一種腈水合酶基因工程菌及應用的製作方法

2023-11-06 09:24:02 4

專利名稱：一種腈水合酶基因工程菌及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於工業微生物技術領域，具體地說涉及一種利用諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質粒構建高效表達腈水合酶基因工程菌的方法以及所得到的基因工程菌株和應用。
背景技術：
利用丙烯醯胺(Acrylamide，分子式為C3H5N0，結構式為H2C = CHC0NH2)合成的各種類型的聚丙烯醯胺(PAM)在三次採油、水處理、造紙、採礦、冶金、洗煤和製造高吸水性樹脂等工業生產中具有非常廣泛的應用。 丙烯醯胺的生產一般是以丙烯腈為原料，進行催化水合而成。丙烯醯胺的生產經歷了硫酸水合法、銅催化法、微生物法三個發展階段。由於微生物法具有反應在常溫常壓下進行、能耗低、操作簡單、安全、丙烯腈轉化率高、產物濃度和純度高等優點，與其他方法相比，微生物法具有明顯的優勢。 在利用微生物法的最初階段，主要是篩選和馴化具有腈水合酶活性的菌株。在微生物方面的主要進展有日本，山田秀明研究組在專利《生物學生產醯胺的方法》(專利號ZL88106735))公開了一種野生玫瑰色紅球菌J-l，日本化學工業株式會社在專利《利用微生物製備醯胺的方法》(專利號ZL86100062)公開了一種紅球菌S-6、氧化節桿菌和黃色微桿菌，英國西巴特殊化學水處理有限公司在專利《紫紅紅球菌菌株NCMB 41164及其生產腈水合酶的用途》(申請號200480035487. 1)中公開了 一種了紫紅紅球菌NCMB41164菌株或其突變體，美國亞什蘭許可和智慧財產權有限公司在專利《腈水合酶生產菌株紫紅紅球菌M33的培養方法》(申請號200480043243. 8)"中公開了一種紫紅紅球菌M33，上海市農藥所在專利《微生物催化法生產丙烯醯胺》(申請號03115536. 7)中公開了野生丙酸棒桿菌及其馴化菌株等不同的微生物進行丙烯醯胺的微生物法生產。在生產方法方面，清華大學化工系公開了《一種應用膜技術的微生物轉化生產丙烯醯胺的方法》(專利號ZL 03109806. 1)，《提高腈水合酶產物耐受性的定向培育法》(專利號ZL 03130658. 6)和《葡萄糖-Co2+耦合補加發酵製備腈水合酶的工藝方法》(專利號ZL 03121944.6);河南焦作多生多化工股份有限公司公開了《微生物凝聚法生產丙烯醯胺的方法》(申請號200410010364. 4);德國施託克豪森公司公開了《用一種生物催化劑製備一種丙烯醯胺水溶液的方法》(申請號02808905. 7);《傅立葉變換紅外在線測量丙烯腈和丙烯醯胺》等等。在轉化丙烯腈生產丙烯醯胺的基因研究方面，日本三菱化成株式會社對來自根瘤菌屬的腈水合酶基因和蛋白申請了專利《具有腈水合酶活性的新型蛋白和編碼該蛋白的基因》(申請號93106122.9);三井化學株式會社對來自嗜熱假諾卡氏菌JCM3095的腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因申請了專利《參與活化腈水合酶的蛋白以及編碼它的基因》(專利號ZL99106291.4);《新型腈水合酶》(專利號02156180. X)，並研究了該基因在重組大腸桿菌中的表達；德國底古薩股份公司申請了《紅球菌屬的腈水合酶》(申請號200580008206. 8);日本三菱麗陽株式會社公開了《改良型腈水合酶》(申請號200580016665. 0)，提供了對腈水合酶基因進行定點突變來提高耐熱性的方法；清華大學從諾卡氏菌中克隆獲得了腈水合酶基因並申請了專利《一種腈水合酶及其編碼基因與應用》(專利號ZL 200410042576. O)，進一步對該基因在重組大腸桿菌中的突變和高表達進行了研究。 諾卡氏菌和紅球菌屬於革蘭氏陽性菌株，具有比較厚的細胞壁。同時，作為腈代謝酶系的天然表達菌株，諾卡氏菌和紅球菌中還可能存在某些分子伴侶，或良好的氧化還原環境，使得胞內表達的腈水合酶與重組大腸桿菌相比，具有更高的熱穩定性和底物、產物耐受性。為此，採用諾卡氏菌和紅球菌宿主進行腈水合酶基因的過表達在工業生產中具有更廣闊的前景。

發明內容
本發明目的之一是提供一種高效表達腈水合酶的基因工程菌的構建方法。 本發明目的之二是提供高效表達腈水合酶的基因工程菌株。 本發明目的之三是提供利用腈水合酶基因工程菌株生產丙烯醯胺的方法。 本發明一種高效表達腈水合酶基因工程菌的構建方法，主要是利用諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質粒PNV18和pNV19，既含有諾卡氏菌/紅球菌的複製起點pAL5000，又含有大腸桿菌的複製起點，因此既可以在諾卡氏菌/紅球菌中表達，又可以在大腸桿菌中表達的特點；可以方便地在重組大腸桿菌中實現對外源基因的重組改造，然後轉移至重組諾卡氏菌/紅球菌中進行目標基因的表達。 本發明一種高效表達腈水合酶基因工程菌的構建方法，按照如下步驟進行
(l)根據目的啟動子基因的DNA序列設計引物，以含有目的啟動子基因的DNA為模板進行PCR方法擴增，得到啟動子基因； (2)將啟動子基因與諾卡氏菌_大腸桿菌穿梭質粒分別進行雙酶切，36 38t:反應過夜；然後將酶切產物純化，再用T4DNA連接酶在3 5。C進行連接反應14 16h，得連接反應物； (3)將連接反應物轉化宿主菌e. coli JM109感受態細胞，塗布LB平板(卡那黴素抗性基因kan+)，挑選陽性克隆，並進行培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因的諾卡氏菌_大腸桿菌穿梭質粒； (4)根據腈水合酶基因序列設計上、下遊引物，並以具有原始腈水合酶基因的諾卡氏菌Nocardia YS-2002的總DNA為模板進行PCR擴增，得腈水合酶的DNA序列；然後用EcoRI和BamHI進行雙酶切，再用T4連接酶將腈水合酶DNA序列插入大腸桿菌質粒pET28，獲得重組質粒pET28-NHase;再用試劑盒定點突變方法將腈水合酶基因的a亞基起始密碼子gtg突變為atg，獲得突變腈水合酶基因NHaSeM ; (5)以步驟(4)獲得的突變腈水合酶基因NHaseM的DNA序列為模板進行PCR擴增，獲得突變腈水合酶基因NHaSeM的DNA序列，然後用BamHI和HindIII對突變腈水合酶基因NHaSeM與諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質粒進行雙酶切，36 38t:反應過夜；然後將酶切產物純化，再用T4DNA連接酶在3 5t:進行連接反應14_16h，得連接反應物；
(6)將步驟(5)連接反應物轉化宿主菌E. coli JM109感受態細胞，然後塗布在LB平板(Kan+)培養基上，挑選陽性克隆，並在LB培養基中37t:過夜培養，然後提取小量質粒進行酶切驗證，可得帶有目的啟動子基因及突變腈水合酶基因NHaSeM的穿梭質粒；
(7)將步驟(6)所得穿梭質粒以電穿孔轉化法轉化宿主細胞，即獲得具有目的啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM的基因工程菌。 上述構建方法步驟(1)中所述的目的啟動子基因為醯胺酶啟動子基因或大腸桿菌tac啟動子基因。 上述構建方法中所述的醯胺酶啟動子基因，其-35區和-10區序列分別為TTGTGG和TAACGT ;它來自諾卡氏菌Nocardia YS-2002,用上遊引物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT和下遊引物CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT,以諾卡氏菌Nocardia YS-2002的DNA為模板進行PCR擴增可得醯胺酶啟動子基因。 上述構建方法中所述的大腸桿菌tac啟動子基因，其-35區和-10區序列分別為
TTGACA和TATAAT。大腸桿菌tac啟動子基因來自質粒pMAL-p2x (美國NEB公司)，以上遊
引物CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT和下遊引物CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT為擴增引
物，以質粒pMAL-p2x的DNA為模板進行PCR擴增可得大腸桿菌tac啟動子基因。 上述構建方法步驟(2)中所述的諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質粒為諾卡氏菌-紅球
菌穿梭質粒pNV18或pNV19(pNV18 :DDBJ資料庫，AB267085 ;pNV19 :DDBJ資料庫，AB267086)
及其衍生質粒。 所述的衍生質粒可以是pNV18. 1等。 上述構建方法步驟(2)中酶切產物的純化可以採用PCR產物回收試劑盒或其它分子克隆中常用的純化方法。 上述構建方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因是指來自於諾卡氏菌的原始腈水合酶基因(Genbank :AY168347)或經過突變、重排、缺失等方法獲得的與來自諾卡氏菌的腈水合酶基因的DNA序列一致性大於等於70%、蛋白質序列一致性大於等於70%的同源基因。 上述構建方法步驟(4)中所述的試劑盒定點突變方法(ExSite PCR-basedsite-directed mutagenesis kit， Stratagene， USA) 見Yue SHI等 (EnzymeandMicrobial Technology, 2004， 35 (6-7) ， 557-562);可將腈水合酶基因的a亞基起始密碼子gtg突變為atg，從而獲得突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述構建方法步驟(4)中所述的突變腈水合酶基是指a亞基起始密碼子gtg突變為atg的腈水合酶基因。 上述構建方法步驟(3)中所述的目的啟動子基因的諾卡氏菌-大腸桿菌穿梭質粒
為帶有醯胺酶啟動子基因或tac啟動子基因的pNV18質粒及其衍生質粒。 上述構建方法步驟(6)中所述的穿梭質粒為帶有醯胺酶啟動子基因或tac啟動子
基因及突變腈水合酶基因NHaSeM的pNV18質粒及其衍生質粒。 上述構建方法步驟(7)中所述的宿主為諾卡氏菌或紫紅紅球菌。 上述宿主所述的諾卡氏菌是諾卡氏菌Nocardia YS-2002或其誘變株；其中諾卡
氏菌Nocardia YS-2002是發明人從來自勝利油田採集的菌株通過篩選得到；Nocardia
YS-2002的誘變株可採用Nocardia YS-2002在紫外燈下加入LiCl2方法進行誘變獲得。
上述宿主所述的紫紅紅球菌是紫紅紅球菌Rhodococcus rhodochrousATCC33278 (在美國菌種保藏中心保藏)或其馴化株或誘變株。 上述構建方法步驟(7)中所述的獲得具有目的啟動子和突變腈水合酶基因的基因工程菌可以是諾卡氏基因工程菌或紫紅紅球菌基因工程菌。 利用上述構建方法所得的腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動子基因或醯胺酶啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株中所述的突變腈水合酶基因是指a亞基起始密碼子gtg突變為atg的腈水合酶基因。 上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶tac啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaSeM。
上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌TH-1， Nocardia，於2007年7月12日保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中心，菌種保藏登記號為CGMCC No. 2104，它帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌TH-2 ， R. rhodochrous ，於2007年7月12日保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物保藏中心，菌種保藏登記號為CGMCCNo. 2105，它帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株，攜帶醯胺酶啟動子基因和突變腈水合酶基因NHaseM。 上述腈水合酶基因工程菌株是諾卡氏菌N0Cardia/pNV-Pa-NHM，它帶有醯胺酶啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 上述腈水合酶基因工程菌株是紫紅紅球菌rh0d0Chr0uS/pNV-Pa-NHM，它帶有醯胺酶啟動子和突變腈水合酶基因NHaSeM。 利用上述腈水合酶基因工程菌生產丙烯醯胺的方法，按照如下步驟進行
(1)將在4t:保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養基中，在28 30°C 、搖床轉速為150 250轉/min的條件下培養32 56小時，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培養基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白腖7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L， MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其餘為水； (2)按照0. 5 1. 0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接種到裝有培養基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉速為200 300轉/min的條件下培養32 48小時，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白腖7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L，MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH7. 5，其餘為水; (3)按照5. 0 10. 0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉接種到裝有培養基的發酵罐中，在28 3(TC、pH7. 5 8. 5條件下培養36 48小時，得發酵液；所述培養基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5. 0 10. 0g/L，尿素7. 5 10. 0g/L， KH2P040. 5 1. 0g/L，K2HP04 0. 5 1. 0g/L，MgS04 *7H20 0. 5 1. 5g/L，味精0. 5 1. 5g/L，CoCl20. 04 0. 12mM，丙烯醯胺2 6mM，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH 7. 5 8. 5，其餘為水；
(4)將發酵液稀釋為5 8g/L(乾重)的菌液，然後用中空纖維微濾膜對收穫的菌體進行微濾洗滌，清洗時採用正洗和反洗雙向反覆操作直至洗滌液的色度為5 20，蛋白質濃度為3 10卯m ;正洗壓力控制為0. 06 0. lMPa，反洗壓力控制為0. 01 0. lMPa ;再將菌液配成10 20g/L(乾重)，體積分數5 8%，打入水合反應釜，調節丙烯腈流量至0. 5 1. OmVh，然後向水合釜內流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調小；反應釜夾套通-5 -9。C冷凍鹽水或液氨，在16 26°C， p朋.7 7. 5條件下進行水合反應1 3小時；接著用循環泵將水合液打入中空纖維超濾膜分離系統，用正洗和反洗方法反覆操作濾去水合液中的細胞雜質和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質濃度為5 15ppm，得到丙烯醯胺水合液。 上述生產丙烯醯胺的方法步驟(1)中所述的腈水合酶基因工程菌是指諾卡氏菌Nocardia/pNV-Pa-NHM、諾卡氏菌TH-1、紫紅紅球菌R. rhodochrous/pNV-Pa-NHM或紫紅紅球菌TH-2。 上述生產丙烯醯胺的方法中所述的泡敵是聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚，可從市場上購買。 上述生產丙烯醯胺的方法中步驟(2)中當大量種子細胞形態為鏈球狀時，結束種子培養，生物量約為3 6g/L。 上述生產丙烯醯胺的方法中步驟(3)中至菌體形態為單個小球狀，生物量^ 8g/L，腈水合酶酶活^ 1850U/ml。 上述生產丙烯醯胺的方法步驟(4)中所述的腈水合酶基因工程菌細胞可以重複使用3 8次。 上述生產丙烯醯胺的方法中清洗時採用正洗和反洗雙向反覆操作，是為了防止堵塞。 上述生產丙烯醯胺的方法步驟(4)中當丙烯醯胺濃度達到25% 40% (W% V)，丙烯腈濃度小於0. 1% (W% V)，丙烯酸副產物《0. 5% (W% V)時，可停止水合反應。
本發明採用諾卡氏菌或紅球菌為宿主菌株，採用諾卡氏菌/紅球菌_大腸桿菌穿梭質粒高表達腈水合酶基因，通過穿梭質粒上啟動子基因的篩選優化及腈水合酶基因的突變改造，提高重組菌株腈水合酶的活性、熱穩定性和產物、底物耐受性；採用基因重組諾卡氏菌或基因重組紅球菌游離細胞為催化劑，可實現大宗化學品丙烯醯胺的微生物法生產。
本發明的優點和有益效果(1)本發明所得腈水合酶基因工程菌株腈水合酶表達水平高；(2)本發明腈水合酶酶活水平高，熱穩定性好，對丙烯腈和丙烯醯胺耐受性好；(3)本發明方法生產的丙烯醯胺質量高，適於工業化的生產。


圖1攜帶tac啟動子(Ptac)的腈水合酶表達穿梭質粒pNV_PtaC-NHM的示意圖。
圖2攜帶醯胺酶啟動子(Pa)的腈水合酶表達穿梭質粒pNV-Pa-NHM的示意圖。
具體實施方式
實施例1 攜帶tac啟動子的穿梭質粒pNV18-Ptac-NHM的構建 以質粒pMAL-p2x(美國NEB公司)為模板進行PCR擴增，上遊引物為CGGAATTCATTCTCATGTTTGACAGCT (下劃線部分為EcoRI酶切位點)和下遊引物為CGGGATCCGGTCCTTG TTGGTGAAGT (下劃線部分為BamHI酶切位點)得到含有tac啟動子(-35 區和-10區序列為TTGACA和TATAAT)的DNA序列；用EcoR I和BamH I雙酶切tac啟動 子基因和穿梭質粒pNV18，37t:反應過夜；將酶切產物用PCR產物回收試劑盒純化，然後採 用T4DNA連接酶在fC進行連接反應14h ;將連接反應產物轉化宿主菌E. coli JM109的感 受態細胞，挑選陽性克隆，在LB培養基中37t:過夜培養後提取小量質粒進行酶切和電泳驗 證，得到含有tac啟動子的穿梭質粒；用BamHI和HindIII雙酶切所得的含有tac啟動子 的穿梭質粒，用T4DNA連接酶連接插入a亞基起始密碼子gtg突變為atg的腈水合酶基因 (突變方法見Yue SHI等，Enzyme and MicrobialTechnology， 2004， 35 (6-7) ， 557-562)，轉 化E.coli JM109的感受態細胞，挑選陽性克隆，在LB培養基中37t:過夜培養後提取小量質 粒進行酶切和電泳驗證，驗證正確的穿梭質粒即為攜帶tac啟動子的突變腈水合酶基因表 達穿梭質粒pNV-Ptac-NHM(見圖1)。
實施例2 攜帶醯胺酶啟動子(Pa)的穿梭質粒pNV18-Pa-NHM的構建 以發明人實驗室馴化篩選的諾卡氏菌Nocardia YS-2002 (保存在清華大學化 工系生物化公所生物信息與生物催化工程實驗室)的總DNA為模板進行PCR擴增，上 遊弓I物CGGAATTCTGCGGACGGCGGATACGT (下劃線部分為EcoRI酶切位點)和下遊引物 CGGGATCCCTAGGACTCCTTAGTGACT(下劃線部分為BamHI酶切位點)，獲得醯胺酶啟動子基因 Pa的DNA序列；用EcoR I和BamH I雙酶切Pa和穿梭質粒pNV18， 37。C反應過夜；將酶切 產物用PCR產物回收試劑盒純化後，在4t:採用T4 DNA連接酶進行連接反應14h。將連接 反應物轉化宿主菌E. coli JM109感受態細胞，塗布LB平板(Kan+)，挑選陽性克隆，進行搖 瓶培養12h。收穫細胞，提取小量質粒進行酶切和電泳驗證，得含有pa的質粒；用BamHI和 HindIII雙酶切含有pa的質粒、用T4DNA連接酶連接插入a亞基起始密碼子gtg突變為 atg的腈水合酶基因(突變方法見Yue SHI等，Enzyme and Microbial Technology, 2004， 35 (6-7) ， 557-562)，轉化E. coli JM109的感受態細胞，挑選陽性克隆，搖瓶培養後提取小量 質粒再次進行酶切和電泳驗證。驗證正確的穿梭質粒即為攜帶Pa啟動子的突變腈水合酶 基因表達穿梭質粒pNV-Pa-NHM(見圖2)。
實施例3 基因重組諾卡氏菌TH-1的構建 將實施例1構建的帶有tac啟動子和突變腈水合酶基因高表達穿梭質粒 pNV-Ptac-NHM以電穿孔法轉化諾卡氏菌Nocardia YS-2002的感受態細胞，可得基因重組 諾卡氏菌TH-1。其中，諾卡氏菌感受態細胞的製備採用《分子克隆指南》(J.薩姆布魯克， D.W.拉賽爾著)中革蘭氏陽性菌感受態細胞的製備方法。取liU純化後的質粒於一個 1. 5ml的離心管中，將其和0. 1CM的電轉杯一起置於冰上預冷；將50 y 1製備好的感受態細 胞轉移至此l. 5ml的離心管中，小心混勻，冰上放置lOmin ;打開電轉儀，調節電壓為1250V ; 將穿梭質粒和感受態細胞的混合物轉移至已預冷的電轉杯中，輕輕敲擊使得混合物均勻進 入電轉杯的底部，同時注意混合物中不能有氣泡。將電轉杯放入電轉化儀，按下電擊鍵，聽 到蜂鳴聲後，向杯中迅速加入800 1的S0C液體培養基(配方見《分子克隆指南》)，重懸 細胞後，轉移到1.5ml的離心管中。置於28t:，220rpm搖床培養2h ;取200iU菌液塗布於 含有20 g/ml卡那抗生素的LB固體培養基平板，放入2『C培養箱培養60 72小時後出現重組諾卡氏菌的單菌落，得基因重組諾卡氏菌Nocardia/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH-1。
實施例4 基因重組紅球菌TH-2的構建 將實施例1所得pNV-Ptac-NHM穿梭質粒以電傳孔法轉化宿主細胞紅球 菌R. rhodochrous ATCC 33278，其中電轉化方法同實施例3，獲得基因重組紅球菌 R. rhodochrous/pNV-Ptac-NHM，菌株名為TH-2。
實施例5 : 諾卡氏菌TH-1腈水合酶的表達試驗 採用500ml帶擋板的三角搖瓶，裝培養基的量為10%，將實施例3所得諾卡氏菌 TH-1和諾卡氏菌Nocardia YS-2002 (簡稱"野生菌")在28。C搖床分批培養，搖床轉速為 200rpm，培養92小時。所述培養基的組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，尿素7. 5g/ L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP04 0. 5g/L， MgS04 7H200. 5g/L，泡敵0. 2g/L， pH值為7. 5，二價鈷離 子40ppm，其餘為水；結果表明，採用tac啟動子表達腈水合酶的重組諾卡氏菌的生長情況 與原始菌株基本一致，酶活表達情況則有所不同。在發酵培養48小時，重組菌的酶活達到 2939U/ml，而野生菌酶活為2711U/ml，重組菌酶活比野生菌提高了 8.4% ;發酵培養72小 時，重組菌酶活(3331U/ml)比野生菌(2838U/ml)提高17.4%。繼續發酵培養到92小時， 重組菌酶活高達4015U/ml 。其中，腈水合酶的酶活檢測採用標準的氣相色譜內標法，酶活的 國際單位定義為每分鐘催化生成lPmol丙烯醯胺所需的酶量；lymol丙烯醯胺/(min. ml菌液)=1U/ml 。
實施例6 紫紅紅球菌TH-2腈水合酶基因的表達試驗 將實施例4所得基因重組紫紅紅球菌TH-2進行72h搖瓶培養，並以原始野生菌株 R. rhodochrous ATCC 33278為對照，在28°C 、搖床轉速200轉/min條件下培養48小時，培 養基的組成比例為葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白腖7g/L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP04 0. 5g/ L，MgS04 *7H20 0. 5g/L，pH7. 5，甲基丙烯醯胺O. 2g/L，其餘為水。結果表明，野生紫紅紅球菌 的腈水合酶活性很低，總酶活僅為49U/ml，但重組紫紅紅球菌TH-2的總酶活提高到352U/ ml，比野生菌株提高了約7.2倍。
實施例7、 利用諾卡氏菌TH-1生產丙烯醯胺的試驗 挑取諾卡氏菌TH-1固體平板上光滑、溼潤的單菌落，接種在50ml種子培養基中 (500ml搖瓶)中，28t:培養48h，搖床轉速200轉/min(所述培養基的組成比例為葡萄 糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白腖10g/L， KH2P04 0. 5g/L， K2HP040. 5g/L， MgS04 7H20 0. 5g/L， pH7. 5，其餘為水)，得活化的諾卡氏菌TH-1 ;然後以體積比為0. 5%的接種量接種到500L 種子罐中，攪拌轉速250轉/min， 2『C培養40hr，種子細胞形態變為鏈球狀，結束種子培 養(培養基組成同前)，以體積比為10%的接種量轉接裝液量為3噸的5!113發酵罐(發酵 培養基的組成比例為葡萄糖30g/L，酵母膏5. Og/L，尿素7. 5g/L， KH2P04 0. 75g/L， K2HP04 0. 75g/L， MgS04 7H20 1. Og/L，味精0. 75g/L， CoCl2 0. 06mM，丙烯醯胺4mM，泡敵0. 2g/L， pH 7. 5，其餘為水)，2『C條件下培養至40h時，菌體形態為單個小球狀，生物量為10g/L，腈水 合酶酶活為2780U/ml。
停止培養，將3噸發酵液稀釋到4噸，採用微濾膜洗滌細胞，正洗壓力壓力約 0. 08MPa、反洗壓力約0. 09Mpa ;按照5%的體積分數配製細胞懸浮液，重懸液的酶活力約為 2300U/ml。調節初始丙烯腈流量1. OmVh，向水合釜內流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步 調小；反應釜夾套通_5°C冷凍鹽水，保證水合溫度維持在20°C左右，pH7. 5， 2小時後測定丙 烯醯胺濃度達到30% (W% V)，結束水合反應。採用循環泵將丙烯醯胺水溶液打入中空纖維 超濾膜分離系統進行超濾分離，結果得到30%的丙烯醯胺水溶液，外觀清澈透明；經檢測 雜蛋白含量為8ppm，色度為10，丙烯腈濃度0.01% (W% V)，丙烯酸副產物濃度O. 1%，是高 質量的丙烯醯胺水劑產品。 基因工程菌游離細胞反覆使用6次後，腈水合酶顯著失活，將細胞離心、收集後進
行廢棄處理。 實施例8 利用紫紅紅球菌TH-2生產丙烯醯胺的試驗 按照實施例7所描述的方法，挑取基因重組紫紅紅球菌TH-2的單菌落，進行搖瓶 培養、種子罐培養和發酵罐培養，得到12g/L的重組紅球菌，腈水合酶酶活為690U/ml。收 獲重組紅球菌游離細胞，按照實施例7所描述的方法，微濾洗滌後，催化水合丙烯腈生產丙 烯醯胺。按照10%的體積分數配製細胞懸浮液，重懸液的酶活力約為1000U/ml。調節初 始丙烯腈流量1. OmVh，向水合釜內流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調小。反應釜夾套 通-5t:冷凍鹽水，保證水合溫度維持在2(TC左右，pH7. 5，2小時後測定丙烯醯胺濃度達到 20% (WXV)，結束水合反應。採用循環泵將丙烯醯胺水溶液打入中空纖維超濾膜分離系統 進行超濾分離，結果得到20 %的丙烯醯胺水溶液，外觀清澈透明，雜蛋白含量為15ppm，色 度為20，丙烯腈濃度0. 08% (W% V)，丙烯酸副產物濃度0. 4%，是合格的丙烯醯胺水劑產
權利要求
一種腈水合酶基因工程菌株紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)TH-2，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC No.2105。
2. 利用權利要求1所述的腈水合酶基因工程菌生產丙烯醯胺的方法，按照如下步驟進行(1) 將在4t:保藏的腈水合酶基因工程菌接入活化培養基中，在28 30°C 、搖床轉速為150 250轉/min的條件下培養32 56小時，得到活化的腈水合酶基因工程菌的菌液；其中所述培養基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白腖7 10g/L，KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L， MgS04 7H20 0. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其餘為水；(2) 按照0. 5 1. 0%的體積百分比將步驟(1)的腈水合酶基因工程菌液接種到裝有培養基的種子罐中，在28 3(TC、搖床轉速為200 300轉/min的條件下培養32 48小時，得腈水合酶基因工程菌的種子液；所述的培養基的組成比例為葡萄糖20 30g/L，酵母膏1 5g/L，蛋白腖7 10g/L， KH2P04 0. 5 0. 75g/L， K2HP04 0. 5 0. 75g/L，MgS04 7H200. 5 1. 0g/L， pH7. 5，其餘為水;(3) 按照5. 0 10. 0%的體積百分比將步驟(2)所得種子液轉接種到裝有培養基的發酵罐中，在28 3(TC、pH7. 5 8. 5條件下培養36 48小時，得發酵液；所述培養基的組成比例為葡萄糖20 40g/L，酵母膏5. 0 10. 0g/L，尿素7. 5 10. 0g/L，KH2P04 0. 5 1. 0g/L，K2HP04 0. 5 1. 0g/L，MgS04 *7H20 0. 5 1. 5g/L，味精0. 5 1. 5g/L， CoCl2 0.04 0. 12mM，丙烯醯胺2 6mM，泡敵0. 2 0. 3g/L， pH 7. 5 8. 5，其餘為水；(4) 將發酵液稀釋為5 8g/L的菌液，然後用中空纖維微濾膜對收穫的菌體進行微濾洗滌，清洗時採用正洗和反洗雙向反覆操作直至洗滌液的色度為5 20，蛋白質濃度為3 10卯m ;正洗壓力控制為0. 06 0. lMPa，反洗壓力控制為0. 01 0. lMPa ;再將菌液配成10 20g/L，體積分數5 8% ，打入水合反應釜，調節丙烯腈流量至0. 5 1. 0mVh，然後向水合釜內流加丙烯腈，流加速度從高向低逐步調小；反應釜夾套通_5 _9°〇冷凍鹽水或液氨，在16 26°C，pH6. 7 7. 5條件下進行水合反應1 3小時；接著用循環泵將水合液打入中空纖維超濾膜分離系統，用正洗和反洗方法反覆操作濾去水合液中的細胞雜質和雜蛋白，直至水合液的色度為5 15，蛋白質濃度為5 15ppm，得到丙烯醯胺水合液。
全文摘要
本發明公開了一種腈水合酶基因工程菌株紫紅紅球菌(R.rhodochrous)TH-2，該菌株能高表達腈水合酶，並且酶活水平高，熱穩定性好，對丙烯腈和丙烯醯胺耐受性好；此外本發明還公開了利用該基因工程菌株生產丙烯醯胺的方法，用該方法生產所得丙烯醯胺質量高。
文檔編號C12P13/02GK101709286SQ20091021017
公開日2010年5月19日 申請日期2007年9月20日 優先權日2007年9月20日
發明者于慧敏, 劉昌春, 沈忠耀 申請人:清華大學