利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法
2023-12-09 05:57:31
專利名稱：利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法
技術領域：
本發明涉及植物育種領域，具體地，本發明涉及一種利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法。
背景技術：
人們早已發現各主要農作物的雜種優勢現象，並且將其廣泛用於玉米、高粱、水稻、油菜等農作物生產實際中。現有農作物雜種優勢的利用方式有較多缺陷，選育實用的優良組合難度大，影響了雜種優勢潛力的發揮。主要作物中小麥，棉花，大麥，大豆等幾乎還沒有利用雜種優勢。提高配合力，降低種子生產成本，提高強優組合的選育效率，是農作物雜種優勢利用研究的發展方向。
三系法是利用雜種優勢的重要途徑。雜交制種中的三系包括核質互作型雄性不育系，保持系和恢復系。在自然界中核質互作雄性不育類型非常豐富，植物進化過程中由於生殖隔離等原因，種間，亞種間，甚至品種間雜交等都能產生細胞質核互作雄性不育。一般來說，質的提供親本和核的提供親本遺傳距離小的不育細胞質，難找到保持系，它們的不育系大多敗育不徹底，難以得到利用。質的提供親本和核的提供親本遺傳距離大的不育細胞質，易找到完全不育保持系，但一般難以恢復，配組欠自由。有很多不育細胞質由於難找到完全恢復系，不能配出結實正常組合，沒能得到利用。如普通小麥T型核質互作型雄性不育系，儘管它們敗育徹底，不育系容易選育。
影響核質互作型雄性不育性育性恢復的基因有主效恢復基因和次要恢復基因。水稻野敗核質互作型雄性不育系的主效恢復基因有兩個，T S Bharaj將它們定位於水稻第7和第10染色體上。恢復系中，主效基因和次要恢復基因共同作用能夠使核質互作型雄性不育系育性恢復為可育。缺乏次要恢復基因或者次要恢復基因作用弱的恢復系的育性恢復能力差。
核質互作型雄性不育系是目前水稻雜種優勢利用的主要遺傳工具。所配雜交水稻在中國種植面積接近水稻種植面積的50％。對水稻核質互作型雄性不育系的基本要求是不育性穩定，敗育徹底，受環境條件影響小，花粉不育度＞99.5％；開花習性良好，柱頭大而外露，張穎角度大、時間長，花時集中；一般配合力強；株葉型好，抗性和米質好。目前可利用的優良的水稻核質互作型雄性不育系有限，不育系間遺傳差異小，類型相似。難以將存在於各種水稻核質互作型雄性不育系中的優良性狀綜合在一起，導致現有優良雜交水稻組合的產量，適應性、抗病蟲性、稻米品質等不能滿足各地對水稻生產的不同要求。高產優質的雜交粳稻組合和適合長江流域作雙季早稻的早中熟組合較缺乏。
核質互作型雄性不育導致不育系開花習性變差，花時推遲，許多不開穎、時間分散，花時不集中，柱頭活力下降。敗育程度越高，則開花習性越差，而且更難恢復。敗育不徹底的不育系開花習性影響較小，一般表現開花較早，花時集中，開穎好，相對容易恢復。生產上，敗育不徹底的核質互作型雄性不育系II-32A、協青早A、川香29A等都具有優良的開花習性。協調不育系不育穩定性、開花習性、和可恢復性是水稻核質互作型雄性不育系選育的一個主要問題。
生產上一個優良核質互作型雄性不育系由於繁殖面積大，其保持系容易流失，育種單位的智慧財產權難以保護，不育系繁殖的保密工作也非常重要。
我們的在研究中發現，水稻野敗核質互作型雄性不育系做母本與恢復系雜交，後代中的完全可育株系的育性恢復能力一般僅表現為部分恢復，或者完全無恢復能力，這種「同質恢法」選育恢復系效果不佳；某些與水稻野敗核質互作型雄性不育系雜交產生完全不育F1的親本，並不是保持系，用這種傳統的鑑定保持系的方法是不準確的，將這些親本的細胞核完全回交到不育細胞質中，後代表現為完全雄性可育。我們進一步發現上述現象是由於許多次要恢復基因的遺傳表現隱性、不完全隱性；次要恢復基因在純合狀態下的效應高於雜合狀態下的效應的結果。雜合的次要恢復基因可能不表達或者對提高花粉可育度作用很小；純合的次要恢復基因具有顯著提高花粉可育度的作用。
發明內容
本發明的發明人為了解決目前雜種優勢利用中存在的核質互作型雄性不育系可恢復性欠佳，異交習性欠理想，雜交種花粉可育度較低以及結實受環境影響較大，和不育系的保密問題而提出並完成本發明。
本發明的目的是提供一種利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法。
根據本發明的利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種方法包括以下步驟1)選取核質互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢復系R；2)製備保持系B的具有次要恢復基因的近等基因系B』；3)A與B』雜交，並鑑定出完全雄性不育的A/B』F1；4)利用完全雄性不育的A/B』F1作為母本與恢復系R雜交制種，生產A/B』//R F1雜交作物種子。
進一步，根據本發明的利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法包括以下步驟1)選取核質互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢復系R；
2)製備保持系B的具有次要恢復基因的近等基因系B』；3)製備B』的近等基因系B」，其中，B』和B」具有不同的次要恢復基因，主要差別在於次要恢復基因在染色體上的位置不同；4)A與B』雜交，然後A/B』再與B」雜交，並鑑定出完全雄性不育的A/B』//B」F1；5)利用完全雄性不育的A/B』//B」F1作為母本與恢復系R雜交制種，生產A/B』//B」///R F1雜交作物種子。
根據本發明的方法，其中，所述核質互作型雄性不育係為水稻核質互作型雄性不育系，優選豐源A、或湘8A、Caiapo A；或T型小麥核質互作型雄性不育系，優選小麥T753369A。
本發明根據核質互作型雄性不育系的許多次要恢復基因不表現為顯性；次要恢復基因純合能夠顯著提高花粉可育率；以及降低不育系A的敗育程度能夠提高不育系異交能力的原理，將不表現為顯性的次要恢復基因轉入保持系B中，育成保持系的具有次要恢復基因的近等基因系B』，A/B』(A與B』的雜交後代)作為雜交制種用的母本，與優良恢復系配R組為強優勢組合；並可用與B』的次要恢復基因不同的近等基因系B」與A/B』雜交，獲得A/B』//B」種子作為雜交制種用的母本，與優良恢復系R配組為強優勢組合供生產應用。其利用程序如下不育系A/保持系B-不育系A繁殖(A與B細胞核相同)不育系A/B』或不育系A/B』//B」-生產制種用不育系種子A/B』//R或A/B』//B」///R進行優良雜交組合制種，生產大田用雜交種子。
這些組合不降低A/B//R的雜種優勢，能夠保持A/B//R的F1群體農藝性狀，並且能夠達到異交習性大幅度改善，可恢復性提高，與恢復系配組的雜種F1可育程度提高，可育穩定性提高，不育系和保持系B能夠保密的目的。具體地，本發明所用的不育系A可以是各種不育性穩定的作物核質互作型雄性不育系，例如，野敗粳型水稻核質互作型雄性不育系，T型小麥核質互作型雄性不育系，野敗型秈型水稻核質互作型雄性不育系等。
本發明中B』和B」以及B基本相似，互為近等基因系。B』以及B」與B的關鍵差別在於，B』以及B」某些位點含有次要恢復基因。B』與B」的關鍵差別在於次要恢復基因位置不同。B』和B」以及B之間的差別一般不影響A與A/B』或A與A/B』//B」之間的相似性，不導致A/R與A/B』//R或A/R與A/B』//B」之間出現雜種優勢差異。
本發明應用的次要恢復基因是在雜合狀態下導致雄性可育的作用沒有或很小，雖然可降低不育系敗育程度，產生一定的可育花粉，但不表現出導致不育系產生自交結實的作用，而在純合條件下，其作用則能夠大幅度提高雄性不育系的花粉育性恢復程度，多不表現為顯性。
本發明所用的不育系A一般敗育徹底，不育性穩定，A/B』不育性株間整齊，A/B』和A/B』//B」的F1允許有少量可育花粉，但不自交結實。在雜合狀態下，本發明中次要恢復基因可允許的導致花粉可育程度高低由不同不育系的遺傳背景決定，最關鍵的指標要求是在生產制種中不導致自交結實。
用回交方法或者轉基因方法可將不表現為顯性的次要恢復基因轉入保持系B中，育成保持系B的具有次要恢復基因的近等基因系，作為B』或B」使用。
本發明可利用分子標記在具有次要恢復基因的分離群體中鑑定出次要恢復基因，找出恢復系或部分恢復系中位於作物不同染色體上的不表現為顯性的次要恢復基因。利用與其緊密連鎖的分子標記進行輔助選擇，將部分次要恢復基因回交轉入保持系中，育成保持系B』；另外用同樣辦法將其他位點的次要恢復基因也轉入保持系中，育成保持系B」。
強恢復系中含有主效恢復基因和次要恢復基因。本發明利用不育系A與強恢復系雜交，並用不育系A進行多次回交，各世代選擇高度可育的回交後代單株，這些高度可育的回交後代單株除帶有主效恢復基因外，還有次要恢復基因，其他遺傳成分與不育系A基本相同。利用這些回交後代單株作為父本，與保持系B雜交(換掉不育細胞質)，後代自交，遺傳穩定後，選留與保持系相似的具有不表現為顯性的次要恢復基因的後代株系。具體篩選方法可以是用這些後代株系作為父本以及輪迴親本，與不育系A測交並回交，進行鑑定。這些後代株系當選與不育系A的測交F1表現完全雄性不育，異交習性好，可恢復性好，並且與不育系A的回交F1表現育性分離(證明父本含有次要恢復基因)。確定最優的株系之一為B』。
用另外一個具有不表現為顯性的次要恢復基因的保持系的近等基因係為父本與A/B』F1雜交，鑑定出雄性不育、不導致自交結實、異交習性好和可恢復性好的復交F1的作為A/B』//B」使用，該父本作為B」使用。
利用不育系A與B』雜交或A/B』與B」雜交，生產種子供雜交制種用。進而利用A/B』和A/B』//B」與優良恢復系R配組強優勢組合用於生產。
本發明對A/B不育系繁殖實行嚴密控制。繁殖一畝，以供A/B』//R1萬畝制種；A/B』//B」///R100萬畝制種使用。實現對保持系B保密，從而實現對不育系的控制。
本發明的優點和積極效果如下擴大不育細胞質的利用範圍通過種間，亞種間或品種間雜交，細胞質和細胞核的互作能夠產生雄性不育，從而可以獲得新的雄性不育細胞質源。實踐中一些不育細胞質源難以找到完全恢復系，沒能得到利用，但它們一般敗育徹底，不育性穩定，配合力好。通過B』和B」的使用，能夠使不育系母本中，增加次要恢復基因，與恢復系雜交後，某些次要恢復基因能夠純合，而提高雜種可育度達到正常可育水平。這樣，所謂不能恢復的不育細胞質源也可能得以利用。
提高雜種F1的可育度完全恢復系中含有較多次要恢復基因，其中一些與B』和B」中的次要恢復基因等位，在雜交組合F1中表現純合，而能夠提高雜種育性。A/B//B』中，B』和B」中的次要恢復基因不同，減數分裂後，能夠比較均勻地分布到不育系群體中的各個個體中，與恢復系雜交配組，不但能夠提高雜交種的可育度，而且能夠使單株之間的可育度差異變小。生產上多數雜交水稻組合併沒有達到完全可育水平，育性程度低於常規品種，結實受環境影響大，利用本發明的方法製備的不育系與恢復系雜交，能夠提高雜交組合的育性水平，提高雜種在各種環境條件下的結實穩定性。T型核質互作型雄性不育系是雜交小麥生產中較好的不育類型，但其恢復源少，完全恢復所需要的恢復基因數目較多，由於恢復基因在純合和雜合時表現不一樣，選育優良恢復系有較大難度。在其不育母本中，加入雜合狀態的次要恢復基因，不致引起不育母本敗育不徹底，而在與恢復系雜交制種時，某些次要恢復基因能夠純合，而提高雜種育性，解決T型核質互作型雄性不育系難恢復問題，促進雜交小麥研究的成功。
提高不育系選育的效率一個好的不育系需具備不育性好，配合力好，開花習性優良，株葉型好，抗性和米質好等優點。理論上，只有當一個穩定的品系的細胞核完全被代換到不育細胞質中，才能準確了解開花習性是否優良以及這個品系是否是保持系。因此，在育種實踐中鑑定雜交後代單株的不育保持能力和開花習性事先沒有預見性，容易造成最後獲得的不育系敗育欠徹底或開花習性不好。優良核質互作型雄性不育系的選育難度大，效率較低。利用本發明，對不育系的要求降低，其可恢復性和異交習性可較差，而通過B』和B」的使用，解決不育系可恢復性和異交習性較差的問題，這樣，能夠使大量的配合力好，農藝性狀優良的不育系得到利用。
提高不育系異交能力雄性不育導致不育系開花習性變差，花時推遲，許多不開穎、開花時間分散，花時不集中，柱頭活力下降。敗育不徹底的不育系影響較小，一般表現開花較早，花時集中，開穎好。B』和B」中的次要恢復基因對改良不育系異交習性作用大，能夠從中選擇到異交習性非常優異的A/B』和A/B』//B」，協調好異交習性與不育性的關係。本發明的方法關鍵要求不育母本不自交結實，實踐表明，有時3％花粉可育度也不導致自交結實，異交習性則能夠得到顯著提高。例如絕大部分粳稻對野敗是保持的。但一般野敗粳稻核質互作型雄性不育系開花習性太差，不具實用性。利用本發明的方法能夠解決這一問題。通過B』和B」的使用，降低不育母本的敗育程度，能夠改善野敗粳稻核質互作型雄性不育系異交習性。
實現對親本不育系的嚴密控制過去核質互作型雄性不育系繁殖(A/B)時，由於面積大，容易流失保持系，對育種單位的研究成果難以保護，採用本發明，A/B繁殖一畝，可供A/B//B』100畝生產使用，可供A/B//B』///B」1萬畝生產使用，可供100萬畝A/B//B』///B」////R制種田使用，可供1億畝大田種植。即種植1億畝雜交作物，只需要A/B繁殖一畝，這樣，能夠很好地將B保密。採用A/B//B』///R方式，也僅需要A/B繁殖繁殖100畝。B也能夠很好地保密。只要B不流失，他人則無法生產不育系A。
提高雜種優勢水平父母本親源關係越遠，雜種優勢越強。但是一般與恢復系親源關係太遠的不育系難恢復，異交習性差。通過B』和B」的使用，能夠協調不育系不育穩定性、異交習性、和可恢復性的關係。所以與恢復系親源關係遠的不育母本能夠得到利用。這樣能夠擴大父母本親源關係，提高雜種優勢水平。如野敗粳稻核質互作型雄性不育系的利用，可以將秈型品種間雜交稻優勢提高到秈粳亞種間水平。
應用本發明的方法能夠解決目前雜種優勢利用中存在的核質互作型雄性不育系可恢復性欠佳，異交結實率低，雜交種可育度較低，結實受環境影響大的問題，改變由於不育系遺傳單一，生產上缺乏高產優質的雜交粳稻組合和適合長江流域作雙季早稻的早中熟組合，雜交中晚稻產量則呈現徘徊局面。有利於雜交水稻再一次飛躍發展。利用該發明有利於培育強優勢雜交小麥組合和其他強優勢雜交作物，形成我國具有自主智慧財產權的雜種優勢利用技術，保持我國在該領域的領先地位。它的廣泛應用，可能使作物雜種優勢利用更加普及，在今後糧食安全保障的建立中發揮重大作用。
具體實施例方式
本發明中所使用的各小麥或水稻品種均為市售可得的，並且均為育種領域中常規使用的品種。
實施例1豐源A/豐源B』//蜀恢527組合的製備不育系A豐源A，秈稻野敗核質互作型雄性不育系(雜交水稻，2006 21(1)51-53)；保持系B豐源B，細胞核與豐源A的相同。
恢復系R蜀恢527(雜交水稻，2004，19(4)12-14)次要恢復基因提供親本明恢63，野敗型秈稻強恢復系(作物研究，2004，18(4)26)
1)利用豐源A與明恢63雜交，並用豐源A回交，獲得豐源A//豐源A/明恢63的雜交種子。在F1群體中選擇結實高的單株，作父本用豐源A回交，獲得豐源A///豐源A//豐源A/明恢63雜交種子。
2)在豐源A///豐源A//豐源A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用豐源A回交，獲得豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63雜交種子。
3)在豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用豐源A回交，獲得豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63雜交種子。
4)在豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用豐源A回交，獲得豐源A//////豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63雜交種子。
5)在豐源A//////豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用豐源B回交，獲得豐源B///////豐源A//////豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63雜交種子。
6)在豐源B///////豐源A//////豐源A/////豐源A////豐源A///豐源A//豐源A/明恢63的F1(即BC6F1)群體中選擇性狀與豐源B完全相似的單株。在BC6F2中仍然選擇性狀與豐源B完全相似的單株，這些單株中，有較大部分含有主效恢復基因和次要恢復基因。BC6F2自交結實得到BC6F3，它們的次要恢復基因能夠繼續純合，選擇性狀整齊的BC6F3株系中的單株與豐源A測交。
豐源A/BC6F3的F1中，篩選保持完全不育(即該BC6F3不含有主效恢復基因和顯性次要恢復基因)、異交習性變優的組合，並當選該BC6F3株系，同時用豐源A/BC6F3的F1作母本與該株系回交，以及豐源A/BC6F3的F1作母本與恢復系蜀恢527雜交，如果上述回交F1育性發生分離，說明BC6F3株系含有不表現為顯性的次要恢復基因；如果與恢復系雜交的F1比豐源A/蜀恢527可育程度高以及可育性更加穩定，說明次要恢復基因的存在提高了雜種育性；當選作為雜交親本的BC6F3株系，在其中選擇單株作為豐源B』。
豐源A/豐源B』F1，在自然條件下表現完全不育，異交能力提高，與優良恢復系蜀恢527制種，制種產量較豐源A/蜀恢527提高31.3％。豐源A/豐源B』//蜀恢527F1自交結實率高，群體整齊，外形與豐源A/蜀恢527F1一致。受抽穗期低溫影響，豐源A/蜀恢527F1的自交結實率僅為76.8％，豐源A/豐源B』//蜀恢527F1自交結實率達到88.5％，提高了雜種結實穩定性。豐源A/豐源B』//蜀恢527F1產量較豐源A/蜀恢527提高了4.8％。
實施例2湘8A/湘8 B』//湘8B」///蜀恢527組合的製備協青早A是一個核質互作型水稻雄性不育系，零輪是一個具有次要恢復基因的水稻品系。我們發現，協青早A/零輪F1僅表現0.12％的花粉可育度，自交結實為0，將零輪細胞核完全回交到協青早A細胞質中，則表現為完全雄性可育。表明在雜合狀態下，零輪的次要恢復基因基本上不起雄性可育的作用，而在純合條件下，其作用則能夠導致完全雄性可育。
我們利用121個在染色體上比較均勻分布的SSR分子標記在232個協青早A/零輪///協青早A/零輪//零輪的雜種F1植株中，發現了零輪6個次要恢復基因，分布於第2、5、6、8、10、12染色體上，它們分別與SSR分子標記(Cornell大學植物育種系Susan McCouch實驗室)RM211、BM55、RM275、BM189、RM244、RM270緊密連鎖，將它們分別定名為Pf1、Pf2、Pf3、Pf4、Pf5、Pf6。這些次要恢復基因的遺傳表現隱性和不完全隱性。次要恢復基因純合後，提高花粉可育度的效應表現為極顯著。我們利用這6個分子標記進行輔助選擇，將零輪的次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3通過回交轉入湘8B中，育成湘8B』；將零輪的次要恢復基因Pf4、Pf5、Pf6也通過回交轉入湘8B中，育成湘8B」。過程如下。
不育系A秈稻野敗核質互作型雄性不育系湘8A(雜交水稻，2002，17(2)3)保持系B湘8B，細胞核與湘8A的相同恢復系R蜀恢527(雜交水稻，2004，19(4)12-14)次要恢復基因提供親本零輪(雜交水稻，1997，12(1)7-10)1)湘8B』的製備湘8B為母本與零輪雜交，獲得湘8B/零輪F1。
湘8B/零輪F1與湘8B回交，獲得湘8B/湘8B//零輪迴交群體BC1F1利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定BC1F1，選擇具有次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的單株作父本，再與湘8B雜交，獲得回交群體BC2F1。
利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定BC2F1，選擇具有次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的單株作父本，再與湘8B雜交，獲得回交群體BC3F1。
利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定BC3F1，選擇具有次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的單株作父本，再與湘8B雜交，獲得回交群體BC4F1。
利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定BC4F1，選擇具有次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的單株作父本，再與湘8B雜交，獲得回交群體BC5F1。
利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定BC5F1，選擇具有次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的單株作父本，再與湘8B雜交，獲得回交群體BC6F1，自交產生BC6F2。
在BC6F2中利用RM211、BM55、RM275分子標記鑑定，選擇具有純合次要恢復基因Pf1、Pf2、Pf3的性狀與湘8B完全相似的單株，自交產生BC6F3。BC6F3株係為父本與湘8A測交。當選保持完全不育，異交習性優良的測交F1。同時用該測交F1與恢復系雜交，如果與恢復系雜交的F1比湘8A/蜀恢527可育程度高以及可育性更加穩定，說明次要恢復基因的存在提高了雜種育性。當選作為雜交親本的BC6F3株系，在其中選擇單株作為湘8B』。同時測定湘8A/湘8B』//湘8B』F1不表現雄性不育。
2)湘8B」的製備採用上述同樣原理和程序，利用BM189、RM244、RM270分子標記，將Pf4、Pf5、Pf6次要恢復基因轉入湘8B中，育成湘8B」。同時測定湘8A/湘8B」//湘8B」的F1不表現雄性不育，湘8A/湘8B』//湘8B」F1，在自然條件下表現雄性不育，其異交能力和可恢復性均高於湘8A。與優良恢復系蜀恢527制種，制種產量較湘8A/蜀恢527提高22.4％。湘8A/湘8B』//湘8B」///蜀恢527F1自交結實率高，可育性穩定。湘8A/蜀恢527F1自交結實率僅為74.5％，湘8A/湘8B』//湘8B」///蜀恢527F1自交結實率達到91.5％，產量較湘8A/蜀恢527F1提高了6.2％。
實施例3 Caiapo A/CaiapoB』//CaiapoB」///廣親26窄早組合的製備不育系ACaiapo A。細胞核與Caiapo B的相同。Caiapo A是一個粳稻野敗核質互作雄性不育系，開花習性差，閉穎率達43％，開花遲，花時分散，不能夠用於商業制種。與廣親和恢復系廣親26窄早雜交，F1結實僅為67.3％。
保持系BCaiapoB，爪哇型粳稻品種。(Theoretical and Applied Genetics，2001，102(1)41-52)。
恢復系R廣親26窄早(雜交水稻，1996，7(6)4-7)次要恢復基因提供親本明恢63，野敗型秈稻強恢復系(作物研究，2004，18(4)26)1)Caiapo B』的製備
1)利用Caiapo A與明恢63雜交，並用Caiapo A回交，獲得Caiapo A//CaiapoA/明恢63的雜交種子。在F1群體中選擇結實高的單株，作父本用Caiapo A回交，獲得Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63雜交種子。
2)在Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用Caiapo A回交，獲得Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//CaiapoA/明恢63雜交種子。
3)在Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用Caiapo A回交，獲得Caiapo A/////Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//CaiapoA/明恢63雜交種子。
4)在Caiapo A/////Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用Caiapo B回交，獲得Caiapo B//////Caiapo A/////Caiapo A////Caiapo A///Caiapo A//Caiapo A/明恢63雜交種子。
5)在Caiapo B//////CaiapoA /////CaiapoA////CaiapoA///CaiapoA//CaiapoA/明恢63的F1(即BC5F1)群體中選擇性狀與CaiapoB完全相似的單株。在BC5F2中仍然選擇性狀與CaiapoB完全相似的單株，這些單株中，有較大部分含有主效恢復基因和次要恢復基因。BC5F2自交結實得到BC5F3，它們的次要恢復基因能夠繼續純合，選擇性狀整齊的BC5F3株系中的單株作為父本和輪迴親本與CaiapoA測交並回交。以及用CaiapoA/BC5F3的F1作母本與恢復系廣親26窄早雜交。這些BC5F3株系當選為與Caiapo B相似的具有不表現為顯性的次要恢復基因的近等基因系與Caiapo A的測交F1表現完全雄性不育，異交習性好，可恢復性好；並且與Caiapo A的回交F1表現育性分離(證明父本含有次要恢復基因)；並且與恢復系雜交的復交F1比CaiapoA/廣親26窄早F1可育程度高以及可育性更加穩定(說明次要恢復基因的存在提高了雜種育性)。確定一個優良的具有不表現為顯性的次要恢復基因的近等基因系作為B』。
2)Caiapo A的B」的製備用另外一個具有不表現為顯性的次要恢復基因的保持系的近等基因係為父本與Caiapo A/B』F1雜交，鑑定出雄性不育、不導致自交結實、異交習性好和可恢復性好的復交F1，該近等基因系作為Caiapo A的B」使用。
Caiapo A/Caiapo B』//Caiapo B」F1在自然條件下表現完全不育，異交習性改善，閉穎率僅17％，開花與恢復系基本同步，與恢復系廣親26窄早的制種異交率達到33.2％，制種產量較Caiapo A/廣親26窄早提高87.6％。CaiapoA/CaiapoB』//CaiapoB」///廣親26窄早雜種F1自交結實率高，達到83.4％。而Caiapo A/廣親26窄早F1自交結實率僅為67.3％。Caiapo A/Caiapo B』//CaiapoB」///廣親26窄早F1產量較Caiapo A/廣親26窄早F1提高了27.6％。
Caiapo A/ Caiapo B』//Caiapo B』F1和 Caiapo A/Caiapo B」//CaiapoB」F1不表現雄性不育，只要Caiapo B保密，可以實現對Caiapo A的控制。實施例4小麥T753369A/T753369B』//T恢7269-10組合的製備不育系AT753369A，(華北農學報，200419(4)21-23)小麥T型核質互作型雄性不育系T753369A是一個小麥T型核質互作型雄性不育系，性狀優良、配合力好，但是與恢復系T恢7269-10雜交，所配雜種結實不正常。
保持系BT753369B，細胞核與T753369A的相同。
恢復系RT恢7269-10(遺傳學報，2003，30(5)459-464)次要恢復基因提供親本原恢3號(核農學報，2000，14(1)1-5)1、T753369B』的製備
1)利用T753369 A與原恢3號雜交，並用T753369 A回交，獲得T753369A//T753369 A/原恢3號的雜交種子。在F1群體中選擇結實高的單株，作父本用T753369A回交，獲得T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號雜交種子。
2)在T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用T753369 A回交，獲得T753369 A////T753369 A///T753369A//T753369 A/原恢3號雜交種子。
3)在T753369A////T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用T753369 A回交，獲得T753369 A/////T753369A//// T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號雜交種子。
4)在T753369 A/////T753369 A////T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號的F1群體中選擇結實高的單株，作父本用T753369 B回交，獲得T753369B//////T753369 A/////T753369 A////T753369 A///T753369 A//T753369 A/原恢3號雜交種子。
5)在T753369 B//////T753369A/////T753369A////T753369A///T753369A//T753369A/原恢3號的F1(即BC5F1)群體中選擇性狀與T753369B完全相似的單株。在BC5F2中仍然選擇性狀與T753369B完全相似的單株，這些單株中，有較大部分含有主效恢復基因和次要恢復基因。BC5F2自交結實得到BC5F3，它們的次要恢復基因能夠繼續純合，選擇性狀整齊的BC5F3株系中的單株作為父本和輪迴親本與T753369A測交並回交。以及T753369A/BC5F3的F1作母本與恢復系T恢7269-10雜交。這些BC5F3株系當選為與T753369 B相似的具有不表現為顯性的次要恢復基因的近等基因系與T753369A的測交F1表現完全雄性不育；並且與T753369A的回交F1表現育性分離(證明父本含有次要恢復基因)；並且與恢復系T恢7269-10雜交的復交F1比T753369A/T恢7269-10 F1可育程度高以及可育性更加穩定(說明次要恢復基因的存在提高了雜種育性)。確定一個優良的具有不表現為顯性的次要恢復基因的近等基因系作為B』。
2、T753369B」的製備用另外一個具有不表現為顯性的次要恢復基因的保持系的近等基因係為父本與T753369A/B』F1雜交，鑑定出雄性不育、不導致自交結實和可恢復性好的復交F1，該近等基因系作為T753369A的B」使用。
T753369A/T753369B』//T753369 B」F1在自然條件下表現雄性不育，與恢復系T恢7269-10雜交，雜種F1結實率正常，達到90.4％，產量較T753369A/T恢7269-10F1提高了12.1％。而T753369A/T恢7269-10F1的自交結實率僅為73.9％。
權利要求
1.一種利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟1)選取核質互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢復系R；2)製備保持系B的具有次要恢復基因的近等基因系B』；3)A與B』雜交，並鑑定出完全雄性不育的A/B』F1；4)利用完全雄性不育的A/B』F1作為母本與恢復系R雜交制種，生產A/B』//R F1雜交作物種子。
2.一種利用核質互作型雄性不育系的次要恢復基因進行雜交作物育種的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟1)選取核質互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢復系R；2)製備保持系B的具有次要恢復基因的近等基因系B』；3)製備B』的近等基因系B」，其中，B』和B」具有不同的或者在染色體上的位置不同的次要恢復基因；4)A與B』雜交，然後A/B』再與B」雜交，並鑑定出完全雄性不育的A/B』//B」F1；5)利用完全雄性不育的A/B』//B」F1作為母本與恢復系R雜交制種，生產A/B』//B」///R F1雜交作物種子。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，通過回交方法或者轉基因方法製備B』或B」。
4.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述核質互作型雄性不育係為各種不育性穩定的作物核質互作型雄性不育系。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述水稻核質互作型雄性不育係為豐源A、或湘8A、Caiapo A。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述T型小麥核質互作型雄性不育係為小麥T753369A。
全文摘要
本發明提供了一種利用核質互作型雄性不育系次要恢復基因的雜交作物育種方法，該利用方法包括以下步驟1)選取核質互作型雄性不育系A、其保持系B、和恢復系R；2)製備雄性不育保持系B的的具有次要恢復基因的近等基因系B』或B」；3)鑑定出完全雄性不育的A/B』F
文檔編號A01H1/06GK101049082SQ20061007271
公開日2007年10月10日 申請日期2006年4月7日 優先權日2006年4月7日
發明者李新奇, 趙昌平, 袁隆平 申請人:湖南雜交水稻研究中心, 北京市農林科學院