Ii型豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法及其應用的製作方法

2023-11-02 22:25:02 1

專利名稱：Ii型豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物新技術領域，尤其涉及一種II型豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法及其應用。
背景技術：
斷奶仔豬多系統衰竭症候群(PMWS)是1997年在加拿大首先發生一種新的豬病，表現進行性消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、腹瀉、黃疸。1998年，Ellis等首次分離到該病的病原，為II型豬圓環病毒(PCV2)。郎洪武等(2000)對北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南7省(市)22個豬群的559份血清檢測表明，PCV2總陽性率為42.9％。周繼勇等對浙江省杭州地區28個豬場採集了1677份豬血清，用IFA試驗檢測血清中PCV2抗體，結果PCV2抗體總陽性率為57.25％，表明PCV2在我國的流行情況也比較嚴重。PMWS對養豬業造成重大經濟損失，PCV2是疫苗的研製成為急需解決的問題。
常規疫苗包括滅活苗或弱毒苗，但由於PCV2在細胞培養中不產生細胞病變，難以產生高滴度的病毒粒子，用常規技術製備PCV2疫苗十分不便，至今尚無II型豬圓環病毒常規疫苗可用。核酸免疫是一種新型的免疫技術，它是將編碼抗原基因的表達性載體通過肌肉注射的方法給予動物，誘導機體產生免疫應答。
細胞因子佐劑對核酸疫苗的增強作用越來越受到人們的重視，根據產生的Th細胞亞群的不同，細胞因子可分為Th1型細胞因子(IL-2，IFN-γ，IL-12，IL-15，IL-18)和Th2型細胞因子(IL-4，IL-5，IL-6，IL-10)兩類。細胞因子基因佐劑的應用對核酸免疫技術起了巨大的推動作用，能有效克服某些核酸疫苗免疫效力不足問題。IL-2和IFN-γ是常見的Th1型細胞因子，IL-4是常見的Th2型細胞因子，可以作為基因佐劑來增強PCV2核酸疫苗的免疫效力。我們用真核表達載體pCI-neo構建的PCV2基因、豬細胞因子、以及融合表達載體，轉染PK-15細胞後，經間接免疫螢光(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或Westernblot檢測，證明能在PK-15細胞中表達。在此基礎上，將其作為核酸疫苗分別免疫4-6周齡豬，發現能誘導產生針對PCV2的體液免疫和細胞免疫反應。表明我們構建的真核表達質粒可作為核酸疫苗來使用。

發明內容
本發明的目的是提供一種II型豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法及其應用。
製備方法為1)設計特異性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因組為模板，通過PCR的方法克隆PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，與pCI-neo構建為真核表達載體；2)分離豬外周血單個核細胞，通過RT-PCR方法克隆豬IFN、IL-2和IL-4基因，並與pCI-neo構建為真核表達載體；3)以上述重組載體為基礎，分別構建PCV2 ORF2與PCV2的其它基因或與豬細胞因子基因的融合表達載體；所構建的核酸疫苗免疫小鼠後，能誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應。
所構建的核酸疫苗免疫仔豬後，能誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應。
本發明的優點(1)不需培養病毒，生產周期短；(2)不需細胞培養，有效防止其它豬源病毒的汙染；(3)不表達對機體有害的致病蛋白，安全性高；(4)可同時激活體液免疫與細胞免疫應答；


圖1，真核表達載體pCI-neo的結構示意圖；圖2，pCI-PCV2-ORF1重組質粒的鑑定，1.MluI和SalI雙酶切，切出約945bp大小片段；2.以F1P1/F1P2作為引物的PCR產物960bp；3.以PC1/PC2作為引物的PCR產物1045bp；M.DNA marker；圖3，豬IFN-γ、IL2、IL4基因的RT-PCR結果，分別擴增出大小為501bp、465bp、402bp的特異性條帶；M.DNA marker；圖4，pCI-pIL2重組質粒的鑑定，1.MluI和SalI雙酶切約465bp；2，3.以PIL21/PIL22為引物的PCR產物約480bp；4.以PC1/PC2為引物的PCR產物約587bp；M.DNA marker；圖5，pCI-pIL4重組質粒的鑑定，1.MluI和SalI雙酶切約412bp片段；2.以PIL41/PIL42為引物的PCR產物約420bp；3.以PC1/PC2為引物進行的PCR產物約524bp；M.DNA marker；圖6，pCI-pIFN重組質粒的鑑定，1.MluI和SalI雙酶切約507bp；2.以IF1/IF2為引物的PCR產物519bp；3以PC1/PC2為引物的PCR產物約597bp；M.DNAmarker；圖7，pCI-PCV2-ORF1轉染細胞的IFA檢測(200×)，以豬PCV2多抗血清為一抗、FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，IFA法檢測轉染48h後的PK15，發現細胞的胞漿中呈現特異性的螢光染色；圖8.pCI-PCV2-ORF2轉染細胞的IFA檢測(200×)，以豬PCV2多抗血清為一抗、FITC標記的羊抗鼠IgG為二抗，IFA法檢測轉染48h後的PK15，發現細胞的胞漿中呈現特異性的螢光染色。
具體實施例方式
本發明所說PCV2 ORF2與PCV2其它基因的融合表達載體的構建是將PCV2ORF2與PCV2 ORF1、ORF3、ORF4基因相連接，並亞克隆於真核表達載體pCI-neo，構建重組質粒pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4作為PCV2核酸疫苗。
PCV2 ORF2與豬細胞因子基因的融合表達載體構建是將PCV2 ORF2與豬IFN-γ、IL-2、IL-4基因相連接，並亞克隆於真核表達載體pCI-neo，構建重組質粒pCI-PCV2-ORF2-pIFN、pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4作為PCV2核酸疫苗。
本發明性能的測定1)將純化的重組質粒，用脂質體轉染PK15細胞，轉染後收集培養不同時間(24h、48h、72h)的細胞上清液進行ELISA檢測或活性試驗，對培養48h後的細胞進行IFA或Western blot檢測，證明重組載體在真核細胞中的可以正確表達。
2)用製備重組載體免疫6-8周齡BALB/C雄鼠，間隔2周免疫三次，證明重組質粒可誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應。
3)用製備的重組載體免疫4-6周齡仔豬，間隔2周免疫3次，證明重組質粒可誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應，同時對豬無致病性。
實施例1II型豬圓環病毒核酸ORF1~ORF4真核表達載體的構建根據PCV2毒株HZ0201的基因序列，分別設計PCV2 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4基因的特異性引物，引物序列如下PCV2 ORF1基因引物f1p1ATAACGCGTCATGCCCAGCAAGAAGf1p2GCGGTCGACGACTCAGTAATTTATTTCATATGGPCV2 ORF2基因引物
f2ms1GCGGTCGACTCATTAAGGGTTAAGTGGGf2ms2TATACGCGTTTATGACGTATCCAAGGAGGPCV2 ORF3基因引物f3P1TAAGTCGACCTTACTGATGGAGTGTGGf3P2ATAACGCGTATGGTAACCATCCCACPCV2 ORF4基因引物f4P1TATGTCGACTCTCAGGGACAACGGf4P2ATAACGCGTCAATGACGTGTACATTAGTCT以上的上、下遊引物分別引入MluI和SalI位點。
同時根據pCI-neo載體序列，在其多克隆位點附近分別設計上下遊引物，用於重組載體的鑑定PC1GAGTACTTAATACGACPC2CGAAGCATTAACC以抽提的PCV2基因組DNA為模板，擴增PCV2的以上基因。PCR程序為95℃變性10min，後按95℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 90sec進行30個循環，最後72℃延伸10min。
用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物並回收純化分別為945bp、702bp、315bp、180bp的特異性片段，用MluI和SalI雙酶切，與同樣經MluI和SalI雙酶切並回收純化的pCI-neo載體用T4 DNA連接酶進行連接反應，轉化E.coliTOP10感受態細胞，在含Amp的LB培養基平板上挑取陽性克隆，經酶切、PCR和測序鑑定，正確構建pCI-PCV2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2、pCI-PCV2-ORF3、pCI-PCV2-ORF4真核表達載體。
實施例2豬IL2、IL4和IFN-γ真核表達載體的構建採取健康大約克豬血10ml，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，後懸浮於RPMl1640綜合培養基中，將細胞懸液稀釋至2×106/ml，加conA終濃度至10mg/ml，置於細胞培養板中，CO2培養箱中37℃培養48h。然後取培養細胞用Trizol Reagent提取總RNA。根據已發表的豬IL2、IL4和IFN-γcDNA序列，設計上下遊引物豬IL2引物PIL21ATAACGCGTCAATGTATAAGATGCAGPIL22TCAGTCGACTTATCAAGTCAGTGTTG豬IL4引物
PIL41ATAACGCGTGCTCTATTCATGGGPIL42TATGTCGACTTCAACACTTTGAGTAT豬IFN-γ引物IF1ATAACGCGTACAATGAGTTATACAACIF2TAGGTCGACACAATTATTTTGATGCT以上的上、下遊引物分別引入MluI和SalI位點。
按RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit說明書，以Olig(dT)18為引物，M-MuLV逆轉錄酶作用下反轉錄合成豬IL-2 cDNA第一鏈；反轉錄產物在94℃ 40s，45℃ 40s，72℃ 50s的條件下進行PCR擴增，共30個循環。最後72℃延伸10min，PCR產物經1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析並回收，應分別擴增出大小為465bp、402bp、501bp的特異性條帶。用MluI和SalI雙酶切RT-PCR擴增產物，與同樣經MluI和SalI雙酶切回收純化的pCI-neo載體連接，轉化E.coli TOP10感受態細胞，在含Amp的LB培養基平板上挑取陽性克隆。經酶切、PCR和測序鑑定，正確構建pCI-pIL2、pCI-pIL4和pCI-pIFN真核表達載體。
實施例3PCV2 ORF2與PCV2其它基因的融合表達載體構建設計引物，以PCV2基因組為模板，通過PCR方法擴增PCV2 ORF2基因，擴增產物用XhoI和MluI雙酶切，與同樣酶切的pCI-PCV2-ORF1、pCI-PCV2-ORF3、pCI-PCV2-ORF4載體相連，構建為pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4融合表達載體。
PCV2 ORF2的擴增引物分別為pCI-PCV2-ORF2-ORF1f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm21TAGACGCGTAAAGGGTTAAGTGGGGGGTpCI-PCV2-ORF2-ORF3f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm20TAGACGCGTAGGGTTAAGTGGGGGGTpCI-PCV2-ORF2-ORF4f2xm1TCTCTCGAGTATGACGTATCCAAGGAGGCf2xm22TAGACGCGTAAGGGTTAAGTGGGGGGTPCR程序為95℃變性10min，後按94℃ 40s，52℃ 40s，72℃ 50s進行35個循環，最後72℃延伸10min。
實施例4PCV2 ORF2與豬細胞因子基因的融合表達載體構建設計引物，以PCV2基因組為模板，通過PCR方法擴增PCV2 ORF2基因。將擴增產物用XhoI和MluI雙酶切，與同樣酶切的pCI-pIL2、pCI-pIL4、pCI-pIFN載體連接，構建為pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4、pCI-PCV2-ORF2-pIFN融合表達載體。
構建pCI-PCV2-ORF2-pIL2的擴增引物同pCI-PCV2-ORF2-ORF4，為f2xm1/f2xm22；構建pCI-PCV2-ORF2-pIL4、pCI-PCV2-ORF2-pIFN的擴增引物同pCI-PCV2-ORF2-ORF3，為f2xm1/f2xm20，PCR程序同實施例3。
實施例5重組表達載體在真核細胞中的表達檢測以1ug純化質粒加2ul Invitrogen公司的Lipofectamine Reagent轉染試劑，按說明書轉染2×105PK15細胞。為檢測PCV2 ORF1、ORF2、ORF3和ORF4及其融合表達產物，分別以PCV2 ORF1~4特異性單抗和PCV2病毒多抗為一抗，按常規進行間接免疫螢光(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或Western blot，檢測PCV2 ORF1~4編碼產物在真核細胞中的表達。為檢測豬IL2、IL4和IFN-γ基因及其融合表達產物，分別以豬IL2、IL4和IFN-γ特異性單抗為一抗，按常規進行IFA試驗，檢測以上豬細胞因子基因在真核細胞中的表達。檢測結果表明，所構建的重組載體均能在真核細胞中正確表達。
實施例6重組豬IL2、IL4的生物學活性檢測用MTT法檢測PK15細胞表達的重組pCI-pIL2、pCI-pIL4的生物學活性分離豬外周血單個核細胞(PBMC)，製備1×106~5×106懸液，加conA至終濃度20μg/ml，分裝於96孔板中，誘導培養3-5天後，每孔加入100μl倍比稀釋的PK15細胞培養上清，每個樣品設3-5個重複，繼續培養72h，加入5mg/ml的MTT溶液20μl，繼續培養4h。每孔加入100μl含0.04mol/LHCl的異丙醇，置培養箱恆溫反應2小時，取出細胞培養板，室溫下放置20min，用酶聯儀測定A490光密度值。表明重組豬IL2、IL4具有生物學活性。
實施例7PCV2核酸疫苗對小鼠的免疫效果檢測大規模製備質粒，紫外分光光度法測定DNA含量和純度，調整DNA濃度為1mg/ml。免疫6-8周齡BALB/C雄鼠，方法為後肢股四頭肌每側各肌注7.5g/L的布比卡因10μl，72h後每側注射重組質粒50μl，即100μg質粒/只，每組6隻-10隻。每隔2周按相同方法注射相同劑量，共免疫三次。同時設空載體組作對照。免疫結束後第二周分別通過淋巴細胞增殖試驗(LPA)、T淋巴細胞介導的細胞毒試驗(CTL)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測免疫鼠的細胞免疫及體液免疫應答。檢測結果表明免疫鼠可產生針對PCV2的特異性細胞免疫及體液免疫反應。
淋巴細胞增殖試驗(LPA)的具體過程基因免疫結束後第2周，取免疫小鼠的脾臟，製備脾淋巴細胞懸液，將細胞濃度調整為1×I06/ml，加入96孔板，每孔200ul，加入純化的PCV2和ORF2蛋白進行刺激(另設空白對照)，每樣平行三孔。37℃，5％CO2條件下培養68h後，每孔中加入5mg/mlMTT溶液20ul，37℃下5％CO2培養箱中繼續培養4h，小心吸棄孔內培養上清，加入DMSO150ul/孔，振蕩10min，測定各孔OD490值，計算增殖指數。增殖指數抗原刺激組OD490值/空白對照組值OD490值。
T淋巴細胞介導的細胞毒試驗(CTL)的具體過程基因免疫結束後第2周進行檢測，在24孔培養板中加入2×I07/ml免疫鼠脾細胞懸液0.25ml，同時加入1ml RPM 11640培養液，置37℃5％條件下培養5d，收集細胞，洗2次，計活細胞數，調成5×I06/ml作為效應細胞備用。將接種PCV2的，處於對數生長期的PK15細胞，清洗2次，消化，懸浮為2×I05個/mL作為靶細胞。96孔培養板中加入效應細胞100μl和靶細胞100μl，每個樣本設3個復孔。並設效應細胞自然釋放孔、陰性對照(不加效應細胞)、最大釋放孔(用100μl 1％NP40代替效應細胞)。37℃5％條件下培養6h後取出。200×g離心培養板10min，每孔吸100μl上清液，對應加入另一塊96孔酶聯檢測板中，每孔加入新配製的LDH底物混合液100μl，，室溫放置20min。在酶標儀上測各孔的OD值，檢測波長為492nm，參考波長為650nm。特異性殺傷活性(細胞毒)的計算先將3個復孔的OD值計算平均值，然後按計算細胞毒百分數細胞毒％＝(試驗孔OD值—靶細胞自然釋放孔OD值/最大釋放孔OD值—靶細胞自然釋放孔OD值)×100％.
實施例8PCV2核酸疫苗對豬的免疫效果檢測大規模製備質粒，免疫4-6周齡、PCV2抗體陰性豬，每隻豬注射相應質粒200μg，免疫程序為間隔2周免疫3次，同時設空載體組作對照。首免後每周採血，通過ELISA檢測血清中PCV2抗體效價；同時首次免疫後每周採血，通過流式細胞儀計數血液中的CD4+、CD8+T細胞的變化；免疫結束後第2周，取免疫豬的脾臟，檢測淋巴細胞增殖活性(LPA)和T淋巴細胞介導的細胞毒(CTL)作用。結果表明PCV2核酸疫苗能有效介導機體對PCV2的特異性免疫反應。
實施例9PCV2核酸疫苗對豬的安全性試驗為檢測PCV2 ORF1~4核酸疫苗對豬是否安全，基因免疫後觀察豬的精神狀態、採食、體溫、體重等變化；免疫結束後取實驗豬的腹股溝淋巴結進行組織組織學檢查，並用免疫組化(IHC)檢測淋巴組織中的PCV2編碼蛋白的分布。
結果表明PCV2核酸疫苗對豬的精神狀態、採食、體溫、體重等無明顯影響，不產生明顯組織學病變，有較高安全性。
權利要求
1.一種豬II型圓環病毒核酸疫苗的製備方法，其特徵在於方法的步驟為1)設計特異性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因組為模板，通過PCR的方法克隆PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，與pCI-neo構建為真核表達載體，以PCV2 ORF1、ORF2、ORF3、ORF4基因作為PCV2核酸疫苗的基本組成部分；2)分離豬外周血單個核細胞，通過RT-PCR方法克隆豬IFN、IL-2和IL-4基因，並與pCI-neo構建為真核表達載體，以豬IFN-γ、IL-2、IL-4基因作為基因佐劑；3)以上述重組載體為基礎，分別構建PCV2 ORF2與PCV2的其它基因或與豬細胞因子基因的融合表達載體。
2.根據權利要求1所述的一種豬II型圓環病毒核酸疫苗的製備方法，其特徵在於所說PCV2 ORF2與PCV2其它基因的融合表達載體的構建是將PCV2 ORF2與PCV2 ORF1、ORF3、ORF4基因相連接，並亞克隆於真核表達載體pCI-neo，構建重組質粒pCI-PCV2-ORF2-ORF1、pCI-PCV2-ORF2-ORF3、pCI-PCV2-ORF2-ORF4作為PCV2核酸疫苗。
3.根據權利要求1所述的一種豬II型圓環病毒核酸疫苗的製備方法，其特徵在於所說PCV2 ORF2與豬細胞因子基因的融合表達載體構建是將PCV2 ORF2與豬IFN-γ、IL-2、IL-4基因相連接，並亞克隆於真核表達載體pCI-neo，構建重組質粒pCI-PCV2-ORF2-pIFN、pCI-PCV2-ORF2-pIL2、pCI-PCV2-ORF2-pIL4作為PCV2核酸疫苗。
4.一種豬II型圓環病毒核酸疫苗的應用，其特徵在於所構建的核酸疫苗免疫小鼠後，能誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應。
5.一種豬II型圓環病毒核酸疫苗的應用，其特徵在於所構建的核酸疫苗免疫仔豬後，能誘導機體產生針對PCV2的體液免疫及細胞免疫反應。
全文摘要
本發明公開了一種II型豬圓環病毒核酸疫苗的製備方法及其應用。製備方法為1)設計特異性引物，以PCV2杭州株(HZ0201)的基因組為模板，通過PCR的方法克隆PCV－2的ORF1、ORF2、ORF3和ORF4基因，與pCI－neo構建為真核表達載體；2)分離豬外周血單個核細胞，通過RT－PCR方法克隆豬IFN、IL－2和IL－4基因，並與pCI－neo構建為真核表達載體；3)以上述重組載體為基礎，分別構建PCV2 ORF2與PCV2的其它基因或與豬細胞因子基因的融合表達載體；本發明的優點(1)不需培養病毒，生產周期短；(2)不需細胞培養，有效防止其它豬源病毒的汙染；(3)不表達對機體有害的致病蛋白，安全性高；(4)可同時激活體液免疫與細胞免疫應答。
文檔編號A61K39/12GK1579553SQ200410018528
公開日2005年2月16日 申請日期2004年5月18日 優先權日2004年5月18日
發明者周繼勇, 申會剛, 郭軍慶 申請人:浙江大學