體外誘導造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的方法與應用的製作方法
2023-10-25 11:19:17 6
專利名稱：體外誘導造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體的說是涉及一種在無血清培養體系中利用基質細胞的支持作用誘導不同來源的造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的方法及其用途。
背景技術：
目前臨床輸血治療面臨的兩個主要問題是血液來源緊張和輸血相關傳染病的發生，對於前一問題經常可以在電視、報紙、網絡等媒體上見到相關報導，更嚴重的是後一問題，目前我國登記的愛滋病患者中有7萬多例是在獻血、輸血過程中感染的，因此迫切尋找新的更安全的血液來源。
隨著對造血幹細胞分化發育研究的深入，體外誘導造血幹祖細胞高效率擴增產生完全成熟的紅細胞，逐漸成為解決臨床輸血治療面臨的困境的一個可行的方向。
目前對於體外大規模產生紅細胞的研究一般在無血清培養體系中進行，這樣可以避免血清中一些尚未確定的物質的影響，而且可以避免血清中可能存在的汙染源。
要達到可以規模化生產紅細胞，有三個關鍵的問題需要解決，一是擴增效率的提高；二是產生的紅細胞完全脫核，具有完全的功能；三是使整個生產體系避免汙染，確保安全。
目前有研究在無血清培養體系中能使造血幹細胞(HSC)在體外持續擴增45天，細胞數目擴增107倍，但其紅細胞脫核效率不高，另一項研究利用基質細胞的造血支持作實現了紅系祖細胞的完全脫核，生成了有功能的紅細胞，為體外產生紅細胞的研究提供了好的研究基礎，但其在研究中應用了動物細胞系，使其安全性受到了很大的質疑。
另外目前有研究已從小鼠胚胎幹細胞(ES)中大規模培養得到紅系祖細胞，並且紅系祖細胞能分化為成熟的脫核紅細胞，更重要的是注射到小鼠體內時紅系祖細胞不具有致瘤性。已有研究對人ES細胞展開了類似研究，誘導人ES細胞分化得到紅系祖細胞，然後實現紅系祖細胞的完全脫核，生成可供臨床輸血治療應用的紅細胞，這也將是未來ES細胞應用的一個方向，體外大規模培養紅細胞最終應用於臨床仍有很多問題要需要研究，首先就要建立一種高效、安全的生成有完整功能的紅細胞的技術方法，為最終的應用和開展紅細胞發育的相關研究打下基礎。
發明內容
本發明提供了一種在無血清培養體系中利用基質細胞的支持作用誘導不同來源的造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的方法，為尋找新的紅細胞來源提供了新的方法，還可以為紅系細胞發育及紅細胞相關疾病的基礎研究和尋找治療方法提供很好的體外細胞模型。
本發明通過以下技術方案實現1.用免疫磁珠法分離不同來源的HSC，體外在無血清培養體系中利用細胞因子組合大規模擴增得到不同發育階段的純的紅系祖細胞；2.分離人源的造血支持作用的基質細胞，並對其生長特性及表面標誌等特性進行鑑定分析；3.將不同發育階段的紅系祖細胞與基質細胞在脫核培養體系中共培養，使紅系祖細胞達到完全脫核，生成具有完整生理功能的紅細胞；上述方法中所說的不同來源的造血幹/祖細胞包括臍帶血、外周血、骨髓、患者經細胞因子動員後的外周血及人ES細胞經體外誘導分化得到的造血幹/祖細胞。
上述方法中所述人源的基質細胞包括流產胎兒肝臟來源的基質細胞、流產胎兒骨髓來源的間充質幹細胞(MSC)、成人骨髓來源的MSC，及脂肪等其它組織來源的MSC等具有造血支持作用的基質細胞。
上述方法中所應用的基質細胞是原代細胞，並非永生化細胞系。
上述方法中基質細胞是用鈷源(鈷-60)照射或絲裂黴素處理後細胞生長受抑制的細胞，可更好的發揮造血支持作用。
上述方法中的紅系祖細胞的無血清誘導體系是在無血清培養基StemSpanSFEM(Stem Cell公司產品，Cat# 09600)中加入促紅細胞生成素(Epo，Sigma公司產品，Cat# E5627)3-5U/mL、幹細胞生長因子(SCF，RD公司產品，Cat#255-SC)50-100ng/mL、胰島素樣生長因子-1(IGF-1，RD公司產品，Cat#291-G1)40-60ng/mL、地塞米松(Dex，Sigma公司產品，Cat#D1756)1μM等細胞因子組合實現的。
上述方法中的不同階段紅系祖細胞是指HSC誘導分化8天以後的紅系祖細胞。
上述方法中的紅系祖細胞與基質細胞共培養是直接接觸培養。
上述方法中的紅細胞脫核培養體系是在無血清培養基中加入Epo 8-10U/mL、IGF-1 40-60ng/mL，鐵飽和的轉鐵蛋白(Sigam公司，Cat#T0665)500μg/mL等因子並補充Fe如加入Iron Supplement(Sigma公司產品，Cat#I3153)來實現。
上述方法中的無血清培養基可以是在StemSpan SFEM培養基，也可以是在IMDM培養基(GIBCO公司產品，Cat#12200-028)中加入1～2％BSA、10μg/ml人胰島素、200μg/ml轉鐵蛋白、2mmol/L L-穀氨醯胺及10-4mol/L 2-巰基乙醇作為基礎培養基來實現。
圖1流式細胞術檢測分離得到的CD34+細胞的純度A為陰性對照；B為CD34+細胞檢測結果；圖2胎兒肝臟基質細胞形態學觀察；圖3第30代胎兒肝臟基質細胞核型分析結果；圖4流式細胞術檢測胎兒肝臟基質細胞表面標誌；圖5體外培養不同階段紅系祖細胞的形態學觀察A為誘導第1天鏡下觀察紅系祖細胞形態；B為誘導第5天鏡下觀察紅系祖細胞形態；C為誘導第8天鏡下觀察紅系祖細胞形態；
圖6體外培養紅系祖細胞增殖曲線；圖7不同階段紅系祖細胞Wright-Gimesa染色A為誘導第4天紅系祖細胞Wright-Gimesa染色；B為誘導第8天紅系祖細胞Wright-Gimesa染色；圖8流式細胞術檢測不同階段紅系祖細胞表面標誌A為誘導第7天紅系祖細胞表面標誌流式檢測結果；B為誘導第14天紅系祖細胞表面標誌流式檢測結果；C為誘導第21天紅系祖細胞表面標誌流式檢測結果；圖9紅系祖細胞與基質細胞共培養顯微鏡觀察和不同階段脫核的紅細胞Wright-Gimesa染色A為脫核體系中培養第3天紅系細胞形態學觀察；B為脫核體系中培養第6天紅系細胞形態學觀察；C為脫核體系中培養第6天紅細胞Wright-Gimesa染色；D為脫核體系中培養第10天紅細胞Wright-Gimesa染色；具體實施方式
實施例1臍帶血單個核細胞(MNC)的分離在產婦知情同意的情況下採集足月順產胎兒臍帶血80-100ml，用於分離HSC。
1.1肝素抗凝的新鮮血液標本按1∶1的體積比與PBS混勻，混勻後再按4∶1的體積比與0.5％甲基纖維素混勻，室溫下靜置30min，待紅細胞自然沉降至界限分明時，吸出上清部分置50mL離心管中，室溫1,500rpm離心5min；1.2棄上清，加10mLPBS懸浮細胞，同上離心洗滌；1.3棄上清，用5mL PBS重懸細胞；1.4在10mL離心管中加入預先平衡至室溫的5mL人淋巴細胞分離液(天津灝洋生物製品科技有限責任公司產品，Cat#LTS1077)，然後沿管壁緩慢加入5mL細胞懸液，室溫，1,500rpm離心25min；1.5收集界面MNC細胞層，室溫，1,500rpm離心5min，棄上清；
1.6用1mL PBS懸浮細胞，移入1.5mL Ep管中，計數。
實施例2從MNC中分離CD34+細胞(採用miniMACS分離系統)2.1每108個臍血單個核細胞(MNC)懸浮於300μL4℃預置的PBS中，加入100μL非特異性阻斷抗體FcR封閉劑，混勻。然後再加100μL磁珠偶聯的CD34單克隆抗體(FcR封閉劑、磁珠偶聯的CD34單克隆抗體均購自Miltenyi Biotec公司，Lot#5050601032)，混勻，4℃孵育30min；2.2補加500μl PBS，4C，1,500rpm離心3min，棄上清；2.3用1mL除氣的PBS重懸細胞，製備單細胞懸液；2.4將MACS分離柱固定於MACS磁場(MACS分離柱及磁場均購自MiltenyiBiotec公司)內，用除氣的2mL PBS衝洗分離柱；2.5將單細胞懸液緩慢貼壁加入分離柱，避免產生氣泡，待其自然流出後用500μL除氣的PBS洗滌不結合的細胞，共4次；2.6將分離柱移出磁場，用1mL PBS加壓洗脫，收集組分為CD34+細胞。計數。
實施例3造血幹細胞純度分析免疫磁珠標記的細胞兩次通過分離柱純化，分為兩組，一組為測試組，用PE標記的抗CD34抗體(Miltenyi Biotec公司產品)檢測分離得到的CD34+細胞純度，另一組為對照組，採用PE標記的抗小鼠IgG(中山公司產品)與分離得到的CD34+細胞孵育作為對照組，經流式細胞儀檢測CD34+細胞的純度可達到98.64％(圖1)。
實施例4胎兒肝臟來源的基質細胞的分離培養徵得流產患者本人同意取其14周胎齡流產胎兒，分離肝臟組織，用生理鹽水灌注血管，將組織中血液充分衝出，取合適大小的組織塊，去除筋膜等，用消毒滅菌剪刀將肝臟組織剪碎成1mm3大小，將其排列於25mm2的培養瓶中，每瓶種20塊組織，然後將其倒置於5％的CO2孵箱中，半小時後將培養瓶翻轉，加入約3mL培養基，放入孵箱中繼續培養，大約2天後可見有細胞從組織塊邊緣爬出，繼續培養當細胞鋪滿培養瓶底80％時，將其用0.25％胰酶(Gibco公司產品，Cat#25200-056)消化下來，連同組織塊一起種入新瓶中，24小時後換液去除不貼壁的細胞及殘留組織塊，細胞長滿以後常規傳代培養。所用培養基為高糖DMEM(Sigma公司產品，Cat#D5648)和DF-12培養基(Sigma公司產品，Cat#D0547)1∶1混合後加入10％胎牛血清(Biochrom公司產品，cat#S0115)。胎兒肝臟基質細胞在體外呈成纖維細胞狀生長(圖2)，細胞常規傳代至第30代時取細胞作核型分析，結果顯示其經體外傳代培養後仍保持其正常核型(圖3)。
實施例5流式細胞術檢測胎肝基質細胞表面標誌分離的胎肝基質細胞體外培養傳至第10代時胰酶消化收集細胞，並用PBS洗滌2次，去除細胞表面殘留血清蛋白的影響，細胞計數後等分成8管，分別標記待測抗體及相應對照抗體，每管細胞數不少於5×105，室溫避光標記半小時後，用PBS洗滌細胞2次，以去除殘留抗體，最後用1％多聚甲醛固定細胞，用流式細胞術檢測表面分子表達情況，結果見(圖4)，可以看出胎兒肝臟基質細胞基本不表達造血細胞表面標誌CD45 1.94％，CD34 0.59％；而其他基質細胞表面標誌卻高表達CD90 84.20％，CD71 54.28％，CD44 93.88％，CD29 98.79％，是一群MSC樣細胞，具有同樣的造血支持作用。
實施例6體外誘導臍帶血來源的HSC生成純的紅系祖細胞免疫磁珠法分離的CD34+細胞以5×105/mL接種於24孔板，培養體系組成是在無血清培養基StemSpan SFEM中加入Epo 5U/mL、SCF 100ng/mL、IGF-150ng/mL、Dex 1μM等細胞因子，誘導分化8天後可以觀察到細胞體積變大，細胞形態趨於均一(圖5)，紅系祖細胞可以在體外維持增殖達50天，細胞增殖曲線見(圖6)。
實施例7紅系祖細胞Wright-Gimesa染色收集細胞約5×104個，在離心機上將細胞均勻甩片至載玻片上，室溫用配製好的Wright-Gimesa染液原液固定2分鐘，後換用稀釋液染色18分鐘，後用水衝去染液，乾燥後置顯微鏡下觀察細胞形態，並用圖像採集系統採集圖像，顯示培養細胞為純的紅系祖細胞，細胞大小均一，發育階段亦相近，見(圖7)，證明此誘導途徑是高效的。
實施例8流式細胞術檢測造血細胞表面標誌將不同培養時間的懸浮培養的細胞收集後用PBS洗滌2次，後均勻分成8管，每管細胞不少於5×105個分別標記相應抗體，進行三標流式細胞術檢測，室溫避光標記半小時後收集細胞，用PBS洗滌2次，用1％多聚甲醛固定後送去檢測，流式細胞儀檢測同樣證明培養細胞逐漸呈均一的紅系祖細胞的表面標誌，CD71和CD117均高表達，GlyA隨著細胞的逐漸成熟表達亦逐漸升高，而其他系血細胞的表面標誌基本不表達或表達很低，從另一個角度證明這一無血清培養體系對於擴增紅系祖細胞是高效的(圖8和表1)。
表1不同培養時間細胞表面標誌檢測
實施例9將紅系祖細胞與基質細胞共培養使紅系祖細胞脫核生成紅細胞紅系祖細胞去核分化體系是在無血清培養基StemSpan SFEM中加入Epo 10U/mL，鐵飽和的轉鐵蛋白500μg/mL，IGF-1 50ng/mL，1×Iron Supplement等細胞因子組成，胎兒肝臟來源的基質細胞用10μg/mL的絲裂黴素處理後用作基質細胞，將發育不同階段(誘導8天後)的紅系祖細胞與基質細胞共培養(圖9)，脫核培養3天後可見有脫核紅細胞出現，第10天可見細胞基本全部脫核，生成成熟紅細胞(圖9)。
實施例10體外培養紅細胞的檢測將體外培養的紅細胞用血細胞分析儀分析常規指標，檢測結果顯示紅細胞平均容積(MCV)為105±7fl，紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)為25±4％，紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)為28±2pg，檢測結果與正常外周血紅細胞接近，顯示該誘導培養體系能夠成功誘導造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞。
權利要求
1.一種誘導不同來源造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的方法，其特徵在於利用基質細胞與無血清培養體系的共同作用，實現造血幹/祖細胞分化為紅系祖細胞，進而脫核生成具有完整功能的紅細胞。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於造血幹/祖細胞可來源於臍帶血、外周血、骨髓、患者經細胞因子動員後的外周血及人ES細胞經體外誘導分化得到的造血幹/祖細胞。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所用的基質細胞包括流產胎兒肝臟來源的基質細胞、流產胎兒骨髓來源的MSC、成人骨髓來源的MSC，及脂肪等其它組織來源的MSC等具有造血支持作用的基質細胞。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所用的基質細胞是分離的原代細胞，並非永生化細胞系，使用前採用鈷源照射或絲裂黴素處理，細胞生長受到抑制以更好發揮造血支持作用。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所用的紅系祖細胞的無血清誘導體系是在無血清培養基中加入促紅細胞生成素、幹細胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、地塞米松等細胞因子組合實現的。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所用的紅細胞脫核培養體系是在無血清培養基中加入Epo、IGF-1，鐵飽和的轉鐵蛋白等因子並補充Fe來實現。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所用的無血清培養基可以是商品化的StemSpan SFEM培養基，也可以通過在IMDM培養基中補充加入BSA、人胰島素、轉鐵蛋白、L-穀氨醯胺及2-疏基乙醇作為基礎培養基。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於紅系祖細胞與基質細胞的共培養是直接接觸培養。
9.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於通過本技術方法的實現可作為體外模型用於研究紅細胞分化發育的機制。
10.利用上述方法獲得的成熟紅細胞的用途，其特徵在於通過規模化應用獲得的大量紅細胞製品，可為解決血源緊張及防止血源性疾病的傳播提供良好的紅細胞替代品，並為研究紅細胞相關疾病的發病機理及其治療方法提供體外細胞模型。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體為一種在無血清培養體系中利用基質細胞的支持作用誘導不同來源造血幹/祖細胞分化為成熟紅細胞的技術方法。本技術方法通過胎兒肝臟來源的基質細胞或胎兒骨髓來源的間充質幹細胞與體外誘導到不同階段的紅系祖細胞共培養，實現紅細胞的完全脫核，生成具有完整功能的紅細胞。本技術方法的實現及規模化應用可以提供大量通用型或稀有血型的紅細胞製品，為解決血源緊張及防止血源性疾病的傳播提供完全天然的紅細胞替代品，還可作為體外模型用於研究紅細胞分化發育的機制，並為研究紅細胞相關疾病的發病機理及其治療方法提供體外細胞模型，具有巨大的市場價值及廣闊的應用前景。
文檔編號C12N5/08GK101045914SQ200610066208
公開日2007年10月3日 申請日期2006年3月29日 優先權日2006年3月29日
發明者裴雪濤, 習佳飛, 王韞芳, 張鵬, 閆舫, 白慈賢, 南雪, 陳琳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所