衰老特性被改變的轉基因植物的製作方法

2023-10-05 02:04:04

專利名稱：：衰老特性被改變的轉基因植物的製作方法
技術領域：
：本發明主要涉及植物分子生物學領域。具體地說，本發明涉及被發育特異性啟動子激活的插入基因的轉基因植物。
背景技術：
：葉衰老是細胞發生特殊代謝和結構改變直至死亡的一個發育階段(Nooden，植物的衰老和老化(SenescenceandAginginPlants)，(L.D.Nooden和A.C.Leopold，編)，pp.391-439，AcademicPress，SanDiego，CA，1988)。這是植物生活周期中的一個重要階段，被認為通過將營養物質重新循環到生長活躍的區域而有益於植物的健康。葉衰老可能由許多外因誘導，例如避光、缺乏無機鹽、乾旱和病原體侵染(Thomas等，植物生理學年鑑(Ann.Rev.PlantPhysical.)3183-111，1980)，也可能是由種子的發育之類的發育過程(Nooden，1988，同上)誘導的。沒有上述因素時，在許多種植物中，葉衰老以年齡依賴型方式發生(Batt等，實驗植物學雜誌(J.Exp.Bot.)26569-579，1975；Hensel等，植物細胞(PlantCell)5553-564，1993；Jiang等，植物生理學(PlantPhysicol.)101105-112，1993)。生理學及遺傳學研究顯示，衰老是一個很有規律的過程(Nooden，1988，同上；Thomas，1980，同上)。葉衰老進程通過因葉綠素損失而導致枯黃表現出來，這是葉綠體分解的結果(Thomson等，植物的衰老其生物化學及生理學(PlantSenescenceItsBiochemistryandPhysiology)pp.20-30，1987；Woolhouse，加拿大植物學雜誌(Can.J.Bot)622934-2942，1984)。葉衰老涉及蛋白質、核酸及膜的降解，以及營養物質因這些降解而運輸到植物的其它器官例如發育中的種子，葉或貯藏器官(Nooden1988，同上；Woolhouse，1984，同上)。分子研究顯示，基因表達的改變與衰老程序有關。在衰老過程中，編碼與光合作用相關的蛋白質的mRNA水平下降(Bate等，實驗植物學雜誌(J.Exp.Bot.)42801-811，1991；Hensel等，植物細胞(PlantCell)5553-564，1993；Jiang等，植物生理學(PlantPhysicol.)101105-112，1993)，而編碼與衰老程序相關的蛋白質的基因的mRNA水平上升(Graham等，植物細胞(PlantCell)4349-357，1992，Hensel等，植物細胞(PlantCell)5553-564，1993；Kamachi等，植物生理學(PlantPhysicol.)931323-1329，1992；Taylor等，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905118-5122，1993)。幾種在營養物質的降解和代謝中起作用的酶的活性也被證實在衰老過程中有所上升(Blank等，植物生理學(PlantPhysicol.)971409-1413，1991；Debellis等，植物細胞生理學(PlantCellPhysicol.)321227-1235，1991；Friedrich等，植物生理學(PlantPhysicol.)651103-1107，1980；Pistelli等，植物生理學雜誌(J.PlantPhysicol.)19723-729，1992)。雖然已經知道了衰老過程中的一般變化，但是有關營養物質的再轉移如何發生的許多生化細節仍然不確定。而且，對於伴隨衰老的基因表達的改變是如何調控的知之甚少。在植物分子生物學領域需要有一種在植物發育的衰老階段啟動基因表達的啟動子。作為達到該目標的第一步，我們研究了擬南芥葉衰老階段發生的大分子改變。擬南芥中葉衰老的開始由葉齡確定(Hensel等，同上)。擬南芥中葉衰老的這種可預測性方便了在完整植株中對與自然發生的葉衰老有關的RNA、葉綠素、蛋白質和基因表達的改變所進行的整體研究。我們還使用該體系分離和鑑定了豐度增加和減少的mRNA在葉衰老過程中時序表達方式。這些衰老特異性mRNA使得我們能夠如後文所述分離和鑑定新的衰老特異性啟動子。發明綜述本發明涉及一種遺傳構建物，包含與一段編碼蛋白質的DNA序列可操作地連接的SAG12啟動子序列，該序列並非天然地與該啟動子序列連接。較好的是，該SAG12啟動子是SAG12-1序列。最好是，SAG12啟動子是SEQIDNO2的開頭602bp，而蛋白質編碼序列編碼的是異戊烯基轉移酶。本發明還涉及包含這種遺傳構建物的細胞或植物。本發明的目的之一是提供一種遺傳構建物，它包含與蛋白質編碼序列可操作地連接並啟動衰老特異性基因表達的啟動子序列。本發明的目的之二是提供與一種酶的編碼序列連接的衰老特異性啟動子，該酶催化一種植物激素最好是細胞分裂素的合成。本發明的目的之三是提供與異戊烯基轉移酶序列連接的衰老特異性啟動子。本發明的目的之四是提供包含只在衰老組織中表達的轉基因的轉基因植物。本發明的特徵在於，基因表達可以特異性地定位於衰老組織，由此避免可能造成損傷的組成型表達。閱讀以下說明、附圖和權利要求後，本發明的其它目的、優點和特徵將是顯而易見的。圖1是一個二元載體中的SAG12-1啟動子/GUS/MAS-ter構建物圖。圖2是一個二元載體中的SAG12-1啟動子/IPT/NOS-ter構建物圖。圖3是SAG12-1啟動子/IPT/NOS-ter構建物的核酸序列。「a」和「b」標記對應於圖1和圖2中的「a」和「b」。本發明的說明本
發明內容之一是一種遺傳構建物，它包含與一段外源性基因序列可操作地連接的衰老特異性啟動子，該外源性基因序列非天然地與該啟動子相關。本發明鑑定了一個有用的衰老特異性啟動子，在本文中定義為SAG12。衰老特異性啟動子的獲得使得衰老形態學被改變例如延緩衰老的轉基因植物的生成成為可能。這一發現提供了延長有用植物生長的機制。後文對從擬南芥中分離特定的SAG12啟動子SAG12-1進行了詳細描述。簡而言之，分離出與SAG12cDNA對應的基因組克隆在一起的此處稱為「SAG12」的衰老特異性cDNA。從該基因組材料中分離出SAG12-1啟動子。「SAG」表示衰老相關基因。SEQIDNO1和圖3包含SAG12-1啟動子的一種實施方式的序列。SEQIDNO2描述了該啟動子的截短形式。兩種形式的SAG12-1啟動子都足以按衰老特異性方式啟動基因表達。後文還描述了一種以相似方法分離自擬南芥的第二種衰老特異性啟動子。第二種啟動子在此表示為「SAG13」。SAG13啟動子也是從擬南芥基因組中分離的。SEQIDNO3包含SAG13啟動子核苷酸序列，其中包括轉錄起始位點上遊的1782鹼基對。利用「衰老特異性啟動子」來表示SAG12-1啟動子和SAG13啟動子能夠在植物組織中以發育調控方式優先啟動基因表達，從而基本上只在植物組織衰老時表達3』蛋白質編碼區。較好的是，SAG12啟動子包含與SEQIDNO2的開頭602bp具有足夠同源性的核苷酸，從而使該啟動子能夠較好地在衰老組織中表達基因。較好的是，SAG13啟動子包含後文SEQIDNO3中的某一部分。雖然該完整序列對衰老特異性啟動子活性來說已足夠，但較短的序列可能也已足夠。截短SEQIDNO3，然後憑經驗測試這些截短的衰老特異性啟動子活性，由此可以方便地確定這種較短序列的邊界。後文中的實施例描述了來自擬南芥的衰老特異性cDNA克隆的產生、這些克隆的鑑定，以及使用這些cDNA克隆來獲得特定的SAG12衰老特異性啟動子SAG12-1和另一啟動子SAG13。據信，適用於本發明的還有與SAG12-1或SAG13充分同源的其它衰老特異性啟動子。利用以下所述的技術可以方便地得到這些同源啟動子。SAG12啟動子的創建在後文實施例中描述了使用SAG12cDNA克隆來分離SAG12啟動子。該cDNA克隆是由似乎僅在衰老過程中表達的RNA獲得的。已經使用SAG12cDNA篩選擬南芥文庫來獲得SAG12基因。該基因原先被表示為SAG12-1，因為認為在擬南芥中有兩個SAG12基因，但是現在認為只有一個。SAG12-1啟動子是從SAG12-1基因組克隆獲得的。SEQIDNO1和圖3揭示了SAG12-1啟動子的2073bp序列。此外，後文的研究還表明可以將SAG12-1啟動子截短至602bp而仍然具有功能。SEQIDNO2描述與SAG12-1基因5』非翻譯區連接的602bp。有多條路徑可以獲得SAG12啟動子。最簡便的是根據SEQIDNO1和SEQIDNO2以及圖3顯示的序列合成一寡核苷酸探針，然後在擬南芥基因組文庫中探測SAG12啟動子的拷貝。估計，少量的核苷酸增加、缺失和突變不影響SAG12啟動子的功能。此外，由於正常的等位變異，在擬南芥種群中可能存在SAG12基因(或SAG13)及啟動子序列中的變異。此外，很可能而且據估計，可以從其它植物中回收得到同源的序列。所以，合適的SAG啟動子序列可能並不與SEQIDNO1或SEQIDNO2完全一致。後文詳細說明了一種測定方法，通過它可以確定一個候選基因組序列是否與衰老特異性SAG12-1啟動子充分同源以適用於本發明。此外，據估計，602bp的SEQIDNO1可以進一步截短而仍然產生合適的SAG12啟動子。本領域的一般技術人員很容易理解，可以從該602bp序列進行5』或3』的截短，或內部缺失，並對這些截短片段的衰老特異性活性進行經驗測試，以找出SAG12-1啟動子較小的截短形式。較好的是，將SAG12-1的5』非翻譯區部分與啟動子序列相加。SEQIDNO1和SEQIDNO2顯示了該序列。在圖3中，5』非翻譯區是標記+1和「NcoI」之間的區域。SAG13啟動子創建用相同的方法分離和鑑定後文實施例中的SAG13啟動子。同時考慮由等位變異等造成的SAG13序列中的變異。SAG12與SAG13並不明顯同源。候選啟動子的測定一旦分離出一個候選基因組序列，就可能希望確定該DNA序列是否是SAG12啟動子或SAG13啟動子。可以利用植物分子生物學中的常用方法來測序該DAN序列，以確定該序列是否與SEQIDNO1，2或3一致。如果候選序列與SEQIDNO1的開頭2073bp、SEQIDNO2的開頭602bp，或SEQIDNO3的開頭1782bp一致或同源，那麼該序列就是合適的SAG12啟動子或SAG13啟動子。如果序列不一致但高度同源，即同源性超過95％，可能分離到的是等位SAG12或SAG13啟動子。可能希望進行一次功能測試來確定該序列是否與SEQIDNO1的開頭2073bp，SEQIDNO2的開頭602bp，或SEQIDNO3的開頭1782bp充分同源而適用於本發明。「充分同源」指候選序列的核苷酸序列同源性至少為95％，而且其在衰老植物組織中優先啟動基因表達的能力與SAG12-1啟動子序列基本相當。以下說明的是確定候選序列是否適用的測定法。為了進行這種確定，可以根據以下所述的實施例將候選啟動子與報導蛋白的編碼序列例如編碼β-葡糖醛酸酶的GUS序列連接。美國專利5,268,463公開了GUS基因的序列。用包括GUS基因在內的表達盒轉化植物可以確定GUS報導序列是否只在衰老組織中表達，是否被組成型表達，或根本沒有表達。只有顯示報導序列僅在衰老組織而不在其它組織中表達的結果才表明是合適的啟動子。或者，如後文所述，可以將候選序列與異戊烯基轉移酶序列連接後轉化到菸草植株中。實施例的表2顯示了用連接IPT基因的SAG12啟動子轉化的植株和包含SAG12啟動子與GUS報導基因連接而成的構建物的轉基因對照植株之間的具體差異。候選啟動子必需表現出相當的功能才適用於本發明。所以，候選啟動子必需滿足三條標準。第一，它必須可以用根據SEQIDNO1的開頭2073bp，SEQIDNO2的開頭602bp或SEQIDNO3的對應部分合成的寡核苷酸探針分離或雜交。第二，它必須與SEQIDNO1的開頭2073bp、SEQIDNO2的開頭602bp或SEQIDNO3的對應部分充分同源以啟動報導基因例如GUS的衰老特異性表達。第三，它必須提供與實施例表2中所述的SAG12或SAG13啟動子相當的衰老特異性表達。創建遺傳構建物一旦獲得了SAG12或SAG13啟動子，創建的遺傳構建物必須同時包含該啟動子和一段蛋白質編碼序列。「遺傳構建物」用於描述一段可操作地連接的啟動子和基因序列。通常，啟動子序列是基因序列的5』端或「上遊」。啟動子應該能夠啟動以基因序列為模板的轉錄活性。合適的外源性基因序列能夠表達一種RNA分子。該RNA分子可以被翻譯或不被翻譯成成熟蛋白質。為了表達反義mRNA，「外源性基因序列」的可以是反義取向的。較好的是，外源性基因序列編碼一種蛋白質。在本發明的一種實施方式中，外源性基因編碼催化某種植物激素生物合成的酶，這種生物激素以細胞分裂素為佳。最好的是，酶是IPT(異戊烯基轉移酶)。可以利用標準分子生物學方法將克隆得到的啟動子與蛋白質的編碼序例如IPT序列連接。已經分離、測序並公開了多個編碼IPT的基因。攜有這些基因的菌株已經在ATCC保藏，並可以向其獲取，同時包括已公開的序列信息，可以使用PCR及其它基因擴增和回收技術來分離IPT基因。IPT序列的實例(同時被稱為tmr或tzs)存在於Crespi等，歐洲分子生物學協會雜誌(EMBOJ.)11795-804(1992)；Goldberg等，核酸研究(NucleicAcid.Res.)124665-4677(1984)；HeideKamp等，核酸研究(NucleicAcid.Res.)116211-6223(1983)；Strabala等，分子和普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)216388-394(1989)。可以利用質粒或病毒載體或分子生物學領域已知用於創建能夠轉化到植物細胞內的構建物的方法來創建遺傳構建物。本文描述的是適合利用農桿菌屬(Agrobacterium)系統轉化的遺傳構建物的創建。但是，還有轉化植物和創建轉基因植物的其它方法，例如粒子轟擊和電穿孔，這些需要許多不同的載體系統。構建和將這些載體用到轉化系統中的能力是本領域技術人員眾所周知的。植物衰老的改變得到了有效的植物衰老特異性啟動子就能夠創建衰老特性被改變的轉基因植物。可以將只在植物細胞進入衰老時才變得有效的遺傳構建物插入植物。這種衰老特異性表達作用允許這樣一類基因在植物中表達，即此類基因在植物發育的任何其它階段的表達都會導致植物形態學或繁殖能力的衰退。例如，現在可以將編碼細胞分裂素生物合成酶的基因插入在衰老特異性啟動子的調控之下，使得植物組織不會在衰老前的生長階段受到過量細胞分裂素的影響。然後，在衰老開始時，衰老特異性基因激活細胞分裂素的產生，從而改變植物中衰老的進程。具體地說，已經發現，衰老特異性啟動子與細胞分裂素產生基因序列的組合創建了一種轉基因植物，該植物從根本上延緩了衰老。與對應的非轉基因植物相比，這類植物的營養性生長將更長，產生更多的花、種子或果實。估計，可以將影響植物成熟和衰老的其它區域置於衰老特異性啟動子之後，並轉化到植物中以產生改變了衰老特性的有用的轉基因植物。實施例材料和方法植物材料擬南芥生態型Landsbergerecta種子在2.5％的氯化鈉溶液中滅菌5分鐘，然後用無菌水洗滌5次。滅菌後的種子於4℃在1mM的赤黴酸A3中浸泡5小時，然後播種在Somerville等在葉綠體分子生物學中的方法(MethodsinChloroplastMolecularBiology)，ElsevierBiomedicalPress，NewYork，NY，pp.129-137，1982中所述的以擬南芥營養液飽和的泥炭蘚、蛭石和珍珠巖(1∶1∶1)混合物上。植株的生長條件為，23℃，相對溼度60％，120μmolm-2s-1的連續光，連續光來自冷白色螢光(80％)和白織燈泡(20％)的混合光，下灌溉以水。在這些條件下，植物營養性生長約3周，形成6-7片蓮座葉，然後抽苔。在不同的時刻，收穫完全舒展的第5和第6蓮座葉。收穫後立即將全部組織冷凍在液氮中並在-80℃保存。葉綠素和蛋白質的定量將45cm2的新鮮葉在65℃於乙醇中浸泡2小時，利用分光光度法測定葉綠素的量(Wintermans等，生物化學和生物物理學學報(Biochem.Biophys.Acta.)109448-453(1965))。乙醇孵育並大致真空乾燥後，將這些葉用於總蛋白提取。45cm2葉原料的邊角料在液氮中粉碎，重懸在9mlpH8的10mM檸檬酸鈉、1mMEDTA、1％SDS溶液中，在70℃攪拌孵育30分鐘。離心分離可溶性成份和不溶性成份。將沉澱組分溶解在10ml1NNaOH中，在30℃放置通宵。然後，根據Lowry等在生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)193265-275(1951)中所示的方法，和修改後的Pterson在生物化學紀事(Aanl.Biochem.)83346-356(1977)中和Larson等在生物化學紀事(Aanl.Biochem.)155243-248(1986)中所示的方法定量可溶性組分和沉澱組份中的蛋白質水平。對來自三批相互獨立的擬南芥的三份複製樣品進行了分析。RNA分析如Puissant等在生物技術(BioTechniques)8148-149(1990)中所示抽提總RNA，並利用分光光度法定量(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningALaboratoryManual)，ColdSpringHarborPress，NY，1989)。為了進行RNA凝膠印跡分析，在甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳分離RNA樣品，轉移到聚碸薄膜(Gelman，AnnArbor，MI)上，與隨機引物法(John等，細菌雜誌(J.Bacteriol.)170790-795，1988)製備的32P標記的探針雜交。將RAN按質量基礎(每根泳道5μgRNA)和面積基礎(每根泳道半片葉當量的RNA)上樣。利用Betagenβ顆粒掃描儀(IntelliGenetics，Inc.，MountainView，CA)定量與RNA雜交的探針的量。分析了用相互獨立的三批組織製備的RNA凝膠印跡的cDNA克隆。cDNA文庫的構建和篩選如Crowell等在美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)878815-8819(1990)中所述分離用於構建cDNA文庫的Poly(A)+RNA。從S2葉和S3與S4葉的集合中分離的RNA用於構建兩個cDNA文庫。以寡聚(dT)17-XbaI為引物，利用SuperScriptTMRNaseH-逆轉錄酶合成cDNA第一鏈，根據製造商的建議(BRL，Gaithersberg，MD)，利用大腸桿菌DNA聚合酶I、大腸桿菌連接酶和RNAseH合成第cDNA二鏈。雙鏈cDNA在BioGelA0.5m色譜柱(BioRad，Richmond，CA)上按大小分離以去除短於200bp的cDNA。EcoRI接頭銜接子(Promega；Madison，WI)連接cDNA，然後用聚核苷酸激酶磷酸化cDNA的5』末端。利用瓊脂糖凝膠電泳將cDNA按大小分離，電洗脫大於500bp的cDNA，將他們連接到用EcoRI切割並去磷酸化的pBluescriptSKII(+)(Stratagene，LaJolla，CA)中。利用電穿孔法將連接產物引入大腸桿菌DH5α。S2和S3/4cDNA文庫都包含1×105個重組克隆。為了篩選文庫，根據記載(Sambrook等1989，同上)製備文庫的複製濾膜，並與用脫氧腺苷5-[α-32P]三磷酸進行的Poly(A)+RNA逆轉錄製備的cDNA探針雜交。為了進行交叉雜交分析，利用隨機引物法製備對應於cDNA插入片段的探針，並與候選質粒的斑點印跡雜交(Sambrook等1989，同上)。經歷特定的表型和生物化學改變的擬南芥的葉衰老我們根據表型外觀將擬南芥的蓮座葉分為S1至S5五個階段，測定每個階段的RNA、蛋白質和葉綠素的量。S1階段的葉表現出最早的可見的衰老表徵-葉端的葉綠素流失。隨著葉的繼續衰老，葉綠素繼續流失。在S2、S3、S4和S5階段的葉中，約25％、25-50％、50-75％和75％以上的葉面變黃。我們的目測評價對應於特定的葉綠素流失程度。在我們的培養條件下，在葉完全舒展後的3、5、7、9和10天，葉子分別到達S1、S2、S3、S4和S5階段。在衰老過程中，葉中RNA、蛋白質和葉綠素的量逐漸減少。RNA和蛋白質的減少開始於最早被察覺的葉綠素流失(S1階段)之前，隨著葉的衰老而繼續。在葉綠素流失量和RNA及蛋白質的減少之間有一個高度可再現性關聯。衰老相關基因的分離為了確定在衰老過程中擬南芥葉中豐度升高的mRNA，我們示差篩選了一個由衰老中的葉的mRNA構建的cDNA文庫。具體地說，用分離自S2葉以及S3和S4葉混合物的模板RNA構建了兩個cDNA文庫。分別用分離自非衰老(NS)葉和S2或S3/S4葉的Poly(A)+RNA逆轉錄生成的cDNA探針示差篩選S2和S3/S4的cDNA文庫。示差篩選S3/S4的cDNA文庫鑑定出在衰老過程中豐度升高的mRNA。從該文庫中挑選出23個與S3/S4的cDNA探針的雜交強於與NScDNA探針的cDNA克隆用於進一步的鑑定。我們稱之為衰老相關性基因(SAGs)。交叉雜交顯示，該集合包括6種cDNA。隨後對每一家族中最長的cDNA進行分析。表1列出了對應於SAGcDNA的mRNA的長度。表1.SAG核苷酸中的mRNA的大致長度用NS和S2cDNA探針示差篩選S2cDNA文庫顯示，大多數差異表達的克隆與NScDNA探針的雜交強於與S2cDNA探針的雜交。這些cDNA克隆對應於在衰老過程中豐度降低的mRNA。在衰老過程中，葉的光合作用產量以及編碼光合作用所需蛋白質的轉錄產物的水平下降(Hensel等，1993，同上)。所以，編碼光合作用相關性蛋白的轉錄產物的對應cDNA可能存在於豐度隨衰老下降的克隆組中。隨機挑選了6種與NS雜交強於與S2cDNA探針雜交的cDNA用於進一步研究，以提供SAGcDNA的對照。我們稱之為衰老負調節基因(SDG)1至6。我們想要強調的是，SDG1至6對應於文庫中很少量的豐度隨衰老急劇下降的組分。自然的葉衰老過程中的基因表達在葉衰老過程中測定不同時刻對應於分離的cDNA克隆的穩態mRNA水平。按質量基礎上的差異表達為基礎分離出該cDNA集合。具體地說，用等質量(dpm)32P標記的cDNA篩選文庫的複製濾膜，cDNA通過分離自NS或衰老葉的Poly(A)+RNA經逆轉錄來製備。由於在衰老過程中葉中的總RNA量下降，Poly(A)+RNA也可能相應地減少。如果Poly(A)+RNA水平隨衰老過程下降，cDNA示差篩選可能選出的SAG克隆其對應信息如果按照單個細胞測定表達，則在衰老過程中保持恆定，而在將表達與RAN質量相關時，這些信息的豐度增加。例如，如果大多數mRNA減少，以單個細胞為基礎保持恆定水平的SAG信息在質量基礎的豐度上會表現為增加。為了確定SAGmRNA水平在衰老過程中是否增加，我們在每個階段檢測了同時與質量和葉面積相關的這些信息的表達。同時按質量基礎和面積基礎檢測時，對應於SAG基因的穩態mRNA水平上升。基於葉面積的上升表明SAGmRNA/細胞在衰老過程中上升。在質量基礎上檢測時，所有SAGmRNA水平在衰老的後期(S3-S5)最高。但是，在葉面積基礎上檢測時，某些SAGmRNA(例如13和15)再現性地在衰老前期表現出最高水平。SAG12表現出最高誘導水平之一，並且在檢測手段的限制內，似乎只在衰老過程中表達。即使進行長時間的自顯影或用β粒子收集器測定，在非衰老葉RNA的泳道中也沒有可檢知的SAG12信號。SAG12mRNA水平在衰老的全過程中都增加，在衰老後期達到最大值。在同時與RAN質量和葉面積相關聯進行檢測時，對應於6種負調節基因的穩態RNA水平隨衰老下降。和預計的一樣，這種下降在檢測隨面積的表達時比檢測隨質量的表達時大得多。如前所述，葉中大多數mRNA遵循這種方式，其中包括光合作用中涉及的例如葉綠素a/b結合蛋白(CAB)和二磷酸核酮糖羧基酶/加氧酶小亞基(Rubisco)(Hensel，等，1993，同上)的核編碼基因的對應mRNA。我們還檢測了我們所定義的衰老階段的CABmRNA水平。我們發現，在葉的衰老過程中，CABmRAN以與SDG相近的速度下降。但是，交叉雜交分析顯示6種SDG克隆都不是CAB或Rubisco基因家族的成員。衰老特異性啟動子的分離我們用SAG12cDNA篩選擬南芥基因組文庫中含有SAG12的SAG12啟動子區的克隆。該文庫由明尼蘇達大學的DavidMarks提供。我們發現，在擬南芥基因組中有一個SAG12拷貝。圖1是一個包含與GUS報導基因連接的2073bp的SAG12-1啟動子和5』非翻譯區的構建物圖。圖2是與SAG12-1的5』非翻譯序列、異戊烯基轉移酶基因和NOS終止序列連接的SAG12-1啟動子的核苷酸序列圖。將SAG12-1啟動子片段(開始於-2073bp的EcoRV位點，並通過一個由寡聚誘變在SAG12-1起始密碼子位置人工生成的NcoI位點)克隆在pGEM5Zf(+)(Promega，Madison，WI)的EcoRV-NcoI位置。該構建物被命名為pSG499。將包含1.87kb的GUS和0.8kb的MAS終止子的一段2.6kb的SalI-SalI片段克隆在pUC18的SalI位點。植物分子生物學(PlantMol.Biol.)15373-381(1990)中記述了MAS終止子。該構建物被命名為pSG486-2。將pSG499中NcoI到PstI的2.2kb的SAG12-1啟動子克隆到pSG486-2中的NcoI-PstI位置。該構建物被命名為pSG506。然後將含有SAG12-1啟動子GUSMAS終止子的PstI-XbaI片段克隆到一個二元載體的PstI-XbaI位置，形成圖1所示的構建物。將含有0.7kbIPT和0.3kbNOS終止子序列(YiLi等，生物學進展(Dev.Biol.)153386-395(1992))的一段1kb的NcoI-XbaI片段克隆到pSG506的NcoI-XbaI位置，取代GUSMAS終止子片段。這一新的構建物被命名為pSG516。然後將pSG516中含有SAG12-1啟動子IPTNOS終止子片段的SpeI-SpeI片段克隆到一個二元載體的XbaI位置(SpeI和XbaI都具有相容的粘性限制性末端)，形成圖2所示的構建物。我們測繪了SAG12-1的轉錄起始位點(在圖3中以+1示出)，並且融合了一段2180bp的片段，該片段包括位於該起始位點上遊的2073bp和107bp的以下兩個基因的SAG12-15』非翻譯區(UTR)報導基因葡糖醛酸酶(GUS)和異戊烯基轉移酶(IPT)，後者是催化細胞分裂素生物合成中限速步驟的酶。啟動子片段開始於圖1，2和3中點「a」。SEQIDNO1是SAG12-1啟動子的序列，IPT基因的序列和NOS-終止子的序列。利用農桿菌介導的轉化(Horsch等，科學(Science)2271229-1231，1985；Valvekens等，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)875536-5540，1988)將上述基因轉導到擬南芥和菸草中。。固定形成的植株，並用比色法測定GUS基因的表達。轉基因表達測定表明，與報導基因融合的SAG12-1基因組序列包含一個衰老特異性啟動子。在擬南芥和菸草中，GUS報導基因都在衰老葉中表達，但不會在衰老前的葉中檢測到。在轉基因菸草中，我們進行了更廣泛的測定，並發現SAG12-1啟動子在衰老過程中在花部分也很活躍。該結果並不出奇，因為花器官在發育和進化上與葉相關(即，花器官被認為是改性的葉)。我們發現，與GUS基因融合的一段709bp片段(轉錄起始位點上遊602bp；圖1的「b」點)在轉基因植物中的GUS表達方式與使用2180bp片段的相同。所以，這一較小的區域包含了衰老特異性調節所必需的全部調控信號。SEQIDNO2是SAG12-1基因轉錄起始位點上遊的這602bp和107bp的5』非翻譯區。使用衰老特異性啟動子延緩衰老在包括單子葉植物和雙子葉植物的許多植物中，細胞分裂素被認為能夠在離體的和植株上正在自然衰老的葉中抑制葉衰老(參見Nooden，植物的衰老和老化(SenscenceandAgeinginPlant)pp.391-439，1988和VanStaden等，植物的衰老和老化(SenscenceandAgeinginPlant)pp.281-328，1988)。而且，細胞分裂素防止葉衰老還能夠保持葉的光合作用活性。多項研究證明用細胞分裂素處理在防止葉綠體降解的同時刺雷射合作用以及葉綠體和胞質蛋白的合成(VanStaden等，同上)。雖然大多數關於細胞分裂素對衰老的作用的研究涉及使用外源性細胞分裂素，但是有證據表明，內源性細胞分裂素是天然的葉衰老調節劑。Nooden等(Nooden等，植物生理學(PlantPhysiol.)9333-39，1990)最近研究了在完整植株上正在自然衰老的黃豆葉中的細胞分裂素流量。在引起黃豆衰老的種子發育後期階段，由根流向葉的細胞分裂素急劇減少。而且，去除豆莢逆轉了衰老過程，恢復了細胞分裂素向葉的流動。轉基因植物研究為此提供了進一步的支持。來自根癌農桿菌Ti質粒的T-DNA的異戊烯基轉移酶基因(IPT)催化細胞分裂素生物合成中的限速步驟。過量表達IPT基因的轉基因植物通常表現出一定程度的葉衰老延緩(Li等，生物學進展(Dev.Biol.)153386-395，1992；Ooms等，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)17727-743，，1991；Smart等，植物細胞(ThePlantCell)3647-656，1991)。但是，IPT在這些轉基因植物中的表達並不是葉特異性的，所以表現出典型由細胞分裂素過量引起的發育異常，例如根發育遲緩和沒有頂端優勢。本發明的目標是使得細胞分裂素以一定的水平僅在衰老的葉中產生，從而抑制衰老又不幹擾植物其它方面的發育。用圖2所示的遺傳構建物生成了8個轉基因菸草系。表達SAG12-1/IPT融合體的8種轉基因菸草表型都很正常(即沒有分支、花的發育和根生長方面的改變)，但是轉基因植物所有的葉在花和種子發育的全過程中都保持了高水平的葉綠素。沒有轉化的對照植株和用與SAG12-1/IPT融合體類似但以GUS基因取代IPT序列的構建物轉化的植株在花和種子發育過程中表現為大量下部葉衰老。這樣，在不幹擾植物發育其它方面的同時達到的改變衰老的目的。轉基因植物具有顯著提高的生物量和花及種子產量。以下表2所示，雖然葉的數量和開花時間相同，但和表達GUS的對照轉基因植物相比，IPT轉基因植物中的總生物量和開花數量明顯增加。由於對照和IPT植株中每朵花中的種子產率相同，IPT轉基因植物中的種子產量幾乎增加一倍。在因蟲害而終止實驗後，IPT轉基因植物仍繼續生長(對照植株停止生長)，如果實驗繼續，產量的提高可能還要大。所以，該系統能夠用於同時提高生物量和種子的產量，並促進觀賞植物的開花。我們還將圖2所示的SAG12-IPT構建物引入擬南芥中並證明它在這種植物中也抑制葉衰老。SAG12-1/IPT構建物是利用YiLi提供的IPT構建物(Li等，生物學進展(Dev.Biol.)153386-395，1992)構建的。該IPT基因的有用特性是在轉錄起始位點引入了一個NcoI位點。IPT基因可以由我們以前的工作中方便地獲得(參見例如Akiyoshi等，美國科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)815994-5998)，但是我們選用Li的構建物以省略克隆步驟。該構建物使用了一個胭脂氨酸合成酶基因(NOS)的終止子(在mRNA生成正確3』末端的序列)(Bevan等，核酸研究(NucleicAcidsResearch)11369-385，1983)。SAG13啟動子的分離在前文所述的mRNA文庫中鑑定了23個與葉衰老相關的cDNA克隆。前文描述了其中之一SAG12的鑑定，使用相似的方法鑑定SAG13及其相關的啟動子。SAG13克隆包含一段1.24kb插入片段。該插入片段被用於製造篩選前文所述擬南芥基因組文庫的探針。找到兩個不同的基因組克隆(即，在擬南芥基因組中有兩個SAG13拷貝)。這兩個克隆包含一段3.53kb的EcoRI-SalI片段，該片段包含轉錄起始位點的上遊區域。將這些DNA片段亞克隆在pBluescriptIISK載體的EcoRI和SalI位點，然後測序。該片段包含全部SAG13cDNA序列和上遊啟動子序列。後文SEQIDNO13顯示SAG13上遊啟動子的序列。轉錄起始位點在第1782位核苷酸，翻譯起始位點在第1957位核苷酸。兩個序列基本一致，但在1009處，該基因的一個拷貝具有一個G殘基，而另一個是A殘基。表2SAG12-IPT轉基因及相關植株某些特性的比較Wisconsin38SAG12-GUSSAG12-GUS/SAG12-IPT(野生型)植株SAG12-IPT植株植株葉綠素含量(μgcm-2葉#7)39天a19.911±0.64221.627±1.89322.117±1.94425.638±1.87768天b1.239±0.7191.797±1.57516.905±1.55118.527±2.855蛋白質含量(μgcm-2葉#7)39天a52.47±1.7552.27±1.0171.33±7.0471.60±3.8668天b16.00±5.2919.60±10.6554.40±3.4949.60±5.88花總數178.3±28.1176.2±51.1318.6±44.2327.5±46.3種子產量(g/株)20.436±4.18221.142±3.68330.240±4.03731.154±4.100生物量(g/株)c107.51±14.41101.64±10.97151.80±20.40150.79±20.15植株高度(cm)d176.25±14.27172.54±6.70178.38±10.54180.15±7.91主幹上的葉數33.3±0.533.0±0.933.1±1.033.5±1.4a)在出芽39天後，各種基因型植株的第7葉完全展開但並不衰老b)在出芽68天後，野生型和SAG12-GUS植株的第7葉完全衰老c)除種子之外，植株地上部分的乾重d)從地面至最高花柄取樣量Wisconsin388株；SAG12-GUS13株；SAG12-GUS/SAG12-IPT8株；SAG12-IPT13株序列表(1)一般信息(i)申請人Amasino，RichardMGan，Sushang(ii)發明名稱衰老特性被改變的轉基因植物(iii)序列數量3(iv)通訊地址(A)收件人QuarlesBrady(B)街道1SouthPinckneyStreet(C)城市Madison(D)州WI(E)國家US(F)郵編53703(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentInRelease#1.01.30版(vi)本申請資料(A)申請號(B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Seay，NichlasJ(B)登記號27,386(C)參考/案卷號960296，92808(ix)電訊信息(A)電話608-251-5000(B)電傳608-251-9166(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特徵(A)長度3183鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「SAG12-1啟動子DNA」(xi)序列描述SEQIDNO1GATATCTCTTTTTATATTCAAACAATAAGTTGAGATATGTTTGAGAAGAGGACAACTATT60CTCGTGGAGCACCGAGTCTGTTTTATATTAGAAACCCGATTGTTATTTTTAGACTGAGAC120AAAAAAGTAAAATCGTTGATTGTTAAAATTTAAAATTAGTTTCATCACGTTTCGATAAAA180AAATGATTAGTTATCATAGCTAATATAGCATGATTCTAAATTTGTTTTTTGACACCCTTT240TTTTCTCTCTTTGGTGTTTTCTTAACATTAGAAGAACCCATAACAATGTACGTTCAAATT300AATTAAAAACAATATTTCCAAGTTTTATATACGAAACTTGTTTTTTTAATGAAAACAGTT360GAATAGTTGATTATGAATTAGTTAGATCAATACTCAATATATGATCAATGATGTATATAT420ATGAACTCAGTTGTTATACAAGAAATGAAAATGCTATTTAAATACCGATCATGAAGTGTT480AAAAAGTGTCAGAATATGACATGAAGCGTTTTGTCCTACCGGGTATCGAGTTATAGGTTT540GGATCTCTCAAGAATATTTTGGGCCATATTAGTTATATTTGGGCTTAAGCGTTTTGCAAA600GAGACGAGGAAGAAAGATTGGGTCAAGTTAACAAAACAGAGACACTCGTATTAGTTGGTA660CTTTGGTAGCAAGTCGATTTATTTGCCAGTAAAAACTTGGTACACAACTGACAACTCGTA720TCGTTATTAGTTTGTACTTGGTACCTTTGGTTAAGAAAAAGTTGATATAGTTAAATCAGT780TGTGTTCATGAGGTGATTGTGATTTAATTTGTTGACTAGGGCGATTCCTTCACATCACAA840TAACAAAGTTTTATAGATTTTTTTTTATAACATTTTTGCCACGCTTCGTAAAGTTTGGTA900TTTACACCGCATTTTTCCCTGTACAAGAATTCATATATTATTTATTTATATACTCCAGTT960GACAATTATAAGTTTATAACGTTTTTACAATTATTTAAATACCATGTGAAGATCCAAGAA1020TATGTCTTACTTCTTCTTTGTGTAAGAAAACTAACTATATCACTATAATAAAATAATTCT1080AATCATTATATTTGTAAATATGCAGTTATTTGTCAATTTTGAATTTAGTATTTTAGACGG1140TTATCACTTCAGCCAAATATGATTTGGATTTAAGTCCAAAATGCAATTTCGTACGTATCC1200CTCTTGTCGTCTAATGATTATTTCAATATTTCTTATATTATCCCTAACTACAGAGCTACA1260TTTATATTGTATTCTAATGACAGGGAAACTTTCATAGAGATTCAGATAGATGAAATTGGT1320GGGAAACATCATTGAACAGGAAACTTTTAGCAAATCATATCGATTTATCTACAAAAGAAT1380ACTTAGCGTAATGAAGTTCACTTGTTGTGAATGACTATGATTTGATCAAATTAGTTAATT1440TTGTCGAATCATTTTTCTTTTTGATTTGATTAAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCT1500TGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACTATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGAT1560TCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGATGCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAA1620AAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCATGTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTA1630TACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATGTCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAA1740TTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTATGCAAAACATCATCAACACATATCCAACT1800TCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAAAATAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTA1860ATCATCAATTATAAATGTTTACAAAACTAATTAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAAT1920CCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTTCAGGTTGATGTAGGACTAAAATGGCTACG1980TATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTATGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAAC2040AAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCATGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTA2100TTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCTTCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGT2160CATTTAACTTTCCTAAAACCATGGACCCTGCATCTAATTTTCGGTCCAACTTGCACAGGA2220AAGACGACGACCGCGATAGCTCTTGCCCAGCAGACAGGGCTTCCAGTCCTTTCGCTTGAT2280CGGGTCCAATCGTGTCCTCAACTATCAACCGGAAGCGGACGACCAACAGTGGAAGAACTG2340AAAGGAACGACGCGTCTCTACCTTGATGATCGGCCTCTGGTGGAGGGTATCATCGCAGCC24T0AAGCAAGCTCATCATAGGCTGATCGAGGAGGTGTATAATCATGAGGCCAACGGCGGGCTT2460ATTCTTGAGGGAGGATCCACCTCGTTGCTCAACTGCATGGCGCGAAACAGCTATTGGAGT2520GCAGATTTTCGTTGGCATATTATTCGCCACAAGTTACCCGACCAAGAGACCTTCATGAAA2580GCGGCCAAGGCCAGAGTTAAGCAGATGTTGCACCCCGCTGCAGGCCATTCTATTATTCAA2640GAGTTGGTTTATCTTTGGAATGAACCTCGGCTGAGGCCCATTCTGAAAGAGATCGATGGA2700TATCGATATGCCATGTTGTTTGCTAGCCAGAACCAGATCACGGCAGATATGCTATTGCAG2760CTTGACGCAAATATGGAAGGTAAGTTGATTAATGGGATCGCTCAGGAGTATTTCATCCAT2820GCGCGCCAACAGGAACAGAAATTCCCCCAAGTTAACGCAGCCGCTTTCGACGGATTCGAA2880GGTCATCCGTTCGGAATGTATTAGGTTACGCCAGCCCTGAGCTCGATCGTTCAAACATTT2940GGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAAT3000TTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGA3050GATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAA3120TATGGCGCGCAAACTGGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGAA3180TTC3183(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特徵(A)長度709鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「SAG12-1啟動子DNA(截短形式)」(xi)序列描述SEQIDNO2AAGCTTTTAACTTGCACGAATGGTTCTCTTGTGAATAAACAGAATCTTTGAATTCAAACT60ATTTGATTAGTGAAAAGACAAAAGAAGATTCCTTGTTTTTATGTGATTAGTGATTTTGAT120GCATGAAAGGTACCTACGTACTACAAGAAAAATAAACATGTACGTAACTACGTATCAGCA180TCTAAAAGTATTTTTTTCCAAATAATTTATACTCATGATAGATTTTTTTTTTTTGAAATG240TCAATTAAAAATGCTTTCTTAAATATTAATTTTAATTAATTAAATAAGGAAATATATTTA300TGCAAAACATCATCAACACATATCCAACTTCGAAAATCTCTATAGTACACAAGTAGAGAA360AATAAATTTTACTAGATACAAACTTCCTAATCATCAATTATAAATGTTTACAAAACTAAT420TAAACCCACCACTAAAATTAACTAAAAATCCGAGCAAAGTGAGTGAACAAGACTTGATTT480CAGGTTGATGTAGGACTAAAATGGCTACGTATCAAACATCAACGATCATTTAGTTATGTA540TGAATGAATGTAGTCATTACTTGTAAAACAAAAATGCTTTGATTTGGATCAATCACTTCA600TGTGAACATTAGCAATTACATCAACCTTATTTTCACTATAAAACCCCATCTCAGTACCCT660TCTGAAGTAATCAAATTAAGAGCAAAAGTCATTTAACTTTCCTAAAACC709(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特徵(A)長度1974鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)說明/desc＝「SAG13啟動子DNA」(xi)序列描述SEQIDNO3GAATTCTCAGTGTTCTCTTAAATCAAATCTCTCACACTATGAGTATATGAACAAAATCAT60ATACATATCACAATTCCATTATGGATATCTCCCAATCTATCTCTCATACATGAAAATGTT120CTATTTCGATCTTGTATTTAATAATGTTAATACTCTGTTTTAATTTGTGTATCCTGATTT180TTTTTTCTTTTTGAAGTTCAACAAATATATCAAAATAACTCAGAACCATTACTATTTTTT240CTTAGTTCATCAATTCTTTACTACACATAGAAACGTATTTATCTTGTTTGATCTACTTTG300ACTCTATATATGTCATGTGGCATCTCTGGTCATTGCTAGTCACAGGTAAAAGTAAAAATT360GATCAAAGATAAAGAGTCTTTCATGGTAAAAATTCTCTTGTAACTGGTGGAGATAGTAGA420TGTCAATTCGTTTGCAATAACTTACATTTGCAATAACATGTCAGCCATATTTATTTTAAAT480TTCCATGCATTTGATATTATTTTCTCTCTAATACATATATGATGTGTTACGGTCATTCTA540AAAATCCAGTTGACAGCATAATGAAGCTGGTACACCATACATGCACTTGATTATATATGG600ATGTTACTGCCATGATTGATGTTTTGATGGAATTAGTGTTAAAGGATGGACCCTCACTAA660CGCGGTTGGAAATTATGATCAAACTCTTCAATGTCACTTATCAAGAGAGCTAATGACTAG720CACGTTTAGTTGTTCTGTTGTTTCTTATGGCTGCTTAATGTCTCCATCAAATATTTAGAC780ATTGTGGCTAGTAAAATGCCATCTACCTTAATCCTATATATAAGTATAACTAGATAATAA840TCCATATTTTTGCTGGGTTTAGTAGCTGATACGACGTTTATGGTTGTTATTGAGTTTGAA900TACAAAATATAGAGTATTGTTGGAGTTATATTGATTTTTGTTCATATTAGTTAACAAATA960ATAAAAAAATTAAGAAAGGTTTTTGAAAATGCATCTTCTAGAATATATRTATATTCGAAA1020AAGTCACATCTTTAATTGACATATGTTTTGTTTGTTTGTTTTTTTTTACTGGCCACACAA1080ATTGACAACAATGGTCATGCATGAAATGAAATGTTTGTTGTCAATTTTTTTTACTAACTT1140GTAATATCATTATGAAATGAAATAGAAGGTATATATTACAAAATATTACCTAAAAGTAGA1200GCAATCTTAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAACAAGATTA1260CAATGCATTTAAAAAGAGATGGAAAGAATCCGAGCTATCGAATCCAAAGAAGCATCTACT1320TCCTCCATCTGTTCTTGTATCGTCTACCAGAGATGGTGTTCCGGATCTCTCGATCAATAT1380TCTTAAAGATGGTTGTTGGAGGGATCCTTTGGCTATTATGGAGAACATTATTCGTTTATC1440TCCAGATGTGATAGACAAAGGGCTGTGTGGCCTGTGAGACCGATGGCCACTTAATTATTG1500GTTTTTTGTCAATGGTTGTGTATGCATAGAAATTCCCACAACCGTTTGTGGCTTAACACA1560ATTTACCAGGGGTTTAAGTGGTTAAATTGATACATGTAGATCTAAAGTTTTATGCTAATA1620TAAATTAGTTTTAATTATATAAATTTTAACTACGCTCATGACACGTAAATGGTAGACCAA1680TATGTGGTGCTCTATTAACTAAGGGGTGCTTCATTATTAATTCATAAAGATTTCTTTACT1740ATACAAGACTTGTCAAAAGGAAAAGTAGTATTTTCGTACTACGTCTACCCCTCTCACGGA1800TATGTGTGGTCGAGCAGTCATTATCATAATGTGGAATTTTGAATTGAGCGAGGTTTCAAA1860GTTCAAAACTATCACAACTAGTCTTGATCAATTCTATATAAGATCTGTGATCTTGGTTGA1920AGAAAAGAATCGTCGTAGGTTGATATTTAACAAGGAATGGCAAAGGAAGGGGGC197權利要求1.一種遺傳構建物，它包含SAG12或SAG13啟動子序列，啟動子序列與並不天然與之相連的蛋白質編碼DNA序列可操作地連接。2.根據權利要求1所述的構建物，其中的啟動子序列包含SEQIDNO2的開頭602bp。3.根據權利要求1所述的構建物，其中的啟動子序列包含SEQIDNO3的開頭1782bp。4.根據權利要求1所述的構建物，其中的蛋白質編碼序列編碼一種植物激素合成酶。5.根據權利要求4所述的構建物，其中的蛋白質編碼序列編碼催化植物激素細胞分裂素合成的酶。6.根據權利要求5所述的構建物，其中的蛋白質編碼序列編碼異戊烯基轉移酶。7.根據權利要求1所述的構建物，它還包含SAG12-1的5』非翻譯區。8.一種遺傳構建物，它包含一個SAG12啟動子，該啟動子與編碼催化細胞分裂素合成的酶的DNA序列可操作地連接。9.根據權利要求8所述的構建物，其中的DNA序列編碼異戊烯基轉移酶。10.包含權利要求2所述的構建物的細胞。11.包含權利要求8所述的構建物的細胞。12.包含權利要求1所述的構建物的植物。13.包含權利要求8所述的構建物的植物。14.一種遺傳構建物，它包含一個SAG13啟動子，該啟動子與編碼催化細胞分裂素合成的酶的DNA序列可操作地連接。15.一種衰老被延緩的轉基因植物，它在其基因組中按5』至3』方向包含一個遺傳構建物，該構建物包括一個衰老相關性啟動子和催化細胞分裂素合成的酶的編碼區。16.根據權利要求15所述的轉基因植物，其中的啟動子選自SAG12啟動子或與SAG12序列足夠同源的啟動子，後者在擬南芥中表達GUS時以接近SAG12啟動子的水平優選在衰老組織中表達酶。17.根據權利要求15所述的轉基因植物，其中的啟動子是SAG13。18.根據權利要求15所述的轉基因植物，其中的酶是IPT。19.一種衰老被延緩的轉基因植物，在其基因組中包含一個外源遺傳構建物，從其5』至3』包含一個衰老特異性啟動子，一段某種酶的蛋白質編碼區，該酶若被表達將在植物細胞中催化細胞分裂素的產生，和轉錄終止序列，其中的外源遺傳構建物在進入衰老期的組織中表達以延緩植物組織的衰老。20.根據權利要求19所述的轉基因植物，其中的細胞分裂素是IPT。21.根據權利要求19所述的轉基因植物，其中的啟動子是SAG12-1。22.根據權利要求19所述的轉基因植物，其中的啟動子是SAG13。全文摘要本發明公開了一種遺傳構建物,包含與一段編碼蛋白質的DNA序列可操作地連接的SAG12啟動子序列,該序列並非天然地與該啟動子序列連接。較好的是,該SAG12啟動子序列是序列2(SEQIDNO.2)的開關602bp,而蛋白質編碼序列編碼的是異戊烯基轉移酶。文檔編號C12N9/10GK1192120SQ96193703公開日1998年9月2日申請日期1996年2月20日優先權日1995年3月29日發明者R·M·阿馬西諾,S·甘申請人:威斯康星鋁研究基金會