胸骨切開術後促進胸骨癒合的方法
2023-12-08 23:31:26 2
專利名稱：胸骨切開術後促進胸骨癒合的方法
技術領域：
本發明涉及一種使用含有血管發生因子的活性劑在諸如心臟直視手術或冠狀動脈手術這樣的手術中的胸骨切開術(即切開接近心臟的胸骨)後促進胸骨癒合的方法，所述的胸骨切開術包括取出至少一條胸廓內動脈(下文有時稱作「ITA」)的胸骨切開術。
背景技術：
在大多數情況下，胸骨切開術在對諸如冠心病這樣的各型心臟病實施手術的過程中始終是必不可少的，所述的冠心病包括心肌梗塞及其人工引起的併發症、心臟瓣膜病、主動脈病和先天性心臟病。然而，使胸骨癒合需要時間且有時不能充分癒合。
胸骨癒合緩慢或不良癒合是胸骨切開術後進行心臟手術的難題之一。癒合緩慢延長了患者的住院時間且顯著增加了健康護理成本並延緩了患者重返工作崗位或社會活動。胸骨不良癒合是通過胸骨切開進行的心臟手術後的嚴重問題之一且通常導致胸骨傷口的深度感染，儘管加強了昂貴的護理，但是這種感染仍然會使死亡率和發病率增加。目前的研究記載了胸骨不良癒合的危害因素如下肥胖、慢性阻塞性肺病(諸如慢性支氣管炎或肺氣腫)、老齡化、外周血管疾病、重複手術、糖尿病、應用胸廓內動脈(ITA)導管、手術時間、心輸出量降低、人工換氣時間和出血用再探查。因上述危害因素而使患者數量增加且胸骨癒合緩慢/不良癒合甚至成為更嚴重的問題。胸骨癒合緩慢/不良癒合通常限制了兩側胸廓內動脈(下文有時稱作「BITA」)在冠狀動脈分流術、尤其是證實得益於BITA移植術的糖尿病患者的心臟中進行的冠狀動脈分流術中的應用，這是因為糖尿病患者通常發展為胸骨壞死(即胸骨死亡)、特別是在取出BITA後(即以便製成心臟用移植物)因缺乏供血的胸骨壞死。
已經報導了鹼性成纖維細胞生長因子(下文有時稱作「bFGF」)不僅是一種強血管發生(即生成新血管並增加對胸骨的供血量)促分裂原、而且還可以刺激骨形成。諸如aFGF、VEGF、TGFβ這樣的其它生長因子在通過其血管發生作用促進胸骨癒合方面具有不同程度的有益作用。
本發明人中的某些人已經在EP-A-0 493 737中提出了含有bFGF的活性劑在治療骨疾病中的用途且在EP-A-0 702 959中提出了含有bFGF的交聯明膠的凝膠製劑。即本發明人中的某些人已經在EP-A-0 493 737中提出了使用含有bFGF的活性劑治療骨疾病且在EP-A-0 702 959中提出了含有bFGF的交聯明膠的凝膠製劑。在EP-A-0 493 737中，一種新型的活性劑用於治療骨疾病，諸如各種創傷性骨折、各種疲勞骨折、病理性骨折，包括伴隨骨質疏鬆、骨軟化症、惡性腫瘤、多發性骨髓瘤等的骨折；伴隨如上所述的各種疾病的骨強度的降低；和伴隨如上所述的各種疾病的骨形成的抑制。在EP-A-0 702 959中公開了一種增加血紅蛋白濃度的作用、增加骨礦物含量的作用等。他們已經證實混入了bFGF的明膠的水凝膠可在體內促進血管發生作用和骨再生。
此外，本發明人中的某些人已經在《神經外科學雜誌》(J.Neurosurg.)第86卷第871-875頁(1997)中報導了使用家兔模型進行的在可生物降解的水凝膠中混入的bFGF在頭顱骨再生中的潛在作用且在《生物物質》(Biomaterials)第19卷第807-815頁(1998)中報導了使用與可生物降解的水凝膠複合的bFGF對頭顱骨缺陷實施在臨床上被認為幾乎是不可能的骨再生。然而，在上述參考文獻中，沒有記載有關在包括取出ITA的胸骨切開術在內的胸骨切開術後使胸骨癒合的信息。胸骨具有與頭顱骨或長骨不同的形狀和供血量(即不同的供血動脈)；在胸骨切開術(即幾乎始終是縱切而非橫切)後這種差異更為明顯。
發明概述本發明的一個目的是提供一種在包括取出BITA的胸骨切開術在內的胸骨切開術後促進胸骨癒合的方法，該方法可以縮短患者的住院時間並可以減少與胸骨不良癒合相關的併發症且由此降低健康護理成本、有利於患者重返工作崗位並有助於提高他們的生產能力。本發明可以通過使用含有血管發生或骨發生因子的活性劑而使胸骨有效癒合。
在克服胸骨切開術後胸骨癒合緩慢或不良癒合的難題的嘗試中，本發明人已經開發了幾種如下所述的促進胸骨癒合的方法。簡單地說，本發明對胸骨或周圍的組織施用了一種或多種上述血管發生因子或其基因而用於促進血管發生，從而補償對胸骨的供血不足或幫助骨發生(即幫助生成胸骨的骨組織)以便使胸骨穩定和幫助胸骨癒合。
即本發明涉及一種在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後增強胸骨癒合或治療的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明還涉及一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的的胸骨切開術後使胸骨處的骨再生的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明進一步涉及一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
此外，本發明涉及一種在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位的方法，該方法包括在胸骨切開術後應用一種用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
此外，本發明涉及一種在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療的活性劑，所述的促進胸骨癒合或治療通過在胸骨切開術後施用用於治療胸骨的該活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明還涉及一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使骨再生的活性劑，所述的使骨再生通過在胸骨切開術後施用用於治療胸骨的該活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明進一步涉及一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化的活性劑，所述的使胸骨周圍血管化通過在胸骨切開術後施用用於治療胸骨的該活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
此外，本發明涉及一種在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位的活性劑，所述的治療過程通過在胸骨切開術後施用用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
此外，本發明涉及一種活性劑在取出或不取出至少一條胸廓動脈的胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療中的用途，其通過在胸骨切開術後施用用於治療胸骨的該活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明還涉及一種活性劑在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使骨再生中的用途，其通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
本發明進一步涉及一種活性劑在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化中的用途，其通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
此外，本發明涉及一種活性劑在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位中的用途，所述的用途通過在胸骨切開術後施用一種用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
附圖簡述附
圖1是表示三組中與手術前水平相比胸骨周圍的血流量；附圖2A-2C是手術後4周胸骨周圍的結締組織的顯微照片，其中附圖2A是A組(bFGF)、附圖2B是B組(對照組)且附圖2C是C組(假擬組)；附圖3是表示三組中胸骨周圍血管數量的比較的示意圖；附圖4A和4B是分別表示三組中骨礦物含量和骨礦物密度的比較的示意圖，其中A組是bFGF組、B組是對照組且C組是假擬組；附圖5是表示手術後2周或4周三組中新骨形成的面積的比較的示意圖。
附圖6A-6C是顯示手術後2周獲自胸骨的組織橫切面的示意圖，其中A組是bFGF組、B組是對照組且C組是假擬組；附圖7A-7C是顯示手術後4周獲自胸骨的組織橫切面的顯微照片，其中A組是bFGF組、B組是對照組且C組是假擬組；附圖8A和8B是顯示手術後4周獲自胸骨的骨閃爍圖的照片，其中A組是bFGF組且B組是對照組；附圖9是表示手術後4周兩組中從給予99mTc-MPD開始30分鐘和60分鐘後骨閃爍圖比較的示意圖；附圖10A和10B是顯示手術後4周胸骨的X光照片，其中A組是bFGF組且B組是對照組；且附圖11A和11B是表示手術後4周胸骨的骨量和骨密度的比較的示意圖，其中A組是bFGF組且B組是對照組。
優選實施方案的描述下文具體地描述本發明。
在本發明用於包括取出BITA的胸骨切開術在內的胸骨切開術後促進胸骨癒合的方法中，施用於胸骨或胸骨周圍的促進胸骨癒合的活性劑含有bFGF或某些其它血管發生因子，諸如鹼性成纖維細胞生長因子(下文有時稱作「bFGF」)、酸性成纖維細胞生長因子(下文有時稱作「aFGF」)、血管內皮生長因子(下文有時稱作「VEGF」)、組織生長因子-β(下文有時稱作「TGF3」)、肝細胞生長因子(下文有時稱作「HGF」)、骨形態發生蛋白(下文有時稱作「BMP」)、血小板衍生生長因子(下文有時稱作「PDGF」)、組織生長因子-α(下文有時稱作「TGFα」)、其它生長因子；和可以使用誘發血管發生和/或骨發生的蛋白質、核酸和基因。在這些血管發生因子中，從使胸骨癒合的角度來看，bFGF可能是最有效的，部分原因是bFGF既具有血管發生(即生成新血管並增加對血管的供血量)的作用又具有骨發生(即幫助生成胸骨的骨組織)的作用。然而，在某些諸如輕度的胸骨局部缺血等這樣的情況下也可以使用其它諸如VEGF等這樣的血管發生因子。
可以以包含諸如bFGF這樣的血管發生/骨發生因子、生理鹽水或其它常規助劑(葡萄糖、蔗糖、緩衝液等)的溶液、使用所述溶液的注射劑或噴霧劑、含有上述溶液的軟膏劑或包括水凝膠在內的凝膠的形式使用所述的血管發生/骨發生因子或其類似物。在它們中，本發明的活性劑特別優選的形式是水凝膠，這是因為這種凝膠在靶區域上停留數周並持續提供血管發生/骨發生因子至胸骨癒合為止。水凝膠的形狀可以是片狀、糊狀、顆粒狀、管狀、盤狀或微球體狀。本發明的活性劑可以採取局部或非局部的施用途徑，不過優選局部施用，因為局部施用對患者身體的其它部位幾乎沒有影響、更少的併發症的機會且對靶區域(即胸骨)的作用更為明顯。
當使用水凝膠形式的至少一種血管發生/骨發生因子時，通過分子間作用力使所述的血管發生/骨發生因子以物理方式固定入所述的水凝膠，且在體內伴隨該水凝膠(hydrogen)生物降解，血管發生/骨發生因子逐步釋放出來。作為物理方式的固定可提及的有例如離子鍵、配位鍵、疏水作用等。所述血管發生/骨發生因子的緩釋作用僅受水凝膠生物降解速率的控制，但不受因所述血管發生/骨發生因子單純擴散而導致的緩釋作用的控制。水凝膠的生物降解速率受到水凝膠中水含量的控制。當水分含量高時，水凝膠的生物降解速率提高，而當水分含量低時，水凝膠的生物降解速率下降，使得緩釋期延長。
當使用例如水凝膠形式的本發明活性劑時，可以通過將bFGF作為活性組分混入緩釋交聯的明膠凝膠的方式來製備它。對作為用於本發明的交聯明膠凝膠的原料的明膠凝膠沒有特別限制且可以選自一般獲得的明膠。明膠的實例可以包括例如鹼處理的具有約4.9等電點的明膠(獲自Nitta Gelatin Inc.，Japan)和酸處理的具有約9.0等電點的明膠(獲自NittaGelatin Inc.，Japan)。作為明膠，不僅可以使用一種類型的明膠，而且可以根據所用目的的不同而使用在諸如溶解度、分子量、等電點和材料方面不同的明膠的混合物。作為這類明膠，可以使用例如EP-A-0 702 959中記載的那些明膠。作為用於製備本發明水凝膠的其它物質，可以使用例如膠原蛋白、透明質酸、藻酸、澱粉、果膠、甲殼質、脫乙醯殼多糖或這些多糖類的衍生物。
本發明中使用的用於交聯明膠的交聯劑可以選自對活體無毒性的物質。對於這類交聯劑可以提及的例如有戊二醛；水溶性碳化二亞胺，諸如1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽和1-環己基-3-(2-嗎啉代乙基)碳化二亞胺-metho-對甲苯磺酸鹽、雙環氧化合物和福馬林。在它們中，特別優選戊二醛和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽。
通過熱處理或用紫外線照射可以使明膠交聯而獲得具有不同生物降解性的水凝膠。以明膠水凝膠片的總重為基準，明膠水凝膠片中的水分含量優選85％-99％(重量)、更優選90％-98％(重量)、特別優選92％-97(重量)。
在血管發生/骨發生因子中，如上所述，用作胸骨切開術後、尤其是採集BITA後用於促進胸骨癒合的活性劑的有效組分的bFGF是眾所周知的血管發生/骨發生因子或生長因子。例如，在EP-A-0 493 737中，且其存在在人、牛、小鼠、大鼠等中得到了證實。基本上，來自任意動物來源的bFGF在體內具有相同的活性。然而，在用於本發明在胸骨切開術後促進胸骨癒合的活性劑中，根據抗原性/骨發生性而優選使用與在人體中產生的bFGF(人bFGF)具有相同胺基酸序列的bFGF。除bFGF和上述血管發生/骨發生因子外，還可以使用如EP-A-0 493 737中所述的bFGF的類似物。
可以將本發明的活性劑施用於胸骨表面；作為骨蠟或膠的部分單獨施用於胸骨內側或施用於杆或釘或鉸鏈型裝置的表面；使之直接與肋骨或軟骨(即軟骨)或其連接處接觸；或施用於胸廓內動脈的床上。
在本發明中，特別可以提及幾種胸骨切開術後促進胸骨癒合的方法。
第一種方法是噴霧或塗抹(oint)至少一種血管發生因子/骨發生因子諸如bFGF、aFGF、TGFβ、VEGF、HGF、BMP、PDGF、TGFα、其它細胞因子或製備上述物質的基因到胸骨邊緣(和因冠狀動脈分流術而採集了ITA(s)的患者的ITA床)。
第二種方法是注射含有至少一種血管發生因子/骨發生因子諸如bFGF、aFGF、TGFβ、VEGF、HGF、BMP、PDGF、TGFα、其它細胞因子或製備上述物質的基因的溶液到胸骨邊緣或周圍組織(和因冠狀動脈分流術而採集了ITA(s)的患者的ITA床)。
第三種方法是使用我們開發的可生物降解的水凝膠，該水凝膠包含能夠使至少一種血管發生因子/骨發生因子諸如bFGF、aFGF、TGFβ、VEGF、HGF、BMP、PDGF、TGFα、其它細胞因子或製備上述物質的基因在作用部位釋放延長的時間期限的酸性明膠。可以將該水凝膠施用於胸骨的後(即內側)表面、也可以將該水凝膠施用於胸骨的前(即外側)表面；可以將該水凝膠施用於ITA(s)床以便恢復從胸壁對胸骨的供血。
第四種方法是插入含有至少一種血管發生因子/骨發生因子諸如bFGF、aFGF、TGFβ、VEGF、HGF、BMP、PDGF、TGFα、其它細胞因子或使上述物質的基因的材料到胸骨骨髓(即內部)。可以將這第四種方法與上述方法結合使用以便進一步促進胸骨癒合(即從內部和外部)。
本發明胸骨切開術後促進胸骨癒合的活性劑的有效劑量隨患者的疾病程度、年齡或健康狀況等的不同而改變。但就骨折的情況而言，作為有效組分的所述劑量一般在約0.1μg-10mg/胸骨切開部位的範圍。為了加速癒合，一般優選的施用途徑是給藥活性劑使其直接與胸骨切開部位接觸(1)從外側接觸(即在胸骨表面)；(2)從內側接觸(即在胸骨或胸骨骨髓內)；和(3)施用於ITA床上(即ITA及其蒂位於的區域)。
本發明的上述活性劑對胸骨切開術後使胸骨處的骨再生或胸骨切開術後使胸骨周圍血管化也是有效的。因此，為了使胸骨切開術後胸骨處的骨再生或胸骨切開術後使胸骨周圍血管化，可以對患者應用與如上所述相似的方法。實施例下文參照實施例描述本發明。實施例1對通過在大鼠中實施胸骨切開術並取出BITA後局部使用bFGF評價本發明在促進胸骨癒合中的作用。
通過鹼法使用Ca(OH)2從牛骨膠原蛋白(Nitta Gelatin Co.，Osaka，Japan)中分離具有4.9等電點的明膠。當通過凝膠過濾色譜法與聚乙二醇標準樣品對照測定時，該明膠的重均分子量為99000。具有9.6等電點的人重組bFGF由Kaken Pharmaceutical Co.，Tokyo，Japan提供。
(i)混有bFGF的明膠水凝膠片的製備在25℃下使10wt％的明膠水溶液以化學方式與不同量的戊二醛交聯而製備具有不同交聯度的片。簡單地說，將4.5ml含有戊二醛的明膠水溶液澆鑄入特氟隆(Teflon)塑模(5×5cm2，1.8mm深)。在25℃下持續12小時的交聯反應後，在37℃下將所得的水凝膠片浸入50mM甘氨酸水溶液中1小時以便使戊二醛的殘餘醛基封端；用雙蒸水、100％乙醇和高壓滅菌的雙蒸水衝洗以便獲得無菌的片。將它們凍幹、隨後用含有100μg的bFGF的水溶液浸漬而獲得混入了bFGF的明膠水凝膠。由此製備的水凝膠片為矩形(1×10mm)且厚度為0.7mm。所有實驗過程均在無菌條件下進行。
(ii)動物實驗給重300g-400g的15隻雄性Wistar大鼠在用乙醚麻醉後經口腔插管並給它們在體積循環的小動物通風器(Rodant通風器型號683，HARVARD，USA)上通風。在手術過程中使用1％-2％的異氟烷維持麻醉狀態。在仰臥位置上實施中線皮膚切開後，將兩側主要的胸肌與胸骨的連接處分隔開並暴露兩側的肋間肌。使用顯微衝擊儀謹慎實施中線胸骨切開術。使用骨蠟(NESTOR，Nippon Shoji，Japan)使骨髓中的出血停止。除用電凝固器破壞BITA外，還用6-0號聚丙烯縫合線將BITA的開始端與遠端分枝連接。放置混有bFGF的明膠水凝膠片(100μg/片)並用6-0號聚丙烯縫合線固定而不使BITA缺損。作為對照組，我們單獨實施中線胸骨切開術並以相同方式取出BITA。在施用正內呼吸壓使肺完全膨脹後，通過用4根胸骨周圍中斷的縫合線與4-0號Nespolene縫合線封閉胸骨。用4-0號尼龍單絲線仔細將肌層與皮膚縫合。在皮膚封閉後立即經肌內給予鏈黴素(50mg/大鼠)。
將15隻大鼠分成三組A組取出BITA並在中線胸骨切開術後將混有bFGF的明膠水凝膠片施用在胸骨上、B組僅取出BITA、C組具有完整的BITA(每組5隻動物)。將2隻因手術後心包內出血、2隻呼吸衰竭或1隻感染而死亡的5隻動物排除出本研究。在手術後4周通過靜脈內給予超劑量的戊巴比妥鈉處死大鼠。取出胸骨並用10wt％甲醛的PBS溶液固定4天以便評價骨再生的情況。
(iii)胸骨周圍血流量的測定在胸骨閉合後和手術後2或4周使用非接觸性雷射流量計(ALF21N，Advance，Tokyo，Japan)測定胸骨周圍的血流量。該裝置可瞬時測定毛細血管血液灌注參數(血流量、體積和速度)。在本研究中僅監測血流量並記錄(mL/分鐘/100g)。使雷射束通過光學纖維定向於具有3.0mm直徑的測定探頭。將該探頭放置在單獨接近胸骨的直線距離為10mm的肋間肌內，使得所研究的測定區域約為5mm直徑和1mm深度。然後將He-Ne光切換到二極體雷射(2mW，780nm)以便測定胸骨周圍的血流量，使用都卜勒位移計算血流量。所述探頭包括兩種光學纖維一種用於雷射照明，而另一種用於接收反射光和發散光。在獲得穩定的基線後記錄每次測定的三個讀數並取平均值。
(iv)血管發生的組織學評價統計用蘇木精-伊紅和氮烷染色的標本中的小動脈。從胸骨內側的胸骨周圍區域中隨機選擇5個區域(5mm×5mm)。我們通過使用目鏡測微尺(Olynpus，Tokyo，Japan)以×400放大倍數統計5個隨機選擇的單位面積(500μm×500μm)上的平均血管數量來估計每個5mm×5mm區域中的小動脈密度。統計25個單位面積(5個區域，每個區域中有5個單位面積)上血管的總數。
(v)骨形成的評價通過雙能量X射線吸收法(DEXA)和組織學檢查法評價血管周圍骨形成的情況。在對三組實施中線胸骨切開術後4周時通過DEXA、使用骨礦物分析儀(Dichroma Scan 600，Aloka Co.，Tokyo，Japan)測定血管周圍的骨礦物密度(BMD)。用虛擬的已知礦物含量校準儀器。以20mms-1的速度進行每次掃描且掃描長度為1mm。在每個實驗組中對限制到第三至第六肋骨的胸骨進行DEXA測定。
在4℃下使骨的樣本在10wt％ EDTA溶液中去礦化3天、包埋入石蠟並切成10μm厚度的切片。在手術後2和4周時製備切成分為4個等部分的胸骨的切片並用蘇木精-伊紅(HE)染色。使用帶有與圖象分析系統連接的圖象照相機的顯微鏡(SP-1000，Olympus，Tokyo，Japan)分析組織切片。以2×放大倍數測定每個切片中胸骨內新骨的面積。
(vi)統計學分析通過單向ANOVA分析全部數據以便評價實驗組之間的統計顯著性。將實驗結果表示為平均值±標準誤差。在95％的置信區間下與對照組進行顯著性檢驗。
(vii)胸骨周圍的血流量將結果概括在附圖1中。附圖1是每組中手術前後胸骨周圍的血流量的示意圖。在A組中(施用bFGF和水凝膠)，胸骨周圍的血流量大於B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠)中胸骨周圍的血流量。這一結果提示施用在胸骨後(即內側)表面和胸廓內動脈床上的含有bFGF的水凝膠有助於胸骨上/周圍的血管發生。手術前胸骨周圍的血流量(PBF)為8.6±0.6(平均值±SD)ml/分鐘/100g。儘管單獨進行中線胸骨切開術後的PBF沒有顯著改變，但是在取出BITA後該值被顯著降低至8.5±0.6ml/分鐘/100g。手術後4周時在A組、B組或C組中的PBF分別為9.7±1.2ml/分鐘/100g、6.5±0.6ml/分鐘/100g、8.2±0.5ml/分鐘/100g。在三組中觀察到了顯著性差異(p＜0.001)。
(viii)血管發生的組織學評價對胸骨周圍的血管發生進行的組織學研究證實了血管數量增加。在A組中胸骨周圍的毛細血管和小動脈(10-50μm直徑)比B組和C組中胸骨周圍的毛細血管和小動脈多(附圖2A-2C)。附圖2A、2B和2C顯示了手術後4周胸骨周圍的結締組織的顯微照片。在A組(施用bFGF和水凝膠)中，觀察到了大量血管發生(附圖2A)，而在B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠，附圖2B)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠，附圖2C)中幾乎沒有觀察到血管發生。這一結果強烈提示附圖1中觀察到的A組胸骨周圍血流量的增加是由血管發生導致的。附圖3表示三組中胸骨周圍小動脈和毛細血管/單位面積的數量。即附圖3表示各組中胸骨周圍的血管數量。在A組(施用bFGF和水凝膠)中的胸骨周圍的結締組織中觀察到了更大量的血管。另一方面，在B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠)中觀察到了顯著更少的血管數量。在A組中胸骨周圍小動脈和毛細血管/單位面積的數量明顯多於其它兩組(A組30.5±3.2，B組15.8±2.7，C組12.3±1.5血管/單位面積，p＜0.01)。
(ix)骨形成的評價附圖4A和4B分別表示不同手術後4周大鼠胸骨的BMC(骨礦物含量)和BMD(骨礦物密度)的測定結果。即附圖4表示各組中骨礦物含量(附圖4A)和骨礦物密度(附圖4B)。在A組(施用bFGF和水凝膠)中，骨礦物含量高於B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠)；這一結果提示A組的胸骨再生(即癒合)更多。在全部組中，骨礦物密度處於相同的水平；這一結果提示A組中已經再生出了具有正常質量的胸骨。
A組中的BMC為65.5±15.7mg，這一數值顯著高於B組和C組(B組47.6±6.4mg；C組41.3±17.5mg)。另一方面，在三組中BMD均沒有顯著改變(A組51.1±8.1mg/mm2；B組50.0±6.1mg/mm2；C組43.7±8.5mg/mm2)。
附圖5表示不同手術後2和4周所有組中胸骨的新骨形成面積的結果。附圖5表示手術後2周和4周新骨形成的面積。手術後2周，A組(施用bFGF和水凝膠)傾向於具有比B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠)形成更多的骨，且這種差異在2周後(即手術後4周)變得更大和更為顯著。手術後2周，A組的新骨形成面積傾向於大於B組和C組，而在三組中沒有顯著性差異(A組1.79±1.22mm2；B組0.87±0.70mm2；C組1.37±0.92mm2)。另一方面，A組在手術後4周新骨形成的面積顯著地大於其它兩組(A組5.13±2.82mm2；B組2.17±0.91mm2；C組2.01±0.89mm2)。
附圖6A-6C和7A-7C分別顯示了不同手術後2和4周胸骨的組織切片。即附圖6A、6B和6C是手術後2周來自胸骨橫切面的顯微照片。在A組(施用bFGF和水凝膠，附圖6A)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠，附圖6C)中，胸骨已經開始癒合。另一方面，在B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠，附圖6B)中胸骨沒有開始癒合。此外，附圖7A、7B和7C是手術後4周來自胸骨橫切面的顯微照片。在A組(施用bFGF和水凝膠)中，胸骨幾乎癒合完全且不存在胸骨的不良或過度癒合(附圖7A)。另一方面，在B組(對照組，不使用bFGF、也不使用水凝膠，附圖7B)和C組(假擬組，不使用bFGF、而使用水凝膠，附圖7C)中胸骨癒合不充分。手術後2周，在A組和C組中觀察到原始胸骨周圍出現一些軟骨骨化，而在B組中沒有觀察到這一現象。手術後4周，B組和C組在原始胸骨周圍出現部分軟骨骨化。相反，A組具有幾乎完全癒合的胸骨，其中充滿了再生的骨組織。
在本發明中，可以提供在包括取出BITA後的胸骨切開術在內的胸骨切開術後促進胸骨癒合的幾種方法。根據本實驗中獲得的數據，通過胸骨和周圍組織的血管發生並通過骨發生導致胸骨癒合得到促進；通過局部施用的血管發生/骨發生因子(例如在本實驗中是bFGF)既可以誘發血管發生也可以誘發骨發生。實施例2在小獵犬(beagle dog)中通過在實施胸骨切開術並取出BITA後局部使用bFGF評價本發明對促進胸骨癒合的作用。
(i)混有bFGF的明膠水凝膠片的製備按照與實施例1的(i)相同的方式，在25℃下使具有4.9等電點的鹼處理的明膠以化學方式與戊二醛交聯而製備無菌的片。將它們凍幹、隨後用含有100μg的bFGF的水溶液浸漬而獲得混入了bFGF的明膠水凝膠。由此製備的水凝膠片為矩形(1×10mm)且厚度為0.7mm。相應的水凝膠片的水分含量為95％。所有實驗過程均在無菌條件下進行。
(ii)動物實驗給重10kg-12kg的8隻小獵犬在用乙醚麻醉後經口腔插管並在仰臥位置上實施中線胸骨切開術，且使用電手術刀以有蒂方式將每條狗的兩側胸廓內動脈從原始位置上剝離至劍突炎的高度。將剝離的兩側胸廓內動脈完全分離並使用1-0號絲線在中側和邊側上切斷並取出。
將這8條狗分成2組A組取出BITA並在中線胸骨切開術後使混有bFGF的明膠水凝膠粘合在胸骨上，而B組僅取出BITA(每組4隻動物)。通過以化學方式使具有4.9等電點的鹼處理的明膠與戊二醛交聯來製備明膠水凝膠片。以明膠水凝膠片的總重為基準，該明膠水凝膠中含有的水分按重量計為95％。
(iii)骨形成的評價通過骨閃爍圖(使用亞甲基二膦酸鎝99；下文縮寫為「Tc-99-MDP」)、胸骨的X射線照相術和雙能量X射線吸收法(DEXA)評價血管周圍骨形成的情況。
(iv)骨閃爍圖的分析對手術4周後相應的狗經靜脈內給予Tc-99-MDP並在給藥60分鐘後拍攝狗的骨閃爍圖。結果如附圖8A(A組)和8B(B組)中所示。正如從這些照片中觀察到的，顯然可以認為A組中Tc-99-MDP在胸骨處的累積多於B組中Tc-99-MDP在胸骨處的累積。
此外，將胸骨分成三組作為有興趣的區(ROI)且基於作為參比區(ref-ROI)的前縱隔部分的計算相應區域中的陰影部分的比例以便進行定量評估。結果如附圖9中所示，在給予Tc-99-MDP 30分鐘後，A組為234.9±31.0％，而B組為176.2±39.0％；且在給予Tc-99-MDP 60分鐘後，A組為282.7±22.9％，而B組為174.2±27.2％。因此，在這些組中觀察到了顯著性差異(p＜0.001)。
(v)胸骨的X射線照相術通過X射線照相術來評價手術4周後胸骨周圍骨的再生情況。結果如附圖10A(A組)和10B(B組)中所示。
在A組中，可認為在所有部分中均有足夠的骨再生，而在B組中，存在許多骨再生不充分的部分且有些部分是部分分離的。
(vi)雙能量X射線吸收法(DEXA)為了定量地評價胸骨再生的情況，將具有0.1cm×1.0cm大小的有興趣的區(ROI)設在胸骨切口部分且通過使用DEXA測定該部分處的骨密度。測定部分是兩側胸骨內第一與第六肋之間的胸骨切口部分。結果如附圖11中所示。正如從附圖11中觀察到的，A組中骨的量為21.4±11.1mg，而B組中骨的量為8.6±7.4mg；且A組中骨的密度為125.8±70.5mg/mm2，而B組中骨的密度為66.7±44.3mg/mm2。因此，可以理解的是A組表現出顯著高於B組的數值，由此在這些組中觀察到了顯著性差異(p＜0.001)。
權利要求
1.一種在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨治療的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
2.權利要求1的方法，其中將所述的活性劑施用於胸骨表面或內側、施用於胸骨周圍的組織、施用於胸廓內動脈床或使其直接與肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位接觸。
3.權利要求1或2的方法，其中將所述的活性劑以溶液，生理鹽水或其它常用助劑，使用所述溶液的注射劑或噴霧劑，凝膠，骨蠟、膠或軟膏的形式施用於受損部位。
4.權利要求1-3中任意一項的方法，其中將所述的活性劑以水凝膠的形式施用於胸骨表面或內側、施用於胸骨周圍的組織或施用於胸廓內動脈床。
5.權利要求4的方法，其中所述的水凝膠是一種交聯的水凝膠，它包括鹼處理的具有約4.9等電點的明膠或酸處理的具有約9.0等電點的明膠和鹼性成纖維細胞生長因子和/或其類似物以及一種交聯劑。
6.權利要求1-5中任意一項的方法，其中所述的血管發生因子、骨發生因子或其類似物是選自下列成分組成的組的至少一種鹼性成纖維細胞生長因子；酸性成纖維細胞生長因子；血管內皮生長因子；組織生長因子-β；肝細胞生長因子；骨形態發生蛋白；血小板衍生生長因子；組織生長因子-α；細胞因子；誘發血管發生和骨發生中的至少一種的蛋白質、核酸和基因；及其類似物。
7.權利要求1-6中任意一項的方法，其中所述的血管發生因子、骨發生因子或其類似物是鹼性成纖維細胞生長因子或其類似物。
8.權利要求1-7中任意一項的方法，其中對受損部位給予約0.1μg-10mg/胸骨切開術部位的用量的所述有效組分。
9.一種在胸骨切開術或取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨處的骨再生的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
10.一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
11.一種在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位的方法，該方法包括在胸骨切開術後施用一種用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位的步驟，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
12.一種在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療胸骨的活性劑，所述的促進胸骨癒合或治療胸骨過程通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
13.一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使骨再生的活性劑，所述的使骨再生過程是通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
14.一種在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化的活性劑，所述的使胸骨周圍血管化通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
15.一種在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位的活性劑，所述的治療過程通過使胸骨切開術後施用一種用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
16.一種活性劑用於在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療胸骨中的用途，所述的用途通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
17.一種活性劑用於在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療胸骨中的用途，所述的用途通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
18.一種活性劑用於在胸骨切開術或在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後使胸骨周圍血管化的用途，所述的用途通過在胸骨切開術後施用該用於治療胸骨的活性劑到該胸骨或其周圍來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
19.一種活性劑在取出或不取出至少一條胸廓內動脈的胸骨切開術後治療骨折部位中的用途，所述的用途通過在胸骨切開術後施用一種用於治療骨折部位的活性劑使其直接接觸肋骨或軟骨或其連接處的骨折部位來進行，其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物組成的組的至少一種作為有效組分。
全文摘要
本發明公開了一種在取出或不取出至少一條胸動脈的胸骨切開術後促進胸骨治療的方法,該方法包括在胸骨切開術後向該胸骨或在該胸骨周圍施用一種用於治療胸骨的活性劑的步驟,其中所述的活性劑包括選自血管發生因子、骨發生因子及其類似物諸如bFGF、aFGF、TGFβ、VEGF、HGF、BMP、PDGF、TGFα,其它細胞因子或基因的至少一種作為有效組分和一種用於該方法的活性劑;一種胸骨切開術後促進胸骨癒合或治療的包括上述活性組分的活性劑和該活性劑的用途。
文檔編號A61K38/22GK1382058SQ00813621
公開日2002年11月27日 申請日期2000年9月29日 優先權日1999年9月30日
發明者米田正始, 田畑泰彥 申請人:科研製藥株式會社, 米田正始, 田畑泰彥