用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法

2023-12-09 09:31:01 3

用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法
【專利摘要】本發明涉及一種有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法。該方法的具體步驟為：將幹擾家蠶CREB基因表達的靶序列與家蠶的U6啟動子插入pMD18T載體，構建適合在家蠶中表達的pMD18T-U6-shRNA質粒，將該質粒用脂質體轉染方法轉染家蠶卵巢細胞系（BmN）71～73小時後，用Westernblot方法檢測CREB蛋白表達量。用CREB基因的5』-GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT-3』構建的shRNA幹擾質粒能使的家蠶CREB蛋白的表達量下降50%以上。發明從技術層面為利用shRNA方法下調CREB基因表達提供了有效的靶點。
【專利說明】用shRNA有效幹擾家奮CREB基因表達的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用hsRNA( short hairpin RNA,短髮卡RNA)有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法。
【背景技術】
[0002]CREB(cAMP response element binding )蛋白是真核生物保守的轉錄因子之一。我們克隆了家蠶的CREB基因，家蠶CREB蛋白與真核生物CREB的同源性高，且家蠶CREB的表達與家蠶的滯育誘導相關。為了闡明家蠶CREB基因的表達參與家蠶滯育誘導的分子機制，我們利用家蠶BmN細胞系建立了用hsRNA方法下調家蠶CREB基因表達的技術體系。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在於提供一種用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，建立利用hsRNA下調家蠶CREB基因表達的技術體系。
[0004]為達到上述目的，本發明採用下述技術方案:
一種用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於:操作步驟如下:
(I)shRNA幹擾質粒載體構建:在家蠶CREB基因中選擇4個幹擾靶點，利用PCR技術，以家蠶U6啟動子為模板，根據選定的家蠶CREB靶點序列設計引物，合成U6-shRNA片段。將U6-shRNA片段連接到pMD18-T載體上，得到適合家蠶細胞中表達的pMD18-U6_shRNA質粒。
[0005](2)用脂質體轉染家蠶BmN細胞系:(i) BmN細胞系的培養:利用含10±0.2%FBS的TC-100培養液，280C ± I°C生化培養箱中培養。細胞培養至密度為IO6~IO7個/ml時傳代，BmN傳代周期約為6±0.1天；(ii)細胞轉染:轉染試劑採用Qiagen公司的Effectenetransfection kit,按說明書中推薦的方法進行轉染。即，將細胞鋪於24孔板內，每孔匯合率達90%以上，細胞數量約6~8X IO5個；鋪板12±0.5小時後，吸出培養基，向每孔中加入350μ 1±30μ I新鮮培養基，放回培養箱繼續培養；在滅菌的1.5ml離心管中將pMD18_U6_shRNA質粒與約55~60 μ I的EC buffer混合，再加入7~9 μ I enhancer並混勻，室溫靜置5±0.1min後再加入25±2 μ I Effectene並混勻，室溫靜置9~llmin，向離心管中加入350μ 1±30μ I新鮮培養基並混勻；將離心管中的混合液加入細胞中培養6h±0.5h後換新鮮培養基。
[0006](3)用Western blot檢測CREB蛋白表達量:(i)蛋白抽提:BmN細胞系轉染71-73小時後，吸去培養的BmN細胞系中的培養基，用PBS清洗細胞1-2次，向細胞中加100 μ I ± 10 μ I RIPA裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min後，離心12000土 100rpm, 30min±2min取上清,製備成蛋白樣品供分析；(ii) SDS-PAGE凝膠電泳:將製備的蛋白加入上樣緩衝液RSB， 用100°C ±10°C水煮沸5min±0.5min後，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品。用5±0.5%濃縮膠和12±0.2%分離膠電泳分離，上樣量為20 μ g /泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約3±0.1小時，至指示劑溴酚蘭至膠底邊即停止電泳；(iii)轉膜、雜交及顯影:將電泳膠上蛋白轉到PVDF膜，在用PBS配製成5±0.05%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉2±0.1小時；經CREB抗體作為一抗和相應的二抗反應後，用ECL試劑盒發光和X感光片感光約5-60秒(曝光時間根據發光強弱)。經顯影、定影和水洗後，晾乾；(iv)掃描與灰度定量分析:顯影后的X光片用掃描儀掃描，運用Bio-Rad公司Quantity One軟體對顯影的蛋白條帶進行定量分析。CREB表達量最低的幹擾質粒確定為最佳的幹擾祀點。
[0007]以上方法程序框圖見附圖1。
[0008]本發明與現有技術相比較，具有以下顯而易見的突出實質性特點和顯著技術進
`少:
本發明的創新之處在於找出利用shRNA方法下調家蠶CREB基因表達的有效靶點(5，-GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』)，使家蠶CREB蛋白表達量下調50%以上(結果見附圖2)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是本發明的操作程序框圖。
[0010]圖2是ShRNA對BmN細胞系CREB的下調作用示圖。(圖中:圖A是Western blot結果，CREB為細胞系CREB蛋白表達量，Actin為內參。I為對照組(用綠色螢光蛋白基因為靶標構建的shRNA質粒轉染家蠶BmN細胞系)，2為處理組(用家蠶CREB基因靶標序列5』 -GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』構建的shRNA質粒轉染家蠶BmN細胞系);圖B是圖A灰度分析結果，用CREB/Actin的相對比值表示。
【具體實施方式】
[0011]本發明的優選實施例結合附圖詳述如下:
實施例一:
用ShRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於，操作步驟如下:
(1)shRNA幹擾質粒載體的構建；
(2)用脂質體轉染家蠶BmN細胞系；
(3)用Westernblot檢測CREB蛋白表達量。
[0012]實施例二:
本實施例與實施例一基本相同，特別之處如下:
所述步驟:(DshRNA幹擾質粒載體構建的具體操作方法:利用PCR技術，以家蠶U6啟動子為模板，根據選定的家蠶CREB幹擾片段5』 -GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』設計引物，合成U6-shRNA片段；將U6-shRNA片段連接到pMD18_T載體上，得到適合家蠶細胞中表達的pMD18-U6-shRNA質粒。(2)用脂質體轉染家蠶BmN細胞系的具體操作方法:(i)BmN細胞系的培養:利用含10±0.2%FBS的TC-100培養液，28°C 土 1°C生化培養箱中培養。細胞培養至密度為IO6~IO7個/ml時傳代，BmN傳代周期約為6±0.1天；(ii)細胞轉染:轉染試劑採用Qiagen公司的Effectene transfection kit,按說明書中推薦的方法進行轉染。即，將細胞鋪於24孔板內，每孔匯合率達90%以上，細胞數量6~8 X IO5個；鋪板12±0.5小時後，吸出培養基，向每孔中加入350 μ I ±30 μ I新鮮培養基，放回培養箱繼續培養；在滅菌的1.51111離心管中將口]\?18州6-8111?應質粒與約55~6(^ I的EC buffer混合，再加入7~9 μ Ienhancer並混勻，室溫靜置5±0.Imin後再加入25±2 μ I Effectene並混勻，室溫靜置9"llmin,向離心管中加入350 μ 1±30μ I新鮮培養基並混勻；將離心管中的混合液加入細胞中培養6h±0.5h後換新鮮培養基。(3)用Western blot檢測CREB蛋白表達量的具體操作方法:(i)蛋白抽提:BmN細胞系轉染7廣73小時後，吸去培養的BmN細胞系中的培養基，用PBS清洗細胞1-2次，向細胞中加100 μ I ± 10 μ I RIPA裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min±3min後，離心12000±100 rpm, 30min±2min取上清，製備成蛋白樣品供分析；(ii)SDS-PAGE凝膠電泳:將製備的蛋白加入上樣緩衝液RSB，用100°C ±10°C水煮沸5min±0.5min後，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品。用5±0.5%濃縮膠和12±0.2%分尚膠電泳分尚，上樣量為20 μ g /泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V,分尚膠為100V,電泳時間約3±0.1小時，至指示劑溴酚蘭至膠底邊即停止電泳；(iii)轉膜、雜交及顯影:將電泳膠上蛋白轉到PVDF膜，在用PBS配製成5 土0.05%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉2 ±0.1小時45CREB抗體作為一抗和相應的二抗反應後，用ECL試劑盒發光和X感光片感光約5~60秒，曝光時間根據發光強弱而定；經顯影、定影和水洗後，晾乾；(iv)掃描與灰度定量分析:顯影后的X光片用掃描儀掃描，運用Bio-Rad公司Quantity One軟體,對顯影的蛋白條帶進行定量分析。
[0013]實施例三:
參見圖1和圖2。
[0014]本用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，操作步驟如下:
1.shRNA幹擾質粒載體構建的操作方法:利用PCR技術，以家蠶U6啟動子為模板，根據選定的家蠶CREB幹擾片段5』 -GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』設計引物，合成U6_shRNA片段。將U6-shRNA片段連接到pMD18-T載體上，得到適合家蠶細胞中表達的pMD18-U6_shRNA質粒。
[0015]2.用脂質體轉染家蠶BmN細胞系的操作方法:(i) BmN細胞系的培養:利用含10±0.2%FBS的TC-100培養液，28°C `土 1°C生化培養箱中培養。細胞培養至密度為IO6~IO7個/ml時傳代，BmN傳代周期約為6±0.1天；(ii)細胞轉染:轉染試劑採用Qiagen公司的Effectene transfection kit,按說明書中推薦的方法進行轉染。即，將細胞鋪於24孔板內，每孔匯合率達90%以上，細胞數量約6~8X105個；鋪板12±0.5小時後，吸出培養基，向每孔中加入350 μ I ±30 μ I新鮮培養基，放回培養箱繼續培養；在滅菌的1.5ml離心管中將pMD18-U6-shRNA質粒與約55~60 μ I的EC buffer混合，再加入7~9 μ I enhancer並混勻，室溫靜置5±0.1min後再加入25±2μ I Effectene並混勻，室溫靜置lOmin，向離心管中加入350μ 1±30μ I新鮮培養基並混勻；將離心管中的混合液加入細胞中培養6h±0.5h後換新鮮培養基。
[0016]3.用Western blot檢測CREB蛋白表達量的操作方法:(i)蛋白抽提:BmN細胞系轉染7廣73小時後，吸去培養的BmN細胞系中的培養基，用PBS清洗細胞1_2次，向細胞中加100μ 1±10μ I RIPA裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min±3min後，離心12000±100 rpm, 30min±2min取上清，製備成蛋白樣品供分析；(ii) SDS-PAGE凝膠電泳:將製備的蛋白加入上樣緩衝液(RSB)，用100°C ±10°C水煮沸5min±0.5min後，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品。用5±0.5%濃縮膠和12±0.2%分離膠電泳分離，上樣量為20μ g /泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約3±0.1小時，至指示劑溴酚蘭至膠底邊即停止電泳；(iii)轉膜、雜交及顯影:將電泳膠上蛋白轉到PVDF膜，在用PBS配製成5±0.05%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉2±0.1小時；經CREB抗體作為一抗和相應的二抗反應後，用ECL試劑盒發光和X感光片感光約5-60秒(曝光時間根據發光強弱)。經顯影、定影和水洗後，晾乾；(iv)掃描與灰度定量分析:顯影后的X光片用掃描儀掃描，運用Bio-Rad公司Quantity One軟體,對顯影的蛋白條帶進行定量分析。
[0017]結果表明，利用5』 -GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』靶標序列建立的pMD18-U6-shRNA質粒幹擾效率達50%以上。
【權利要求】
1.一種用ShRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於，操作步驟如下: (1)shRNA幹擾質粒載體的構建； (2)用脂質體轉染家蠶BmN細胞系； (3)用Westernblot檢測CREB蛋白表達量。
2.根據權利要求1所述用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於:所述步驟:(I) shRNA幹擾質粒載體構建的具體操作方法:利用PCR技術，以家蠶U6啟動子為模板，根據選定的家蠶CREB幹擾片段5』 -GGTGCAGTCTGTTATTCAACCT -3』設計引物，合成U6-shRNA片段；將U6-shRNA片段連接到pMD18_T載體上，得到適合家蠶細胞中表達的pMD18-U6-shRNA 質粒。
3.根據權利要求1所述用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於:所述步驟(2)用脂質體轉染家蠶BmN細胞系的具體操作方法:(i) BmN細胞系的培養:利用含10±0.2%FBS的TC-100培養液，28°C ±1°C生化培養箱中培養；細胞培養至密度為IO6~IO7個/ml時傳代，BmN傳代周期約為6±0.1天；(ii)細胞轉染:轉染試劑採用Qiagen公司的Effectene transfection kit,按說明書中推薦的方法進行轉染；即，將細胞鋪於24孔板內，每孔匯合率達90%以上，細胞數量6~8 X IO5個；鋪板12±0.5小時後，吸出培養基，向每孔中加入350 μ I ±30 μ I新鮮培養基，放回培養箱繼續培養；在滅菌的1.5ml離心管中將pMD18_U6_shRNA質粒與約55~60 μ I的EC buffer混合，再加入7~9 μ I enhancer並混勻，室溫靜置5±0.1min後再 加入25±2 μ I Effectene並混勻，室溫靜置9~llmin，向離心管中加入350 μ 1±30 μ I新鮮培養基並混勻；將離心管中的混合液加入細胞中培養6h±0.5h後換新鮮培養基。
4.根據權利要求1所述用shRNA有效幹擾家蠶CREB基因表達的方法，其特徵在於:所述步驟(3)用Western blot檢測CREB蛋白表達量的具體操作方法:(i)蛋白抽提:BmN細胞系轉染7f73小時後，吸去培養的BmN細胞系中的培養基，用PBS清洗細胞1_2次，向細胞中加100μ 1±10μ I RIPA裂解液，收集細胞至1.5ml管中，冰上靜置30min±3min後，離心12000± 100 rpm, 30min±2min取上清，製備成蛋白樣品供分析；(ii) SDS-PAGE凝膠電泳:將製備的蛋白加入上樣緩衝液RSB，用100°C ±10°C水煮沸5min±0.5min後，立即移入冰上冷卻，作為電泳的上樣樣品；用5±0.5%濃縮膠和12±0.2%分離膠電泳分離,上樣量為20μ g /泳道，電泳電壓，濃縮膠為70V，分離膠為100V，電泳時間約3±0.1小時，至指示劑溴酚蘭至膠底邊即停止電泳；(iii)轉膜、雜交及顯影:將電泳膠上蛋白轉到PVDF膜，在用PBS配製成5±0.05%的脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉2±0.1小時；經CREB抗體作為一抗和相應的二抗反應後，用ECL試劑盒發光和X感光片感光約5~60秒，曝光時間根據發光強弱而定；經顯影、定影和水洗後，晾乾；(iv)掃描與灰度定量分析:顯影后的X光片用掃描儀掃描，運用Bio-Rad公司Quantity One軟體,對顯影的蛋白條帶進行定量分析。
【文檔編號】C12N15/113GK103757052SQ201410000451
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月2日 優先權日:2014年1月2日
【發明者】宋紅生, 張鴻雁, 樊宗標, 杜騰飛, 黃延旺, 趙怡姣, 潮夢凌 申請人:上海大學