蛋白激酶Nβ的應用的製作方法

2023-12-08 19:50:31

專利名稱：蛋白激酶Nβ的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白激酶Nβ的應用。
現代藥物開發不再依賴於或多或少試探的方法，而典型地包含闡明構成疾病或症狀基礎的分子機制，鑑定候選靶分子和評估所述靶分子。一旦可獲得這樣證實的靶分子(在本文中也稱作靶)，可以檢驗針對其的候選藥物。在很多情形中，這些候選藥物是可以由合成或天然化合物組成的化合物文庫的成員。組合文庫的使用也很常見。這些化合物文庫在本文中還稱為候選化合物文庫。儘管過去該方法已經證明是成功的，它仍然耗時費錢。當前將不同技術用於靶鑑定和靶證實。
仍然有許多腫瘤和癌是人類健康的大威脅。為了產生更安全和更有效的具有更小副作用的藥物，必須了解經適當化合物處理後可特異性地或選擇性地影響它們的活性或存在的靶分子。因為可以是潛在或候選藥物的化合物與靶之間的優選地選擇性和特異性相互作用，靶在疾病或疾病症狀如例如癌、腫瘤發生和轉移中的功能可能被影響，因此疾病被治療或預防和疾病症狀被改善。
因此構成本發明基礎的問題是提供適於用於腫瘤發生和癌的治療中治療方法的靶。構成本發明基礎的另一問題是提供涉及腫瘤發生和轉移的靶。
構成本發明基礎的問題在第一方面通過將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用作PI3-激酶途徑的下遊靶、優選作為PI3-激酶途徑的下遊藥靶來解決。
構成本發明基礎的問題在第二方面通過將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物用於製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第一和第二方面的應用的實施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照資料庫登記號PID g7019489或資料庫登記號gi 7019489的胺基酸序列，或其部分或衍生物。
構成本發明基礎的問題在第三方面通過將編碼蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物的核酸用於治療和/或預防疾病和/或製備用於診斷疾病的診斷劑來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第三方面的應用的實施方案中，蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照資料庫登記號PID g7019489或資料庫登記號gi7019489的胺基酸序列，或其部分或衍生物。
在按照本發明第三方面的應用的實施方案中，核酸是按照SEQ ID NO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸。
在按照本發明任一方面的應用的另一個實施方案中，蛋白激酶Nβ由按照SEQ ID NO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸編碼。
在按照本發明第三方面的應用的優選實施方案中，由於遺傳密碼的簡併性核酸序列將與按照本發明第三方面的本發明的核酸雜交。
在按照本發明任一方面的應用的另一個實施方案中，核酸序列是在嚴謹條件下與按照SEQ ID NO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸序列或其部分雜交的核酸序列。
在按照本發明任一方面的應用的優選實施方案中，疾病的特徵在於與所述疾病有關的細胞缺少PTEN活性，顯示增加的攻擊行為，或是晚期腫瘤細胞。
在按照本發明第三方面的應用的更優選的實施方案中，疾病是晚期腫瘤。
構成本發明基礎的問題在第四方面通過篩選治療和/或預防疾病和/或製備用於診斷疾病的診斷劑的試劑的方法來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組，其包含以下步驟a)提供候選化合物，b)提供蛋白激酶Nβ的表達系統和/或檢測蛋白激酶Nβ活性的系統；c)將候選化合物與蛋白激酶Nβ的表達系統和/或檢測蛋白激酶Nβ活性的系統接觸；d)確定蛋白激酶Nβ的表達和/或活性是否在候選化合物的影響下改變。
在按照本發明第四方面的方法的實施方案中，候選化合物包含在化合物文庫中。
在按照本發明第四方面的方法的另一個實施方案中，候選化合物選自包含肽，蛋白質，抗體，抗促成素(anticaline)，功能核酸，天然化合物和小分子的各類化合物的組。
在按照本發明第四方面的方法的優選實施方案中，功能核酸選自包含適體(aptamer)，適配酶(aptazyme)，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
在按照本發明第四方面的方法的另一優選實施方案中，蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是與本發明其它任何方面有關描述的那些。
構成本發明基礎的問題在第五方面通過將蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸或其部分或衍生物用作開發和/或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑的靶分子來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第五方面的應用的實施方案中，藥物和/或診斷劑包含試劑，其選自由包含抗體，肽，抗促成素，小分子，反義分子，適體，spiegelmer和RNAi分子的組。
在按照本發明第五方面的應用的優選實施方案中，試劑與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用。
在按照本發明第五方面的應用的備選實施方案中，試劑與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，特別是與蛋白激酶Nβ的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
構成本發明基礎的問題在第六方面通過將與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽用於開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第六方面的應用的實施方案中，多肽選自由以下各項組成的組針對蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的抗體和結合蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的多肽。
構成本發明基礎的問題在第七方面通過將與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸用於開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第七方面的應用的實施方案中，核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
構成本發明基礎的問題在第八方面通過將與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸用於開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑來解決，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
在按照本發明第八方面的應用的實施方案中，相互作用的核酸是反義寡核苷酸，核酶和/或siRNA。
在按照本發明第八方面的應用的另一實施方案中，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。
在按照本發明第八方面的應用的實施方案中，蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是與本發明任一方面相關描述的一種。
構成本發明基礎的問題在第九方面通過優選用於預防和/或治療疾病的藥物組合物來解決，該藥物組合物包含至少一種試劑和至少一種藥用載體，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組，其中疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
構成本發明基礎的問題在第十方面通過用於表徵疾病或症狀的試劑盒來解決，所述疾病或症狀選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組，所述試劑盒包含至少一種試劑和任選地至少一種其它化合物，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組。
本發明人已經意外地發現蛋白激酶Nβ，在本文也稱為PKNβ，是與癌和腫瘤有關的有價值的靶。更具體地，本發明人已經發現蛋白激酶Nβ是PI-3激酶/PTEN途徑的下遊靶。更意外地本發明人發現蛋白激酶Nβ與腫瘤發生和轉移關聯。特別是後者作用似乎與抑制功能、更具體地PTEN腫瘤抑制功能的喪失強烈相關。如將在實施例中顯示，在作為PI-3激酶途徑抑制劑的PTEN無活性的症狀中蛋白激酶Nβ將被上調。由於蛋白激酶Nβ的上調，發生該上調的細胞將顯示轉移行為和遷移行為的增加。這意味著蛋白激酶Nβ的抑制劑是控制細胞轉移和遷移行為的適當方法，這是治療腫瘤和癌的適當方法，該腫瘤和癌更具體地是轉移性的和其細胞顯示轉移和/或遷移行為的那些腫瘤和癌，在本文中通常稱為「本文所述疾病」或「本文所述症狀」。本文所述疾病以及本文所述症狀還包含腫瘤發生和轉移。這特別適用於本文所述的那些疾病和本文所述的那些症狀，其中與這些疾病或疾病症狀有關的細胞是PTEN陰性，這意味著腫瘤抑制劑PTEN無活性或具有降低水平的活性。該疾病還包含其中通常涉及PI3-激酶途徑的那些疾病。除了轉移瘤以外，特別是糖尿病分別屬於這種類型的疾病和疾病症狀。因此，細胞，特別是與本文所述疾病或疾病症狀有關的和為PTEN陰性的那些，對於其作用模式是降低或消除各個有關細胞中蛋白激酶Nβ活性的藥物治療敏感。因此，使用所述藥物可以有利地治療患者，該患者腫瘤特徵在於優選過度激活的PI3-激酶途徑，包括但不限於通過擴增或誘變編碼PI3-激酶途徑組分的基因(p110，Akt)或是PTEN陰性的或具有PTEN陰性的細胞，特別是如果這些細胞涉及本文所述疾病或本文所述疾病症狀。該活性的降低可來源於轉錄水平或翻譯水平，即蛋白激酶Nβ的酶促活性的降低。不希望侷促於任何理論，後一方面，即改變蛋白激酶Nβ的活性也是來自本發明人關於PKNβ特性的理解的結果，即PKNβ的酶促活性也可以上調和下調，更優選下調。
另一組可以使用所述藥物有利地治療的患者是患有癌症的那些，其喪失PTEN功能的發生率高，特別是在晚期腫瘤中(Cantley，L.C.和Neel，B.G.(1999).New insights into tumor suppressionPTEN suppresses tumorformation by restraining the phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway.ProcNatl Acad Sci U S A 96，4240-4245；Ali，I.U.(2000).Gatekeeper forendometriumthe PTEN tumor suppressor gene.J Natl Cancer Inst 92，861-863)。PTEN的喪失與各種腫瘤細胞增加的攻擊和入侵行為相關。因此，在本發明的優選實施方案中，可以將也可以用作與本發明各個方面相關的分析工具或手段的、分別針對蛋白激酶Nβ或編碼其的核酸的那些診斷劑和治療劑用於任何腫瘤，條件是符合上述前提，即PTEN與增加的攻擊和入侵行為相關。
基於本文提供的公開內容，即蛋白激酶Nβ是下遊藥靶和蛋白激酶Nβ是腫瘤發生和轉移和與其相關或由其導致的疾病的靶，可以設計，篩選或製備這種藥物。
由於蛋白激酶Nβ涉及以上概述的機制，它還可以用作診斷細胞或其體內具有該類細胞的患者的狀態，其是否將分別進行轉移和腫瘤發生的標記。作為這種方法起作用和適用於該目的的實例是例如ICAM-1。ICAM-1用於胃癌進行轉移的預後(Maruo Y，Gochi A，Kaihara A，ShimamuraH，YamadaT，TanakaN，OritaK.Int J Cancer.2002 Aug 1；100(4)486-490)，其中發現s-ICAM-1水平在肝轉移的患者中升高。在另一個實施例中，將骨橋蛋白用作乳腺癌的預後標記(Rudland PS，Platt-Higgins A，El-TananiM，De Silva Rudland S，Barraclough R，Winstanley JH，Howitt R，WestCR.Cancer Res.2002 Jun 15；62(12)3417-3427)。在這個範圍內蛋白激酶Nβ的存在或存在水平(蛋白質或mRNA)或活性水平可以用作標記，與蛋白激酶Nβ或多或少特異性相互作用的任何化合物因此將是適當的診斷劑。
下面將公開在任何情形下與蛋白激酶Nβ特異性和/或選擇性相互作用的藥物和診斷劑的方法和設計原理。
根據這些發現激酶Nβ證明是允許選擇性調節僅一些典型地涉及PI-3激酶途徑的方面，即轉移和遷移的適當下遊藥靶，和選擇性和特異性的診斷方法，即檢測典型地涉及PI3-激酶途徑的過程，更具體地轉移和遷移。
PI3-激酶途徑其特徵在於經生長因子誘導後的PI3-激酶活性和平行的信號途徑。細胞的生長因子刺激導致細胞膜上它們相關受體的激活，其又與胞內信號分子如PI3-激酶相關並將PI3-激酶激活。PI3-激酶(由調節p85和催化p110亞基組成)的激活通過磷酸化導致Akt的激活，由此支持細胞應答如擴增，存活或向下遊遷移。PTEN因此是涉及磷脂醯肌醇(PI)3-激酶途徑的腫瘤抑制劑，過去已經廣泛研究其在調節細胞生長和轉化中的作用(關於綜述參見Stein，R.C.和Waterfield，M.D.(2000).PI3-kinase inhibitiona target for drug development？Mol Med Today 6，347-357；Vazquez，F.和Sellers，W.R.(2000).The PTEN tumor suppressorproteinan antagonist of phosphoinositide 3-kinase signaling.BiochimBiophys Acta 1470，M21-35；Roymans，D.和Slegers，H.(2001).Phosphatidylinositol 3-kinases in tumor progression.Eur J Biochem 268，487-498)。腫瘤抑制劑PTEN通過逆轉PI3-激酶-催化反應起PI3-激酶負調節物的作用和由此確保途徑的激活以瞬時和可控方式發生。PTEN的功能失活導致PI3-激酶信號的慢性超活化。通過加入小分子抑制劑LY294002可以阻斷PI3-激酶活性。以平行途徑作用的信號激酶MEK的活性和下遊響應可以例如被小分子抑制劑PD98059抑制。
PI3-激酶途徑通過PTEN功能喪失的慢性激活是腫瘤發生和轉移的主要貢獻者，顯示該腫瘤抑制劑代表控制細胞增殖的重要關卡。PTEN剔除(knock out)細胞顯示與其中PT3-激酶途徑已經通過PI3-激酶的激活形式被慢性誘導的細胞類似的特性(Di Cristofano，A.，Pesce，B.，Cordon-Cardo，C.和Pandolfi， P.P.(1998).PTEN is essential for embryonic development andtumour suppression.Nat Genet 19，348-355.Klippel，A.，Escobedo，M.A.，Wachowicz，M.S.，Apell，G，Brown，T.W.，Giedlin，M.A.，Kavanaugh，W.M.和Williams，L.T.(1998).Activation of phosphatidylinositol 3-kinase issufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic ofoncogenic transformation.Mol Cell Biol 18，5699-5711.Kobayashi，M.，Nagata，S.，Iwasaki，T.，Yanagihara，K.，Saitoh，I.，Karouji，Y.，Ihara，S.和Fukui，Y.(1999).Dedifferentiation of adenocarcinomas by activation ofphosphatidylinositol 3-kinase.Proc Natl Acad Sci U S A 96，4874-4879).
PTEN涉及也稱為PTEN相關途徑的幾個途徑如PI3K/PTEN途徑，Akt途徑，EGF-相關自分泌迴路(loop)和mTOR途徑。PI3-激酶途徑實際上是直接或間接涉及PI3-激酶的任何途徑。PI3-激酶在該途徑中可以用作抑制劑或激活劑，或者它可以被途徑的其它元件調節。
存在豐富的現有技術描述涉及PI3-激酶途徑的疾病和症狀。這些症狀和疾病中的任何一種可以因此通過本文教導設計、篩選或製備的本發明方法和藥物和診斷劑處理。為了不限制性地舉例說明的原因，它是指下列各項子宮內膜癌，結腸直腸癌，神經膠質瘤，子宮內膜癌，腺癌，子宮內膜增生，考登症候群，遺傳性非息肉病結腸直腸癌，Li-Fraumene’s症候群，乳腺-卵巢癌，前列腺癌(Ali，I.U.，Journal of the National Cancer Institute，Vol.92，no.11，June 07，2000，第861-863頁)，班-佐症候群，LDD(Lhermitte-Duklos』症候群)(Macleod，K.，上文)錯構瘤-巨頭病，包括Cow病(CD)和Bannayan-Ruvalcaba-Rily症候群(BRR)，黏膜皮膚損傷(例如毛膜瘤(trichilemmonmas))，巨頭，智力低下，胃腸harmatomas，脂瘤，甲狀腺腺瘤，乳腺纖維囊性病，小腦發育不良性神經節細胞瘤和乳腺和甲狀腺惡性腫瘤(Vazquez，F.，Sellers，W.R.，上文)。
鑑於此，蛋白激酶Nβ是PI3-激酶途徑有價值的下遊藥靶，其可以用副作用比針對蛋白激酶Nβ下遊的靶的其它藥物小的藥物處理。因此本發明提供適合設計、篩選、開發和製備藥物活性化合物的藥靶，這些化合物比本領域已知的那些如例如LY294002更有選擇性。通過對效應分子該特定部分即蛋白激酶Nβ和途徑中涉及的任何另外的下遊分子的控制，僅極有限量的其平行分支或信號級聯放大中另外的上遊靶可能導致不期望的作用。因此，與細胞周期、DNA修復、細胞調亡、葡萄糖轉運、翻譯有關的PI-3激酶/PTEN途徑的其它活性將不受影響。此外，不誘導胰島素信號，這意味著實際上避免了與LY294002的使用相關的觀察到的糖尿病響應或其它副作用。LY294002(2-(4-嗎啉基)8-苯基色酮)是Lilly研究實驗室(Indianapolis)開發的作為PI-3K抑制劑的幾種色酮衍生物小分子抑制劑之一(Vlahos等，1994，JBC，269，5241-5248)。它靶向PI-3K分子它們的催化亞基，p110並且通過與ADP競爭結合催化中心來發揮作用。然而，LY294002不能辨別不同的p110同工型(α，β，γ，δ)，這些同工型提示具有不同細胞功能。
蛋白激酶Nβ也是雷帕黴素處理的mTOR的另一下遊。mTOR(雷帕黴素的哺乳動物靶)，也稱為Raft或FRAP，作用於PI3-激酶的下遊來調節諸如pp70S6激酶依賴性進入細胞周期的過程。mTOR用作生長因子和營養可用性的傳感物以通過激活pp70S6激酶和起始因子4E來控制翻譯。mTOR的功能受細菌大環內酯雷帕黴素抑制，雷帕黴素抑制T-細胞和某些腫瘤細胞的生長(Kuruvilla和Schreiber 1999，Chemistry Biology 6，R129-R136)。
雷帕黴素及其衍生物是當前用於臨床的適當藥物的事實證明藥靶更有益和具有更小副作用，更具體地它是關於例如Yu等(Yu，K.等(2001)Endrocrine-RelatCanc 8，249)證明的特定分子機制。
蛋白激酶Nβ是蛋白激酶C家族的成員，該家族據說是蛋白質-絲氨酸/蘇氨酸激酶。典型地，這種類型的蛋白激酶包含一個調節和一個催化亞基，使用鈣離子和磷脂作為輔因子。二醯甘油用作這種類型的蛋白激酶家族的激活劑。蛋白激酶C家族的成員涉及與激素或神經遞質有關的幾個信號途徑。這些蛋白激酶通過磷酸化調節它們的靶蛋白的活性。本領域已知非生理性的持續激活蛋白激酶C導致轉化的細胞表型，其可導致癌症產生。
蛋白激酶Nβ作為mRNA的完整序列可在資料庫中獲得，例如登記號為gi 7019488或NM_013355。使用遺傳密碼，從該mRNA中可推斷出具體的胺基酸序列。而且，蛋白激酶Nβ的胺基酸序列可在資料庫中以登記號gi 7019489或NP_037487.1獲得。屬於本發明範圍內的是可以按照本發明使用其衍生物或截短形式(version)，只要可以實現期望效果。衍生化和截短的程度因此可以由本領域技術人員通過常規分析測定。就核酸序列而言那些核酸序列也被術語編碼蛋白激酶Nβ的核酸序列包含，這些核酸序列可以與上述登記號指定的核酸或可以衍生於上述胺基酸序列的任何核酸序列雜交。該雜交為本領域技術人員已知。這種雜交的細節可以獲自Sambrook，J.Fritsch，E.F.和Maniats，T.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nded.Cold Spring HarborCold Spring HarborLaboratory。在一個優選實施方案中，雜交是嚴謹條件下的雜交。另外，編碼蛋白激酶Nβ的核酸也是與任何上述核酸序列同源的核酸序列，其中同源程度優選為75，80，85，90或95％。另外的與蛋白激酶Nβ有關的參考文獻尤其有Shibata H.等，J.Biochem.(Tokyo)2001 Jul；130(1)23-31；Dong，LQ，Proc Natl Akad Scie USA，2000，May 09；97(10)5089-5094；和Oishi，K.，Biochem Biophys Res Commun.1999，Aug.11；261(3)808-814。
尤其在M.musculus，R norvegicus，A.thaliana，C.elegans，D.melanogaster和S.cerevisiae中可以發現人蛋白激酶Nβ的同源物。對於上述各種物種，對比區域的百分同一性和長度分別為67％和279個胺基酸，51％和866個胺基酸，38％和305個胺基酸，36％和861個胺基酸，63％和296個胺基酸和44％和362個胺基酸。本領域技術人員公認這些或其它同源物中的任何一種原則上適合於實施本發明，除非使用該同源物產生的藥物或診斷劑可以仍與人蛋白激酶Nβ或其它任何預定蛋白激酶Nβ相互作用。
人胺基酸序列還可以獲自ProtEST，登記號pirJC7083，其中各種蛋白激酶Nβ稱為JC7083蛋白激酶。人蛋白激酶Nβ的基因位於第9條人染色體上。蛋白激酶Nβ的cDNA來源通常是多種癌和各種胎兒或胚胎組織，更具體地，尤其是胃，腺癌，腦，乳腺，burkitt，淋巴瘤，子宮頸，軟骨肉瘤，結腸，胎兒眼，胎兒晶狀體，胎兒眼前段，胎兒視神經，胎兒視網膜，胎兒視網膜中央窩(foveal)，胎斑肽脈絡膜，fibrotheoma，種系，nead頸，心臟，腎，大細胞癌，平滑肌肉瘤，轉移性軟骨肉瘤，卵巢，甲狀旁腺，成視網膜細胞瘤，橫紋肌肉瘤，小細胞癌，鱗狀細胞癌，睪丸，和子宮。從該表中明顯的是在本文中也稱為藥劑(medicament)的藥物和診斷劑，包括腫瘤分類(staging)劑，即分別可以用於區分患者關於他可能遭受的疾病階段的狀態以及用於監視施用於患者的治療功效的試劑，其按照本文提供的技術教導設計、篩選或製備，除了本文公開的其它任何疾病和本文公開的疾病症狀以外，其可以用於治療、預防、診斷、預後和監視這些疾病或涉及特定細胞、組織或器官的任何疾病。這些疾病和疾病症狀也應當包含在術語「本文所述疾病」中。
鑑於本文公開的意外發現，蛋白激酶Nβ因而可以用作預防和/或治療本文所述的各種疾病和疾病症狀的藥物，和用於為此目的製備藥物和用於製備診斷劑。
在將以上定義的蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物本身用作藥物的情況下，將它優選用作天然存在的蛋白激酶Nβ的競爭劑和由此抑制其正常生物學功能。特別優選用於該目的的蛋白激酶Nβ是催化缺陷型的。這種蛋白激酶Nβ可分別施用於生物和細胞，或可以通過基因治療的方式導入生物或各個細胞。
除了其本身是潛在藥物以外，蛋白激酶Nβ可以用作針對可以用作藥物或候選藥物或用作診斷劑的化學化合物的化合物。這些化學化合物屬於不同類別的化合物如抗體，肽，抗促成素，適體，spiegelmer，核酶，反義寡核苷酸和siRNA以及小分子。使用蛋白激酶Nβ其本身作為物理或化學實體或與蛋白激酶Nβ有關的信息，設計、選擇、篩選產生和/或製備化合物。在所述類別的化合物的設計、選擇、篩選、產生和/或製備方法中，蛋白激酶Nβ也將稱為靶，其用於該方法中而不是將各種化合物向需要其的患者的最終施用中。在提供各種類別的化合物的方法中，可以使用蛋白質蛋白激酶Nβ，在本文中也稱為蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸。本文所用的術語蛋白激酶Nβ包含蛋白激酶Nβ的任何片段或衍生物，其允許設計、選擇、篩選、產生和/或製備各類化合物中所述類別的化合物，其在應用時又由於有活性而作為藥物或作為診斷劑。本文所用的編碼蛋白激酶Nβ的術語核酸應當包含任何核酸，其包含編碼如上定義的蛋白激酶Nβ的核酸或其部分。同樣考慮編碼蛋白激酶Nβ的核酸的一部分，只要它仍適合設計、選擇、篩選、產生和/或製備所述類別的化合物，其在應用時又由於有活性而作為藥物或作為診斷劑。編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以是基因組核酸，hnRNA，mRNA，cDNA或其中每個的一部分。
如以上概述，屬於本發明範圍內的是除了本文所述的蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或為此的核酸序列，還可以使用其它工具或化合物以便產生或抑制產生於蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的作用。這些工具可以在篩選方法中確定或選擇。在該篩選方法中，第一步是提供一種或多種所謂的候選化合物。本文所用的候選化合物是在測試系統中檢測其適合性的化合物，該適合性是關於治療或減輕本文所述各種疾病和本文所述疾病症狀或被用於這種疾病和疾病症狀的診斷工具或試劑的適合性。如果候選化合物在測試系統中顯示各種作用，所述候選化合物是治療所述疾病和疾病症狀的適當工具或試劑，和原則上，以及所述疾病和疾病症狀的適當診斷劑。在第二步中將候選化合物與蛋白激酶Nβ表達系統或蛋白激酶Nβ的基因產物、優選各種基因表達產物如hnRNA或mRNA，或蛋白激酶Nβ活性系統或蛋白激酶Nβ接觸。蛋白激酶Nβ活性系統在本文中也稱為檢測蛋白激酶Nβ活性的系統和/或優選在該系統的含義中也是有活性的。
蛋白激酶Nβ表達系統基本上是顯示或展示蛋白激酶Nβ表達的表達系統，其中表達的程度或水平基本上可以改變。優選地，蛋白激酶Nβ活性系統基本上是其中測量活性或活性狀態而不是蛋白激酶Nβ表達的表達系統。備選地，蛋白激酶活性系統是其活性可以測量的蛋白激酶Nβ或者提供或包含蛋白激酶Nβ的系統。在這些系統的任何一個中，檢驗在候選化合物的影響下蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的活性是否不同於沒有候選化合物的情形。不管具體系統是否是表達系統或活性系統，屬於本發明範圍內的是可以出現活性和表達分別增加或降低並且可以測量。典型地，表達系統和/或活性系統是體外反應，如細胞提取物或細胞提取物的級分如核提取物。本文所用的蛋白激酶Nβ表達系統也可以是細胞，優選與本文所述疾病和本文所述疾病病症有關的組織或器官的細胞。
例如通過測量在候選化合物的影響下編碼蛋白激酶Nβ的核酸量、更具體地mRNA的增加或減少或表達的蛋白激酶Nβ的增加或減少，可以在每個表達水平上確定活性系統或表達系統中是否有增加或降低。測量所需技術，更具體地諸如對於mRNA或蛋白質的這類變化的定量測量，是本領域技術人員公知的。本領域技術人員還公知的是例如通過使用適當抗體測定蛋白激酶Nβ的量或含量的方法。可以如本領域技術人員所知和例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)所述產生抗體。
在蛋白激酶Nβ表達系統的情形中，優選可以在功能測定中測定蛋白激酶Nβ活性的增加或降低。
通常通過將候選化合物的水溶液加入各自反應系統中進行將候選化合物分別與表達系統和活性系統接觸，該反應系統在本文中通常稱為測試系統。除了水溶液以外，可以使用候選化合物在有機溶劑中的混懸液或溶液。水溶液優選為緩衝液。
優選地，在每輪分別使用表達系統和活性系統中，僅使用單一候選化合物。然而，還屬於本發明範圍內的是幾個該類測試在高通量系統中平行進行。
按照本發明的方法的另一步驟在於測定在候選化合物的影響下，表達系統和活性系統的表達或活性是否分別相對於蛋白激酶Nβ或編碼其的核酸變化。典型地，這通過將加入候選化合物後的系統反應與未加入候選化合物的系統反應比較完成。優選地，候選化合物是化合物文庫的成員。基本上任何化合物文庫適合於本發明目的，而與化合物類別無關。適當的化合物文庫尤其有由小分子組成的文庫，由肽、蛋白質、抗體、抗促成素和功能核酸組成的文庫。如本領域技術人員公知可以產生後者化合物並在本文中概述。
蛋白激酶Nβ蛋白質的特異性抗體或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的製備為本領域技術人員已知，並且例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。優選地，單克隆抗體可以與本發明結合使用，其可以按照Cesar和Milstein的方案和基於其的進一步發展來製備。本文所用抗體包括但不限於，完全抗體，抗體片段或衍生物如Fab片段，Fc片段和單鏈抗體，只要它們適合於和能夠與蛋白激酶Nβ結合。除了單克隆抗體以外，還可以使用和/或產生多克隆抗體。多克隆抗體的產生也為本領域技術人員已知，例如在Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。優選地，用於治療目的的抗體是以上定義的人源化的或人的抗體。
按照本發明可以使用的抗體可以具有一個或幾個標記或標籤。這些標記或標籤可以在其診斷應用或其治療應用中用於檢測抗體。優選地，標記和標籤選自包含抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、生物素、金和螢光素的組，並例如在ELISA方法中使用。這些和另外的標記以及方法在例如Harlow，E.，和Lane，D.，″AntibodiesA Laboratory Manual，″Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)中描述。
還屬於本發明範圍內的是，標籤或標記顯示除了檢測以外的額外功能，如與其它分子相互作用。該相互作用可以例如是與其它化合物的特異相互作用。這些其它化合物可以是其中使用抗體的系統如人或動物體固有的那些或通過使用各自抗體分析的樣品。適當的標記可以例如是生物素或螢光素，其特異相互作用的配偶體如抗生物素蛋白和鏈黴抗生物素蛋白等存在於各種化合物或結構上以與如此標記或帶標籤的抗體相互作用。
使用蛋白激酶Nβ蛋白質或編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以產生的另一類藥物以及診斷劑是與其結合的肽。這些肽可以通過使用按照現有技術的方法如噬菌體展示產生。基本上，產生諸如噬菌體形式的肽文庫，這種文庫與靶分子接觸，在本情形中靶分子是例如蛋白激酶Nβ。隨後從各自反應中優選作為與靶分子的複合體去除與靶分子結合的那些肽。本領域技術人員已知結合特性至少在一定程度上依賴於具體實現的實驗設定如鹽濃度等。在從未結合的文庫成員中分離以較高親和力或較大力與靶分子結合的那些肽以後，和任選地還在從靶分子和肽的複合體中去除靶分子以後，可以隨後表徵各個肽。在表徵前，任選地如例如通過增殖編碼肽的噬菌體來實現擴增步驟。表徵優選包含將靶結合肽測序。基本上，肽不受它們的長度限制，然而在各種方法中優選獲得優選長度約為8-20個胺基酸的肽。文庫的大小可以為約102至1018，優選108至1015種不同的肽，然而不限於此。
一種具體形式的靶結合多肽是所謂的「抗促成素」，其尤其在德國專利申請DE 197 42 706中描述。
按照本發明，蛋白激酶Nβ蛋白質以及編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以在篩選方法中用作製備或開發治療本文所述疾病和本文所述疾病症狀的藥物的靶，以及製備和/或開發用於診斷所述疾病和所述症狀的工具，其中在篩選方法中使用小分子或小分子文庫。該篩選包含同時或順序將靶分子與優選來自上面指定文庫的那些的單個小分子或多種小分子接觸的步驟，和鑑定與靶分子結合的那些小分子或文庫成員，其如果連同其它小分子篩選，可以從未結合或未相互作用的小分子中分離。應當認識到結合和未結合可強烈受具體的實驗設定影響。在改變反應參數的嚴謹度方面可以改變結合和未結合的程度，這允許微調該篩選方法。優選地，在鑑定一種或幾種與靶分子特異相互作用的小分子以後，可以進一步表徵該小分子。這種進一步表徵可以例如在於鑑定小分子和確定其分子結構和另外的物理、化學、生物和/或醫學特性。優選地，天然化合物具有約100-1000Da的分子量。還優選地，小分子是遵守本領域技術人員已知的Lepinsky五項法則的那些。備選地，與優選非合成的天然產物相反，還可以限定小分子以使它們是優選產生於組合化學的合成小分子。然而，應當注意這些定義是僅幫助對本領域各個術語的一般理解。
還屬於本發明範圍內的是將蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸用作製備或選擇適體和spiegelmer的靶分子，其然後可以直接或間接用作藥物或診斷劑。
適體是單鏈或雙鏈的並且與靶分子特異性相互作用的D-核酸。適體的製備或選擇例如在歐洲專利EP 0 533 838中描述。基本上實現下列步驟。首先，提供核酸即潛在適體的混合物，其中每個核酸典型地包含幾個、優選至少8個順序隨機化的核苷酸的片段。該混合物隨後與靶分子接觸，其中如基於與候選混合物相比，對靶增加的親和力或與其的更大力，核酸與靶分子結合。結合核酸隨後從混合物的剩餘部分中分離。任選地，使用例如聚合酶鏈式反應擴增如此獲得的核酸。這些步驟可以重複數次最終提供與靶特異性結合的核酸比率提高的混合物，然後從中任選地選擇最終結合核酸。這些特異性結合的核酸稱為適體。明顯的是在產生或鑑定適體的方法的任何階段，可以取單個核酸混合物樣品來使用標準技術測定其序列。在本發明範圍內的是可以例如通過引入產生適體的本領域技術人員已知的限定化學基團來穩定適體。該修飾可以例如在於在核苷酸糖部分的2』-位引入氨基。適體當前用作治療劑。然而，還屬於本發明範圍內的是如此選擇或產生的適體可以用於靶驗證和/或作為先導物質用於開發藥物，優選基於小分子的藥物。這實際上通過競爭測定完成，其中靶分子和適體之間的特異相互作用受候選藥物的抑制，候選藥物從靶和適體的複合體中替代適體，可以假定各個候選藥物允許特異性抑制靶和適體之間的相互作用，和如果相互作用是特異性的，所述候選藥物至少在原則上將適合於阻斷靶和因此在各種包含該靶的系統中降低其生物有效性或活性。如此獲得的小分子可以然後進行進一步的衍生化和修飾以優化其物理、化學、生物和/或醫學特性如毒性、特異性、生物可降解性和生物利用度。
基於類似原理產生或製備spiegelmer，其可以按照使用蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸的本發明使用或產生。Spiegelmer的製備在國際專利申請WO 98/08856中描述。Spiegelmer是L-核酸，這意味著它們由L-核苷酸組成，不同於如適體由D-核苷酸組成的適體。Spiegelmer其特徵在於它們在生物系統中具有極高穩定性和與適體相比與它們針對的靶分子特異性相互作用的事實。為了產生spiegelmer，產生D-核酸異質群體並將該群體與靶分子的旋光對映體接觸，在本情形中例如與天然存在的蛋白激酶Nβ的L-對映異構體的D-對映異構體接觸。隨後，分離不與靶分子的旋光對映體相互作用的那些D-核酸。然而，分離與靶分子的旋光對映體相互作用的那些D-核酸，任選地測定和/或測序和隨後基於獲自D-核酸的核酸序列信息合成相應的L-核酸。序列和與靶分子的旋光對映體相互作用的上述D-核酸相同的這些L-核酸，將特異性地與天然存在的靶分子而不是與其旋光對映體相互作用。類似於產生適體的方法，還可以重複各個步驟數次和由此富集與靶分子的旋光對映體特異性相互作用的那些核酸。
基於本文公開的作為靶分子的蛋白激酶Nβ或編碼蛋白激酶Nβ的核酸可以製備或產生的另一類化合物是核酶，反義寡核苷酸和siRNA。
所有上述核酸的共同特徵是它們不與靶分子在翻譯產物水平上(在本情形中蛋白激酶Nβ)相互作用，而是與轉錄產物(即編碼蛋白激酶Nβ的核酸如基因組核酸或其衍生的任何核酸如分別地相應的hnRNA，cDNA和mRNA)相互作用。因此，上述類別的化合物的靶分子優選為蛋白激酶Nβ的mRNA。
核酶是有催化活性的核酸，優選由基本上包含兩部分的RNA組成。第一部分顯示催化活性而第二部分負責與靶核酸(在本情形中編碼蛋白激酶Nβ的核酸)的特異相互作用。當靶核酸和核酶的第二部分之間典型地通過兩條雜交鏈上基本上互補的鹼基序列雜交和沃森-克裡克鹼基配對相互作用時，催化活性部分可變得有活性，這意味著它在分子內或分子間催化靶核酸，假定核酶的催化活性是磷酸二酯酶活性。隨後，可以進一步降解靶核酸，由於缺乏新合成的蛋白激酶Nβ和在先存在的蛋白激酶Nβ的更新，最終導致靶核酸以及衍生於所述靶核酸的蛋白質(在本情形中為蛋白激酶Nβ)的降解。核酶，它們的應用和設計原理為本領域技術人員已知，例如在Doherty和Doudna(Ribozym structures and mechanism.Annu ref.Biophys.Biomolstruct.2001；30457-75)和Lewin Hauswirth(RibozymeGene TherapyApplications for molecular medicine.200 17221-8)中描述。
反義寡核苷酸分別在製備藥物和作為診斷劑中的應用是基於類似的作用方式。基本上，基於鹼基互補性反義寡核苷酸與靶RNA、優選與mRNA雜交，由此激活RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶聯的DNA激活。然而，除了硫代磷酸酯偶聯的DNA以外，磷酸二酯偶聯的DNA被細胞核酸酶迅速降解。這些抗性的非天然存在的DNA衍生物與RNA雜交後不抑制RNase H。換句話說，反義多核苷酸僅作為DNA RNA雜交複合體有效。這類反義寡核苷酸的實例尤其在美國專利US 5,849,902和US5,989,912中描述。換句話說，基於靶分子(在本情形中為編碼蛋白激酶Nβ的核酸)的核酸序列，其來自從中原則上可以推斷各自核酸序列的靶蛋白質，或通過知道如特別是mRNA的核酸序列，基於鹼基互補的原理可以設計適當的反義寡核苷酸。
特別優選的是含有短序列的硫代磷酸酯DNA(3-9個鹼基)的反義-寡核苷酸。激活細菌RNase H需要最少3個DNA鹼基，哺乳動物RNase H激活需要至少5個鹼基。在這些嵌合寡核苷酸中，存在形成RNase H的底物的中央區域，側鄰由不形成RNase H的底物的修飾核苷酸組成的雜交「臂」。例如通過2』-O-甲基或2』-氟可以修飾嵌合寡核苷酸的雜交臂。備選方法在所述臂中使用膦酸甲酯或氨基磷酸酯鍵。用於實施本發明的反義寡核苷酸的另外實施方案是對甲氧基寡核苷酸，部分對甲氧基寡脫氧核糖核苷酸或對甲氧基寡核苷酸。
對於本發明特別相關和有用的是在上述兩個US專利中更具體描述的那些反義寡核苷酸。這些寡核苷酸不含有天然存在的5′→3′-連接的核苷酸。然而寡核苷酸具有兩類核苷酸激活RNase H的2』-脫氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2』-修飾核苷酸。2』-修飾核苷酸之間的鍵可以是磷酸二酯，硫代磷酸酯或對乙氧基磷酸二酯。通過連續的RNase H-激活區域完成RNase H的激活，該區域在3和5之間含有激活細菌RNase H的2』-脫氧硫代磷酸酯核苷酸和在5和10之間含有激活真核的、特別是哺乳動物RNase H的2』-脫氧硫代磷酸酯核苷酸。防止降解的保護是通過使5』和3』末端鹼基高度抗核酸酶和任選地通過放置3』末端保護基團來完成。
更具體地，反義寡核苷酸包含5』末端和3』末端；11-59 5′→3′-連接的核苷酸獨立地選自由2』-修飾磷酸二酯核苷酸和2』-修飾的對烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組；和其中5』-末端核苷酸與3個和10個連續硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸之間的RNase H激活區域連接，和其中所述寡核苷酸的3』-末端選自由反向脫氧核糖核苷酸、1-3個硫代磷酸酯2』-修飾核糖核苷酸的連續序列、生物素基團和對烷氧基磷酸三酯核苷酸組成的組。
還可以使用反義寡核苷酸，其中不是5』末端核苷酸而是上述3』末端核苷酸與RNase H-激活區域連接。而且，5』末端選自特定組而不是所述寡核苷酸的3』末端。
適當的和有用的反義寡核苷酸還有以下那些包含5』末端RNase H激活區域和在5個和10個連續脫氧硫代磷酸酯核苷酸之間；在11-59個連續5′→3′-連接的2』-甲氧基核糖核苷酸之間含有RNase H激活區域；和核酸外切酶封閉基存在於寡核苷酸的3』末端，其來源於由非-5′-3′-磷酸二酯-連接的核苷酸，1-3個連續的5′-3′-連接的修飾核苷酸和非核苷酸化學封閉基組成的組。
如下可以表徵兩類特別優選的反義寡核苷酸第一類反義寡核苷酸，在本文中也稱為第二代反義寡核苷酸，包含總共23個核苷酸，其包含5′→3′方向的7個2』-O-甲基核糖核苷酸的一段序列，9個2』-脫氧核糖核苷酸的一段序列，6個2』-O-甲基核糖核苷酸的一段序列和3』-末端2』-脫氧核糖核苷酸。從7個2』-O-甲基核糖核苷酸的第1個基團開始，首先4個是硫代磷酸酯連接，而隨後4個2』-O-甲基核糖核苷酸是磷酸二酯連接。此外，在最後一個即2』-O-甲基核糖核苷酸的最3』-末端和由9個2』-脫氧核糖核苷酸組成的序列的第一個核苷酸之間存在磷酸二酯鍵。所有2』-脫氧核糖核苷酸是硫代磷酸酯連接。硫代磷酸酯還存在最後一個即最3』-末端的2』-脫氧核苷酸和隨後由6個2』-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個2』-O-甲基核糖核苷酸之間。從6個2』-O-甲基核糖核苷酸的該基團開始，它們中的首先4個，再次以5′→3′方向，是磷酸二酯鍵連接的，而它們中的最後3個，對應於位置20-22，是硫代磷酸酯連接的。最後一個，即末端3』-末端2』-脫氧核苷酸通過硫代磷酸酯鍵與最後一個即最3』-末端2』-O-甲基核糖核苷酸連接。
該第一類也可以通過參考下列示意性結構描述RRRnnnnNNNNNNNNNnnnRRRN。因此，R表示硫代磷酸酯連接的2』-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；n表示2』-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)。
第二類特別優選的反義寡核苷酸，在本文中也稱為第三代反義寡核苷酸或GeneBlocs，也包含具有下列鹼基結構(5′→3′方向)的總共17-23個核苷酸。
在5』-末端存在反向無鹼基核苷酸，其是適合於賦予對外切核酸酶活性的抗性的結構和例如在WO 99/54459中描述。該反向無鹼基與磷酸二酯連接的5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸的序列連接。在該5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸的序列之後有7-9個2』-脫氧核糖核苷酸的序列，其全部都是硫代磷酸酯連接的。最後一個即最3』-末端的2』-O-甲基核糖核苷酸和包含2』-脫氧核苷酸的序列的第一個2』-脫氧核苷酸之間的連接是通過磷酸二酯鍵發生。與7-9個2』-脫氧核苷酸的序列鄰近，連接由5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸組成的序列。最後一個2』-脫氧核苷酸與稍後提及的由5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸組成的序列的第一個2』-O-甲基核糖核苷酸的連接是通過硫代磷酸酯鍵發生。5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸的序列是磷酸二酯連接的。在第二個5-7個2』-O-甲基核糖核苷酸序列的3』-末端連接另一個反向無鹼基。
該第二類還可以通過參考下列示意性結構描述(GeneBlocs代表第三代反義寡核苷酸，也具有下列示意性結構)帽-(np)x(Ns)y(np)z-帽或帽-nnnnnnnNNNNNNNNNnnnnnnn-帽。因此，帽代表兩個末端處的反向脫氧無鹼基或類似修飾；n代表2』-O-甲基核糖核苷酸(A，G，U，C)；N表示硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸(A，G，T，C)；x表示5-7的整數；y表示7-9的整數；和z表示5-7的整數。
應當注意整數x，y和z可以彼此獨立地選擇，儘管優選x和z在給定反義寡核苷酸中相同。因此，下列第三代反義寡核苷酸的鹼基設計或結構可以如下帽-(np)5(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)5-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)7(Ns)9(np)6-帽，帽-(np)5(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)7(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)7(np)7帽，帽-(np)5(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)7(Ns)8(np)7-帽，帽-(np)5(Ns)9(np)7-帽，帽-(np)6(Ns)9(np)7-帽和帽-(np)7(Ns)9(np)7-帽。
基於本文提供的技術教導可以產生的和可以用作藥物和/或診斷劑的另一類化合物是針對編碼蛋白激酶Nβ的核酸、優選mRNA的小幹擾RNA(siRNA)。siRNA是典型長度為約21至約23個核苷酸的雙鏈RNA。兩條RNA鏈之一的序列對應於待降解的靶核酸如編碼蛋白激酶Nβ的核酸的序列。換句話說，知道靶分子(在本情形中蛋白激酶Nβ)的核酸序列，優選mRNA序列，可以設計雙鏈RNA，兩條鏈之一與所述例如蛋白激酶Nβ的mRNa互補，當將所述siRNA應用於含有編碼蛋白激酶Nβ的基因、基因組DNA、hnRNA或mRNA的系統時，各自的靶核酸將被降解和因此降低各個蛋白質的水平。設計、構建和使用所述siRNA分別作為藥物和診斷劑的基本原理尤其在國際專利申請WO 00/44895和WO 01/75164中描述。
基於上述設計原理，一旦已知編碼蛋白激酶Nβ的核酸序列，可以分別產生這些siRNA，反義寡核苷酸和核酶。這對於核酸的前體分子如hnRNA、cDNA等包括基因組核酸也是正確的。當然，考慮到鹼基對互補的基本原理，優選基於沃森-克裡克鹼基配對，還知道各自的反義鏈可以允許設計基於這些核酸的化合物。因此，本發明的另一方面涉及針對蛋白激酶Nβ的或蛋白激酶Nβ特異性的特定siRNA，核酶和反義核苷酸。下面，這通過siRNA進一步舉例說明，然而這同樣適用於反義寡核苷酸和核酶，如本領域技術人員所公認的。
該siRNA包含優選15-25個核苷酸的長度，其中這實際上意味著包含15，16，17，18，20，21，22，23，24或25個核苷酸的任何長度。在另一實施方案中，siRNA甚至可以顯示更多的核苷酸。按照本領域公知的設計原理，可以產生各自的siRNA。因此，本文要求的siRNA包含優選15-25個連續核苷酸的任何核苷酸長度的一段序列，其至少部分與編碼PKN-β的有意義或反義鏈互補，第二條核糖核苷酸鏈，其分別與第一條鏈和因此編碼蛋白激酶N-β的反義鏈和有意義鏈至少部分互補。本領域已知的產生或製備siRNA的任何設計原理可以應用於該類雙鏈結構。本文公開的siRNA空間(space)包含siRNA分子，其反義鏈以對應於上述PKN-β編碼序列的第1個核苷酸的核苷酸開始。另外的這種siRNA分子以對應於上述PKN-β編碼序列的第2個核苷酸的核苷酸開始，等等。重複這種類型的對PKN-β編碼序列的掃描以便提供所有可能的可以針對PKN-β的siRNA分子。如此產生的任何siRNA分子的長度可以是適合於siRNA的任何長度，更具體地上述任何長度。優選地，除了反義鏈或有意義鏈最5』末端的核苷酸以外，本文公開的siRNA分子空間中的各種siRNA分子重疊。明顯的是如此獲得的反義序列必須通過鹼基配對互補以便形成功能活性siRNA所需的至少部分雙鏈的結構。
基於上述類別的化合物如抗體、肽、抗促成素、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸以及siRNA的作用方式，因此還屬於本發明範圍內的是使用分別靶向蛋白激酶N-β和編碼其的核酸的這些化合物中任何一種，以製備針對本文所述任何疾病和本文所述任何疾病症狀的藥物或診斷劑。另外，這些試劑可以用於分別監視所述疾病和疾病症狀的進展和施用的任何治療的成功。
按照本發明設計的各類化合物如抗體、肽、抗促成素、小分子、適體、spiegelmer、核酶、反義寡核苷酸和siRNA也可以包含在藥物組合物中。優選該藥物組合物用於治療本文所述疾病或本文所述疾病症狀。在一個實施方案中藥物組合物還可以包含一種或幾種上述類別的化合物和/或單一類別的一個或多個成員，和任選地另外的藥物活性化合物，和藥用載體。該載體可以是液體或固體，例如溶液，緩衝液，醇溶液等。適當的固體載體尤其是澱粉等。本領域技術人員已知的是提供按照上述類別的化合物的不同化合物的各種製劑，以便實現特定給藥途徑如口服、腸胃外、皮下、靜脈內、肌內等。
上述不同類別的化合物的各種化合物也可以單獨或組合附屬於或包含在試劑盒中。除了各種化合物以外該試劑盒另外包含一種或多種附加成分(element)或化合物，其中該成分選自包含緩衝液、陰性對照、陽性對照和各種化合物的使用說明的組。優選地，各種化合物以乾燥或液體形式存在，優選作為每次單一給藥的單位劑量存在。試劑盒可以特別用於治療、診斷或監視疾病或對本文所述疾病和疾病症狀施加的治療的進展。
現在通過下列附圖和實施例進一步舉例說明本發明，其不意欲限制保護範圍。從所述附圖和實施例中，可以理解實施方案和優勢，其中

圖1顯示生長因子誘導的PI3-激酶途徑激活的圖示；圖2顯示同位PC-3小鼠模型中在用雷帕黴素處理後淋巴結轉移的測量；圖3顯示鑑定PKNβ為PI3-激酶途徑下遊藥靶的實驗方法；圖4顯示對PKNβ的初級GeneBloc篩選；圖5顯示用PKNβ特異的GB轉染的PC3細胞在matrigel上的生長；圖6顯示通過在HeLaB細胞中瞬時表達siRNA的RNA幹擾；圖7顯示在使用蛋白激酶Nβ反義和有意義序列作為探針雜交後人前列腺細胞和人前列腺癌細胞的照片；圖8顯示描述使用兩種不同siRNA構建體的同位前列腺腫瘤模型中原發性腫瘤體積的圖表(圖8A)，描述使用兩種不同siRNA構建體的同位前列腺腫瘤模型中淋巴結體積轉移的圖表(圖8B)，和在使用對照siRNA(圖8C1)和蛋白激酶Nβ特異性siRNA構建體(圖8C2)的同位前列腺腫瘤模型中前列腺和淋巴結的照片；圖9顯示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它們的活性的蛋白質印跡分析，使用MPB作為標準磷酸化底物，在HeLa細胞中瞬時過量表達，抗-蛋白激酶Nβ抗體(抗-PK)用於檢測激酶衍生物的相對表達水平(圖9A)，另外的不同蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白質印跡分析，使用磷酸化形式的蛋白激酶Nβ的特異性抗體(圖9B)，和所用各種蛋白激酶Nβ衍生物的圖示(圖9C)；圖10顯示各種蛋白激酶Nβ衍生物的蛋白質印跡(圖10A)，監視其在HeLa細胞中的表達水平，和蛋白激酶Nβ衍生物的磷酸化的凝膠分析(圖10B)；圖11顯示檢測蛋白激酶Nβ的蛋白質底物磷酸化的免疫沉澱測定結果，通過蛋白質印跡法(圖11A)或通過放射自顯影檢測摻入32P-標記的磷酸鹽(圖11B)來檢測其磷酸化形式。為了確保在各個免疫沉澱物中存在可比較量的PKNβ，使用抗-PKNβ抗體重探測圖11A所示的濾液(「激酶」，圖11C)。
圖12顯示比較用LY294002處理不同時間的樣品中HeLa和PC-3細胞中內源蛋白激酶Nβ的表達的蛋白質印跡分析。平行監視磷酸化AKT的水平以證實PI3-激酶抑制劑的功效。
圖13顯示免疫-複合體中存在的各種重組PKNβ衍生物的相對蛋白質量和激酶活性。在裂解指定時間之前已經用PI3-激酶抑制劑LY294002處理表達各種重組蛋白質的細胞。
圖14顯示一組照片，其中通過聚焦螢光顯微鏡研究PKNβ及其衍生物如PKNβ野生型(圖14A)、PKNβ衍生物TA(圖14B)、PKNβ衍生物KE(圖14C)和PKNβδN(圖14D)的細胞分布。HA-標記的PKNβ重組衍生物在HeLa細胞中瞬時表達48小時。在固定和透化處理以後，通過使用抗-HA抗體接著FITC-偶聯的抗小鼠抗體檢測重組蛋白質的表達。通過用羅丹明-鬼筆毒環肽標記細胞骨架肌動蛋白來復染細胞。
圖1顯示生長因子誘導的PI3-激酶途徑激活的圖示。生長因子刺激細胞導致細胞膜上它們相關受體的激活，其又與胞內信號分子如PI3-激酶相關並將其激活。腫瘤抑制劑PTEN幹擾PI3-激酶介導的下遊應答和確保途徑的激活以瞬時方式發生。LY294002是PI3-激酶的小分子抑制劑。PI3-K的一個已知下遊基因是mTOR(雷帕黴素的哺乳動物靶)，其可以通過臨床批准的藥物雷帕黴素(Rapamune)抑制。PI3-K涉及細胞增殖、細胞存活、葡萄糖轉運、翻譯、轉移和遷移的調節。X表示下遊效應物，其表示預計涉及促進癌細胞轉移行為的潛在藥物靶。在途徑中作用於更下遊的該類效應物分子可能代表比更「上遊」的靶如mTOR更好的藥靶，因為它們具有較小的多效作用。
結合下列實施例更詳細地討論圖2至圖5的主題。
圖6顯示通過在HeLaB細胞中瞬時表達siRNA幹擾。
(A)通過啟動子(U6+2)驅動表達靶特異序列(來源於目的基因的模板，含有21-鏈節的有意義和反向互補序列，連接12-鏈節的聚A序列)來產生siRNA分子。經轉錄後RNA可能形成雙鏈siRNA分子。
(B)siRNA表達的靶基因的模板序列。將相應的序列引入攜帶U6+2啟動子盒的表達載體。
(C)siRNA表達對細胞生長和增殖的影響。通過在用於RNAi幹擾實驗的HeLaB細胞中轉染瞬時表達構建體(見上文)。在轉染後48小時收穫細胞，隨後接種(80000個細胞/孔)在「matrigel」凝膠上。通過在matrigel上測定轉染細胞的生長/增殖來分析RNA幹擾對相應基因的表達的影響。靶向PTEN的siRNA的表達對matrigel上HeLaB細胞生長無影響(右圖)，而p110β和PKNβ特異的siRNA的表達嚴重幹擾HeLaB在matrigel上的生長行為(中圖和右圖)。
實施例1材料和方法細胞培養人前列腺癌PC-3細胞獲自美國典型培養物中心(ATCC)。細胞在F12K營養混合物(Kaighn’s改進)中培養，該營養混合物含有10％胎小牛血清(CS)，慶大黴素(50μg/ml)，和兩性黴素(50ng/ml)。按照製造商的使用說明，通過使用各種陽離子型脂質如Oligofectamine，Lipofectamine(LifeTechnologies)，Argfectin50或Profectin50(Atugen/GOT Berlin，Germany)，或FuGene 6(Roche)，在96孔或10-cm板中進行轉染(30％-50％匯合)。通過將預形成的無血清培養基中的5x濃縮的GeneBloc和脂質複合物加入完全培養基中的細胞來轉染GeneBlocs。對於平鋪在96孔中的細胞總轉染體積為100μl，對於10cm平板中的細胞為10ml。取決於細胞密度，最終脂質濃度為0.8-1.2μg/ml；GeneBloc濃度在每個實驗中顯示。將培養的細胞胰蛋白酶消化，在通過培養基終止胰蛋白酶作用後收穫。加入洗滌步驟(PBS；離心5分鐘/1000rpm)，最後，考慮接種的細胞數和體積重懸浮沉澱。
通過Taqman分析測定RNA水平的相對量使用Invisorb RNA HTS 96試劑盒(InVitek GmbH，Berlin)分離和純化在96-孔中轉染的細胞的RNA。使用300nM PKNβ5』引物，300nM PKNβ3』引物和100nM標記的PKNβTaqman探針Fam-Tamra，通過實時RT-PCR(Taqman)分析檢測PKNβmRNA表達的抑制。按照製造商的使用說明在下列條件下在50μl中進行反應並在ABI PRISM 7700測序儀(Applied Biosystems)上分析48℃30分鐘，95℃10分鐘，接著95℃15秒和60℃1分鐘40個循環。
在matrigel基質上的體外生長當接種在Matrigel上時用5μM LY294002或DMSO處理PC3細胞。如果在接種前轉染細胞，用GeneBloc轉染細胞和在轉染後48小時胰蛋白酶消化。在培養基中洗滌細胞，接種到用250l matrigel基底膜基質(BectonDickinson)預包被的雙份24-孔(每孔100.000個細胞)中。在溫育24-72小時後用與Axiovert S100顯微鏡(Zeiss)連接的Axiocam照相機以5x放大率照相。
Affymetrix根據製造商的方案，使用總RNA試劑盒(AMBION)製備來自Matrigel上生長的細胞的總RNA。在最後步驟中將沉澱的總RNA重懸浮在Invisorb裂解緩衝液中並使用Invisorb spin細胞-RNA試劑盒(INVITEK)純化。根據Affymetrix的方案製備生物素標記的cRNA，將15μg cRNA雜交到Affymetrix GeneChip組HG-U95上。
數據分析使用Affymetrix GeneChip軟體Microarray Suite v4.0分析原始數據。作為一組對應於一個轉錄物的16-20個探針對的平均的與錯配寡核苷酸相比完全匹配寡核苷酸的雜交信號的差異，計算每個探針組的強度。探針組的平均差異與轉錄物的豐度成比例。在比較前將不同測定的總信號強度換算成相同值。通過成對比較來自實驗和基線測定的相應探針對的強度，使用Affymetrix軟體計算倍數變化。使用Affymetrix描述的抉擇矩陣，軟體還產生絕對調用(call)(在實驗中轉錄物缺乏，臨界或存在)和差異調用(與另一個實驗相比一個實驗中轉錄物的豐度增加，臨界增加，無變化，臨界降低，降低)。結果輸出到Microsoft Excel(絕對調用，差異調用，倍數變化)中並過濾。丟棄具有缺少調用或無變化調用的所有探針組並通過倍數變化將表分類。
動物研究按照食品與藥物管理局的非臨床實驗室研究的良好實驗室規範(GLP條例)和根據作為立法基礎的德國動物保護法進行體內實驗。
雄性shoeNMRI-nu/nu小鼠(Tierzucht Schnwalde GmbH)，在SPF條件下保養(層流氣流設備，Scantainer，Scanbur)，用作人前列腺癌細胞的受體。將2×106/0,03ml腫瘤細胞接種到年齡為6-8周和重28-30g的動物的前列腺的左背側葉(iprost；同位的)或肝臟的左側葉的頂部(ihep；異位的)。為此，小鼠接受全身麻醉，使用Ketanest(Parke-Davis GmbH)和Rompun(Bayer Vital GmbH)80∶1的混合物，劑量分別為100mg/kg和5mg/kg。在腹部身體表面徹底消毒後，通過腹部皮膚和腹膜壁進行切割，從包皮腺邊緣附近開始和測量約1cm。藉助一對鑷子和棉拭，顯現前列腺。同位細胞攻擊，接著藉助放大鏡和通過使用攜帶30G 0,30×13的微型手術針(Becton Dickinson)的1ml注射器(Henke Sass Wolf GmbH)。施用是成功的，在接種位點觀察到顯著皰疹。關於腹膜壁和腹部皮膚的Michel鉗11×2mm(Heiland)，通過縫合材料(PGA Resorba，Franz Hiltner GmbH)閉合傷口。傷口噴霧(Hansaplast Sprühpflaster，Beiersdorf AG)覆蓋損傷。在手術後階段期間將動物保養在溫暖環境中直至完全醒來。按照每組由5-10隻動物組成的治療組的數量隨機化動物。依次檢查它們，包括記錄發現。施用Ssniff NM-Z，10mm，可高壓滅菌(ssniff Spezialditen GmbH)，作為強化食物和通過HCl酸化飲用水，兩者都任意。
評估為了收到實際劑量水平，在治療日登記體重。同時，從體重發展可以獲得以認識治療方式對整個生物體的影響。
在第0(基線)；14；28；和35天(犧牲)進行血穿刺。從短期麻醉的動物(二乙醚，Otto Fischar GmbH)的眼眶靜脈中吸血。為治療的相容性和副作用提供數據的評估參數如下白細胞數；血小板數；酶。另外的血載參數是膽紅素；肌酸酐；蛋白質；脲；尿酸。
將所有犧牲的動物完全解剖並照相記錄。通過一對測徑器二維測量腫瘤(前列腺)和轉移瘤(尾部，腰部，腎淋巴結轉移瘤)。按照V(mm3)＝ab2/2計算體積，b＜a。通常，實施治療方法的細胞數導致關於前列腺100％的腫瘤吸收。登記一些器官(肝臟；脾；腎)的重量以便發現另外的關於了解次級副作用的數據。
對於組織學分析，將腫瘤組織，即前列腺腫瘤和淋巴結轉移瘤的樣品固定在5％甲醛中並包埋石蠟。常規地，將切片HE染色，如果需要製備特異染色(Azan，PAS)。
為了檢測腫瘤和轉移細胞的人源，將充分的組織樣品冷凍在液氮中。當使用PCR和用huHPRT特異擴增子的Taqman分析時，我們可以在5mg組織中檢測到50個人細胞。
通過Mann和Whitney u-檢驗統計學證實治療結果。
實施例2對下遊藥靶適合性概念的實驗證據如在結合於此作為參考的本說明書介紹部分中概述，與信號途徑下遊連接的靶對於設計或開發藥物和診斷劑都有價值。明顯的是，如果特定靶與其它不同途徑連接或者由於它在信號途徑中的位置與許多生物學現象連接如轉移和遷移、生長翻譯細胞調亡、細胞周期、DNA修復等，如在PI-3激酶的情形中，處理該靶的任何化合物可能具有多種副作用，其可能對系統有害和從醫學觀點來看是不希望有的。因此，進一步作用下遊的靶應當是治療幹預的第一選擇。
本發明人已經發現在PI3-激酶途徑的控制下涉及除了mTOR以外的另外可能的藥靶，其特異性用於控制轉移和遷移的現象和因此腫瘤發生。在製藥工業中已經發現以Rapamune的商品名出售的雷帕黴素適合於抑制轉移和遷移。這證實了處理下遊藥靶的策略的適合性。
如從圖2中可以知道，雷帕黴素適於減小淋巴結轉移瘤的體積和因此其效果比得上公知的PI3-激酶抑制劑LY294002。如在圖2A中描述，使用腫瘤獲得模型，在第1天開始使用雷帕黴素的處理。使用的兩個濃度，即0.4mg/kg/劑量-2mg/kg/劑量導致淋巴結轉移程度的巨大降低，表示為與磷酸鹽緩衝鹽水陰性對照相比測量的轉移瘤體積(mm3)。
對於組織學分析，將腫瘤組織，即前列腺腫瘤和淋巴結轉移瘤的樣品固定在5％甲醛中並包埋石蠟。常規地，將切片HE染色，如果需要製備特異染色(Azan，PAS)。
在從第28天開始處理的Rapamune處理確立(established)腫瘤模型的情形中也基本上獲得相同結果。
測量在用雷帕黴素(Rapamune)處理以後在同位PC-3小鼠模型中的淋巴結轉移。在圖2(A)中顯示(A)腫瘤獲得模型的結果。用0.03ml前列腺內2×106PC3細胞注射裸shoeNMRI-nu/nu小鼠(每組8隻)，每日腹膜內使用Rapamune進行處理，共28天，劑量為2mg/kg和0.4mg/kg。PBS用作對照。
為了處理確立的腫瘤(B)，允許細胞ipros生長28天，在移植後第29天至第50天口服使用Rapamune進行處理。如A中概述選擇劑量。分別在第29天和第51天犧牲動物，測定總淋巴結轉移。
實施例3鑑定PKNβ作為PI3-激酶途徑中的下遊藥靶基本實驗方法在圖3中顯示。用DMSO或PI3-K抑制劑LY294002處理在Matrigel上培養的PC3細胞，從每個樣品中分離總RNA。進行差異Affymetrix基因表達作圖，使用實時RT-PCR Taqman測定證實表達。將p110用作無差異的標準。PC3細胞是PTEN-/-的，這意味著腫瘤抑制劑PTEN確實在這些細胞中缺乏，以致PI3-激酶途徑被永久激活，導致細胞增加的轉移活性或行為，其表現為它們在matrigel測定中的生長模式。具有侵入生長潛力的細胞在基底膜如matrigel基質上顯示增強生長。(Petersen，O.W.，Ronnov-Jessen，L.，Howlett，A.R.和Bissell，M.J.(1992)Interaction withbasement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiationpattern of normal and malignant human breast epithelial cells.Proc Natl AcadSci U S A，89，9064-9068.(AuchSternberger et al.，2002 Antisense Nucleicacid drug development 12131-143)。
與其相關應當注意PC3細胞在matrigel上生長並將這當作接近體內環境的模型系統，從中分離的RNA假定比獲自生長在非-matrigel環境如常規細胞培養板中的細胞的任何製劑更接近原位情形或結果。
實施例4篩選針對蛋白激酶Nβ的最優反義寡核苷酸如所述用不同的GeneBloc濃度轉染PC3細胞，使用Taqman測定在轉染後24小時測定mRNA水平，該測定使用300nM PKNβ特異的正向和反向引物和100nM探針和人-肌動蛋白的40nM正向和反向引物和100nM探針。將mRNA水平對內部肌動蛋白水平標準化，顯示相對於GBC(用GeneBloc Control轉染的細胞)的量。
其結果在圖4中顯示。從圖4中，作為特別有利的反義寡核苷酸，選擇GeneBlocs 70210和70211用於進一步研究。
關於在各種實施例中本文使用的GeneBloc，應當注意它們都是本文指定的第三代反義寡核苷酸，這意味著，從表1中也是明顯的，大寫字母代表脫氧核苷核苷酸，其通過硫代磷酸酯而不是磷酸二酯鍵連接。
表1所用各種GeneBlocs、它們的別名、相對於靶核酸的錯配和它們的序列和結構特性的綜述
各種GeneBlocs對應於下列SEQ.ID.Nos70669SEQ.ID.No.370670SEQ.ID.No.424536SEQ.ID.No.524537SEQ.ID.No.624538SEQ.ID.No.770210SEQ.ID.No.870211SEQ.ID.No.970671SEQ.ID.No.1070676SEQ.ID.No.1170677SEQ.ID.No.12另外應當注意，考慮到以上反義寡核苷酸是GeneBlocs即第三代反義寡核苷酸的事實，以上的任何「t」實際上是「u」。
實施例5選擇性剔除蛋白激酶Nβ為了證明蛋白激酶Nβ是PI3-激酶途徑適合的下遊藥靶，將獲自實施例4的兩個特別有利的GeneBlocs用於基於matrigel的生長實驗。將Matrigel生長實驗當作顯示各個細胞轉移和遷移行為的替代模型。將更匯合的細胞生長當作它們的轉移和遷移行為增加的指示，這允許細胞擴展到matrigel提供的三維結構上。
如所述轉染PC3細胞並接種在matrigel上，監視生長。從接種在matrigel上的等份細胞中分離mRNA，並使用Taqman測定分析(作圖)。將PKNβ特異的mRNA對內源p110αmRNA水平標準化。將PTEN特異的GeneBloc用作PTEN-/-PC-3細胞中的陰性對照，將p110α特異的GeneBloc用作胞外基質中生長的陽性對照。通過分別比較PKNβ特異的GeneBloc 70210或70211和它們對應的錯配寡核苷酸70676和70677處理的細胞的生長，顯示特異的生長抑制。
各自的結果也在圖5中舉例說明。從這可以知道基因塊70211和70210可能是製備治療本文所述疾病和疾病症狀的藥物或診斷劑的適當化合物。
實施例6通過在HeLaB細胞中瞬時表達siRNA的RNA幹擾本實驗是成功設計允許特異性處理下遊藥靶蛋白激酶Nβ的siRNA的實例。如圖6(A)所示，通過啟動子(U6+2)驅動表達靶特異序列(來源於目的基因的模板，含有21-鏈節的有意義和反向互補序列，連接12-鏈節的聚A序列)來產生siRNA分子。經轉錄後RNA可能形成雙鏈siRNA分子。
在與針對PKNβ的mRNA序列設計的siRNA相同的載體構建體中，將各種構建體如p110β和PTEN分別用作陽性和陰性對照。各自的設計在圖6中顯示。(B)是siRNA表達的靶基因的模板序列，將其導入攜帶U6+2啟動子盒的表達載體。
通過轉染到用於RNAi幹擾實驗的HeLaB細胞中瞬時表達構建體。在轉染後48小時收穫細胞，隨後接種(80000個細胞/孔)在「matrigel」上。通過測定在matrigel上轉染細胞的生長/增殖來分析RNA幹擾對相應基因的表達的影響。靶向PTEN的siRNA的表達對matrigel上HeLaB細胞生長無影響(右圖)，而p110β和PKNβ特異的siRNA的表達嚴重幹擾HeLaB在matrigel上的生長行為(中圖和右圖)。
鑑於此，特定siRNA序列證明是治療本文公開的疾病和疾病症狀的有效方式。
實施例7在人前列腺腫瘤中檢測蛋白激酶Nβ為了提供進一步的證據證明蛋白激酶Nβ是治療前列腺腫瘤的適合的靶，將各種人前列腺組織進行原位雜交。
對於原位雜交從pCR4 Topo載體中序列NM 013355的核苷酸位置1672-2667製備有意義和反義鏈，因此將T7和T3聚合酶用於擴增目的。人前列腺腫瘤細胞(PC-3)在小鼠中生長。在解剖後，將組織冷凍在-20℃異戊烷溶液中，在-15℃切片並保存在-80℃。在雜交前將切片在多聚甲醛中固定。將人腫瘤標本在多聚甲醛中固定並石蠟包埋。將腫瘤標本用蛋白酶K處理並乙醯化。用35S-ATP和35S-UTP雙鏈標記核酸探針，並與組織在58℃在含有50％甲醯胺的雜交緩衝液(0.4M NaCl，50％甲醯胺，1xDenhardt’s，10mM Tris，1mM EDTA，10％葡聚糖硫酸酯，10μg/ml每種tRNA和鮭精DNA，10mM DTT)中溫育。
原位雜交的結果在圖7中描述。使用前列腺腫瘤原位雜交的蛋白激酶Nβ反義探針，腺被強烈染色(圖7A)。與其相反，健康的前列腺組織染色較少並且僅提供背景信號，再次使用反義探針(圖7C)。與其相反，關於兩種組織有意義探針的使用不提供任何信號。
實施例8通過siRNa體內減少原發性腫瘤和淋巴結轉移瘤本實施例涉及靶基因的體內證實，使用同位前列腺腫瘤模型，其中通過使用針對蛋白激酶Nβ的siRNA可以顯示原發性腫瘤和淋巴結轉移瘤的減少都可以實現。結果在圖8A-8C中描述。
在圖8A的圖表中，使用下列兩個siRNA構建體中任何一種可以顯著減小如實施例1中所述測定的同位前列腺腫瘤模型中的原發性腫瘤的體積5』actgagcaagaggctttggag或5』aaattccagtggttcattcca。
作為陰性對照使用針對p110-α亞基的siRNA，作為陽性對照使用針對p110-β亞基的siRNA。陽性對照因此作用於蛋白激酶NβPTEN的上遊調節物。
另一組兩個獨立的siRNA分子被用於降解淋巴節轉移瘤中編碼蛋白激酶Nβ的mRNA。淋巴結轉移瘤是在下列淋巴結中發現的繼發性腫瘤尾部，腰部，腎和縱隔淋巴結，其中尾淋巴結與前列腺最近，縱隔淋巴結與移植腫瘤最遠。如在原發性腫瘤的情形中，siRNA構建體明顯成功地減少了編碼蛋白激酶Nβ的mRNA和由此減小了腫瘤體積(圖8B)。陽性和陰性對照如關於原發性腫瘤減小所討論的。在兩種情形(即原發性腫瘤和淋巴結轉移瘤)中，將人前列腺腫瘤細胞遺傳改造以從聚合酶III U6啟動子表達各自的siRNA分子。
除了這些結果以外，如圖8C1和圖8C2所描述的清楚的表型分析顯示經激活人前列腺腫瘤細胞中的siRNA構建體轉錄後，可以顯著減少淋巴結轉移瘤，在圖8C1中描述的腫脹的淋巴結在如圖8C2描述的siRNA處理的組織中不存在。
實施例9蛋白激酶Nβ的功能表徵本實施例涉及蛋白激酶Nβ的功能表徵，更具體地涉及衍生化，即截短或突變蛋白激酶Nβ的功能胺基酸殘基對其激酶活性和對其激酶活性受磷酸化調節的影響。
如也在圖9C中至少部分用示意圖描述，產生下列蛋白激酶Nβ的衍生物，胺基酸殘基是指本文公開的野生型序列a)包含胺基酸535-889的激酶結構域；b)包含胺基酸288-889的ΔN；c)在位置588處具有賴氨酸至精氨酸的突變的激酶結構域；d)在位置588處具有賴氨酸至穀氨酸的突變的激酶結構域；e)激酶結構域的衍生物，其在磷酸化位點(AGC激活環共有序列)具有突變，胺基酸位置718的蘇氨酸殘基被改變為丙氨酸(TA718)或天冬氨酸或穀氨酸(TD718或TE718)；和f)全長野生型PKNβ分子(889個胺基酸)。
將各自片段在HeLa細胞中瞬時表達。它們的相對表達通過Hela細胞提取物使用抗-PKNβ抗體的蛋白質印跡分析測定。
在大腸桿菌中過量表達PKNβ的C-末端胺基酸(609-889)以後產生多克隆抗-PKNβ抗血清。按照標準方法從包函體中凝膠純化各種蛋白質片段，回收並濃縮。
蛋白激酶Nβ在其C-末端的催化結構域與AGC-類型的激酶分子具有同源性。該激酶家族其特徵在於催化結構域的激活環中保守的蘇氨酸殘基，為了酶促活性需要將其磷酸化。由於該蘇氨酸和激活環周圍胺基酸的高保守性，針對該位點的抗-磷酸抗體可從商業來源中獲得。在圖9中將這些各種抗體稱為抗-P*-PRK，在圖10中稱為抗-P*-AGC激酶。
MPB是髓鞘鹼性蛋白，其是標準體外磷酸化底物。
獲得下列結果
*+有活性-無活性！沒有觀察到如可以從其它激酶可比較的突變中期望的「超活化」(Morgan和Debond，1994)。
結果在圖9中描述。
圖9A顯示不同蛋白激酶Nβ衍生物和它們的活性的凝膠分析，使用MPB作為標準磷酸化底物，在HeLa細胞中瞬時過量表達。如可以從圖9A中獲知，除了全長蛋白激酶Nβ以外，僅其野生型形式的激酶結構域在磷酸化MPB中有活性。
使用相同的蛋白激酶Nβ衍生物，可以觀察到除了包含在位置718處具有突變T/A的激酶結構域的衍生物以外，無論它們另外的內在活性，所有展示的其它衍生物也被磷酸化。
數據顯示功能激酶結構域的存在和位置718處的磷酸化是PKNβ激酶活性的前提條件。然而，如從ΔN形式不能用作激酶可以得出結論，它們是不足夠的。數據還顯示PKNβ在胺基酸718處不自磷酸化，而是需要通過另外的激酶分子磷酸化，因為激酶缺陷型KR588突變體蛋白質在位置718處保持磷酸化。
實施例10全長PKNβ的表徵為了分析全長分子中蛋白激酶Nβ的功能胺基酸殘基的突變，如圖10和11所示進行下列實驗為了測量PKNβ的體外激酶活性，重組HA-或Myc-標記的PKNβ衍生物在HeLa或COS-7細胞中瞬時表達。較小的激酶結構域衍生物用作對照。平行用如實施例9所述抗-蛋白激酶Nβ抗體(圖10A)探測含有重組形式的蛋白激酶Nβ的細胞提取物，以證明可比較的表達水平，和用抗-磷酸AGC位點抗體(也稱為抗-P*-AGC-激酶)(圖10B)檢測以顯示蛋白激酶Nβ衍生物體內不同磷酸化程度。
實施例11全長蛋白激酶Nβ的活性的磷酸化要求和開發非放射性體外激酶測定-蛋白激酶Nβ對HTS測定的適合性通過使用抗-標記抗體從圖10所示細胞提取物中免疫沉澱PKNβ-衍生的分子。如所述(Klippel等，1996)洗滌免疫沉澱並分成兩半。一半與緩衝液中作為磷酸化底物的5μg MBP(UBI)，4mM MgCl2和γ-32P-ATP在室溫下溫育10分鐘。另外，如Klippel等，1998加入磷酸酶抑制劑和非特異性作用的激酶的抑制劑。在通過16％SDS-PAGE分離反應產物以後通過放射自顯影檢測放射性磷酸鹽的摻入(圖11B)。
將免疫沉澱的第二半份與作為磷酸化底物的1μg GST-GSK3融合蛋白(Cell Signaling Technology)在200μM rATP的存在下溫育。隨後通過8-16％梯度SDS-PAGE和使用抗-磷酸GSK3α抗體(Cell SignalingTechnology)的蛋白質印跡法分析反應混合物(圖11A)。任何提取濾液和用抗-PKNβ抗血清重探測以證實各自免疫沉澱中可比較量的PKNβ蛋白質的存在(圖11C)。
通過與活性蛋白平行分析激酶缺陷型變體(例如在ATP結合位點含有突變，參見以上)控制體外磷酸化反應的特異性。
其它為全長野生型蛋白激酶Nβ，在蛋白激酶Nβ的胺基酸718處TA突變變體的情形中缺乏信號顯示該胺基酸殘基確實是抗體檢測的磷酸化位置(圖10B)。激酶缺陷型變體(如圖10和圖9分別顯示的KE或KR突變)在該位點被磷酸化的事實顯示蘇氨酸718不是自磷酸化的底物。而細胞中的另一種激酶必須負責該位點的磷酸化，其中PDK1是可能的候選物。
此外，從該實驗結合實施例9的實驗，顯示位置718處的蛋白激酶Nβ的磷酸化是蛋白激酶Nβ活性的前提條件；所有在該位點檢測的突變抑制磷酸化和導致無活性的激酶分子。因此特別優選的可以結合本文公開的本發明任何方面使用的蛋白激酶Nβ是在位置718處磷酸化的蛋白激酶Nβ或其衍生物，包括如本文所述僅包含激酶結構域的衍生物。數據進一步顯示全長PKNβ也不在胺基酸718處自磷酸化，而是需要通過另一激酶分子磷酸化，因為激酶缺陷型KE588突變蛋白質在位置718處保持磷酸化。
如可以從圖11中看出，可以將測定蛋白激酶Nβ的活性修改為允許篩選蛋白激酶Nβ抑制劑至高通量系統中的形式。
第一步，確定非放射性篩選形式的適合性，其中將如已經結合實施例10討論的各種蛋白激酶Nβ衍生物用於磷酸化適當底物。該底物可以例如是MBP或GSK3肽，其典型地固定在適當載體如瓊脂糖或sepharose珠或在塑料表面上。在本情形中和如圖11A所描述，底物是與副肌球蛋白融合的GSK3-衍生的肽。第一行顯示所有使用不同蛋白激酶Nβ衍生物的各種測定實際上含有所述衍生物。僅全長野生型蛋白激酶Nβ或如實施例9所定義的激酶結構域適合於磷酸化底物。通過抗-磷酸GSK3α抗體(以上所述)檢測本情形中的磷酸化底物。
為了確認在圖11A中描述的非放射性方法足夠敏感，用一半免疫沉澱物使用MBP作為磷酸化底物平行進行放射性方法。激酶活性的效力可以從產生的磷酸化的底物的量獲得，如摻入[32P]後放射自顯影所示。如從圖11A和11B中可以看出，全長野生型蛋白激酶Nβ以及激酶結構域顯示活性，而使用全長KE和全長TA突變蛋白質分別未檢測到(圖11A)或檢測到非特異性激酶的背景活性(圖11B)。
總之，全長野生型蛋白激酶Nβ以及本文公開的激酶結構域的使用是設計HTS形式的篩選方法的適當靶或工具。各種步驟將因此包含a)鑑於蛋白質需要被磷酸化以顯示激酶活性而這不容易通過在細菌系統中表達完成的事實，通過在非細菌表達系統如昆蟲細胞系統中(關於Klippel等，1997中不同激酶的實例)表達產生純化的重組蛋白激酶Nβ蛋白質；b)固定化GSK3-衍生的底物或類似底物，和將底物與純化的蛋白激酶Nβ在rATP，MgCl2和抑制劑的存在下在緩衝液中溫育；c)任選地在連續洗滌和進一步任選地隨後在Delfia或Lance測定系統(Perkin Elmer)中顯影后，通過適當檢測工具如抗體如抗-磷酸-GSK3抗體檢測底物磷酸化，其中磷酸化位點被Europium-標記的抗體結合。結合的Europium的量然後通過時間分辨螢光分析來定量。
實施例12內源性PKN-β的表達水平測定在本實施例中提供實驗證據證明PKN-β以PI3-激酶依賴型方式表達。圖3中顯示的PKN-βRNA的PI3-激酶-依賴型表達在此進一步在蛋白質水平上證實。
如本文實施例1所述培養PC-3細胞。所述PC-3細胞是PTEN-/-。HeLa細胞獲自美國典型培養物中心(ATCC)並如Sternberger等(2002)所述培養。轉染在10-m板中進行(30％-50％的匯合)，按照製造商的使用說明使用Fugene 6(Roche，Nutley，NJ)。將培養的細胞胰蛋白酶消化，在通過培養基終止胰蛋白酶作用以後收穫。
用10μM LY294002或DMSO處理兩種細胞類型，即PC-3細胞和HeLa細胞指定時間，其中將DMSO用作LY294002的溶劑和因此作為陰性對照。
通過SDS-PAGE分級獲得的提取物，隨後通過蛋白質印跡法分析。使用各種抗體檢測所示蛋白質如用作加樣對照的p110、內源性PKN-β和磷酸化Akt的水平。磷酸化Akt(P*-Akt)用作LY294002-介導的處理的功效的對照。
結果在圖12中描述。
在PC-3細胞中PI-3-激酶的抑制導致內源性PKN-β表達在24小時後可見的降低，在48小時處理後蛋白質水平進一步降低。在表達較高量的PKN-β蛋白質的HeLa細胞中，該作用較不顯著，但是在用LY294002處理48小時後可以檢測到減少的量。
從這可以得出結論，PI3-激酶控制PKN-β的表達。
實施例13PKN-β活性需要PI3-激酶在HeLa細胞中瞬時表達重組野生型PKN-β或PKN-β的衍生物(如圖10-11中描述)。所述衍生物是如本文實施例10所述的PKN-β衍生物TA和衍生物KE。在每種情形中如上所述通過myc-標記修飾PKN-β，其允許使用抗-Myc抗體沉澱PKN-β及其衍生物。
為了評估PKN-β的活性，如上所述進行使用免疫沉澱的體外激酶活性。一半沉澱進行體外激酶反應，第二半份通過使用抗-磷酸-PRK抗體的蛋白質印跡法分析。提取濾液並使用抗-PKN-β抗血清重探測。從較早提取的細胞裂解液等分部分中分析磷酸-p70 S6激酶水平，以證實甚至僅在3小時處理後LY294002處理的功效。抗-磷酸p70抗體獲自Cell signaling。
如從圖13可以看出，LY294002處理導致PKN-β激酶活性的強烈抑制，該活性在此再次通過MBP的磷酸化來測量。在僅3小時的處理後，該效果是明顯的，在24小時PKN-β活性幾乎完全被抑制。在LY294002抑制PI3-激酶後也損害PKN-β在位置718處的磷酸化，然而該影響沒有對激酶活性的影響明顯。
PKN-β的TA衍生物用作如上所述的無活性對照，和作為抗-磷酸PRK抗體對位置718(P*-PK)處的磷酸-蘇氨酸的特異性的對照。
PKN-β衍生物KE用作如上所述的激酶缺陷型對照。它的磷酸化狀態似乎在某種程度上還受LY294002處理的影響。這顯示負責在位置718上磷酸化PKN-β的激酶以PI3-激酶依賴型方式完成。
更重要地，本實驗顯示PKN-β不僅受PI3-激酶通過它的表達水平調節(參見圖3和12)，它還在它激活水平上受調節。這些發現顯示PKN-β代表用於幹擾超活性的PI3-激酶途徑以治療幹預的「完美的」下遊靶，因為它完全依賴於在各種水平上由它調節的PI3-激酶。這允許產生對蛋白質PKN-β和編碼其的核酸顯示不同效果的化合物。甚至更重要的，這種PKN-β在翻譯而不是轉錄水平上、即在表達的蛋白質水平上的活性調節，似乎比轉錄水平上的影響更顯著和更持久。
按照本發明另外的篩選方法是基於這種特別的理解和在體外激酶測定中優選使用放射性或非放射性作為讀出。
實施例14PKN-β的定位信號在本實驗中將各種PKN-β衍生物的定位與野生型PKN-β的定位比較。圖14顯示照片，其中通過聚焦螢光顯微鏡研究PKN-β及其衍生物如PKN-β野生型(圖14A)、PKN-β衍生物TA(圖14B)、PKN-β衍生物KE(圖14C)和PKN-βΔN(圖14D)的細胞分布。HA-標記的PKN-β重組衍生物在HeLa細胞中瞬時表達48小時。在固定和透化後，通過使用抗-HA抗體接著FITC-偶聯的抗-小鼠抗體來檢測重組蛋白質的表達。通過用羅丹明-鬼筆毒環肽標記細胞骨架肌動蛋白來復染細胞。
結果在圖14A-14D中描述，其中在每對照片的左側涉及經FITC-特異激發的細胞照片，右方照片顯示經使用羅丹明-鬼筆毒環肽特異的波長激發後的相同細胞。FITC-染色顯示用各種重組蛋白質轉染的細胞。羅丹明-鬼筆毒環肽染色顯示轉染和未轉染的細胞。
如可以從圖14A中獲得，野生型PKN-β主要定位於細胞核。PKN-βTA的磷酸化位點突變體和KE突變體都是激酶缺陷型，與野生型PKN-β相比不再濃縮在核內，而是擴散在整個細胞中。最後，如圖14D中所描述，PKN-β衍生物ΔN，缺少分子N-末端的三個和也是激酶缺陷型(參見圖9)，基本上排除在核以外。
這些數據顯示PKN-β對核的適當核定位取決於它作為活性激酶分子的能力和涉及它N-末端結構域的存在。這暗示PI-3激酶可能也調節它的細胞定位。
在說明書、序列表、權利要求和/或附圖中公開的本發明特徵可以單獨地或以任何組合作為實現本發明各種形式的材料。
序列表110atugen AG120蛋白激酶Nβ的另外應用130A 19015 PCT16012170PatentIn version 3.12101211889212PRT213人類220蛋白激酶Nβ(PKNβ)221MISC FEATURE222(1)..(889)223
4001Met Glu Glu Gly Ala Pro Arg Gln Pro Gly Pro Ser Gln Trp Pro Pro1 5 10 15Glu Asp Glu Lys Glu Val Ile Arg Arg Ala Ile Gln Lys Glu Leu Lys20 25 30Ile Lys Glu Gly Val Glu Asn Leu Arg Arg Val Ala Thr Asp Arg Arg35 40 45His Leu Gly His Val Gln Gln Leu Leu Arg Ser Ser Asn Arg Arg Leu50 55 60Glu Gln Leu His Gly Glu Leu Arg Glu Leu His Ala Arg Ile Leu Leu65 70 75 80Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Ala Glu Pro Val Ala Ser Gly Pro Arg85 90 95Pro Trp Ala Glu Gln Leu Arg Ala Arg His Leu Glu Ala Leu Arg Arg100 105 110Gln Leu His Val Glu Leu Lys Val Lys Gln Gly Ala Glu Asn Met Thr115 120 125His Thr Cys Ala Ser Gly Thr Pro Lys Glu Arg Lys Leu Leu Ala Ala130 135 140Ala Gln Gln Met Leu Arg Asp Ser Gln Leu Lys Val Ala Leu Leu Arg145 150 155 160
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221mRNA
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221misc_feature222(16)..(21)223RNA40012ucagagctta gttggcguug u 2權利要求
1.蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物作為PI 3-激酶途徑的下遊靶、優選作為PI 3-激酶途徑的下遊藥靶的應用。
2.蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物在製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑中的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
3.按照權利要求1或2的應用，其特徵在於蛋白激酶Nβ具有按照SEQ ID NO.1或按照資料庫登記號PID g7019489或資料庫登記號gi7019489的胺基酸序列，或其部分或衍生物。
4.編碼蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物的核酸在治療和/或預防疾病和/或製備用於診斷疾病的診斷劑中的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
5.按照權利要求4的應用，其特徵在於蛋白激酶Nβ具有按照SEQ IDNO.1或按照資料庫登記號PID g7019489或資料庫登記號gi 7019489的胺基酸序列，或其部分或衍生物。
6.按照權利要求4或5的應用，其特徵在於所述核酸是按照SEQ IDNO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸。
7.按照權利要求1，4或5任一項的應用，其中蛋白激酶Nβ由按照SEQ ID NO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸編碼。
8.按照權利要求4的應用，其中要不是遺傳密碼的簡併性所述核酸序列將與如權利要求4所述的核酸雜交。
9.按照前述權利要求中任何一項的應用，其中所述核酸序列是在嚴謹條件下與按照SEQ ID NO.2或按照資料庫登記號gi 7019488或NM_01335、優選NM_01335.1的核酸序列或其部分雜交的核酸序列。
10.按照權利要求2-9中任何一項的應用，其特徵在於所述疾病特徵在於與所述疾病有關的細胞缺少PTEN活性，顯示增加的攻擊行為，或是晚期腫瘤細胞。
11.按照權利要求2-10中任何一項的應用，其中所述疾病是晚期腫瘤。
12.一種篩選用於治療和/或預防疾病和/或製備用於診斷疾病的診斷劑的試劑的方法，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組，其包含以下步驟a)提供候選化合物，b)提供蛋白激酶Nβ的表達系統和/或檢測蛋白激酶Nβ活性的系統；c)將候選化合物與蛋白激酶Nβ的表達系統和/或檢測蛋白激酶Nβ活性的系統接觸；d)確定蛋白激酶Nβ的表達和/或活性是否在候選化合物的影響下改變。
13.按照權利要求12的方法，其特徵在於所述候選化合物包含在化合物文庫中。
14.按照權利要求12或13的方法，其特徵在於候選化合物選自包含肽，蛋白質，抗體，抗促成素，功能核酸，天然化合物和小分子的各類化合物的組。
15.按照權利要求14的方法，其特徵在於所述功能核酸選自包含適體，適配酶，核酶，spiegelmer，反義寡核苷酸和siRNA的組。
16.蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物和/或編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸作為開發和/或製備用於治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑的靶分子的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
17.按照權利要求16的應用，其特徵在於所述藥物和/或診斷劑包含選自一種試劑，所述試劑選自包含抗體，肽，抗促成素，小分子，反義分子，適體，spiegelmer和RNAi分子的組。
18.按照權利要求17的應用，其特徵在於所述試劑與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用。
19.按照權利要求17的應用，其特徵在於所述試劑與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸、特別是與蛋白激酶Nβ的mRNA、基因組核酸或cDNA相互作用。
20.與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽在開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑中的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
21.按照權利要求20的應用，其特徵在於所述多肽選自包含針對蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的抗體和結合蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的多肽的組。
22.與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸在開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑中的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
23.按照權利要求22的應用，其特徵在於所述核酸選自包含適體和spiegelmer的組。
24.與編碼蛋白激酶Nβ的核酸或其部分或衍生物相互作用的核酸在開發或製備治療和/或預防疾病的藥物和/或製備用於診斷疾病的診斷劑中的應用，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
25.按照權利要求24的應用，其特徵在於相互作用的核酸是反義寡核苷酸，核酶和/或siRNA。
26.按照權利要求24或25的應用，其特徵在於編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸是cDNA，mRNA或hnRNA。
27.按照權利要求16-26中任何一項的應用，其中所述蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是權利要求1-11中任何一項描述的一種。
28.按照權利要求12-15中任何一項的方法，其中所述蛋白激酶Nβ和/或編碼蛋白激酶Nβ的核酸是權利要求1-11中任何一項描述的一種。
29.優選用於預防和/或治療疾病的藥物組合物，該藥物組合物包含至少一種試劑和至少一種藥用載體，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的小分子，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸或與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組，其中所述疾病選自包含癌、轉移癌和與PI3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組。
30.表徵疾病或症狀的試劑盒，所述疾病或症狀選自包含癌、轉移癌和與PI 3-激酶途徑有關的任何病理症狀的組，所述試劑盒包含至少一種試劑和任選地至少一種其它化合物，所述試劑選自包含蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物，蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的特異性抗體，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的多肽，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的多肽，與蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物相互作用的核酸，與編碼蛋白激酶Nβ或其部分或衍生物的核酸相互作用的核酸的組。
全文摘要
本發明涉及蛋白激酶Nβ或其片段或衍生物作為PI 3－激酶途徑的下遊靶、優選作為PI 3－激酶途徑的下遊藥靶的應用。
文檔編號A61K38/17GK1674929SQ03819435
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月10日 優先權日2002年8月14日
發明者A·克利佩爾-吉澤, J·考夫曼 申請人:阿圖根股份公司