核酸的表達量和表達模式最佳。本文包括的表達控制元件可得自細菌、酵母、植物或動物(哺乳動物或非哺乳動物)，只要其能夠使有效連接核酸的表達受控。因此，可使用得自任何生物的受物質或刺激物(例如營養物)誘導的任何表達控制元件調節有效連接核酸在黏膜細胞中的轉錄，並且如本文所述在適當時可用於調節所述物質或刺激物作用下的編碼蛋白翻譯。營養調節型表達控制元件以例如調節涉及糖酵解、脂質代謝、碳水化合物代謝和膽固醇(例如類固醇)代謝的酶表達的啟動子形式存在，它們分別受糖、脂肪、碳水化合物和膽固醇調節，並適用於本發明。營養調節型控制元件的具體實例為驅動L-丙酮酸激酶、 乙醯輔酶A羧化酶、spot-14、脂肪酸合酶、磷酸甘油醛脫氫酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸果糖激酶表達的葡萄糖誘導元件(另外參見例如Rutter GA等，News Physiol Sci. 15 149(2000)).營養調節型控制元件的另一個實例是乙醇脫氫酶基因調節元件。營養調節型控制元件的再另一個實例是維生素D效應元件，其能夠在維生素D存在時表達。哺乳動物金屬硫蛋白基因啟動子是金屬誘導的表達控制元件。同組織特異性控制元件一樣，營養調節型控制元件可對多種營養物起反應。例如，葡萄糖誘導元件還可以對乳糖起反應。因此，一種特定的營養物(例如葡萄糖)並未排除其它營養物，因為其它營養物可在較低程度上調節所述控制元件的活性(增加或降低)。細菌營養調節型表達控制元件的實例是受半乳糖苷誘導的Iac阻抑蛋白。酵母營養調節型表達控制元件的實例是存在於GALl和GALlO基因中的gal啟動子，該啟動子具有半乳糖誘導型表達能力。這些元件可有效連接至核酸並導入黏膜細胞中，以便營養調節性生產編碼蛋白。所包括的其它表達控制元件為對非營養物起反應的元件。具體的實例是具口服活性但通常食物中沒有的化學物質或藥物。非營養性藥物或化學物質在攝入時刺激有效連接至非營養型表達控制元件的核酸表達。攝入所述化學物質或藥物的具體量控制產生(通過轉錄或分泌)的核酸或蛋白量。例如，當藥物誘導型表達控制元件使胰島素編碼核酸表達時，通過增加藥物消耗量可使消化道中產生的胰島素量增大。這種非營養型表達控制系統的具體實例可見於例如美國專利號5，989，910,5, 935，934,6, 015，709和6，004，941。本文使用的術語「有效連接」或其各種語法變體是指物理或功能上的所述組分鄰接，使得這些組分可以其希望的方式起作用。在與核酸有效連接的表達控制元件的實例中， 這種關係使所述控制元件調節所述核酸的表達。可在轉錄、翻譯、剪接、信使穩定性等水平上實現表達控制。通常，調節轉錄的表達控制元件鄰接在轉錄核酸的5'末端附近(即「上遊」)。表達控制元件還可以位於轉錄
12序列的3'末端(即「下遊」)或轉錄物之中(例如在內含子中)。表達控制元件可以位於離轉錄序列較遠的位置(例如距所述核酸100-500、500-1000、2000-5000或更多核苷酸)。 有效連接核酸的表達至少部分受控於所述元件(例如啟動子)，使得所述元件調節所述核酸的轉錄，合適時調節轉錄物的翻譯。表達控制元件的一個具體實例是啟動子，其經常位於轉錄序列的5'端。表達控制元件的另一個實例是增強子，其可以位於轉錄序列的5'、3' 端，也可以位於轉錄序列之中。本文使用的術語「產生」或「生產」當應用於黏膜細胞或組織表達的蛋白時，是指黏膜細胞表達或分泌蛋白。因此，當黏膜細胞在信號或刺激物(例如營養物)作用下生產蛋白時，蛋白的表達和分泌超過信號或刺激之前的量。黏膜細胞或組織生產蛋白可能是由於增加了核酸的轉錄、轉錄物的翻譯、轉錄物或蛋白的穩定性或者編碼蛋白的分泌。通常， 信號或刺激物(即促分泌素)增加細胞的蛋白分泌刺激細胞中已翻譯蛋白釋放。其分泌受控的蛋白通常儲存在內分泌細胞的分泌小泡中。另一方面，信號或刺激物可增加蛋白編碼核酸的轉錄或翻譯以及隨後的翻譯蛋白分泌。因此，在非內分泌細胞的實例中，信號或刺激物(例如營養物)可通過營養誘導型表達控制元件刺激蛋白(例如胰島素)編碼核酸的轉錄，細胞隨後在蛋白翻譯以後分泌編碼蛋白。在內分泌細胞(例如消化道內分泌細胞，如K細胞、L細胞等)的實例中，用於使蛋白表達的表達控制元件可以調節或者可以不調節，但在任一種情況下信號或刺激物通常將調節所述細胞分泌蛋白。在此情況下，信號或刺激物起刺激或增加蛋白分泌的促分泌素作用。因此，在內分泌細胞中，無論表達是還是不是營養調節型(例如組成型啟動子)，細胞生產蛋白都是營養調節型，因為蛋白的分泌受營養物調節。因此，「營養調節型」也指營養物調節細胞分泌蛋白。與非內分泌細胞通過增加蛋白編碼核酸轉錄以及隨後的分泌生產蛋白相比，內分泌細胞在信號或刺激物作用下蛋白分泌增加對信號或刺激物的反應更快。相反，在非內分泌細胞中，信號或刺激物(如營養物)可增加蛋白編碼核酸的轉錄，細胞隨後分泌翻譯的蛋白而不需要信號和或刺激物(如營養物)。因此，對於營養調節型轉基因轉化的非內分泌黏膜細胞，轉基因的轉錄為營養誘導型，但分泌不需要營養物。核酸可以編碼治療性多肽，如胰島素、胰高血糖素拮抗劑、瘦素、GLP-I或縮膽囊素。例如，在體內降低葡萄糖水平、提供正常葡萄糖穩態或減輕與慢性或急性高血糖症相關的組織病理學症狀方面保留一定能力的全長胰島素亞序列僅僅是具有其全長相應物一種或多種活性的功能亞序列的一個實例。同樣，在抑制食慾或導致體重穩定或體重減輕、刺激生長、減少凝血時間或出血或提供對外源抗原(例如幽門螺桿菌)的被動保護能力方面保留全部或部分能力的瘦素或CCK或生長激素、凝血因子或抗體的亞序列或變異體是可在動物黏膜組織表達以提供治療利益的功能序列或變異體的另外的實例。因此，由「核酸」編碼的「多肽」、「蛋白」和「肽」包括與天然蛋白一樣的全長天然序列以及功能亞序列、修飾形式或序列變異體，只要所述亞序列、修飾形式或變異體保留一定程度的天然全長蛋白的功能性。本文使用的術語「轉基因」是指已經人工引入到細胞或生物體中的多核苷酸。例如，具有轉基因的黏膜細胞，所述轉基因已通過遺傳操作或「轉化」細胞導入。轉基因導入其中的細胞或其子代叫做「轉化細胞」或「轉化體」。通常，轉基因包含在轉化體的子代中，或者成為細胞所發育生物的一部分。可將轉基因插入到染色體DNA中，或者作為自主複製的質粒、YAC、小染色體等保持。轉基因包括任何轉錄為反義RNA或編碼多肽的基因。由轉基因編碼的特定多肽包括可檢測的蛋白，如螢光素酶、半乳糖苷酶、綠色螢光蛋白(用於非侵入性體內檢測)、 氯黴素乙醯轉移酶或可檢測的蛋白(例如可免疫檢測)。例如，可根據對細胞存活或增殖的檢測(例如在將轉化細胞移植入動物黏膜後)，使用可檢測蛋白評價細胞轉化率(例如體內基因轉移)、細胞移植成功率。治療性蛋白包括胰島素，一種用於治療高血糖症(例如糖尿病)的特定轉基因。胰島素是葡萄糖代謝的主要激素調節物，促進葡萄糖由血液轉運至關鍵的代謝器官，如肌肉、 肝臟和脂肪。如實施例III所顯示，通過胰島素轉基因在轉基因小鼠消化道中產生胰島素預防小鼠患糖尿病。產生胰島素的量足以恢復葡萄糖耐受，而胰島素的定時釋放恢復了正常的葡萄糖穩態。編碼治療高血糖症的治療性蛋白的轉基因的另一個實例是胰高血糖素拮抗劑。胰高血糖素是一種由胰島α-細胞產生的肽激素，是葡萄糖代謝的主要調節物(Unger R. H. & Orci L. N. Eng. J.Med. 304 :1518(1981) ；Unger R. H. Diabetes 25:136(1976))。如同胰島素一樣，血糖濃度介導胰高血糖素分泌。然而，與胰島素相反，胰高血糖素在血糖降低時分泌。因此，胰高血糖素的循環濃度在禁食期間最高，而在進食期間最低。胰高血糖素水平增加以克制胰島素促進葡萄糖儲存，並刺激肝臟釋放葡萄糖至血液中。胰高血糖素拮抗劑的一個具體實例是[脫-His1，脫-Phe6，Glu9]胰高血糖素-NH2。在鏈脲黴素糖尿病大鼠中， 血糖水平在靜脈快速濃注(0. 75μ g/g體重)該胰高血糖素拮抗劑的15分鐘內下降約37% (Van Tine B. Α.等，Endocrinology 137:3316(1996))。編碼治療高血糖症或體重過重(例如肥胖)的治療性蛋白的轉基因的另一個實例是胰高血糖素樣肽-1 (GLP-I)。GLP-I是一種在進食期間由腸L細胞釋放的激素，它刺激胰腺β -細胞以增加胰島素分泌。GLP-I具有另外的活性，這種活性使其成為富有吸引力的肥胖和糖尿病治療劑。例如，GLP-I減緩胃排空、抑制食慾、降低胰高血糖素濃度、增加β-細胞量、刺激胰島素生物合成並以葡萄糖依賴方式分泌，並可能增加組織對胰島素的敏感性 (Kiefier T. J.，Habener J. F. Endocrin. Rev. 20 :876 (2000))。因此，與進食相一致的消化道GLP-I調節釋放有利於對高血糖症或體重過重的治療。抗二肽肽酶IV (DPP IV)的GLP-1類似物提供較長期作用和改善的治療能力。因此，可使用本文所述的本發明，將編碼增加作用持續時間的GLP-I類似物的轉基因靶向消化道，以提供營養調節型產生的GLP-I類似物，用於治療高血糖症或體重過重。編碼治療高血糖症的治療性蛋白的轉基因的另一個實例是激素抵抗素拮抗劑。抵抗素是一種脂肪細胞衍生因子，在飲食誘導形式和遺傳形式的肥胖中其表達提高。中和循環抵抗素改善了肥胖小鼠的血糖和胰島素作用。相反，給予正常小鼠抵抗素損害了葡萄糖耐受和胰島素作用(St印pan CM等，Nature 409 :307(2001)) 0因此，在消化道中產生拮抗抵抗素生物作用的蛋白提供了對肥胖相關的胰島素抗性和高血糖症的有效治療。編碼治療體重過重(例如肥胖)或高血糖症的治療性蛋白的轉基因的再另一個實例是瘦素。瘦素儘管主要是由脂肪細胞產生，但也在胃中以進食依賴性方式小量產生。瘦素將有關脂肪細胞代謝和體重的信息傳送至大腦的食慾中心，食慾中心發出減少食物攝取的信號(促進飽脹感)，並增加機體的能量消耗。每日單次皮下注射瘦素對人體重減輕僅具有很小的作用，但瘦素治療使齧齒動物脂肪量顯著下降，並且血糖降低(Seufert J.等，Proc Natl Acad Sci USA. 96 :674 (1999))。先前的研究已表明，瘦素在循環中迅速降解。因此， 以調節方式由消化道傳遞可能增強瘦素降低食物攝入和體重以及血糖的臨床作用。編碼治療體重過重(例如肥胖)或高血糖症的治療性蛋白的轉基因的再另一個實例是脂肪細胞互補相關蛋白(Acrp30)的C末端球形頭結構域。Acrp30是由分化脂肪細胞產生的蛋白。給予小鼠由球形頭結構域組成的Acrp30的蛋白切割產物使體重顯著下降 (Fruebis J.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA，98 :2005 (2001))。因此，消化道定向表達編碼 Acrp30球形結構域的轉基因可促使體重下降。編碼治療體重過重(例如肥胖)的治療性蛋白的轉基因的再另一個實例是縮膽囊素(CCK)。CCK是在消化道特定營養物作用下由腸分泌的胃腸肽。CCK的釋放與食物消耗量成比例，據信其向大腦發射停止進食的信號GchwartZ M.W.等，Nature 404 661-7K2000))。因此，CCK升高可減少進食量，並促使體重下降或體重穩定(即防止或抑制體重增加)。因此，營養調節型CCK傳遞系統可提供用於減少人攝取食物目的的治療作用。編碼治療性蛋白的轉基因的另一個實例包括治療血友病和其它凝結/凝血疾病的凝血因子(例如凝血因子VIII、IX或X)、治療生長疾病或消耗綜合症的生長因子(例如生長激素、胰島素樣生長因子-1、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、酸性和鹼性成纖維細胞生長因子、轉化生長因子-β等)以及為患者提供抗外源抗原或病原體(例如幽門螺桿菌)的被動免疫或保護或提供對癌症、關節炎或心血管疾病的治療的抗體(例如人抗體或人源化抗體)。編碼治療性蛋白的其它轉基因包括細胞因子、幹擾素(例如幹擾素(INF)、 INF-α 2b 禾口 2a、IFN-α Ni、IFN-β lb、IFN-γ)、白介素(例如 IL-I 至 IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF-α、TNF-β)、趨化因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、多肽激素、抗生素多肽(例如抗細菌、抗真菌、抗病毒和/或抗寄生物多肽)、酶(例如腺苷脫氨酶)、促性腺激素、趨化素、脂質結合蛋白、filgastim(Neupogen)、血紅蛋白、促紅細胞生成素、促胰島素、imigluceras^sarbramostim、組織纖溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、鏈激酶、軸突生長因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、腦衍生軸突因子(BDNF)、軸突生長因子(NGF)、苯丙氨酸氨裂解酶、血栓形成素(TPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷脫氨酶、過氧化氫酶降鈣素、內皮素、 L-天冬醯胺胃蛋白酶、尿酸酶胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶彈性蛋白酶、羧肽酶乳糖酶、蔗糖酶內在因子、降血鈣素甲狀旁腺激素(PTH)樣激素、可溶性CD4以及抗體和/或其抗原結合片段(例如 Fab)(例如 orthoclone OKT-e (抗 CD3)、GPIIb/Iia 單克隆抗體)。本文所述轉基因特別適用於本發明，但不限於此。在這方面，熟練技術人員可容易地預見到其它轉錄為治療性反義RNA或編碼治療性多肽的轉基因。靶細胞包括黏膜細胞或黏膜部位通常不存在的可以或適於在黏膜部位生長的細胞。本文使用的術語「黏膜」當用於表示細胞時，是指可以在黏膜生長的細胞。黏膜細胞包括例如通常可見於動物黏膜的細胞，例如消化道(例如嘴(舌頭和頰組織)、食道和胃、小腸和大腸、直腸、肛門)、呼吸道、肺和鼻咽以及其它腔體(例如陰道)的細胞。因此，黏膜細胞是指通常存在於前述部位的各種細胞類型，包括幹細胞或其它分化為各種黏膜細胞類型的多能細胞。黏膜細胞的具體實例包括內分泌細胞，例如K細胞、L細胞、S細胞、G細胞、D細胞、I細胞、Mo細胞、Gr細胞和腸內分泌細胞。通常，內分泌細胞的特徵為能夠在信號或刺激物(「促分泌素」)作用下將合成的蛋白分泌到血液中。非內分泌黏膜細胞包括排列在大多數黏膜組織外表面的上皮細胞、粘液細胞、絨毛細胞、柱狀細胞、基質細胞和Paneth細胞。通常已知非內分泌細胞在信號或刺激物作用下不將合成的蛋白分泌到血液中。消化道K細胞可以起替代細胞的作用，用於在動物中產生適當調節的生理水平胰島素，這一發現預示了一種糖尿病治療方式，使患者免於胰島素注射並降低甚至消除相關的糖尿病併發症。因為在人消化道中可能存在無數K細胞(Sandst^m 0.，El-Salhy M.， Mech. Ageing Dev. 108 :39 (1999))，所以調節這些細胞中的一部分分泌胰島素可能足以達到治療作用，包括改善與糖尿病相關的綜合症和併發症。消化道是機體最大的內分泌器官，能夠產生巨量的蛋白，並含有易於利用分裂細胞的快速再生組織。靶細胞如K細胞和幹細胞，主要位於容易接受非侵入性基因治療技術的上消化道。因此，非侵入性技術如口服製劑、內窺鏡方法或改良飼管允許利用促進轉基因整合入宿主基因組的載體。已經開發了傳遞基因至腸道細胞(包括幹細胞)的載體(Croyle 等，Gene Ther. 5 :645(1998) ；S. J. Henning, Adv. Drug Deliv. Rev. 17 :341 (1997)，美國專利第5，821,235號和6，110,456號)。這些載體中有許多已批准用於人類研究。因此，以可調節方式分泌蛋白如胰島素、苗條蛋白、胰高血糖素拮抗劑、GLP-l、GLP-2、(ihrelin、縮膽囊素、生長激素、凝血因子、抗體等等的消化道細胞如K細胞，是治療糖尿病、肥胖、生長缺陷和其它可通過在黏膜組織產生蛋白治療的疾病的一種手段。表2顯示了幾種類型的消化道內分泌細胞、在特定營養物(「促分泌素」)作用下由所述細胞分泌的蛋白和典型功能的部分舉例。所述蛋白、內分泌細胞和營養物都適用於本發明。表權利要求
1.遺傳構建物在製備用於治療患有糖尿病或高血糖症的個體的藥物中的用途，其中所述遺傳構建物包含編碼胰島素的核酸，該核酸的表達由葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP) 啟動子驅動。
2.如權利要求1所述的用途，其中所述遺傳構建物被靶向於由消化道內分泌細胞表達。
3.如權利要求1所述的用途，其中所述個體患有肥胖症或體重過重。
4.包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動子的多核苷酸在製備用於治療患有高血糖症或具有患高血糖症風險的個體的藥物組合物或裝置中的用途，所述多核苷酸用於由葡萄糖、蔗糖、果糖、碳水化合物、多肽、胺基酸或脂肪所誘導的消化道內分泌細胞中胰島素的產生。
5.如權利要求2或4所述的用途，其中所述消化道內分泌細胞包括以下細胞中的一種或多種K細胞、L細胞、S細胞、G細胞、D細胞、I細胞、Mo細胞、Gr細胞或腸內分泌細胞， 或者分化為K細胞、L細胞、S細胞、G細胞、D細胞、I細胞、Mo細胞、Gr細胞或腸內分泌細胞的幹細胞。
6.如權利要求4所述的用途，其中所述高血糖症包括糖尿病。
7.如權利要求6所述的用途，其中所述糖尿病包括I型糖尿病。
8.如權利要求6所述的用途，其中所述糖尿病包括胰島素依賴型糖尿病。
9.如權利要求1或4所述的用途，其中所述個體的空腹血漿葡萄糖水平高於IlOmg/dl。
10.如權利要求1或4所述的用途，其中應答於營養物的消化道內分泌細胞中胰島素的分泌增加。
11.如權利要求1或4所述的用途，其中所述遺傳構建物或多核苷酸包括載體。
12.如權利要求11所述的用途，其中所述載體包括病毒載體。
13.製備應答於營養物產生蛋白的消化道黏膜細胞的體外或離體方法，包括(a)在允許細胞體外或離體轉化的條件下將消化道黏膜細胞或消化道黏膜幹細胞與包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動子的多核苷酸接觸；和(b)鑑定受葡萄糖、蔗糖、果糖、碳水化合物、多肽、胺基酸或脂肪調節產生胰島素的細胞轉化體，從而製備應答於營養物產生胰島素的消化道黏膜細胞。
14.受營養物調節產生胰島素的分離或培養的消化道黏膜細胞，其中由包含與編碼胰島素的核酸有效連接的葡萄糖依賴型促胰島素多肽(GIP)啟動子的轉基因實現胰島素的表達。
15.如權利要求13或14所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述消化道黏膜細胞獲自個體。
16.如權利要求15所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述個體是人。
17.如權利要求13或14所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述消化道黏膜細胞獲自胃腸道組織或器官或來源於消化道來源的細胞系。
18.如權利要求17所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述組織是胃或十二指腸。
19.如權利要求13-18中任一項所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述消化道黏膜細胞是內分泌細胞。
20.如權利要求19所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述內分泌細胞是K細胞。
21.如權利要求13或14所述的方法或消化道黏膜細胞，其中所述多核苷酸或轉基因包括載體。
22.通過權利要求13所述的方法製備的分離的消化道黏膜細胞，其中該細胞應答於營養物產生胰島素。
全文摘要
本發明提供用於治療可通過在動物黏膜細胞或組織以可調節方式產生蛋白治療的疾病的組合物和方法。所述治療方法包括體內和活體外方法，包括將分泌所述蛋白的體外轉化細胞植入哺乳動物患者體內。
文檔編號A61P3/04GK102151337SQ201110071640
公開日2011年8月17日 申請日期2001年3月12日 優先權日2000年3月13日
發明者A·T·鍾, T·J·基菲爾 申請人:恩根尼公司