一種纖維蛋白原含量檢測試劑盒的製作方法
2023-12-05 22:51:26 2
本發明涉及生物
技術領域：
，特別涉及一種用Clauss法測定纖維蛋白原含量檢測試劑盒。
背景技術：
：纖維蛋白原是一種由肝臟合成的具有凝血功能的糖蛋白，是纖維蛋白的前體。纖維蛋白原水平增高多見於糖尿病、炎症應激反應，肥胖症；纖維蛋白原水平降低多見於DIC、纖維蛋白溶解。肝功能嚴重障礙或先天性缺乏，均可使血漿纖維蛋白原濃度下降，嚴重時可有出血傾向。此外，纖維蛋白原也被用於心血管意外的致病性研究。纖維蛋白原在肝臟(1.7～5g/天)和巨核細胞內合成，血漿中參考值2～4g/l。纖維蛋白原由2Aα、2Bβ、2γ這6條鏈組成，在凝血酶(因子IIa)作用下，可將纖維蛋白原分子裂解成兩個纖維蛋白肽A片段FPA(從Aα鏈)和兩個纖維蛋白肽B片段FPB(從Bβ鏈)，α鏈與β鏈分別釋放出A肽與B肽，生成纖維蛋白單體。在此過程中，由於釋放了酸性多肽，負電性降低，單體易於聚合成纖維蛋白多聚體。但此時單體之間借氫鍵與疏水鍵相連，尚可溶於稀酸和尿素溶液中。內源凝血途徑中的FXa與因子V(FV)、PF3和鈣離子構成凝血酶原複合物，激活凝血酶原生產凝血酶。進一步在Ca2+與活化的XIII因子(XIIIa)作用下，單體之間以共價鍵相連，則變成穩定的不溶性纖維蛋白凝塊，完成凝血過程。在正常的凝血機制中，必須有鈣離子的參與，而標本採集過程中，為了防止血液凝集加入抗凝劑，抗凝劑中的枸櫞酸根離子抑制了全血鈣離子，因此必須在檢測試劑中加入鈣離子，以還原或補充被抑制的鈣離子，進一步模擬體內正常凝血過程。目前市場上鮮有廠家提到了「含鈣」的試劑體系，大部分產品均忽略或未提及試劑中Ca2+對血漿中FIB定量檢測的重要意義。本發明中的FIB定量試劑盒特將Ca2+加入凝血酶試劑體系中，將在體外更為精確的檢測人血漿中纖維蛋白原的含量，為臨床提供有利的數據參考。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供了一種纖維蛋白原含量檢測試劑盒。該纖維蛋白原含量檢測試劑盒穩定性佳、重複性好，同時操作安全簡便、準確度高、線性範圍寬及兼容性強。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種纖維蛋白原含量檢測試劑盒，包括凝血酶試劑、咪唑緩衝液和定值血漿；凝血酶試劑包括凝血酶、咪唑、氯化鈣、甘露醇、蛋白腖、牛血清白蛋白、疊氮鈉和水。纖維蛋白原含量的測定原理：在過量凝血酶的存在下，被稀釋血漿的凝固時間可直接反映血漿中纖維蛋白原水平。向血漿中加入過量的凝血酶，使纖維蛋白原變為纖維蛋白，從而出現凝固。凝固時間與纖維蛋白原含量呈負相關，通過建立標準曲線而獲得受檢血漿FIB含量的方法，即Clauss法。據調研得知，若將FIB含量和凝血時間分別取對數來繪製定標相關曲線時，曲線的最為理想的斜率值為-1，當曲線斜率值控制在-1～0時，表現為線性範圍小，FIB含量準確性高，當曲線斜率值小於-1時，表現為線性範圍大，FIB含量準確性低。目前未見業內廠家提及該試劑體系中FIB含量對數與凝血時間對數相關曲線斜率值對FIB定量準確性的影響，且同類產品的該相關曲線斜率值大都小於-1。本發明通過研發條件優化，特將該相關曲線斜率值控制在-(1±0.05)，既保證了FIB的檢測範圍又保證了FIB定量的準確性。本發明中的試劑盒適用於臨床實驗室常規檢驗用的Clauss法來檢測纖維蛋白原含量(Fibrinogentest(VonClauss))。不適用於物理化學測定法和免疫法測定纖維蛋白原含量。本發明中的FIB定量試劑盒特將Ca2+加入凝血酶試劑體系中，將在體外更為精確的檢測人血漿中纖維蛋白原的含量，為臨床提供有利的數據參考。本發明通過特定的試劑配方，可進一步提高FIB含量檢測試劑的穩定性和重複性。作為優選，凝血酶試劑中各組分按如下配比配製：作為優選，該凝血酶試劑還包括水，各組分用量為：優選地，凝血酶試劑中各組分用量為：作為優選，凝血酶試劑的pH值為7.35～7.45。作為優選，凝血酶為牛凝血酶。作為優選，咪唑緩衝液包括咪唑、疊氮鈉、氯化鈉和水。作為優選，咪唑緩衝液中各組分用量為：優選地，咪唑緩衝液中各組分用量為：作為優選，咪唑緩衝液的pH值為7.35～7.45。在本發明中，定值血漿來源於健康人血漿，由標準血漿標定得到。作為優選，本發明將FIB含量和凝血時間分別取對數來繪製定標相關曲線時，標定的纖維蛋白原含量對數與凝血時間對數的相關曲線斜率控制在-(1±0.05)。該試劑盒的定標曲線的線性範圍廣，且纖維蛋白原含量測試值準確度高。本發明還提供了一種非診斷目的檢測纖維蛋白原含量的方法，包括如下步驟：將定值血漿採用咪唑緩衝液進行稀釋，得到不同濃度的定值血漿；將定值血漿在37℃條件下預溫3分鐘，加入凝血酶試劑，得到定值血漿的凝血時間，根據不同濃度的定值血漿的凝血時間製作標準曲線；將枸櫞酸鈉(109mmol/L)與靜脈血按體積比1:9的比例混合，離心，得到待測血漿，將待測血漿在37℃條件下預溫3分鐘，加入凝血酶試劑，根據待測血漿的凝血時間獲得纖維蛋白原的含量。本發明提供了一種纖維蛋白原含量檢測試劑盒。該纖維蛋白原含量檢測試劑盒，包括凝血酶試劑、咪唑緩衝液和定值血漿；凝血酶試劑包括凝血酶、咪唑、氯化鈣、甘露醇、蛋白腖、牛血清白蛋白、疊氮鈉和水。本發明具備以下優點：1、本發明通過分析血漿纖維蛋白原含量檢測原理，確定了合適的凝血酶試劑、咪唑緩衝液的配製方案，研製出可用於醫院臨床檢測人血漿FIB含量的體外診斷試劑盒。2、本發明中的凝血酶試劑特含有Ca2+，以還原或補充臨床血樣中被抑制的鈣離子，更為理想地模擬了體內正常凝血過程，為臨床檢測提供更為精確的數據參考。3、本發明試劑盒的定標曲線的線性範圍廣，即FIB含量對數與凝血時間對數的相關曲線斜率穩定在-(1±0.05)，其纖維蛋白原含量測試值準確度高。4、本發明試劑盒基本性能達到行業內標準要求，其準確度高，檢測範圍寬，穩定性好，可向市場進一步推廣使用。5、0～1IU/mL肝素不影響本發明試劑盒凝血時間的檢測，其檢測到的凝血時間與正常凝血時間不超過1.5s，達到行業標準要求。附圖說明圖1示實施例6中FIB含量對數和凝血時間對數相關曲線示意圖；圖2示實施例6中本發明試劑的FIB含量對數和凝血時間對數相關曲線；圖3示實施例6中fisher試劑的FIB含量對數和凝血時間對數相關曲線；圖4示實施例6中Biomedica試劑的FIB含量對數和凝血時間對數相關曲線。具體實施方式本發明公開了一種纖維蛋白原含量檢測試劑盒，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供的纖維蛋白原含量檢測試劑盒中所用試劑或儀器均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1本發明試劑盒的製備及使用方法一、試劑盒製備(1)凝血酶試劑(pH值為7.4)：(2)咪唑緩衝液(pH值為7.4)：(3)定值血漿：3g/L。二、試劑盒的使用方法本發明的試劑盒是在醫院臨床實驗室常規檢驗用凝固法全自動凝血測試儀上進行，其具體使用方法為：1、樣品及試劑的準備：(1)製備待測血漿樣品：靜脈採血，109mmol/L枸櫞酸鈉與全血按1:9比例混合均勻。以2500g離心15分鐘，用塑料移液管取出血漿，血漿樣品必須在4小時內進行測試。(2)FIB凝血酶試劑：每瓶凝血酶按瓶籤標稱量精確加入蒸餾水，輕輕混勻，放置10分鐘平衡至室溫後備用。(3)如需配製參考血漿(或正常質控血漿、異常質控血漿)，請按各自的相關說明書配製。2、纖維蛋白原參考曲線制定(以FIB定標為例)：(1)用咪唑緩衝液製備不同稀釋度的定標血漿，例如定標血漿為3g/L，輸入FIB濃度值，如下表所示：表1定標血漿的配製血漿佔比1:51:101:201:30咪唑緩衝液(μL)2004509501450參考血漿(μL)50505050FIB濃度(g/L)3×233×1/23×1/3(2)定標測定具體步驟如下：3、測病人血樣具體步驟如下：實施例2發明試劑盒最適緩衝體系穩定性的驗證實驗：本實驗為了找到試劑體系中主要成分的最佳配比關係，對該試劑盒中凝血酶試劑和咪唑緩衝液組成成分的濃度進行了對比分析，分別檢測了A、B、C三種緩衝體系配製的試劑在37℃條件下FIB含量變化，評估了對應試劑體系的穩定性情況。其中，A、B、C試劑配方為表2所示：表2不同濃度試劑體系成分組成：具體實驗數據請見下表3所示：表3不同濃度試劑體系穩定性以上實驗數據顯示，該試劑盒採用B試劑體系的穩定性更好，8天內FIB含量檢測值偏差不超過1秒，所以選用B試劑體系作為本發明試劑盒相應的工作液。實施例3發明試劑盒中Ca2+對FIB定量準確性的驗證實驗：本實驗分組為凝血酶試劑中添加Ca2+組和凝血酶試劑中無Ca2+組，添加Ca2+組採用實施例2的B試劑體系進行檢測，無Ca2+組採用在實施例2的B試劑體系基礎上缺少氯化鈣的試劑。每組隨機選取10個試劑進行FIB定量檢測，對照血漿FIB參考值為2.8g/L，分別計算每組檢測值均值、檢測值與參考值的偏差，進而評價凝血酶試劑中Ca2+對FIB定量的影響，相關實驗數據如下表4所示：表4凝血酶試劑中Ca2+對FIB定量準確性的影響以上數據顯示，凝血酶試劑中加入Ca2+組的FIB檢測值與參考值更為相符、偏差較小，即凝血酶試劑中加入Ca2+能使FIB定量結果更為準確。說明本發明試劑盒在FIB凝血酶試劑中添加回補Ca2+可以有效地模擬體內正常凝血過程，為臨床檢測提供更為精確的數據參考。實施例4發明試劑盒與市售同類試劑盒穩定性的比較實驗：此實驗將本發明試劑盒與市售Fisher同類試劑盒的FIB檢測含量進行對比分析，評估本發明試劑與fisher試劑在37℃條件下的穩定性，具體實驗數據如下表5所示：表5發明試劑與市售同類試劑穩定性比較以上實驗數據顯示，本發明試劑8天內檢測值偏差不超過1秒，市售同類檢測試劑三天後的檢測值偏差就超過了1秒，說明本發明試劑盒試劑體系的穩定性更好。實施例5發明試劑與市售同類試劑盒重複性的比較實驗：此實驗將本發明試劑與市售同類試劑的FIB含量檢測進行對比分析，評估本發明試劑與市售fisher試劑的重複性，具體實驗數據如下表6所示：表6發明試劑與市售同類試劑重複性比較以上實驗數據顯示，本發明試劑的FIB含量檢測的變異係數(CV)明顯小於市售同類試劑的FIB含量檢測，即本發明試劑盒重複性好於市售同類產品的重複性。實施例6發明試劑線性範圍驗證實驗：據調研得知，若將FIB含量和凝血時間分別取對數來繪製定標相關曲線，如圖1線1所示，當曲線斜率值為-1時，FIB定量最為精確；如圖1線3所示，當曲線斜率值控制在-1～0時，表現為線性範圍小，FIB含量準確性高；如圖1線2所示，當曲線斜率值小於-1時，表現為線性範圍大，FIB含量準確性低。本發明為了提高FIB定量的準確性，不斷優化實驗條件，最終使該試劑盒的線性範圍縮小，如圖2所示，FIB含量對數與凝血時間對數的定標相關曲線斜率穩定在-(1±0.05)，進而保證了檢測數據的可靠性和線性範圍。在檢測本發明試劑盒相關線性範圍的基礎上，並與fisher試劑和Biomedica試劑進行了對比分析。相關數據請見圖3、圖4。實施例7發明試劑盒檢測範圍驗證實驗：本實驗對兩批發明試劑的檢測範圍進行測試，用接近FIB測試範圍上限的高濃度樣品和咪唑緩衝液稀釋成13個稀釋濃度的定標品，使標稱含量值範圍控制在0.6-8g/L，每個稀釋濃度測試兩次，分別求出測定結果的均值，以稀釋濃度為自變量，測定結果均值為因變量求出線性回歸方程。在此基礎上，通過血凝儀上檢測到的凝血時間換算求出樣品檢測含量，計算檢測含量與標稱含量值的偏差，進而評價本發明試劑的檢測範圍情況及檢測範圍內試劑的準確性情況。實驗檢測結果如下表7和表8所示：表7兩批發明試劑盒試劑檢測範圍測試情況表8試劑檢測範圍內的兩批發明試劑盒的準確性情況以上檢測結果顯示，本發明的FIB定量試劑的檢測範圍寬，即試劑檢測範圍在0.6-8g/L之間，且該範圍內的檢測結果準確性較高。實施例8肝素含量對凝血時間的影響驗證實驗：因為肝素會抑制凝血酶，影響凝血時間的檢測，該實驗檢測分析了0-1IU/mL肝素對本發明試劑的凝血時間影響，每批次重複檢測兩次，具體檢測結果如下表9所示：表9肝素含量對凝血時間的影響情況以上檢測結果顯示，0～1IU/mL肝素不影響本發明三批試劑盒凝血時間的檢測，其檢測到的凝血時間與正常凝血時間不超過1.5s，達到行業標準要求。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3