一種癌症鑑別標誌物及其應用的製作方法

2024-04-16 02:18:05

1.本發明涉及醫學領域，特別涉及一種癌症鑑別標誌物及其應用。


背景技術：

2.甲狀腺癌為一種常見的內分泌系統惡性腫瘤，可分為甲狀腺乳頭狀癌、濾泡性甲狀腺癌、未分化甲狀腺癌和髓樣癌。其中乳頭狀癌(papillary thyroid cancer,ptc)最為常見，佔所有甲狀腺惡性腫瘤的90％以上[xing,mingzhao；haugen,bryan r；schlumberger,martin(2013).progress in molecular-based management of differentiated thyroid cancer.the lancet,381(9871),1058
–
1069.]。根據統計，成年人甲狀腺結節的患病率約為5-10％，其中60歲以上的人群最為嚴重，可高達50-70％[guth s,theune u,aberle j,et al.very high prevalence of thyroid nodules detected by high frequency(13mhz)ultrasound examination.eur j clin invest 2009；39:699-706.]。影像學檢查是一種比較普遍的甲狀腺診斷方法，該方法大多依靠醫生經驗判斷，存在一定的結果誤差，而且影像學對人身體有一定的輻射傷害。細針穿刺活檢也是一種臨床上常見的甲狀腺癌診斷技術，該方法根據穿刺物的細胞學形態對結節的良惡性進行評估。因為甲狀腺良惡性腫瘤的細胞學特徵經常發生重疊，所以約有10-30％的細針穿刺診斷為不明確的細胞學結果[cibas es,ali sz.the 2017bethesda system for reporting thyroid cytopathology.thyroid.2017；27(11):1341-6.]。不確定的穿刺結果會導致約60％的患者遭受過度治療或者漏診[stewart r,leang yj,bhatt cr,grodski s,serpell j,lee jc.quantifying the differences in surgical management of patients with definitive and indeterminate thyroid nodule cytology.eur j surg oncol.2020；46(2):252-7.]。這不僅是增加了患者經濟和身心負擔，還佔據了大量的公共衛生資源，使得醫療保健系統產生巨額的財務成本。因此，鑑別甲狀腺良惡性腫瘤有利於臨床醫師採取更精準的治療方案，具有很重要的臨床和公共衛生意義。
[0003]
表觀遺傳學為一種不涉及dna序列改變但可遺傳的基因表達調控方式，而且能夠遺傳給下一代[nicoglou a,merlin f.epigenetics:a way to bridge the gap between biological fields.stud hist philos biol biomed sci.2017；66:73-82]。dna甲基化是表觀遺傳調控的重要方式之一，是指在dna甲基化轉移酶的作用下，在基因組cpg二核苷酸的胞嘧啶5』碳位共價鍵結合一個甲基基團[bird a.perceptions of epigenetics.nature.2007；447:396-398]。大量的研究表明，dna甲基化能引起染色質結構、dna構象、dna穩定性及dna與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制了基因表達[moore ld,le t,fan g.dna methylation and its basic function.neuropsychopharmacology.2013；38:23-38]。
[0004]
dna甲基化標誌物為現階段最佳的腫瘤體外早診分子標誌物，目前臨床上關於甲狀腺癌診斷標誌物的靈敏度和特異性很有限，尤其是缺乏早期診斷的標誌物，因此更為敏感、特異的早期分子標記物亟待發掘。


技術實現要素：

[0005]
本發明的目的是提供一種癌症鑑別標誌物及其應用。
[0006]
第一方面，本發明要求保護甲基化mreg基因作為標誌物在製備產品中的應用；所述產品的用途為如下中的至少一種：
[0007]
(1)區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤；
[0008]
(2)區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0009]
(3)區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤；
[0010]
(4)區分或輔助區分甲狀腺惡性腫瘤不同亞型；
[0011]
(5)區分或輔助區分甲狀腺惡性腫瘤不同分期。
[0012]
進一步地，(2)和(4)中所述不同亞型可為病理分型，如組織學分型。
[0013]
進一步地，(3)和(5)中所述不同分期可為臨床分期。
[0014]
在本發明的具體實施方式中，(2)中所述區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌。
[0015]
在本發明的具體實施方式中，(3)中所述區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0016]
在本發明的具體實施方式中，(4)中所述區分或輔助區分甲狀腺惡性腫瘤不同亞型具體可為如下任一種：區分或輔助區分甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌、區分或輔助區分甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌、區分或輔助區分甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌、區分或輔助區分甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌、區分或輔助區分甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌、區分或輔助區分甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌。
[0017]
在本發明的具體實施方式中，(5)中所述區分或輔助區分甲狀腺惡性腫瘤不同分期具體可為如下任一種：區分或輔助區分ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、區分或輔助區分ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0018]
第二方面，本發明要求保護用於檢測mreg基因甲基化水平的物質在製備產品中的應用。所述產品的用途為前文(1)-(5)中的至少一種。
[0019]
第三方面，本發明要求保護用於檢測mreg基因甲基化水平的物質和儲存有數學模型建立方法和/或使用方法的介質在製備產品中的應用。所述產品的用途為前文(1)-(5)中的至少一種。
[0020]
所述數學模型按照包括如下步驟的方法獲得：
[0021]
(a1)分別檢測n1個a類型樣本和n2個b類型樣本的基因甲基化水平；
[0022]
(a2)取步驟(a1)獲得的所有樣本的基因甲基化水平數據，按照a類型和b類型的分
類方式，通過二分類邏輯回歸法建立數學模型，確定分類判定的閾值。
[0023]
其中，n1和n2均可為10以上正整數。
[0024]
所述數學模型使用方法包括如下步驟：
[0025]
(b1)檢測待測樣本的基因甲基化水平；
[0026]
(b2)將步驟(b1)獲得的所述待測樣本的基因甲基化水平數據代入所述數學模型，得到檢測指數；然後比較檢測指數和閾值的大小，根據比較結果確定所述待測樣本的類型是a類型還是b類型。
[0027]
在本發明的具體實施方式中，所述閾值設為0.5。大於0.5歸為一類，小於0.5歸為另外一類，等於0.5作為不確定的灰區。其中a類型和b類型為相對應的兩分類，二分類的分組，哪一組是a類型，哪一組是b類型，要根據具體的數學模型來確定，無需約定。
[0028]
在實際應用中，所述閾值也可根據最大約登指數確定(具體可為最大約登指數對應的數值)。大於閾值歸為一類，小於閾值歸為另外一類，等於閾值作為不確定的灰區。其中a類型和b類型為相對應的兩分類，二分類的分組，哪一組a類型，哪一組是b類型，要根據具體的數學模型來確定，無需約定。
[0029]
所述a類型樣本和所述b類型樣本為如下任一種：
[0030]
(c1)甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤；
[0031]
(c2)甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0032]
(c3)甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤；
[0033]
(c4)不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0034]
(c5)不同分期的甲狀腺惡性腫瘤。
[0035]
進一步地，(c2)和(c4)中所述不同亞型可為病理分型，如組織學分型。
[0036]
進一步地，(c3)和(c5)中所述不同分期可為臨床分期。
[0037]
在本發明的具體實施方式中，(c2)中所述甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌。
[0038]
在本發明的具體實施方式中，(c3)中所述甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0039]
在本發明的具體實施方式中，(c4)中所述甲狀腺惡性腫瘤不同亞型具體可為如下任一種：甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌。
[0040]
在本發明的具體實施方式中，(c5)中所述甲狀腺惡性腫瘤不同分期具體可為如下任一種：ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0041]
第四方面，本發明要求保護儲存有數學模型建立方法和/或使用方法的介質在制
備產品中的應用。所述產品的用途為前文(1)-(5)中的至少一種。
[0042]
所述數學模型按照包括如下步驟的方法獲得：
[0043]
(a1)分別檢測n1個a類型樣本和n2個b類型樣本的基因甲基化水平；
[0044]
(a2)取步驟(a1)獲得的所有樣本的基因甲基化水平數據，按照a類型和b類型的分類方式，通過二分類邏輯回歸法建立數學模型，確定分類判定的閾值。
[0045]
其中，n1和n2均可為10以上正整數。
[0046]
所述數學模型使用方法包括如下步驟：
[0047]
(b1)檢測待測樣本的基因甲基化水平；
[0048]
(b2)將步驟(b1)獲得的所述待測樣本的基因甲基化水平數據代入所述數學模型，得到檢測指數；然後比較檢測指數和閾值的大小，根據比較結果確定所述待測樣本的類型是a類型還是b類型。
[0049]
在本發明的具體實施方式中，所述閾值設為0.5。大於0.5歸為一類，小於0.5歸為另外一類，等於0.5作為不確定的灰區。其中a類型和b類型為相對應的兩分類，二分類的分組，哪一組是a類型，哪一組是b類型，要根據具體的數學模型來確定，無需約定。
[0050]
在實際應用中，所述閾值也可根據最大約登指數確定(具體可為最大約登指數對應的數值)。大於閾值歸為一類，小於閾值歸為另外一類，等於閾值作為不確定的灰區。其中a類型和b類型為相對應的兩分類，二分類的分組，哪一組a類型，哪一組是b類型，要根據具體的數學模型來確定，無需約定。
[0051]
所述a類型樣本和所述b類型樣本為如下任一種：
[0052]
(c1)甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤；
[0053]
(c2)甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0054]
(c3)甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤；
[0055]
(c4)不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0056]
(c5)不同分期的甲狀腺惡性腫瘤。
[0057]
進一步地，(c2)和(c4)中所述不同亞型可為病理分型，如組織學分型。
[0058]
進一步地，(c3)和(c5)中所述不同分期可為臨床分期。
[0059]
在本發明的具體實施方式中，(c2)中所述甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌。
[0060]
在本發明的具體實施方式中，(c3)中所述甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤具體可為如下任一種：甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0061]
在本發明的具體實施方式中，(c4)中所述甲狀腺惡性腫瘤不同亞型具體可為如下任一種：甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌。
[0062]
在本發明的具體實施方式中，(c5)中所述甲狀腺惡性腫瘤不同分期具體可為如下任一種：ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡
性腫瘤、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤。
[0063]
第五方面，本發明要求保護一種試劑盒。
[0064]
本發明所要求的試劑盒包括用於檢測mreg基因甲基化水平的物質。所述試劑盒的用途為前文(1)-(5)中的至少一種。
[0065]
進一步地，所述試劑盒中還可含有前文第三方面或第四方面中所述的「儲存有數學模型建立方法和/或使用方法的介質」。
[0066]
第六方面，本發明要求保護一種系統。
[0067]
本發明所要求保護的系統，可包括：
[0068]
(d1)用於檢測mreg基因甲基化水平的試劑和/或儀器；
[0069]
在(d1)中，所述用於檢測mreg基因甲基化水平的試劑可為前文第一方面中所述的用於檢測mreg基因甲基化水平的物質(如引物對)。用於檢測mreg基因甲基化水平的儀器可為飛行時間質譜檢測儀。當然所述用於檢測mreg基因甲基化水平的試劑中還可包含進行飛行時間質譜所用的其他常規試劑。
[0070]
(f2)裝置，所述裝置包括單元x和單元y；
[0071]
所述單元x用於建立數學模型，包括數據採集模塊、數據分析處理模塊和模型輸出模塊；
[0072]
所述數據採集模塊被配置為採集(d1)檢測得到的n1個a類型樣本和n2個b類型樣本的mreg基因甲基化水平數據；
[0073]
所述數據分析處理模塊被配置為接收來自於所述數據採集模塊的所述n1個a類型樣本和n2個b類型樣本的mreg基因甲基化水平數據，按照a類型和b類型的分類方式，通過二分類邏輯回歸法建立數學模型，確定分類判定的閾值；
[0074]
其中，n1和n2均可為10以上正整數。
[0075]
所述模型輸出模塊被配置為接收來自於所述數據分析處理模塊建立的所述數學模型，並進行輸出；
[0076]
所述單元y用於確定待測樣本類型，包括數據輸入模塊、數據運算模塊、數據比較模塊和結論輸出模塊；
[0077]
所述數據輸入模塊被配置為輸入(d1)檢測得到的待測者的mreg基因甲基化水平數據；
[0078]
所述數據運算模塊被配置為接收來自於所述數據輸入模塊的所述待測者的mreg基因甲基化水平數據，並將所述待測者的mreg基因甲基化水平數據代入所述單元x中的所述數據分析處理模塊建立的所述數學模型，計算得到檢測指數；
[0079]
所述數據比較模塊被配置為接收來自於所述數據運算模塊計算得到的檢測指數，並將所述檢測指數與所述單元x中的所述數據分析處理模塊中確定的所述閾值進行比較；
[0080]
所述結論輸出模塊被配置為接收來自於所述數據比較模塊的比較結果，並根據所述比較結果輸出所述待測樣本的類型是a類型還是b類型的結論；
[0081]
所述a類型樣本和所述b類型樣本為如下任一種：
[0082]
(c1)甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤；
170位所示cpg位點的甲基化水平；所述mreg_b_6.7為seq id no.2所示的dna片段自5』端第350-351位和第356-357位所示cpg位點的甲基化水平；所述mreg_b_8為seq id no.2所示的dna片段自5』端第365-366位所示cpg位點的甲基化水平；所述mreg_b_9為seq id no.2所示的dna片段自5』端第446-447位所示cpg位點的甲基化水平；所述mreg_b_10為seq id no.2所示的dna片段自5』端第496-497位所示cpg位點的甲基化水平。所述模型的閾值為0.5。通過模型計算的檢測指數大於0.5的患者候選為甲狀腺惡性腫瘤患者，小於0.5的患者候選為甲狀腺良性腫瘤患者。
[0099]
在前文各方面中，所述mreg基因甲基化水平可為mreg基因中如下(e1)-(e4)所示片段中全部或部分cpg位點的甲基化水平。所述甲基化mreg基因可為mreg基因中如下(e1)-(e4)所示片段中全部或部分cpg位點甲基化。
[0100]
(e1)seq id no.1所示的dna片段或與其具有80％以上同一性的dna片段；
[0101]
(e2)seq id no.2所示的dna片段或與其具有80％以上同一性的dna片段；
[0102]
(e3)seq id no.3所示的dna片段或與其具有80％以上同一性的dna片段；
[0103]
(e4)seq id no.4所示的dna片段或與其具有80％以上同一性的dna片段。
[0104]
進一步地，所述全部或部分cpg位點可為如下任一所示：
[0105]
(f1)mreg基因中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示4個dna片段中的任意一個或多個cpg位點；
[0106]
(f2)mreg基因中seq id no.1所示的dna片段上的所有cpg位點(表1)和seq id no.2所示的dna片段上的所有cpg位點(表2)；
[0107]
(f3)mreg基因中seq id no.1所示的dna片段上的所有cpg位點(表1)和seq id no.3所示的dna片段上的所有cpg位點(表3)；
[0108]
(f4)mreg基因中seq id no.2所示的dna片段上的所有cpg位點(表2)和seq id no.3所示的dna片段上的所有cpg位點(表3)；
[0109]
(f5)mreg基因中seq id no.1所示的dna片段上的所有cpg位點(表1)、seq id no.2所示的dna片段上的所有cpg位點(表2)和seq id no.3所示的dna片段上的所有cpg位點(表3)；
[0110]
(f6)mreg基因中seq id no.2所示的dna片段中的全部cpg位點(表2)或任意12個或任意11個或任意10個或任意9個或任意8個或任意7個或任意6個或任意5個或任意4個或任意3個或任意2個或任意1個cpg位點；
[0111]
(f7)mreg基因中seq id no.2所示的dna片段上如下5項所示cpg位點的全部或任意4項或任意3項或任意2項或任意1項：
[0112]
第1項：seq id no.2所示的dna片段自5』端第167-168位和第169-170位所示cpg位點；
[0113]
第2項：seq id no.2所示的dna片段自5』端第350-351位和第356-357位所示cpg位點；
[0114]
第3項：seq id no.2所示的dna片段自5』端第365-366位所示cpg位點；
[0115]
第4項：seq id no.2所示的dna片段自5』端第446-447位所示cpg位點；
[0116]
第5項：seq id no.2所示的dna片段自5』端第496-497位所示cpg位點。
[0117]
在本發明的具體實施方式中，有些相鄰的甲基化位點在利用飛行時間質譜進行
dna甲基化分析時由於幾個cpg位點位於一個甲基化片段上，峰圖無法區分(無法區分的位點在表6中有記載)，因而在進行甲基化水平分析、以及構建和使用相關數學模型時將其按照一個甲基化位點進行處理。
[0118]
在上述各方面中，所述用於檢測mreg基因甲基化水平的物質可包含(或為)用於擴增mreg基因全長或部分片段的引物組合；所述用於檢測mreg基因甲基化水平的試劑可包含(或為)用於擴增mreg基因全長或部分片段的引物組合。
[0119]
進一步地，所述部分片段可為如下中至少一個片段：
[0120]
(g1)seq id no.1所示的dna片段或其包含的dna片段；
[0121]
(g2)seq id no.2所示的dna片段或其包含的dna片段；
[0122]
(g3)seq id no.3所示的dna片段或其包含的dna片段；
[0123]
(g4)seq id no.4所示的dna片段或其包含的dna片段；
[0124]
(g5)與seq id no.1所示的dna片段或其包含的dna片段具有80％以上同一性的dna片段；
[0125]
(g6)與seq id no.2所示的dna片段或其包含的dna片段具有80％以上同一性的dna片段；
[0126]
(g7)與seq id no.3所示的dna片段或其包含的dna片段具有80％以上同一性的dna片段；
[0127]
(g8)與seq id no.4所示的dna片段或其包含的dna片段具有80％以上同一性的dna片段。
[0128]
在本發明的具體實施方式中，所述引物組合為引物對a和/或引物對b和/或引物對c和/或引物對d。
[0129]
所述引物對a為引物a1和引物a2組成的引物對；所述引物a1為seq id no.5或seq id no.5的第11-35位核苷酸所示的單鏈dna；所述引物a2為seq id no.6或seq id no.6的第32-56位核苷酸所示的單鏈dna；
[0130]
所述引物對b為引物b1和引物b2組成的引物對；所述引物b1為seq id no.7或seq id no.7的第11-35位核苷酸所示的單鏈dna；所述引物b2為seq id no.8或seq id no.8的第32-56位核苷酸所示的單鏈dna；
[0131]
所述引物對c為引物c1和引物c2組成的引物對；所述引物c1為seq id no.9或seq id no.9的第11-35位核苷酸所示的單鏈dna；所述引物c2為seq id no.10或seq id no.10的第32-56位核苷酸所示的單鏈dna；
[0132]
所述引物對d為引物d1和引物d2組成的引物對；所述引物d1為seq id no.11或seq id no.11的第11-35位核苷酸所示的單鏈dna；所述引物d2為seq id no.12或seq id no.12的第32-56位核苷酸所示的單鏈dna。
[0133]
在上述各方面中，檢測所述mreg基因甲基化水平可為檢測腫瘤組織樣本中所述mreg基因甲基化水平。
[0134]
在本發明中，甲狀腺惡性腫瘤組織中的mreg基因中seq id no.1、2、3和4所示的dna片段上甲基化位點的甲基化水平明顯低於甲狀腺良性腫瘤。
[0135]
在本發明中，不同臨床特徵甲狀腺癌如：乳頭狀癌、濾泡癌、髓樣癌和未分化癌腫瘤組織中的mreg基因中seq id no.1、2、3和4所示的dna片段上甲基化位點的甲基化水平越
來越低。
[0136]
在本發明中，隨著甲狀腺惡性腫瘤的分期的增加組織中的mreg基因中seq id no.1、2、3和4所示的dna片段上甲基化位點的甲基化水平越來越低。
[0137]
以上任一所述mreg基因具體可參見genbank登錄號：nm_001372188.1(gi:1728373828)，轉錄變體1；nm_018000.3(gi:1519245324)，轉錄變體2；nm_001372189.1(gi:1728373839)，轉錄變體3；nm_001372190.1(gi:1728373851)，轉錄變體4。
[0138]
本發明證明活檢樣本mreg甲基化可作為甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤、不同亞型或不同分期的甲狀腺惡性腫瘤的鑑別診斷的潛在標誌物。本發明對鑑別甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤、不同亞型或不同分期的甲狀腺惡性腫瘤，以及指導制定合理的臨床治療方案均有重要的科學意義和臨床應用價值。
附圖說明
[0139]
圖1為數學模型示意圖。
[0140]
圖2為甲狀腺良惡性腫瘤數學模型舉例說明。
具體實施方式
[0141]
下面結合具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的範圍。以下提供的實施例可作為本技術領域普通技術人員進行進一步改進的指南，並不以任何方式構成對本發明的限制。
[0142]
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0143]
實施例1、用於檢測mreg基因甲基化位點的引物設計
[0144]
本次檢測選擇了mreg基因四個片段(mreg_a片段、mreg_b片段、mreg_c片段和mreg_d片段)上的cpg位點進行甲基化水平和甲狀腺惡性腫瘤的相關性分析。
[0145]
mreg_a片段(seq id no.1)位於hg19參考基因組chr2:216869695-216870453，正義鏈。
[0146]
mreg_b片段(seq id no.2)位於hg19參考基因組chr2:216870879-216871506，正義鏈。
[0147]
mreg_c片段(seq id no.3)位於hg19參考基因組chr2:216871679-216872350，正義鏈。
[0148]
mreg_d片段(seq id no.4)位於hg19參考基因組chr2:216872329-216872917，正義鏈。
[0149]
mreg_a片段中的位點信息如表1所示。
[0150]
mreg_b片段中的位點信息如表2所示。
[0151]
mreg_c片段中的位點信息如表3所示。
[0152]
mreg_d片段中的位點信息如表4所示。
[0153]
表1mreg_a片段中cpg位點信息
[0154]
cpg位點cpg位點在序列中的位置
mreg_a_1seq id no.1自5』端第26-27位mreg_a_2seq id no.1自5』端第245-246位mreg_a_3seq id no.1自5』端第450-451位mreg_a_4seq id no.1自5』端第628-629位mreg_a_5seq id no.1自5』端第733-734位
[0155]
表2mreg_b片段中cpg位點信息
[0156][0157][0158]
表3mreg_c片段中cpg位點信息
[0159]
cpg位點cpg位點在序列中的位置mreg_c_1seq id no.3自5』端第26-27位mreg_c_2seq id no.3自5』端第116-117位mreg_c_3seq id no.3自5』端第122-123位mreg_c_4seq id no.3自5』端第243-244位mreg_c_5seq id no.3自5』端第251-252位mreg_c_6seq id no.3自5』端第351-352位mreg_c_7seq id no.3自5』端第365-366位mreg_c_8seq id no.3自5』端第421-422位mreg_c_9seq id no.3自5』端第505-506位mreg_c_10seq id no.3自5』端第560-561位mreg_c_11seq id no.3自5』端第573-574位mreg_c_12seq id no.3自5』端第631-632位
[0160]
表4mreg_d片段中cpg位點信息
[0161]
cpg位點cpg位點在序列中的位置mreg_d_1seq id no.4自5』端第26-27位mreg_d_2seq id no.4自5』端第84-85位mreg_d_3seq id no.4自5』端第134-135位
mreg_d_4seq id no.4自5』端第379-380位mreg_d_5seq id no.4自5』端第451-452位mreg_d_6seq id no.4自5』端第560-561位mreg_d_7seq id no.4自5』端第563-564位
[0162]
針對四個片段(mreg_a片段、mreg_b片段、mreg_c片段和mreg_d片段)設計特異性pcr引物，如表5所示。seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9和seq id no.11為正向引物；seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10和seq id no.12為反向引物。seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9和seq id no.11中自5』端第1至10位為非特異性標籤，第11至35位為特異性引物序列；seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10和seq id no.12中自5』端第1至31位為非特異性標籤，第32至56位為特異性引物序列。引物序列中不包含snp和cpg位點。
[0163]
表5、mreg甲基化引物序列
[0164][0165]
實施例2、mreg基因甲基化檢測及結果分析
[0166]
一、研究樣本
[0167]
經患者知情同意，共收集380例甲狀腺良性腫瘤組織和598例甲狀腺惡性腫瘤組織。甲狀腺癌分期以美國癌症聯合會(ajcc)第八版分期系統為判斷標準。根據病理類型，甲狀腺惡性腫瘤包括甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和未分化癌四大類。本次收集的598例甲狀腺惡性腫瘤患者中包括甲狀腺乳頭狀癌380例，甲狀腺濾泡癌138例，甲狀腺髓樣癌44例，甲狀腺未分化癌36例。按照病理分期劃分，598例甲狀腺惡性腫瘤患者中有470例ⅰ期患者，68例ⅱ期患者，24例ⅲ期患者，36例ⅳ期患者。
[0168]
二、甲基化檢測
[0169]
1、提取腫瘤組織中的總dna。
[0170]
2、將步驟1製備的組織樣本總dna進行重亞硫酸鹽處理(參照qiagen的dna甲基化試劑盒說明書操作)。重亞硫酸鹽處理後，原來cpg位點中未發生甲基化的胞嘧啶(c)被轉化成尿嘧啶(u)，而發生甲基化的胞嘧啶保持不變。
[0171]
3、以步驟2經過重亞硫酸鹽處理的dna為模板，採用表5中的4對特異引物對通過dna聚合酶按照常規pcr反應要求的反應體系進行pcr擴增，所有引物都採用常規的標準pcr反應體系，且都按照以下程序進行擴增。
[0172]
pcr反應程序為：95℃，4min
→
(95℃，20s
→
56℃，30s
→
72℃，2min)45個循環
→
72℃，5min
→
4℃，1h。
[0173]
4、取步驟3的擴增產物，通過飛行時間質譜進行dna甲基化分析，具體方法如下：
[0174]
(1)向5μl pcr產物中加入2μl蝦鹼性磷酸鹽(sap)溶液(0.3ml sap[0.5u]+1.7ml h2o)然後按照以下程序在pcr儀中孵育(37℃,20min
→
85℃,5min
→
4℃,5min)；
[0175]
(2)取出2μl步驟(1)得到的sap處理後的產物，根據說明書加入5μl t-cleavage反應體系中，然後在37℃孵育3h；
[0176]
(3)取步驟(2)的產物，加入19μl去離子水，再用6μg resin在旋轉搖床進行去離子化孵育1h；
[0177]
(4)2000rpm室溫離心5min，將微量上清由nanodispenser機械手臂上樣384spectrochip；
[0178]
(5)飛行時間質譜分析；獲得的數據用spectroacquire v3.3.1.3軟體收集，通過massarray epityper v1.2軟體實現可視化。
[0179]
上述飛行時間質譜檢測使用的試劑均來試劑盒(t-cleavage masscleave reagent auto kit，貨號：10129a)；上述飛行時間質譜檢測使用的檢測儀器為massarray
○
r analyzer chip prep module 384，型號：41243；上述數據分析軟體為檢測儀器自帶軟體。
[0180]
5、對步驟4得到的數據進行分析。
[0181]
數據統計分析由spss statistics 23.0進行。
[0182]
非參數檢驗用於兩組之間的比較分析。
[0183]
多個cpg位點的組合對於不同樣品分組的鑑別效果通過邏輯回歸和受試者曲線的統計學方法得以實現。
[0184]
所有的統計檢驗都是雙側的，p值《0.05被認為具有統計學意義。
[0185]
通過質譜實驗，共獲得33個可以區別的峰圖。採用spectroacquire v3.3.1.3軟體根據「甲基化水平＝甲基化片段的峰面積/(非甲基化片段的峰面積+甲基化片段的峰面積)」公式可自動通過計算峰面積得到每個樣本在每個cpg位點的甲基化水平。
[0186]
三、統計分析
[0187]
採用中位數表示甲基化水平，採用非參數檢驗比較兩組或多組之間的甲基化水平差異。通過受試者工作特徵曲線(receiver operating characteristic curve，roc曲線)評價單個cpg位點和多個cpg位點組合的鑑別診斷價值。以雙側p＜0.05為差異有統計學意義，所有數據均通過spss 25.0進行統計分析。
[0188]
四、結果分析
[0189]
1、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤mreg基因甲基化水平分析
[0190]
以380例甲狀腺良性腫瘤和598例甲狀腺惡性腫瘤的組織樣本為研究材料分析mreg基因中所有cpg位點的甲基化水平。甲狀腺良性腫瘤、甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌、甲狀腺未分化癌、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤病例mreg基因4個片段的甲基化水平的具體結果見表6。結果表明，甲狀腺良性腫瘤mreg基因的甲基化水平中位數為0.64(iqr＝0.44-0.73)，甲狀腺惡性腫瘤mreg基因的甲基化水平中位數為0.42(iqr＝0.25-0.58)，不
同亞型mreg基因的甲基化水平中位數依次為：乳頭狀癌0.41(iqr＝0.24-0.57)、甲狀腺濾泡癌0.34(iqr＝0.20-0.53)、甲狀腺髓樣癌0.32(iqr＝0.18-0.51)、甲狀腺未分化癌0.29(iqr＝0.16-0.47)，不同分期mreg基因的甲基化水平中位數依次為：i期為0.40(iqr＝0.24-0.56)、ii期為0.37(iqr＝0.23-0.54)、ⅲ期為0.33(iqr＝0.17-0.49)、ⅳ期為0.29(iqr＝0.14-0.46)。通過比較分析幾者之間的甲基化水平，結果發現甲狀腺良性腫瘤mreg基因中所有cpg位點的甲基化水平顯著高於甲狀腺惡性腫瘤中mreg基因中所有cpg位點的甲基化水平的(表6)。另外，本發明中列出的幾類甲狀腺癌亞型如：甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌組織中的mreg基因中seq id no.1、2、3和4所示的dna片段上甲基化位點的甲基化水平依次呈下降趨勢(表6)，與甲狀腺良性腫瘤之間的差異性越來越明顯。另外，隨著甲狀腺惡性腫瘤分期的增加組織中mreg基因中seq id no.1、2、3和4所示的dna片段上甲基化位點的甲基化水平越來越低(表6)，與甲狀腺良性腫瘤之間差異性也越來越明顯。
[0191]
表6、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤及其各亞型、各分期的mreg基因甲基化水平
[0192][0193]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0194]
2、腫瘤組織中mreg基因甲基化水平可以區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤
[0195]
通過比較分析380例甲狀腺良性腫瘤病例和598例甲狀腺惡性腫瘤病例的mreg甲基化水平，結果發現，甲狀腺惡性腫瘤、甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、髓樣癌和未分化癌患者中mreg_a片段、mreg_b片段、mreg_c片段和mreg_d片段甲基化水平顯著低於甲狀腺良性腫瘤患者中對應片段的甲基化水平(p＜0.05)。具體結果見表7。
[0196]
表7、甲狀腺良性腫瘤與不同亞型甲狀腺惡性腫瘤之間的mreg基因甲基化水平差異
[0197][0198]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0199]
3、腫瘤組織中mreg基因甲基化水平可以區分不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤
[0200]
通過比較分析不同分型的甲狀腺惡性腫瘤(380例甲狀腺乳頭狀癌、138例甲狀腺濾泡癌、44例甲狀腺髓樣癌和36例甲狀腺未分化癌)病例的mreg甲基化水平，結果發現，甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌患者的mreg基因甲基化水平之間有顯著差異(p＜0.05)。具體結果見表8。
[0201]
表8、甲狀腺惡性腫瘤各亞型之間的mreg基因甲基化水平差異
[0202][0203]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0204]
4、腫瘤組織中mreg基因甲基化水平可以區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤
[0205]
通過比較分析380例甲狀腺良性腫瘤病例和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤患者(470例ⅰ期患者、48例ⅱ期患者、24例ⅲ期患者和36例ⅳ期患者)的mreg甲基化水平，結果發現，mreg_a片段、mreg_b片段、mreg_c片段和mreg_d片段甲基化水平隨著分期增加顯著降低(p＜0.01)。具體結果見表9。
[0206]
表9、甲狀腺良性腫瘤與不同分期甲狀腺惡性腫瘤之間的mreg基因甲基化水平差異
[0207][0208]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0209]
5、腫瘤組織中mreg基因甲基化水平可以區分不同分期的甲狀腺惡性腫瘤
[0210]
通過比較分析不同分期的甲狀腺惡性腫瘤患者(470例ⅰ期患者、48例ⅱ期患者、24例ⅲ期患者和36例ⅳ期患者)的mreg甲基化水平，結果發現，ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者的mreg基因甲基化水平之間有顯著差異(p＜0.05)。具體結果見表10。
[0211]
表10、甲狀腺惡性腫瘤不同分期之間的mreg基因甲基化水平差異
[0212][0213]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0214]
6、mreg基因甲基化用於輔助癌症診斷的數學模型的建立
[0215]
本發明建立的數學模型可以用於達到如下目的：
[0216]
(1)區分甲狀腺惡性腫瘤患者和甲狀腺良性腫瘤；
[0217]
(2)區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤；
[0218]
(3)區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤；
[0219]
(4)區分甲狀腺惡性腫瘤不同亞型；
[0220]
(5)區分甲狀腺惡性腫瘤不同分期。
[0221]
數學模型的建立方法如下：
[0222]
(a)數據來源：步驟一中列出380例甲狀腺良性腫瘤和598例甲狀腺惡性腫瘤(甲狀腺乳頭狀癌380例，甲狀腺濾泡癌138例，甲狀腺髓樣癌44例和甲狀腺未分化癌36例)的組織樣本的目標cpg位點(表1-表4中的一種或多種的組合)甲基化水平(檢測方法同步驟二)。
[0223]
(b)模型建立
[0224]
根據需要選取任意兩類不同類型患者數據即訓練集(例如：甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺良性腫瘤和髓樣癌患者、甲狀腺良性腫瘤和未分化癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者)作為用於建立模型的數據，使用sas，r，spss等統計軟體使用二分類邏輯回歸的統計方法通過公式建立數學模型。數學模型公式計算出的最大約登指數對應的數值為閾值或直接設定0.5為閾值，待測樣品經過測試和代入模型計算後得到的檢測指數大於閾值歸為一類(b類)，小於閾值歸為另外一類(a類)，等於閾值作為不確定的灰區。在對新的待測樣品進行預測來判斷屬於哪一類時，首先通過dna甲基化的測定方法檢測該待測樣品mreg基因上一個或者多個cpg位點的甲基化水平，然後將這些甲基化水平的數據代入上述數學模型，計算得到所述待測樣本對應的檢測指數，然後比較所述待測樣本對應的檢測指數和閾值的大小，根據比較結果確定所述待測樣本屬於哪一類樣本。
[0225]
舉例：如圖1所示，將訓練集中mreg基因單個cpg位點的甲基化水平或者多個cpg位點組合的甲基化水平的數據通過sas、r、spss等統計軟體使用二分類邏輯回歸的公式建立用於區分a類和b類的數學模型。該數學模型在此為二類邏輯回歸模型，具體為：ln(y/(1-y))＝b0+b1x1+b2x2+b3x3+
…
+bnxn，其中y為因變量即將待測樣品的一個或者多個甲基化位點的甲基化水平代入模型以後得出的檢測指數，b0為常量，x1-xn為自變量即為該測試樣品的一個或者多個甲基化位點的甲基化水平(每一個值為0-1之間的數值)，b1～bn為模型賦予每一個位點甲基化水平的權重。具體應用時，先根據訓練集中已經檢測的樣本的一個或者多個dna甲基化位點的甲基化水平(x1-xn)及其已知的分類情況(a類或者b類，分別對y賦值0和1)建立數學模型，由此確定該數學模型的常量b0以及各個甲基化位點的權重b1-bn，並由該數學模型計算出的以最大約登指數對應的數值為閾值或直接設定0.5為劃分的閾值。待測樣品經過測試和代入模型計算後得到的檢測指數即y值大於閾值歸為b類，小於閾值歸為a類，等於閾值作為不確定的灰區。其中a類和b類為相對應的兩分類(二分類的分組，哪一組a類，哪一組是b類，要根據具體的數學模型來確定，在此不做約定)。對受試者的樣品進行預測來判斷屬於哪一類時，首先收集受試者的活檢樣本(即腫瘤組織)，然後從中提取dna。將提取的dna通過重亞硫酸鹽轉化後，用dna甲基化的測定方法對受試者mreg基因的單個cpg位點的甲基化水平或者多個cpg位點組合的甲基化水平進行檢測，然後將檢測得到的甲基化數據代入上述數學模型。如果該受試者的mreg基因一個或者多個cpg位點的甲基化水平代入上述數學模型後計算出來的值即檢測指數大於閾值，則該受試者判定與訓練集中檢測指數大於閾值的歸屬一類(b類)；如果該受試者的mreg基因一個或者多個cpg位點
的甲基化水平數據代入上述數學模型後計算出來的值即檢測指數小於閾值，則該受試者跟訓練集中檢測指數小於閾值的歸屬一類(a類)；如果該受試者的mreg基因一個或者多個cpg位點的甲基化水平數據代入上述數學模型後計算出來的值即檢測指數等於閾值，則不能判斷該受試者是a類還是b類。
[0226]
舉例：如圖2所示，舉例說明mreg_b的如下5個可區分cpg位點(mreg_b_4.5、mreg_b_6.7、mreg_b_8、mreg_b_9、mreg_b_10)的甲基化以及數學建模在鑑別甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤組織中的應用：將甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤患者訓練集(在此為：380甲狀腺良性腫瘤和598例甲狀腺惡性腫瘤患者)中已經檢測的mreg_b的上述5個可區分cpg位點的甲基化水平的數據通過spss軟體或r軟體使用二分類邏輯回歸的公式建立用於鑑別甲狀腺惡性腫瘤患者的數學模型。該數學模型在此為二類邏輯回歸模型，由此確定該數學模型的常量b0以及各個甲基化位點的權重b1-bn，在此例中具體為：ln(y/(1-y))＝2.478-1.05*mreg_b_4.5-11.497*mreg_b_6.7+3.572*mreg_b_8+1.003*mreg_b_9+0.97*mreg_b_10，其中y為因變量，即將待測樣品的mreg_b的上述5個可區分cpg位點的甲基化水平代入模型以後得出的檢測指數。mreg_b_4和mreg_b_5位於同一片段，mreg_b_6和mreg_b_7位於同一片段故以mreg_b_4.5和mreg_b_6.7代表這兩個位點甲基化水平的平均值。通過設定0.5為閾值的情況下，待測樣品的mreg_b的上述5個可區分cpg位點的甲基化水平經過測試得到的值代入模型進行計算，得到的檢測指數即y值小於閾值歸為甲狀腺良性腫瘤患者，大於閾值歸為甲狀腺惡性腫瘤患者，等於閾值則不確定為甲狀腺良性腫瘤患者還是甲狀腺惡性腫瘤患者。此模型的曲線下面積(auc)計算結果為0.82(表15)。具體受試者判斷方法舉例如下所示，從兩位受試者(甲，乙)分別收集活檢樣本提取dna，將提取的dna通過重亞硫酸鹽轉化後，用dna甲基化的測定方法對受試者的(mreg_b_4.5、mreg_b_6.7、mreg_b_8、mreg_b_9、mreg_b_10)這5個可區分cpg位點的甲基化水平進行檢測。然後將檢測得到的甲基化水平數據信息代入上述數學模型。甲受試者的mreg_b的上述5個可區分cpg位點的甲基化水平數據代入上述數學模型後計算出來的值為0.81大於0.5，則甲受試者判定為甲狀腺惡性腫瘤患者(與臨床診斷相符)；乙受試者的mreg_b的上述5個可區分cpg位點的甲基化水平數據代入上述數學模型後計算出來的值為0.37小於0.5，則乙受試者判定甲狀腺良性腫瘤患者(與臨床診斷相符)。
[0227]
(c)模型效果評價
[0228]
根據上述方法，分別建立用於發現甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者的數學模型，並且通過受試者
曲線(roc曲線)對其有效性進行評價。roc曲線得出的曲線下面積(auc)越大，說明模型的區分度越好，分子標誌物越有效。採用不同cpg位點進行數學模型構建後的評價結果如表11、表12、表13和表14所示。表11、表12、表13和表14中，1個cpg位點代表mreg_b擴增片段中任意一個cpg位點的位點，2個cpg位點代表mreg_b擴增片段中任意2個cpg位點的組合，3個cpg位點代表mreg_b擴增片段中任意3個cpg位點的組合，
……
以此類推。表中的數值為不同位點組合評價結果的範圍值(即任意個cpg位點組合方式的結果均在此範圍內)。
[0229]
上述研究結果顯示，mreg基因甲基化對於各組的鑑別能力(甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者)隨著mreg基因上甲基化位點個數的增加而增加。
[0230]
除此以外，在表1-表4所示的cpg位點中，還存在少數幾個優選位點的組合比多個非優選位點組合的鑑別能力更好的情況。例如表15、表16、表17和表18所示的mreg_b_4.5、mreg_b_6.7、mreg_b_8、mreg_b_9、mreg_b_10這5個可區分cpg位點的組合是mreg_b中任意5個組合的優選位點。
[0231]
綜上所述，mreg基因上的cpg位點及其各種組合，mreg_a片段上的cpg位點及其各種組合，mreg_b片段上的cpg位點及其各種組合，mreg_b_4.5、mreg_b_6.7、mreg_b_8、mreg_b_9、mreg_b_10位點及其各種組合，mreg_c片段上的cpg位點及其各種組合，mreg_d片段上的cpg位點及其各種組合，以及mreg_a、mreg_b、mreg_c和mreg_d上的cpg位點及其各種組合的甲基化水平對甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺乳頭狀癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺良性腫瘤和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺髓樣癌患者、甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺濾泡癌和髓樣癌患者、甲狀腺濾泡癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、甲狀腺良性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅰ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅱ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者、ⅲ期甲狀腺惡性腫瘤和ⅳ期甲狀腺惡性腫瘤患者具有判別能力。
[0232]
表11、mreg_b的cpg位點及其組合用於區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤
[0233][0234]
表12、mreg_b的cpg位點及其組合用於區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤
[0235][0236]
[0237]
表13、mreg_b的cpg位點及其組合用於區分不同亞型甲狀腺惡性腫瘤患者
[0238][0239]
表14、mreg_b的cpg位點及其組合用於區分不同分期甲狀腺惡性腫瘤患者
[0240][0241]
表15、mreg_b的最佳cpg位點及其組合用於區分甲狀腺良性腫瘤和不同亞型的甲狀腺惡性腫瘤
[0242][0243]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0244]
表16、mreg_b的最佳cpg位點及其組合用於區分甲狀腺良性腫瘤和不同分期的甲狀腺惡性腫瘤
[0245][0246]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0247]
表17、mreg_b的最佳cpg位點及其組合用於甲狀腺惡性腫瘤不同亞型之間的區分
[0248][0249]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0250]
表18、mreg_b的最佳cpg位點及其組合用於甲狀腺惡性腫瘤不同分期之間的區分
[0251][0252]
註：表中的cpg位點均指可區分的cpg位點。
[0253]
以上對本發明進行了詳述。對於本領域技術人員來說，在不脫離本發明的宗旨和範圍，以及無需進行不必要的實驗情況下，可在等同參數、濃度和條件下，在較寬範圍內實施本發明。雖然本發明給出了特殊的實施例，應該理解為，可以對本發明作進一步的改進。總之，按本發明的原理，本技術欲包括任何變更、用途或對本發明的改進，包括脫離了本技術中已公開範圍，而用本領域已知的常規技術進行的改變。按以下附帶的權利要求的範圍，可以進行一些基本特徵的應用。