一種融合基因片段rolB-FGFs及應用的製作方法

2023-12-09 08:43:36 1

專利名稱：：一種融合基因片段rolB-FGFs及應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物領域，確切地說一種融合基因片段rolB-FGFs及應用。
背景技術：
：FGFs(fibroblastgrowthfactors)，在細胞的增值、變異和正常的生長上都是有效的調節劑，它參與病理中腫瘤的處理和轉移(Gaizie，etal，Biochem，CellBiol，1997，75:669)。FGFs具有廣泛的生物學活性，它來源於神經組織、垂體、腎上腺皮質、視網膜、黃體和胎盤等，能剌激所有源自中胚層的細胞以及許多源自神經外胚層和內胚層細胞的增生。在體內，FGFs對內皮細胞有趨化和促有絲分裂作用，促進血管形成；參與細胞過度增生和血管過度形成所引起的多種病理損害。FGFs被認為是剌激血管細胞增殖、遷移和分化的第一分子，是典型的血管生長因子。FGFs具有廣泛的生物學效應。研究發現，FGFs對體外培養的成纖維細胞有促有絲分裂作用。FGFs參與創傷修復，可能是誘發毛細血管內皮細胞增殖，剌激內皮細胞遷移，誘發新毛細血管生長，增加毛細血管網絡.使損傷組織血管化。FGFs還可促進成纖維細胞生長、增殖，促進皮膚再生。迄今為止，至少已經知道23個FGF家族的成員，其中aFGF和bFGF是FGF家族的典型成員，研究的比較成熟，但目前FGF家族的成員大多是通過原核系統或部分真核系統表達出來的，幾乎很少通過植物系統表達，尤其是植物髮狀根系統。近幾年來，利用植物生物反應器表達生產具有臨床應用價值的藥用蛋白(包括疫苗、抗體)已成為生物製藥產業的熱點領域，具有極大的市場前景和商業價值，日益引起人們的關注.但植物生物反應器在研究的過程中，逐步發現許多問題，如蛋白產量低、下遊加工(目的蛋白的提取純化)困難以及由此而引起的高成本等.因此，結合植物自身結構特點，發展植物髮狀根表達系統，不但可以提高植物本身的次生代謝產物含量，同時可以省略下遊加工過程，利於產業化開發，因此本發明採用植物髮狀根系統生產FGFs蛋白，這將結合醫藥與食品領域，開發出功能性食品與藥品的一條重要途徑。利用分泌途徑可以有效地提高外源蛋白的表達量。一般真核生物分泌蛋白N端都有信號肽序列，引導蛋白定位於內質網膜，經高爾基體加工後，運送到細胞的各個部位。在利用生物反應器表達外源蛋白的時候，外源蛋白可以在信號肽的引導下到達細胞的特定部位，或分泌到細胞外，這樣可以避免宿主細胞把外源蛋白視為異己蛋白而降解，從而提高了外源蛋白的表達量。應用信號肽引導外源蛋白分泌表達也是近年來的研究熱點。轉基因植物中標記基因的安全性從一開始就受到了廣泛爭論。人們擔心在轉基因作物的商品化種植過程中，除草劑基因可能經自然雜交，抗生素基因可能通過轉染腸道細菌，從而造成自然界的非轉基因作物對除草劑、人類對抗生素產生抗性。近年來，人們開始採用一種新型的正篩選方法——甘露糖篩選體系。該體系以大腸桿菌磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因為標記基因，甘露糖為篩選劑進行篩選。目前，PMI/甘露糖篩選體系已成功用於甜菜、擬南芥、玉米、小麥、水稻、木薯等植物。實驗證明，髮狀根具有細胞培養和一般器官培養所不能兼備的特點，幾乎所有雙子葉植物中由根部合成的次生代謝物質都可以通過髮狀根來生產，這一生物技術為植物有用成分的大量生產提供了新的途徑，日益引起人們的關注。髮狀根培養是20世紀80年代發展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項技術，它將髮根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri質粒中的T-DNA整合到植物細胞的DNA上，誘導植物細胞產生髮狀根。髮狀根培養是獲得有用次生代謝產物的重要途徑。對於任何一種類型的髮根農桿菌而言，其菌體內部存在著大小各異的3種質體，例如在A4菌株的菌體內，存在著pRiA4a、pRiA4b和pRiA4c3中質粒，其中pRiA4b質粒與髮狀根的誘發有關，它的物理結構見圖1。從圖l可以看出，農杆鹼型Ri質粒有兩個T-DNA區，即TfDNA和TfDNA，這兩段T-DNA之間隔著一段15kb的非轉移DNA。TfDNA大小為1920kb，包括4個與髮狀根形態發生有關的位點rolA、B、C、D，rolA基因在營養階段和生殖階段表達強烈，而在種子中不表達。rolB基因是形成毛狀根的關鍵基因，其表達引起植株產生大量的毛狀根。rolB基因主要限於在分生組織的原始細胞和韌皮部的薄壁組織細胞表達。rolC基因在菸草中表達導致植株變矮、頂端優勢減弱、葉片色素含量下降、雄性不育。自1973年Ackema皿首次報導了髮根農桿菌轉化高等植物以來，迄今為止已經有160多種植物成功地利用Ri質粒進行了轉化。90年代以來，培養珍貴藥用植物髮狀根以獲取次生代謝產物成為研究熱點。由於髮狀根能夠合成其他培養細胞或組織難於合成的植物次生代謝物，人們已將髮狀根培養系統用於藥用植物次生代謝產物生產的研究。周立剛對露水草誘導髮狀根並獲得髮狀根培養物，這是髮狀根誘導在單子葉植物中的一個成功先例(植物研究，1996，18(3):336)。據報導，目前利用髮狀根農桿菌浸染獲得轉化植株或髮狀根的植物，主要集中在雙子葉植物30餘科40個屬中(植物生理學通訊，2004(6):29)。迄今為止，利用髮狀根農桿菌的遺傳轉化已在多種植物中取得成功。如康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)、長春(CatharanthusroseusU、矮牽牛(Petunia)、金魚草(Antirrhi皿mmajusL)、亞美尼亞壺花(Muscariarmeniac咖)等的遺傳轉化系統已經建立並(或)獲得了其轉化再生植株(BioTechnology,1986，4:5330536)。目前，除利用髮狀根來生產藥用植物的次生代謝物外，更多的研究集中在進行次生代謝物的生物轉化和生產有價值的物質等。這一技術必將成為次生代謝產物生產的可靠有效途徑，是大規模生產有用蛋白的重要途徑之一(農業與技術，2007，27(3):31)。儘管用培養髮狀根生產藥物還有許多困難，但可以預見，隨著髮狀根基礎研究工作的深入和代謝工程的應用及培養技術的不斷發展和完善，用髮狀根生產藥物的時代即將來臨，並最終可能導致傳統的植物藥生產方式發生重大的變革，為人類的醫藥保健事業提供取之不盡、用之不竭的資源。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據植物密碼子的偏好性設計的FGFs基因組成；其鹼基序列如SEQIDNO.8(rolB-FGFl)或SEQIDNO:9(rolB-FGF2)或SEQIDN0.10(rolB-FGF7)所示。本發明第二個目的是提供無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體，包含無抗生素標記的P頂基因、分泌型表達的信號肽基因SEAP和上述融合基因片段rolB-FGFs的4pCAMBIA1390，表達載體名稱pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。本發明第三個目的是提供一種髮根農桿菌，它轉化了無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。本發明第四個目的是提供含有FGFs植物髮狀根，它是下述方法生產的1)人工設計合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以髮根農桿菌A4中的Ri質粒為模板，用引物Rl、R2進行PCR擴增，獲得rolB基因；以質粒PUC-FGFs為模板，用引物Fpl、Fp2，經PCR擴增，獲得FGFs基因；3)以獲得的rolB基因和FGFs基因為模板，利用引物Rl和Fp2，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進行融合，獲得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信號肽分泌表達載體的構建，人工合成SEAP信號肽基因，兩端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點，與經kpnI和EcoRI雙酶切的pCAMBIA1390-PIM載體進行連接；5)將融合基因rolB-FGFs和經EcoRI和BglII雙酶切，rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP經EcoRI和BglII雙酶切後的載體大片段進行連接，構建重組的無選擇標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs轉化髮根農桿菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒髮根農桿菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒髮根農桿菌感染植物，培養髮狀根；所述的植物為雙子葉；8)獲得的含有FGFs的髮狀根進行大規模培養。所述的植物優選人參、西洋參或丹參。用步驟8)植物髮狀根及其培養液，分離純化，生產FGFs。所述的FGFs為FGF1，其胺基酸序列如SEQIDNO.3所示或FGF2，其胺基酸序列如SEQIDNO.5所示或FGF7，其胺基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述的rolB基因，其鹼基序列如SEQIDNO.1所示；所述的植物密碼子的偏好性設計的FGFs基因為FGFl，其鹼基序列如SEQIDNO.2所示，或FGF2，其鹼基序列如SEQIDNO.4所示，或FGF7，其鹼基序列如SEQIDNO.6所示；本發明一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據植物密碼子的偏好性設計的FGFs基因組成；引入無抗生素標記的PM基因、人分泌型鹼性磷酸酶信號肽(SEAP)基因，構建了無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體，轉化至髮根農桿菌中，以植物作為宿主，採用髮狀根系統來表達FGFs，從髮狀根和培養液中分別純化出具有活注的FGFs，可產業化生產FGFs，提高了髮狀根誘導率、蛋白表達量、產率和穩定性，無抗生素標記，保護了環境；採用人參作為宿主生產的含FGFs人參髮狀根，具有人參和FGFs雙重的藥理作用，是一種較佳保健品及藥品，用於功能性食品和藥品的開發與應用具有廣闊的前景。圖1是農杆鹼型髮根農桿菌的Ri質粒物理結構圖圖2是含有FGFs的髮狀根培養圖圖3是含有FGFs的髮狀根鑑定圖圖4是FGFs家族部分基因的western檢測圖具體實施例方式實施例1:無抗生素標記的植物分泌型表達載體pCAMBIA1390-PMI-SEAP的構建(1)SEAP信號肽寡核苷酸鏈的退火對人工合成的SEAP信號肽基因序列(北京三博遠志生物有限公司合成)進行了必要的修飾，即在SEAP信號肽基因編碼序列正鏈和負鏈的5'和3'端分別加入了有利於後繼序列連接的kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點。正鏈ATCACTGTCAGACTAGTT-3'負鏈GCATGCATGGTCCCAA-3'分別將合成的兩條寡核苷酸鏈溶解於TE，使其終濃度為25ymol/L。退火反應體系正鏈2.0ill負鏈2.0illNaCl(0.5mol/L)6.0ii1滅菌超純水加至終體積30ii185。C水浴3min，自然冷卻至室溫。(2)SEAP信號肽基因片段與載體的連接退火後的SEAP信號肽基因片段5'和3'端，分別有能與kpnI和EcoRI酶切位點，用kpnI和EcoRI雙酶切載體pCAMBIA1390-PIM，酶切後的載體大片段用瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收，並用鹼性磷酸酶去磷酸化，瓊脂糖凝膠電泳定量後，16t:連接過夜。連接反應體系如下退火後的SEAP信號肽DNAO.10.3pmol去磷酸化的載體pCAMBIA1390-PM0.03pmol10X連接緩衝液lylT4DNA連接酶1ii1滅菌超純水加至終體積10ill(3)重組載體轉化①取一份凍存的感受態細胞冰上融化，加入上述步驟的連接產物，輕輕混勻。②冰浴30min。③將反應管放入預熱至42t:的循環水浴中，放置90s，不要搖動。④快速取出反應管並移置冰上12min。6⑤加入8001YEB培養基，用水浴將培養基加溫至37°C，然後將管轉移到37。C搖床中，振蕩培養(220rpm)lh。取200ii1已轉化的感受態細胞塗布於含Kan(100yg/ml)的YEB瓊脂平板上，37t:培養箱倒置培養1216h。實施例2:無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs的構建在Genebank中查到rolB基因cDNA序列，利用在線軟體Primer5.0和DNAStar設計引物，在上遊引物R1中引入了EcoRI酶切位點，下遊引物R2含有FGFs基因5'端的部分鹼基；人工合成引物(由北京遠志生物公司合成)Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG以髮根農桿菌A4中的Ri質粒(由中國科學院長春左家特產研究所提供)為模板，經過PCR反應擴增出rolB基因的全長序列，PCR反應條件和體系如下(表1、表2):表1表2tableseeoriginaldocumentpage7以FGFs的cDNA序列設計引物，上遊引物Fpl含有rolB基因3'端的部分鹼基，下遊引物Fp2含有BglII酶切位點，人工合成引物(由北京遠志生物公司合成)Fpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG以質粒PUC-FGFs(本實驗室構建保存，PUC空載體購自寶泰克公司)為模板，建立PCR反應體系(表3、表4)，經PCR擴增獲得FGFs基因；表3PCR反應體系50ul為Fpl弓l物~~0.5ulFp2引物0.5"1PUC19-FGFslulPrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4y12Xbuffer25ulddH2018.5表4PCR反應條件:預變性94°C4min變性94。C30sec退火55°C30sec延伸72°C42sec後延伸72°C5min循環數28cycle以rolB基因和FGFs基因為模板，利用Rl和Fp2引物，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進行融合，獲得rolB-FGFs的融合基因，PCR反應條件如表5、表6，將rolB-FGFs融合基因和pCAMBIA1390-PM-SEAP載體(本實驗室保存，由東北師範大學王興智老師贈予)經kpnI和BglII雙酶切，將酶切後得到的rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP載體大片段進行連接，構建重組的無選擇標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs，見附圖2。_^__PCR反應體系50Ul為ri引物~~nnFp2引物lylrolB0.5P1FGFs0.5u1PrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4u12Xbuffer25u1ddH2017.5ulPCR反應條件預變性94°C4min變性94°C30sec退火58°C30sec延伸72°Clmin30sec後延伸72°C5min循環數28cycle實施例3:髮根農桿菌A4介導人參遺傳轉化無抗性標記的pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs質粒DNA轉入髮根農桿菌A4:取1iilpCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs質粒DNA加入到100ii1髮根農桿菌A4感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴放置5min;置於液氮中冷凍5min;迅速轉至37。C水浴鍋中溫育5min;加入lmlYEB培養基中，在28。C搖床上180rpm振蕩培養4h;取適量菌液塗於含有鏈黴素50mg/L和卡那黴素50mg/L的YEB固體培養基中，置於28。C培養24_48h，經抗性篩選、PCR檢測和酶切檢測獲得帶有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒DNA的髮根農桿菌A4單菌落；含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒髮根農桿菌A4的活化從平板上挑取含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒的髮根農桿菌A4單菌落，接種到5mlYEB液體培養基中(含卡那黴素50100mg/L，鏈黴素50100mg/L)，振蕩培養過夜，取100ii1菌液接種到50mlYEB液體培養基中(含卡那黴素50100mg/L，鏈黴素50-100mg/L)，28°C，180rpm振蕩培養至0D6。。=1，1200018000rpm離心10min，菌8體用YEB液體培養基重懸，使0D=0.10.6;人參的遺傳轉化將取生長健壯的2年生的人參(PanaxginsengC.A.Mey.)根用肥皂水洗淨，70%酒精及0.1%氯化汞消毒，無菌水衝洗3次，將參根切成23mm的薄片，置於無激素的MS固體培養基上預培養12d。然後使用滴加法進行侵染，將菌液活化至0D600=0.20.6，再將其稀釋100倍後，用注射器滴加在外植體上58滴，或使用劃刀法，待菌液活化至0D600=0.20.6，再將其稀釋5倍左右，用刀片在人參根片上輕微劃幾刀；置於無激素的MS固體培養基上共培養25d，25t:下暗培養誘導髮根。然後轉到含有20g/L濃度的PIM和抑菌抗生素的培養基上進行抑菌和篩選培養，待4060d後，長出髮狀根，將小髮根切下，轉入新的液體培養基中繼續培養，含有FGFs的髮根見附圖2。以人參無菌苗的莖葉為外植體，先將其用0.1%的氯化汞進行表面消毒，無菌水衝洗3次，每次2min，將葉片上下兩端邊緣切掉，莖段切成1cm左右，置於無激素的MS固體培養基上預培養12d。使其在活化好的菌液中浸泡215min，或者將菌液稀釋5倍後，用刀在莖段或葉片上輕微劃幾刀，但不要劃破，置於無激素的MS固體培養基上共培養25d，25t:下暗培養誘導髮根。西洋參的遺傳轉化取兩年生新鮮西洋參根，用肥皂水反覆衝洗多次，放入O.1%氯化汞溶液中浸泡510min，無菌水衝洗35次。在超淨工作檯上，用接種刀將其切成23mm厚的薄片，用鑷子平放入裝有培養基的三角瓶中，每個三角瓶放置23個根外植體，放入恆溫恆溼培養箱中，25t:預培養23天。與人參一樣採用滴加法或劃刀法進行侵染轉化。具體方法同上。丹參的遺傳轉化將丹參種子流水衝洗24h後，用0.1%的氯化滎表面消毒5min，經滅菌後的蒸餾水漂洗3次，播撒到滅菌後的溼濾紙上發芽。發芽後的種子移到無激素的MS固體培養基中，待長出無菌苗後，用離體葉柄或幼莖都可以直接按上述方法誘導出髮狀根。實施例4:含FGFs植物髮根的鑑定轉基因FGFs髮狀根的PCR鑑定提取轉基因的髮狀根基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別以FGFs、rolB的上下遊引物對基因組DNA進行擴增，擴增的PCR反應條件和體系(表7、表8)，分別擴增出單獨的目的基因及融合後的目的基因。tableseeoriginaldocumentpage9轉基因藥用植物髮狀根的Southern-blot鑑定用CTAB法提取PCR檢測呈陽性的髮狀根基因組DNA，選用BglII酶切過夜。將酶切好的基因組樣品用0.8%瓊脂糖凝膠電泳使各片段按照分子大小依次分開，用鹼變性方法處理凝膠，利用毛細轉移法將酶切片段由凝膠轉移到固相硝酸纖維素膜上。探針標記，雜交等按照地高辛標記試劑盒操作方法操作。FGFlSouthern-blot結果見附圖3。實施例5:轉基因髮根中FGFs蛋白的檢測取lg轉基因人參髮狀根，在液氮中研磨；加入蛋白提取緩衝液(PBS)0.5ml，4°C12000rpm離心5min;取上清液備用，上清液為髮狀根中的可溶性總蛋白。將髮狀根中的可溶性總蛋白，經肝素親和層析、離子交換，分離純化得到FGFs純品蛋白，CM柱層析將CM、S印harose2F凝膠裝柱(5.OcmX50cm)，用23倍體積的緩衝液A平衡，將人參髮狀根可溶性總蛋白緩慢上柱，流速40ml/min，繼續用緩衝液A平衡至A280接近0，用緩衝液B進行洗脫，收集蛋白峰。將H印arinS印haroseCL-6B凝膠裝柱(5.0cmX50cm)，用23倍體積的緩衝液B平衡，將經CM柱層析收取蛋白峰上樣。流速40ml/min，分別用含0.6、1.2、2.Omol/LNaCl的20mmol/LPBpH7.0進行分段洗脫，收集aFGF蛋白峰，經SDS-PAGE電泳後，轉膜用抗兔的多克隆抗體進行Western-blot雜交，表達產物與預期結果相符。FGF1結果見附圖4。實施例6:轉基因髮根中的FGFs蛋白的活性測定用MTT法測定純化後的FGFs蛋白和野生型FGFs對Balb/c3T3細胞的促分裂活性。結果表明，純品蛋白的ED50值與野生型蛋白的ED50值相當。實施例7:轉基因人參髮根的開發應用將含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒的人參髮狀根，凍幹成粉，保存，用於功能性食品和藥品的開發與應用。10權利要求一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據植物密碼子的偏好性設計的FGFs基因組成。2.根據權利要求1所述的一種融合基因片段rolB-FGFs，其特徵在於其鹼基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。3.無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體，包含無抗生素標記的PIM基因、分泌型表達的信號肽基因SEAP和權利要求l或2所述的一種融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，即pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。4.一種髮根農桿菌，它轉化了權利要求3所述的無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。5.含有FGFs植物髮狀根，它是下述方法生產的1)人工設計合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以髮根農桿菌A4中的Ri質粒為模板，用引物Rl、R2進行PCR擴增，獲得rolB基因；以質粒PUC-FGFs為模板，用引物Fpl、Fp2，經PCR擴增，獲得FGFs基因；3)以獲得的rolB基因和FGFs基因為模板，利用引物Rl和Fp2，通過PCR搭橋法，將rolB基因與FGFs基因進行融合，獲得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信號肽分泌表達載體的構建，人工合成SEAP信號肽基因，兩端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位點，與經kpnI和EcoRI雙酶切的pCAMBIA1390-PIM載體進行連接；5)將融合基因rolB-FGFs和經EcoRI和BglII雙酶切，rolB-FGFs融合基因片段與pCAMBIA1390-PIM-SEAP經EcoRI和BglII雙酶切後的載體大片段進行連接，構建重組的無抗生素標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)無抗生素標記的植物雙元表達載體pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs轉化髮根農桿菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒髮根農桿菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs質粒髮根農桿菌感染植物，培養髮狀根；8)獲得的含有FGFs的髮狀根進行大規模培養。6.根據權利要求5所述的含有FGFs植物髮狀根，其特徵在於所述的植物為人參、西洋參或丹參，融合基因rolB-FGFs其鹼基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。7.根據權利要求6所述的含有FGFs植物髮狀根，其特徵在於所述的FGFs為FGF1。8.根據權利要求5、6或7所述的含有FGFs植物髮狀根及其培養液，經分離純化，生產FGFs的應用。9.根據權利要求6或7所述的含有FGFs植物髮狀根，用於製備保健品的應用。全文摘要本發明公開了一種融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根據植物密碼子的偏好性設計的FGFs基因組成；引入無抗生素標記的PIM基因、人分泌型鹼性磷酸酶信號肽(SEAP)基因，構建了無抗生素標記的植物分泌型雙元表達載體，轉化至髮根農桿菌中，以植物作為宿主，採用髮狀根系統來表達FGFs，從髮狀根和培養液中分別純化出具有活泩的FGFs，可產業化生產FGFs，提高了髮狀根誘導率、蛋白表達量、產率和穩定性，無抗生素標記，保護了環境；採用人參作為宿主生產的含FGFs人參髮狀根，具有人參和FGFs雙重的藥理作用，是一種較佳保健品及藥品，用於功能性食品和藥品的開發與應用具有廣闊的前景。文檔編號A01H5/06GK101768597SQ20101010609公開日2010年7月7日申請日期2010年2月5日優先權日2010年2月5日發明者劉秀明,李天航,李校堃,李海燕,楊晶,熊麗東,王豔芳申請人:吉林農業大學