一種新型天然抗腫瘤活性化合物及其製備方法與應用的製作方法

2023-12-09 04:03:36

專利名稱：一種新型天然抗腫瘤活性化合物及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬醫藥技術領域，具體涉及一種新型天然抗腫瘤活性化合物及其製備方法與應用。
背景技術：
楊梅(Myrica ruba Lour，Sieb.Et Zucc.)系楊梅科(Myricae)楊梅屬(Myrica)植物。楊梅的果實、樹皮、根或核仁均可供藥用。其果實甘酸、溫，具有生津解渴、和胃消食之功效，可治煩渴、吐瀉、痢疾、腹痛；其樹皮性溫、味苦辛澀，可治痢疾、跌打損傷、牙痛、湯火傷；其根辛、溫，具有理氣、止血、化瘀之功效，可治胃痛、膈食嘔吐、吐血等症；其種仁可治腳氣。楊梅植物主要含間環二芳基庚烷、黃酮和三萜等類型天然化合物，但其有效成分並不明確，是否具有抑制腫瘤的作用也未得到進一步研究。
癌症是危害人民生命和健康的重要疾病之一，抗腫瘤活性化合物或先導物的發現是抗癌藥物研究的重要方面，而尋找天然的抗腫瘤活性化合物更是迫在眉睫。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種新型天然抗腫瘤活性化合物，從天然植物楊梅獲得。
另一個目的是提供所述新型天然抗腫瘤活性化合物的製備方法。
本發明還有一個目的是提供所述新型天然抗腫瘤活性化合物的應用。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的提供了一種新型天然抗腫瘤活性化合物，具有如下的化學結構 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12選自氫原子(H)，烴基(alkyl)，芳基(aryl)，醯基(acyl)，醯氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羥基(hydroxyl)，滷素(halogen)，氨基(amino)，烴氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，醯氨基(acylamino)，且不全為氫原子(H)；C7，C8，C9，C10，Cn，C12，C13位之間的連接形式為雙鍵或叄鍵或環氧連接。
所述的新型天然抗腫瘤活性化合物，優選例是當R3，R4，R5，R6，R8，R9，R10，R11為氫原子(H)，R1，R2為甲氧基(OCH3)，該化合物為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷。
本發明提供了上述新型天然抗腫瘤活性化合物的製備方法，是用合適的溶劑浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮得到總浸膏，總浸膏用水分散後，用適宜的有機溶劑萃取得到萃取物，萃取物經分離得到所述化合物。
浸提可採用60％-98％乙醇或甲醇，萃取的有機溶劑可採用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一種。
還可以通過化學合成的方法得到(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷類似物。
本發明提供了所述新型天然抗腫瘤活性化合物的應用，主要是在製備作為增強機體免疫、消炎或抑制腫瘤細胞藥物方面的應用。
本發明具有以下有益效果1、本發明提供的新型天然抗腫瘤活性化合物為一全新分子骨架的環狀二芳基庚烷醌類化合物，結構新穎、抗腫瘤活性強，可來源於楊梅植物資源，安全性高。
2、對所述化合物的進一步研究有望發現選擇性高、活性強、毒副作用小、抗瘤譜廣、抗多藥耐藥性好的新型抗癌藥物，具有重要的潛在產業化開發價值以及對人類研究抗癌藥物的重大貢獻。
3、本發明所述化合物的製備方法簡單安全易行。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明實施例1楊梅全植株30Kg(乾重)，粉碎後用95％乙醇浸提(50L×3次)，減壓濃縮得總浸膏1680g。總浸膏溶解在3.0L約40-60℃的溫熱水，冷卻後用氯仿萃取(1.0L×10次)，減壓濃縮得氯仿部分浸膏250g。氯仿部分浸膏經矽膠柱層析，石油醚(60～90℃)-丙酮(石油醚，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，丙酮)梯度洗脫，分成9個部分(TLC作檢測，相同部分合併到一起)；Fr.4經矽膠製備薄層，展開劑為石油醚乙酸乙酯(4∶1，V/V)，分離提純得到化合物1 250mg。
化合物1為桔紅色油狀物，在TLC矽膠薄層板上與10％硫酸乙醇反應顯淺藍色，該化合物的HRMS給出準分子離子峰m/z 395.1467[M+Na]+，示其分子式為C21H24O6；IR吸收峰νmax3435cm-1，1651cm-1，1602cm-1，1507cm-1表明1中含在羥基、共軛羰基和苯環；1HNMR信號δ7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz)顯示分子中存在一個1，2，4-三取代苯環。1H-1HCOSY相關信號說明分子中存在-(CH2)2CH(OH)(CH2)4-結構單元；13CNMR顯示21個碳信號，其中61.3(q)，61.2(q)為兩個甲氧基信號，分子骨架共19個碳信號，13CNMRδ184.1，184.2顯示含有苯醌結構片斷。綜合上述信息，化合物1應為含有醌式結構片斷的二芳基庚烷類化合物。根據此化合物的1H-1H COSY，HMQC，HMBC和NOESY(見附圖
)，確定1為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷。具有如下式1所示化學結構
化合物1的特徵在於顏色和狀態桔紅色油狀物；分子式C21H24O6；比旋光[α]D20+0.027°(c 0.625mg/ml，丙酮)紫外光譜[λmax(MeOH)logε]194nm(0.31)，203nm(0.72)，279nm(0.32)；紅外光譜主要特徵譜帶位於3435，2937，1651，1614，1602，1507，1453，1288，1202，1144，1006，822，759cm-1；質譜ESI(-)371.2(M-H)-；HRESI(+)395.1467(M+Na)+；核磁共振氫譜(600Hz，CDCl3，δin ppm and TMS as internalstandard)2.40(1H，m，Ha-7)，1.68(1H，m，Hb-7)，1.87(1H，m，Ha-8)，1.30(1H，m，Hb-8)，1.60(1H，m，Ha-9)，1.15(1H，t，J＝13.8Hz，Hb-9)，0.98(1H，m，Ha-10)，0.73(1H，t，J＝12.7Hz，Hb-10)，3.72(1H，t，J＝8.3Hz，H-11)，1.94(1H，dt，J＝13.3，4.1Hz，Ha-12)，1.65(1H，m，Hb-12)，2.66(1H，td，J＝13.4，3.2Hz，Ha-13)，2.82(1H，dt，J＝13.8，3.5Hz，Hb-13)，7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz，H-15)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz，H-16)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz，H-18)，5.93(1H，brs，17-OH)，4.01(3H，s，OCH3)，4.05(3H，s，OCH3)；核磁共振碳譜(125Hz，CDCl3，δin ppm and TMS as internalstandard)120.7(s，C-1)，141.0(s，C-2)，144.9(s，C-3)，184.1(s，C-4)，144.4(s，C-5)，146.5(s，C-6)，34.7(t，C-7)，24.1(t，C-8)，26.4(t，C-9)，26.9(t，C-10)，72.1(d，C-11)，33.6(t，C-12)，39.8(t，C-13)，133.7(s，C-14)，130.5(d，C-15)，117.5(d，C-16)，150.9(s，C-17)，131.1(d，C-18)，184.2(s，C-19)，61.3(q，OMe)，61.2(q，OMe)。
實施例2本發明的消炎作用按藥劑學方法，可以將本發明提取物用於製備作為增強機體免疫或消炎的藥物。
下述的藥理實驗表明本發明提取物具有增強機體免疫以及消炎等藥理活性將小鼠40隻，雌雄各半，體重80～150g，經由背部皮下注射0.5％的2，4一ONFB乙醇溶液100pl作為抗原使之增敏，注射2，4一DNFB 4天後增敏成立，第6天在小鼠右耳上塗1％2，4一DNFB一橄欖油溶液作為抗原攻擊，使小鼠產生耳緣接觸性皮膚炎。隨機等分為4組，楊梅提取物於增敏前一天到2，4一DNFB攻擊當天連續7天經口給藥。第1組為蒸餾水對照組，餵以同體積蒸餾水，第2、3、4組分別灌餵0.02％、0.2％、0.5％本發明乙醇提取物溶液0.5ml。取下小鼠左右兩耳，測定左右耳緣18mm重量差及比較浮腫程度。楊梅提取物連續7天經口給藥，對小鼠耳緣浮腫顯示出一定的抑制效果，與蒸餾水對照組相比，小鼠左右耳緣18mm重量差分別小15％、25％、30％左右。
實施例3本發明的抗腫瘤作用通過SRB法檢測細胞的存活率，Hoechst33258核染色法、瓊脂糖凝膠電泳法和流式細胞術來檢測細胞的凋亡情況，來評價化合物1的抗腫瘤活性。
1、試劑DMEM、小牛血清購於GIBCO BRL公司、溴化乙啶(EB)購於上海生工公司、Hoechst33258購於Sigma公司、蛋白酶K(Proteinase K)，100bp DNA ladder購於NEB公司、RNA酶A(RNaseA)購於PROMEGA公司、碘化吡啶(PI)購於Merck公司、瓊脂糖(Argarose)購於西班牙BioWest公司、其餘試劑為國產分析純。
2、儀器CO2培養箱、倒置顯微鏡、螢光顯微鏡、高速冷凍離心機、水平電泳裝置、凝膠掃描分析系統、酶標儀、流式細胞儀。
3、方法細胞培養及化合物1處理腫瘤細胞在含10％小牛血清、100U/L青黴素和100mg/L鏈黴素的DMEM培養基中，於5％CO2、37℃的細胞培養箱內常規培養。取對數生長期的細胞，0.25％胰酶消化，用培養基調成1×105/ml的細胞懸液進行實驗。
設對照組和實驗組。化合物1處理時，實驗組細胞加入不同濃度的化合物1培養48h。對照組不加藥物。
細胞活性測定(SRB法)取培養於96孔板經化合物1處理過的細胞，每孔加入50％(質量體積)的三氯乙酸(TCA)50固定細胞，TCA的終濃度為10％，輕柔地加在每孔液面上；然後在4℃冰箱中放置1h；培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA；培養板空氣中乾燥；每孔加100μL0.4％(wt/Vol)SRB(溶解於1％醋酸中)，室溫下放置30min；棄去各孔內液體後用洗滌5遍，去除未結合的染料，剩餘的1％乙酸衝洗液在水池邊輕輕敲打，保證完全清除衝洗液；接著培養板在空氣中乾燥直到沒有可見的液體；用pH為10.5，10mmol/l unbu-ffered Trisbase(三羥甲基胺基甲烷)溶解，在平板振蕩器上振蕩5min；在酶聯免疫檢測儀測定OD值，用空白對照(沒有接種細胞的生長培養基)調零，所用波長為490～530nm。按下列公式計算殺傷率∶殺傷率(％)＝(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100％。
Hoechst33258核染色樣本製備收集細胞(1×106個)，1000r/min，離心5min，將培養基移去，用PBS洗兩次，迅即加入40g/L的多聚甲醛液固定10min。離心後吸去固定液，以蒸餾水清洗一次，用Hoechst33258(5mg/L)染色10min。用蒸餾水清洗2次後取細胞懸液，滴於載玻片，自然乾燥，在螢光顯微鏡下以340nm激發光觀察並隨機拍照。Hoechst33258是一種DNA螢光染料，可以插入並結合於DNA鏈的A-T區，受到波長200-380nm的紫外線激發，可釋放420nm的藍色螢光，在螢光顯微鏡下，活細胞核呈彌散均勻螢光，核無固縮，故在視野中呈現體積較大的淺染核形態，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染緻密的顆粒塊狀螢光，核出現不同程度的固縮，常可見DNA螢光碎片(凋亡小體)。
DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳將收集的細胞(2×106個)1000r/min，離心5min，移去培養基，用PBS洗兩次，加入400μl含有10mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA、10mmol/L NaCl、1％SDS(pH8.0)的細胞裂解液，充分混勻後加入蛋白酶K(500μg/ml)，37℃消化過夜。在消化液中加入75μl醋酸鉀(8mol/L)，4℃靜置15min，再加入氯仿750μl，充分混勻。10000r/min，離心10min。將上清吸出，加入750μl無水乙醇，上下輕柔顛倒混合，即可見白色沉澱析出。12000r/min，離心10min，吸棄上清，以70％乙醇洗沉澱1次。將沉澱自然乾燥，用40μl TE(10mmol/LTris，1.0mmol/LEDTA，pH7.4，含200μg/ml Rnase A)溶解。於1.0％的瓊脂糖凝膠(含0.4μg/ml EB)上以60V電壓電泳1h，紫外燈下觀察拍照。正常細胞DNA鏈完整，在加樣孔附近呈現粗條帶，而凋亡的細胞DNA鏈以核小體為單位被切割降解，被抽提出來以後在凝膠泳道上呈現180bp為間隔的梯狀DNA電泳帶型。
流式細胞儀分析細胞亞二倍體峰(凋亡峰)將收集的單細胞懸液(1×106個)用PBS洗2次，離心後以70％的4℃乙醇固定過夜。測定前離心棄乙醇，細胞重懸於含有50mg/L碘化丙啶(PI)和50mg/LRnase A的染色液中，避光染色30min。以流式細胞儀進樣測定，每樣本計數12000個細胞，採用螢光強度值並以儀器所配軟體進行數據處理，計算凋亡率。
統計方法定量實驗數據以x±s表示，採用Microsoft Excel t檢驗進行統計學處理，p＜0.05視為有統計學意義。
結果化合物1可濃度依賴性地抑制腫瘤細胞體外生長活性濃度為32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、1.9μg/ml的化合物1對人肺癌細胞A549的殺傷率分別為90.99％、42.66％、21.53％、19.46％。
權利要求
1.一種新型天然抗腫瘤活性化合物，其特徵在於具有如下的化學結構 其中，R1，R2，R3，R4，R5，R6，R7，R8，R9，R10，R11，R12選自氫原子(H)，烴基(alkyl)，芳基(aryl)，醯基(acyl)，醯氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羥基(hydroxyl)，滷素(halogen)，氨基(amino)，烴氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，醯氨基(acylamino)，且不全為氫原子(H)；C7，C8，C9，C10，C11，C12，C13位之間的連接形式為雙鍵或叄鍵或環氧連接。
2.根據權利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物，其特徵是R3，R4，R5，R6，R8，R9，R10，R11為氫原子(H)，R1，R2為甲氧基(OCH3)，該化合物為(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷。
3.一種權利要求2所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的製備方法，其特徵是用合適的溶劑浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮得到總浸膏，總浸膏用水分散後，用適宜的有機溶劑萃取得到萃取物，萃取物經分離得到所述化合物。
4.根據權利要求3所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的製備方法，其特徵是浸提可採用95％乙醇或甲醇，萃取的有機溶劑可採用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一種。
5.一種權利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的製備方法，其特徵是除了(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷以外，其他化合物可以以(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羥基-4，19-二酮基-[7，0]-間環二芳基庚烷為基礎通過化學合成的方法得到。
6.一種權利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的應用，其特徵是在製備作為增強機體免疫或消炎的藥物方面的應用。
7.一種權利要求1所述的新型天然抗腫瘤活性化合物的應用，其特徵是在製備抑制腫瘤細胞藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種新型天然抗腫瘤活性化合物，是一種具有全新分子骨架的化合物，結構新穎、抗腫瘤活性強，可來源於楊梅植物資源，安全性高；同時公開了其製備方法，浸提楊梅植株粗粉，減壓濃縮，用水分散後，用適宜的有機溶劑萃取，分離提純得到所述的化合物，所述化合物在製備抗腫瘤藥物領域應用前景廣闊，為醫學上開發攻克腫瘤的天然藥物打下了基礎。
文檔編號C07C46/00GK101050170SQ20071002745
公開日2007年10月10日 申請日期2007年4月6日 優先權日2007年4月6日
發明者王定勇, 臧林泉, 謝啟宇, 劉恩桂, 潘雪刁, 陳健 申請人:廣東藥學院