利用與轉移相關的多基因標籤來確定肝細胞癌的預後的方法

2023-10-05 09:36:19 4

利用與轉移相關的多基因標籤來確定肝細胞癌的預後的方法
【專利摘要】在Twist1-和MYC-誘導的肝細胞癌(HCC)的條件式轉基因小鼠模型中，單獨的MYC表達導致未能轉移的腫瘤，而Twist1與MYC的共表達則導致與至淋巴結、脾、腹膜和肺的肝外轉移相關的腫瘤。Twist1還引起循環腫瘤細胞的顯著的增加。Twist1和MYC的組合失活導致如由大體病理學和微觀病理學、X-射線計算機斷層掃描和生物發光成像所顯示的原發性腫瘤和轉移性腫瘤兩者的持續消退，以及循環腫瘤細胞的抑制。通過基因組分析鑑定出包括17個上調基因和3個下調基因的20-基因標籤（signature），所述20-基因標籤高度預測患有HCC的人患者中的轉移和總存活。本發明的另一個方面包括確定患者的肝細胞癌的轉移狀態的方法，所述方法包括從來自患有肝細胞癌的受試者的癌樣品獲得第一差異基因表達譜以及創建概述通過所述第一基因表達分析獲得的標準化數據並包括肝癌的轉移狀態的確定的報告。
【專利說明】利用與轉移相關的多基因標籤來確定肝細胞癌的預後的方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求題為「AMETHOD OF DETERMINING THE PROGNOSIS OF HEPATOCELLULARCARCINOMAS USING A MULTIGENE SIGNATURE ASSOCIATED WITH METASTASIS」 且於 2011 年7月12日提交的美國臨時專利申請序列號61/506，763的優先權，在此通過引用將該申請整體併入。
[0003]關於由美國政府提供的資金的聲明
[0004]本發明根據由美國政府的美國國立衛生研究院授予的NIH基金號:CA89305和CA10510，在政府支持下完成。政府在本發明中具有某些權益。
【技術領域】
[0005]本公開一般涉及預測肝細胞癌的結果的基因標籤(gene signature),並涉及鑑定基因標籤的預測成員的方法。本公開還涉及鑑定與轉移性肝細胞癌的消退(regression)相關的靶基因。
[0006]背景
[0007]肝細胞癌(HCC)是主要的全球性癌症健康問題(Jemal等人，(2010) CACancerJ.Clin.60:277-300 ； Altekruse 等人，J.Clin.0ncol.27:1485-1491)。因為其通常在廣泛分布的局部侵入和/或遠端轉移之後被診斷，HCC具有很差的預後(Sherman，M.(2008)New Engl.J.Med.359:2045-2047 ；Tang, Z.Y.(2001) World J.Gastroenterol.7:445-454) ?HCC的鑑定機制和/或預測侵入的方法將具有實質性的臨床重要性(Bruix&Sherman (2005)Hepatology42:1208-1236) ? 先前的報導已鑑定了與 HCC 中(Coulouarn 等人，(2009)0ncogene28, 3526-3536 ;Cou1uarn 等人，(2008) Hepatology47:2059-2067 ；Kapos1-Novak等人，(2006) J.Cl in.1nvest.116:1582-1595 ;Roessler 等人，Cancer Res.70，10202-10212 ；Ye 等人，(2003) Nat.Med.9:416-423)以及其他癌症類型中(Barrier等人，(2006) J.Clin.0ne.24:4685-4691 ；Bos 等人，(2009)Nature459:1005-1009 ；Bueno-de-Mesquita 等人，(2007) Lancet Oncol.8:1079-1087 ;Kang 等人，(2003) CancerCell3:537-549 ;Paik 等人，(2004)New Engl.J.Med.351:2817-2826 ;Salazar 等人，(2011)J.Clin.0ncol.29:17-24 ;Wan 等人，(2005)PLoS 0ne5, el2222)的轉移和侵入相關的基因標籤。Twistl表達與多種腫瘤類型，包括人HCC2-8中的轉移相關(Zhu等人，(2008)J.Huazhong Univ.Sc1.Technolog.Med.Sc1.28:144-146)。
[0008]Twistl是與上皮間質轉化(EMT)相關的鹼性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族的成員，所述上皮間質轉化是這樣一個過程，上皮細胞通過所述過程轉分化成更具侵入性的表型。在人HCC中，Twistl表達與疾病和不良預後的晚期臨床階段相關(Lee等人，(2006)Clin.Cancer Res.12:5369-5376 ；Niu 等人，(2007) J.Exp.Clin.Cancer Res.26:385-394 ；Sun 等人，Hepatology51:545-556 ;Yang 等人,(2009) Hepatology50:1464-1474 ;Ye 等人,(2003)Nat.Med.9:416-423)，並顯示引起體外源自腫瘤的細胞系中的增加的侵入(Lee等人，(2006) Cl in.Cancer Res.12:5369-5376 ;Matsuo 等人，(2009) BMC Cancer9:240 ；Sun等人，Hepatology51:545-556 ；Yang 等人，(2009) Hepatology50:1464-1474 ；Zhao 等人，J.Cell Mo 1.Med.15:691-700)。然而，Twistl在侵入和轉化中的因果作用還有待在任何自生腫瘤模型中被體內證明。
[0009]概述[0010]Twistl的表達與癌症侵入和轉移相關，但對於自生腫瘤的因果作用還有待確立。已產生了 Twistl-和MYC-誘導的肝細胞癌(HCC)的條件式轉基因小鼠模型。單獨的MYC表達導致未能轉移的腫瘤，而Twistl與MYC的共表達則導致與至淋巴結、脾、腹膜和肺的肝外轉移相關的腫瘤。Twistl還造成循環腫瘤細胞中的顯著增加。Twistl和MYC的組合失活導致了如由大體病理學(gross pathology)和微觀病理學、X_射線計算機斷層掃描和生物發光成像所顯示的原發性腫瘤和轉移性腫瘤二者的持續消退，以及循環腫瘤細胞的抑制。基因表達譜顯示，HCC的小鼠模型具有人類疾病的代表性。通過基因組分析鑑定了包括17個上調基因和3個下調基因的20-基因標籤，所述20-基因標籤高度預測患有HCC的人患者中的轉移和總存活。
[0011]本公開的一個方面包括用於對患者中的肝細胞癌預後的基因標籤的實施方案，其中來自基因標籤的差異基因表達預測患有轉移性肝細胞癌的患者的存活，且其中基因標籤包括選自由以下組成的組的多個基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和gstm6。
[0012]在本公開該方面的實施方案中，基因標籤可基本上由以下基因組成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0013]在本公開該方面的實施方案中，基因標籤可由以下基因組成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0014]在本公開該方面的實施方案中，基因標籤可由以下基因組成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0015]本公開的另一個方面包括確定患者的肝細胞癌的轉移狀態的方法的實施方案，該方法包括:從來自患有肝細胞癌的受試者的癌樣品獲得第一差異基因表達譜，其中第一差異基因表達譜可包括選自由以下組成的組的多個基因的表達信息的數據集:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6 ;和創建概述通過所述第一基因表達分析獲得的標準化數據的報告，其中該報告可包括肝癌的轉移狀態的確定。
[0016]在本公開該方面的實施方案中，患者的肝細胞癌的轉移狀態可提供患者中的癌的發展的預後。
[0017]在本公開該方面的實施方案中，第一基因標籤可基本上由以下基因組成:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。[0018]在本公開該方面的實施方案中，第一基因標籤可由以下基因組成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
[0019]在本公開該方面的實施方案中，第一基因標籤可由以下基因組成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0020]在本公開該方面的實施方案中，方法可包括以下步驟:(i)從懷疑患有轉移性肝細胞癌的患者獲得第一生物樣品；(ii)從該生物樣品中分離RNA ;及(iii)確定第一基因標籤的表達的差異水平。
[0021]在本公開該方面的實施方案中，第一基因標籤可包括基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ip1、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6,其中如果當與非轉移性組織中的水平相比時,基因標籤的基因 hbegf > aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ipl、pygb、map3k6 的表達的差異水平提高且基因 acp2、cyp4v2 和 gstm6的表達的差異水平降低，則所述水平表明癌的轉移，從而提供患者中的癌的發展的預後。
[0022]在本公開該方面的實施方案中，方法可包括以下步驟:從未患有肝細胞癌或懷疑未患有發展的轉移性肝細胞癌的受試者獲得第二生物樣品，從該生物樣品中分離RNA ;確定包括基因 hbegf> aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、Ipl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6 的第二基因標籤的差異表達的水平；比較第一和第二基因標籤的表達的差異水平，其中來自第一和第二基因標籤的表達的相對差異水平指示懷疑患有轉移性肝細胞癌的患者中的轉移性肝細胞癌細胞的存在或不存在；和創建概述通過所述基因表達分析獲得的標準化數據的報告，其中所述報告包括患有肝細胞癌的患者的長期存活的可能性的預測。
[0023]在本公開該方面的實施方案中，第一和第二生物樣品來自相同的患者，從而指示患者中的肝細胞癌的進展。`
[0024]在本公開該方面的實施方案中，方法可包括確定基因標籤的基因的表達的差異水平的步驟，包括從第一和第二生物樣品中分離RNA ;以及檢測源自基因標籤的基因的RNA的水平。
[0025]本公開的又另一個方面包括引起動物或人受試者中的肝細胞癌的消退的方法的實施方案，所述方法包括降低Twistl基因的表達水平或其產物的量，從而降低癌的轉移水平。
[0026]附圖簡述
[0027]當結合附圖查閱以下描述的本公開的多種實施方案的詳細描述時，將更容易領會本公開的方面。在以下描述和實施例中更加詳細地描述了這些圖。
[0028]圖1A-1E說明Twistl促進MYC-誘導的HCC的轉移。
[0029]圖1A示意性說明用於產生在肝細胞中共表達鼠(murine)Twistl、人c-MYC和螢火蟲螢光素酶(Luc)的轉基因小鼠的Tet系統。通過當從供水中去除多西環素(Dox)時的轉基因活化誘導成年動物中的肝細胞癌(HCC)。
[0030]圖1B是說明Twistl與MYC協作來誘導52%的動物中的具有多個靶器官的肝外HCC轉移的圖(η=21 ;ρ〈0.001)。單獨的MYC並未誘導HCC轉移(η=30)。
[0031]圖1C顯示了說明小鼠的大體解剖學的一系列數字圖像，顯示MYC/Twistl動物(n=21)中至淋巴結、脾和腹膜(38%,p<0.001)以及肺(29%,p<0.001)的轉移，且單獨的MYC誘導未轉移的HCC，而單獨的Twistl (n=15)對肝重或組織學不具有可識別的作用。
[0032]圖1D顯示了說明MYC的免疫組織化學(IHC)的一系列數字圖像，其顯示在原發性位點和轉移性位點的轉基因表達，表明轉移源自MYC-誘導的原發性腫瘤。
[0033]圖1E顯示了說明免疫組織化學的一系列數字圖像，其顯示E-鈣粘蛋白和β_連環蛋白以與正常肝臟可比較的水平表達並定位於MYC/Twistl原發性和轉移性HCC中的細胞周圍，表明上皮粘附連接(epithelial adherens junction)的保持。MYC HCC顯示異質的及非定域化(delocalized)的E-1丐粘蛋白和β_連環蛋白。
[0034]圖2A-2D說明當Twistl和MYC失活時轉移性HCC的消退。
[0035]圖2Α顯示了說明在疾病進展過程中MYC/Twistl小鼠中的豐富的循環腫瘤細胞(CTC)的圖。螢火蟲螢光素酶(FLuc)的表達在腫瘤發作期間顯著增加(p=0.04)，並然後當MYC/Twistl失活時明顯下降(p=0.0121)(在將Dox重新引回至供水之後)。
[0036]圖2B顯示了說明轉 基因MYC(hMYC)表達的圖，其用於評價CTC的發生率(prevalence),且其顯示在疾病發作期間的增加(p=0.0335)及在MYC/Twistl失活後的顯著降低(0=0.0159)。
[0037]圖2C顯示了在HCC進展期間X-射線計算機斷層掃描(微型CT)的一系列數字圖像。在腫瘤發作期間，檢測到肺轉移和肝臟大小的增加。當MYC/Twistl失活時，肺轉移不再是可檢測的，且肝臟縮回至腫瘤前的大小(pre-tumor size)。
[0038]圖2D顯示了用於移植的MYC/TwistlHCC細胞以研究休眠腫瘤細胞在轉基因失活時是否存留的生物發光成像(BLI)的一系列數字圖像。當MYC/Twistl失活時腫瘤消退並停止發光。MYC和Twistl的再活化引起發光腫瘤的快速再度出現，表明休眠腫瘤細胞在轉基因失活後存留。
[0039]圖3-6C說明了用於人HCC患者中的臨床結果的預測是有用的MYC/Twistl原發性腫瘤對轉移性腫瘤的基因表達分析。
[0040]圖3是來自個體樣品的重要基因的基因聚類(gene clustering)的圖示(AN0VA,p〈0.05 ;>2 倍表達)。正常=正常肝臟，n=2 ；MYC HCC=MYC-誘導的 HCC，n=2 ；MYC/Twi st 1HCC=MYC/Twi st 1HCC, n=6 ；MYC/Twistl MET=MYC/Twistl 轉移，n=8。
[0041]圖4是說明基因在MYC/TwistlHCC和MYC/TwistlMET中表達的一系列圖，其顯示來自兩個人MYC-相關的HCC數據集的基因集的強的富集(strong enrichment)。利用從比較每種腫瘤類型與正常肝臟建立的基因列表(非配對t-檢驗，p〈0.05)，進行GSEA分析以比較鼠HCC表達與人HCC以及轉移基因數據集。
[0042]圖5示意性說明顯示每一種腫瘤類型之間不同的、或重疊的基因標籤的腫瘤類型的比較(非配對t-檢驗，p〈0.05 ;與正常相比>2倍的改變)。
[0043]圖6A和6B是說明圖5中顯示的標籤被分為上調(_UP)基因或下調(_D0WN)基因並被用於在人HCC定群中執行存活分析的一對圖，其中基因表達與臨床結果相關。MYC/TwistlHCC+MET_UP基因與HCC患者中的差的總存活相關(GSE1898 ；KapIan-Meier左側曲線，對數秩檢驗，p=0.002)。該發現在獨立的人HCC定群中得到證實，其顯示MYC/TwistlHCC+MET_UP匹配(aligning)患者的類似的不良預後(GSE14520 ；KapIan-Meier曲線右側，對數秩檢驗，P=0.0001)。
[0044]圖6C是利用MYC/TwistlHCC+MET_UP標籤，基於原發性腫瘤轉移分開HCC患者組的圖解箱線圖(GSE364 ;非配對t-檢驗，p〈0.00001)。
[0045]圖7和圖8A-8C說明了小鼠和人基因表達的比較分析，其鑑定了對人HCC侵入和存活高度預後的17-基因標籤。
[0046]圖7顯示了小鼠MYC/Twist 1HCC+MET_UP標籤和5個現有的人HCC轉移標籤的彙編(人HCC總轉移標籤)之間的基因比較的維恩圖(Venn diagram)，其揭示了在小鼠和人HCC轉移標籤之間重疊的17個上調基因。
[0047]圖8A和8B是說明17-基因標籤是人HCC患者中的差的總存活的預後的一對圖(GSE364 ；KapIan-Meier左側曲線；對數秩檢驗，p=0.004)。該發現在人HCC患者的獨立的數據集中得到證實，其顯示了與17基因標籤匹配的患者(patients aligning withthel7Gene Signature)的類似的不良預後(GSE14520 ;Kaplan_Meier右側曲線；對數秩檢驗，p=0.0012)。
[0048]圖SC是利用17-基因標籤，基於轉移的存在顯示人HCC定群的分層(stratification)的圖解箱線圖(GSE364)(平均值的 t_ 檢驗，p〈0.00001)。
[0049]圖9A和圖9B說明Twistl在人HCC中表達。
[0050]圖9A是顯示在來自患者的8個正常肝臟樣品和40個癌症樣品上執行的qRT_PCR的結果的圖。人HCC的子集具有升高的Twistl表達。Twistl的表達跨所有40個人HCC樣品是可變的，其中一些顯示低於`正常肝中的表達譜的表達，且一些顯示高於正常肝中的表達譜的表達。
[0051]圖9B是說明圖9A的表達數據被分組到組織類型的圖解箱線圖。
[0052]圖10是說明Twistl促進MYC-誘導的HCC的轉移但是當單獨表達時不影響肝臟組織學的一系列數字圖像。正常肝臟對過表達Twistl的肝臟的H&E未顯示組織的組織學中的顯著差異。MYC HCC主要顯示了分化不良的腺樣組織學。MYC/Twistl原發性HCC顯示了類似於MYC HCC的腺樣組織學以及小梁組織學。MYC/Twi st IHCC轉移至肺和淋巴結(LN)並分別顯示小梁和固體(solid)組織學。所有轉移在組織學上被確定為HCC起源的。
[0053]圖11是顯示Twistl增加MYC-誘導的HCC的存活的圖。顯示了關於MYC小鼠、MYC/Twi st I小鼠和Twistl小鼠的Kaplan-Meier存活曲線。MYC小鼠(n=30)以13.2周的中值時間死於HCC。MYC/Twi st I小鼠(n=30)以19.1周的中值時間死於HCC(p〈0.0001，對數秩檢驗)。Twistl小鼠(n=15)從未死於疾病並直至轉基因活化之後的18個月都是健康的。
[0054]圖12-16顯示Twistl增加了鼠和人HCC細胞系的遷移、侵入和轉移。
[0055]圖12是顯示轉導的細胞表達高水平的TWISTl蛋白的免疫印跡的數字圖像。Twistl通過逆轉錄病毒轉導到人Huh7細胞系或源自LAP-tTA/TRE-MYC(MYC)小鼠的鼠HCC細胞系中。
[0056]圖13是為了顯示Twistl增加鼠和人HCC細胞的遷移潛能而執行的劃痕傷口癒合試驗的數字圖像。
[0057]圖14是顯示transwell膠原侵入試驗的圖,其中Twistl的表達顯著地增加了體外鼠和人HCC細胞的侵入(對於每一種細胞系，p〈0.01)。
[0058]圖15是顯示當腹膜內注射至免疫功能低下的(immunocompromised) SCID小鼠中時，MYC HCC (n=4)和由Twistl轉導的MYC HCC(n=4)兩者是致瘤的一系列數字圖像。僅MYC/TwistlHCC呈現了轉移的跡象，其中4隻小鼠中的2隻顯示腎上的致瘤生長。
[0059]圖16是顯示將由載體(n=4)或Twistl (n=4)轉導的人HCC細胞系Huh7靜脈注射到SCID小鼠中以檢查轉移性生長的一系列數字圖像。表達Twistl的細胞顯示在4隻小鼠中的3隻中的轉移性肺生長，而由載體轉導的Huh7注射的動物則未顯示肺轉移的跡象。
[0060]圖17A-17C顯示了說明EMT標誌物在MYC/Twistl轉移性病灶中被最高表達的圖。
[0061]圖17A是顯示與通過qRT-PCR檢查的EMT相關的多種間質標誌物的圖。將MYC/Twistl原發性和轉移性HCC與MYC HCC比較。MMP2顯示了 MYC/Twistl原發性HCC的大幅度增加，儘管相對於MYC或MYC/Twistl原發性HCC，轉移中的Fspl、FoxC2和MMP9是增加的。將所有值都顯示為相對於正常肝臟對照的倍數變化。
[0062]圖17B是顯示上皮標誌物的分析的圖，說明了與MYC HCC相比，MYC/Twistl中的細胞角蛋白8和18(Ck8、Ckl8)、血小板親和蛋白-2(plakophilin-2) (Plako2)和連接蛋白32 (Cx32)的表達僅些許(modest)下降。這四個標誌物與閉合蛋白(Occludin)(Occ) —起顯示了 MYC/Twistl轉移中的顯著較低的表達。
[0063]圖17C是顯示先前涉及的EMT的誘導物的圖。Zebl顯示了 MYC和MYC/Twistl原發性HCC之間的最大增加，且SIPl顯示了轉移的增加。Snaill在樣品之間基本上是未改變的。相對於MYC HCC，Snail2/Slug顯示在MYC/Twist HCC和轉移中的下降的表達。
[0064]圖18和19說明Twistl增加了循環腫瘤細胞(CTC)的發生。
[0065]圖18是說明通過qRT-PCR分析收集自MYC/Twistl小鼠的外周血的CTC標誌物螢火蟲螢光素酶(FLuc)的箱線圖，顯示與正常對照相比的162倍增加及與MYC小鼠相比的19倍增加(p=0.0428)。將表達針對泛素標準化，跨多個樣品平均，並相對於野生型小鼠設定。
[0066]圖19是說明與MYC小鼠相比，MYC/Twistl小鼠顯示轉基因人MYC(hMYC)表達的2156倍增加(p=0.0007)的箱線圖。
[0067]圖20說明對最佳鼠HCC模型標籤和最佳總體鼠和人的比較標籤的人HCC Z-分數存活分析的一對GSEA預排序(pre-rank)富集圖。富集圖圖解顯示了來自MYC/TwistlHCC+MET (最佳鼠模型標籤)和17-基因標籤(鼠HCC和人HCC之間的最佳重疊標籤)的基因在人HCC資料庫內、在正的Z-分數範圍內如何被富集。正的Z-分數譜中的富集顯示這些基因與患者的不良預後相關。這還反映在分別為1.751和1.743的MYC/Twist 1HCC+MET和17-基因標籤的累積NES0兩個標籤經P-值(分別為ρ〈0.00001和ρ=0.006)和FDR值(分別為q=0.014和q=0.012)均達到統計顯著性。
[0068]圖2IA和2IB說明了獨立的人HCC定群證實了源自小鼠腫瘤的標籤與差的存活相關。
[0069]圖21A是顯示MYC/TwistlHCC+MET基因標籤預後人HCC患者中差的總體存活的圖(GSE364 ；KapIan-Meier左側曲線)；在該特定的人HCC定群中，存活比較未達到統計顯著性(對數秩檢測，P=0.12)。
[0070]圖21B是顯示17-基因標籤預後人HCC患者中差的總體存活的圖(GSE1898 ;Kaplan-Meier右側曲線)；在該特定的人HCC定群中，存活比較未達到統計顯著性(對數秩檢測，p=0.16)。
[0071]圖22顯示了小鼠MYC/TwistlHCC+MET_DOWN標籤和現有的人HCC轉移標籤的彙編(人HCC下調轉移標籤)之間的基因比較的維恩圖，其顯示在小鼠和人HCC轉移標籤之間重疊的3個下調基因。
[0072]圖23顯示了小鼠MYC/TwistlHCC+總標籤和現有的人HCC轉移標籤的彙編(人HCC總轉移標籤)之間的基因比較的維恩圖，其顯示在小鼠和人HCC轉移標籤之間重疊的20個
差異調苄基因。
[0073]圖24A顯示了說明20-基因標籤預後人HCC患者中的差的總存活的一對圖(GSE364 ;Kaplan-Meier左側曲線；對數秩檢驗，p=0.004)。該發現在人HCC患者的獨立的數據集中得到證實，其顯示了關於與20基因標籤匹配的患者的類似的不良預後(GSE14520;Kaplan-Meier右側曲線；對數秩檢驗，P=0.0012)。
[0074]圖24B是利顯示用20-基因標籤，基於轉移的存在對人HCC定群的分層的圖解箱線圖(GSE364)(平均值的t檢驗，p〈0.00001)。
[0075]圖25是說明鑑定預後人肝細胞癌的結果的基因標籤的圖示。
[0076]圖26A和26B說明HCC轉移需要MYC和Twistl兩者的表達。
[0077]圖26A是顯示產生源自小鼠Twistl/MYC HCC的細胞系並由組成型MYC或Twistl通過逆轉錄病毒轉導該細胞系並將該細胞系靜脈(IV)注射到免疫功能低下的SCID小鼠中的圖示。
[0078]圖26B是顯示當MYC和Twistl被表達時HCC細胞的靜脈注射導致肺轉移的形成的一系列數字圖像。
[0079]在更加詳細地描述本公開之前，應理解本公開不限於所描述的特定實施方案，且如此本公開當然可以變化。還應理解，本文所使用的術語僅為了描述特定實施方案的目的，而不意圖是限制性的，因為本公開的範圍將僅被所附的權利要求限制。
[0080]公開的描述
[0081]在提供值的範圍的情況下，應理解，除非上下文另外明確指明，在該範圍的上限值和下限值之間的至下限單位的十分之一的每一個中間值以及在所規定的範圍中的任何其他的規定值或中間值都包括在本公開內。這些較小範圍的上限值和下限值可以獨立地被包含在較小範圍中並且也可以被包括在本公開內，在所規定的範圍中經受任何特定排除的限值。在所規定的範圍包括限值中的一個或兩個的情況下，排除那些包括的限值中的一個或兩個的範圍也包含在本公開中。
[0082]除非另外界定，否則本文所使用的所有的技術術語和科學術語具有與本公開所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的意思。雖然與本文描述的方法和材料相似的或等同的任何方法和材料也可被用於本公開的實踐或測試，現在描述優選的方法和材料。
[0083]本說明書中引用的所有的出版物和專利如同每一種單獨的出版物或專利通過引用被併入所具體地且單獨地指示的通過引用被併入本文，且該所有的出版物和專利通過引用被併入本文來公開和描述與引用的出版物相關的方法和/或材料。任何出版物的引用是由於其公開在提交日期之前且不應解釋為承認憑藉在先公開本公開無權先於此出版物。此外，提供的出版物的日期可以不同於可能需要單獨證實的實際出版日期。
[0084]如將對本領域的技術人員明顯的， 當閱讀本公開內容時，本文描述和闡明的每一個單獨的實施方案中具有分立的(discrete)組分和特徵,這些特徵可以容易地與其他若干實施方案的任一個的特徵分開或結合，而並不偏離本公開的範圍或精神。可以按照所列舉的事件的順序或邏輯上可行的任何其他順序來實施任何所列舉的方法。
[0085]除非另外指明，否則本公開的實施方案將採用為本領域的技術內的醫學、有機化學、生物化學、分子生物學、藥物學技術，等等的技術。此類技術在文獻中被充分解釋。
[0086]必須注意到的是，如在本說明書和所附權利要求中使用的，除非在上下文中另外明確指出，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the) 」包括複數指代對象。因此，例如提及「支撐物(support)」包括多個支撐物。除非相反的意圖是明顯的，否則在本說明書中和在下面的權利要求中，將作出提及應被定義為具有以下含義的一些術語。
[0087]如本文所用的，除非另外規定，否則以下術語具有賦予它們的含義。在本公開中，「包括(comprise) 」、「包括(comprising) 」、「包含(containing) 」 和「具有(having)，，及類似術語可具有在美國專利法中賦予它們的含義並可以指「包括(includes) 」、「包括(including)」及類似的術語；當應用於本公開包括的方法和組合物時，「基本上由…組成(consisiting essentially of)」或「基本上包括(consisits essentially) 」 或類似的術語是指如本文公開的那些組合物的組合物，但其可包含另外的結構基團、組成組分或方法步驟(或如以上討論的其類似物或衍生物)。然而，與本文公開的對應組合物或方法的基本特徵和新穎特徵相比，此類另外的結構基團、組成組分或方法步驟等不會實質性影響組合物或方法的基本特徵和新穎特徵。當應用於本公開包括的方法和組合物時，「基本上由…組成」或「基本上包括」或類似的術語具有在美國專利法中賦予的含義，且該術語是開放式的，允許超出所列舉的那些的存在，只要所列舉的那些的基本特徵或新穎特徵未被超出所列舉的那些的存在改變，但排除現有技術實施方案。
[0088]在描述多種實施 方案之前，提供以下定義且除非另外指明，應使用以下定義。
[0089]定義
[0090]在描述和要求所公開的主題中，將根據以下闡述的定義使用以下術語。
[0091]如本文所用的，術語「基因」指包括對產生多肽或前體必需的控制序列和編碼序列的核酸序列。多肽可由全長編碼序列或編碼序列的任何部分來編碼。基因可整體或部分源自本領域已知的任何來源，包括植物、真菌、動物、細菌基因組或附加體(印i some )、真核的、細胞核的或質粒DNA、cDNA、病毒DNA或化學合成的DNA。基因可在編碼區或非翻譯區中包含一個或多個修飾，該一個或多個修飾可影響表達產物的生物活性或化學結構、表達速率或表達控制的方式。此類修飾包括但不限於一個或多個核苷酸的突變、插入、缺失和取代。基因可構成不間斷的編碼序列或其可包括由適當的剪接點界定的一個或多個內含子。
[0092]術語「基因表達」指核酸序列通過該過程經受成功的轉錄和翻譯如此以致可檢測水平的核苷酸序列被表達的過程。
[0093]如本文所用的，術語「基因標籤(gene signature)」指由特定細胞或組織類型表達的一組基因，其中基因一同存在、且特別地、此類基因的差異表達指示/預測某些病症。
[0094]如本文所用的， 術語「陣列」和「微陣列」指通過寡核苷酸在陣列上展示的基因的類型，且其中在陣列上展示的基因的類型取決於陣列的預期目的(例如，監測人基因的表達)。在給定陣列上的寡核苷酸可對應於相同類型、類別或組的基因。如果基因共享某些共同的特徵諸如起源物種(例如，人、小鼠、大鼠)；疾病狀態(例如，癌症)；相同的生物學過程(例如，凋亡、信號轉導、細胞周期調控、增殖、分化)，該基因則被認為是相同類型的。例如，一個陣列類型可以是「癌症陣列」，其中陣列寡核苷酸各自對應於與癌症相關的基因。
[0095]如本文所用的，術語「差異表達的」或「差異表達」指生物標誌物的表達水平的差異，其可通過測量生物標誌物的產物的表達水平分析，諸如，生物標誌物的信使RNA轉錄表達的或蛋白表達的水平的差異。在優選的實施方案中，該差異是統計顯著的。術語「表達水平的差異」指與對照中的給定生物標誌物的可測量的表達水平相比，通過樣品中信使RNA轉錄的量和/或蛋白的量測量的給定生物標誌物的可測量的表達水平的增加或減少。在一個實施方案中，可利用給定的一個生物標誌物或多個生物標誌物的表達水平與對照的給定的一個生物標誌物或多個生物標誌物的表達水平相比的比來比較差異表達，其中比不等於1.0。例如，如果第一樣品中的表達水平與第二樣品相比的比大於或小於1.0，則RNA或蛋白是差異表達的。例如，大於1、1.2,1.5,1.7、2、3、3、5、10、15、20或更大的比，或者小於1、0.8,0.6,0.4,0.2,0.1,0.05,0.001或更小的比。在另一個實施方案中，利用P-值測量差異表達。例如，當利用P-值時，當P-值小於0.1、優選地小於0.05、更優選地小於0.01、甚至更優選地小於0.005、最優選地小於0.001時,生物標誌物被鑑定為在第一樣品和第二樣品之間是差異表達的。
[0096]術語「可檢測的」指RNA表達模式通過本領域技術人員熟知的聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉錄酶-(RT)PCR、差異顯示及Northern分析的標準技術是可檢測的。術語「生物樣品」指獲自生物體(例如，人患者)或獲自生物體的部分(例如，細胞)的樣品。樣品可以是任何生物組織或流體的樣品。樣品可以是「臨床樣品」，其是源自患者的樣品。此類樣品包括但不限於唾液、 血液、血細胞(例如，白細胞)、羊水、血漿、精液、骨髓以及組織或細針活檢樣品、尿、腹膜液，及胸膜液，或來自其的細胞。生物樣品還可包括組織的切片，諸如為組織學目的而截取的冷凍切片。生物樣品還可以被稱為「患者樣品」。
[0097]該方法用於鑑定和證實表明肝細胞癌癌症是否已轉移的本發明的基因表達譜。用於鑑定基因和/或蛋白表達譜的其他方法是已知的；這些可選的方法中的任一個也可被使用。
[0098]本方法可利用測試，其中在一個追蹤中，鑑定了與正常(非癌)組織樣品相比的過量/低水平表達的那些基因。可採用陽性和陰性對照以標準化結果，包括消除在來自相同患者的正常組織中也是差異表達的那些基因和蛋白，及確認感興趣的癌症特有的基因表達
-1'TfeP曰。
[0099]根據良好確立的方法，基於總RNA，可從生物樣品產生基因表達譜(GEP)。簡言之，典型的方法包括從生物樣品分離總RNA、擴增RNA、合成cDNA、用可檢測標記物標記cDNA、使cDNA與基因組陣列諸如AFFYMETRIX U133GENECHIP.RTM.雜交、以及通過測量來自與陣列結合的可檢測標記物的信號強度確定標記的cDNA與基因組陣列的結合。
[0100]可利用市售可得的或定製的探針或寡核苷酸陣列諸如cDNA或寡核苷酸陣列分析組織樣品中的mRNA。這些陣列的使用允許同時測量成千上萬個基因的穩定狀態的mRNA水平，從而展示了用於鑑定諸如不受控制的細胞增殖的發作、抑制(arrest)或調節的效果的有力的工具。陣列上的探針與來自細胞的感興趣的核酸的雜交和/或結合可通過檢測和/或測量接收自標記的探針的信號的位置和強度被確定，或陣列上的探針與來自細胞的感興趣的核酸的雜交和/或結合可被用於檢測來自樣品的與微陣列上已知位置的核酸序列雜交的DNA/RNA序列。信號的強度與樣品組織中存在的cDNA或mRNA的數量成比例。許多陣列和技術是可用的並且有用的。用於確定樣品組織中的基因和/或蛋白表達的方法在例如美國專利號 6，271，002,6, 218，122,6, 218，114 和 6，004，755 中；和 Wang 等人，(2004)J.Clin.0ncol.22:1564-1671 (2004) ;Schena 等人，(1995) Science270:467-470 中描述；通過引用將該全部文獻併入本文。
[0101]作為本公開方法中的第一個步驟，可從組織樣品中分離並標記RNA。對樣品運行平行處理以形成基於mRNA水平的關於基因的過量表達或低水平表達的數據。每一個癌症組織樣品中的基因的過量表達或低水平表達都可與正常(非癌)樣品中的基因表達進行比較。優選地，基於雜交的微陣列探針的強度測量的倍數變化區別上調和下調的水平。約2.0倍或更大倍數的差異或小於約0.05的P-值對於作出此類區別是優選的。即，在基因被稱為在患病細胞對正常細胞中是差異表達的之前，發現患病細胞產生比正常細胞高或低至少約2倍的表達強度。一般地，倍數差異越大(或者P-值越低)，則基因越優選地用作診斷或預後工具。選擇用於本公開的基因標籤的基因具有如下的表達水平，所述表達水平導致利用臨床實驗室儀器與正常基因或非調苄基因的信號以超出背景的量可區別的信號的產生。
[0102]統計值可被用於確信區別調苄基因與非調苄基因和噪音。統計檢驗可鑑定在樣品的不同組之間最顯著地差異表達的基因。學生t_檢驗是強大的統計檢驗的實例，其可被用於發現兩組之間的顯著差異。P-值越低，基因顯示不同組之間的差異的跡象越令人信服(compelling)。然而，由於微陣列允許一次測量多於一個基因，因此可能同時要求數以萬計的統計檢驗。正因如此，不大可能僅通過偶然觀察到小的P-值，且可利用Sidak校準或類似的步驟以及隨機/排列實驗進行調整。經t-檢驗的小於約0.05的P-值是基因的表達水平顯著不同的證據。更令人信服的證據是考慮Sidak校準之後的小於約0.05的P-值。對於每組中的大量的樣品，隨機/排列檢驗(randomization/permutation test)之後的小於約0.05的P-值是顯著差異的最令人信服的證據。
[0103]可被用於選擇產生大於非調苄基因或噪音的信號的信號的基因的另一個參數是絕對信號差的測量。優選地，由差異表達的基因產生的信號與正常基因或非調苄基因的信號相差至少約20%(在絕對基礎上)。甚至更優選的是，此類基因產生與正常基因或非調節基因的表達模式至少約30%不同的表達模`式。
[0104]可利用市售可得的陣列例如AFFYMETRIX U133GENECHIP.RTM.陣列(Affymetrix, Inc.)執行差異表達分析。這些陣列具有用於固定在晶片上的整個人類基因組的探針集，並且可被用於確定測試樣品中基因的上調和下調。具有貼附於其上的能夠檢測表達產物的人類基因組DNA或探針的其它基質(substrate)，諸如從Affymetrix, Agilent Technologies, Inc.或 Illumina, Inc.的可得的基質也可被使用。目前用於本發明的優選的基因微陣列包括Affymetrix U133GENECHIP.RTM.陣列和AgilentTechnologies的基因組cDNA微陣列。用於執行基因表達分析的儀器和試劑是市售可得的。參見，例如，AFFYMETRIX GENECHIP.RTM.System。然後，將由分析獲得的表達數據輸入資料庫。
[0105]對來自相同患者的相同的樣品實施分析以產生平行數據。使用相同的晶片和樣品製劑以降低可變性。
[0106]優選地，還可同時測定被稱為「參考基因」、「對照基因」或「管家基因」的某些基因的表達作為確保表達譜的準確性的手段。參考基因是在許多組織類型(包括癌組織和正常組織)中一致表達的基因，且因此對標準化基因表達譜是有用的。參見，例如，Silvia等人，(2006) BMC Cancer6:200 ；Lee 等人，(2002) Genome Research, 12:292-297 ;Zhang 等人,(2005)BMCMo1.Biol.，6:4。與特有的基因表達譜中的基因平行地確定參考基因的表達提供了用於確定基因 表達譜的技術正常工作的進一步的保證。將關於參考基因的表達數據也輸入資料庫。在目前優選的實施方案中，以下基因被用作參考基因:ACTB、GAPD、⑶SB、RPLPO和/或TRFC。
[0107]基因表達分析鑑定了癌樣品特有的基因表達譜(GEP)，即，由癌細胞差異表達的那些基因。然後利用例如實時定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)驗證該GEP，可利用市售可得的儀器和試劑諸如從Applied Biosystems可得的儀器和試劑實施所述實時定量聚合酶鏈式反應。
[0108]如本文所用的，術語「預後」指可歸因於癌症的死亡或進展的可能性的預測，包括腫瘤疾病諸如HCC的復發、轉移擴散和藥物耐受性。本文所用的術語「預測」指患者將對藥物或一組藥物的有利地或不利地響應的可能性並且還指那些響應的程度。本發明的預測方法可在臨床上被用於通過選擇用於任何特定患者的最適合的治療形式而作出治療決策。本發明的預測方法是預測患者是否有可能有利地響應治療方案，諸如外科介入、利用給定藥物或藥物組合的化學療法、和/或輻射療法的有價值的工具。本文所用的術語「預後」還指可歸因於癌症的死亡或進展的可能性的預測，包括腫瘤疾病諸如HCC的復發、轉移擴散和藥物耐受性。
[0109]如本文所用的，術語「腫瘤」指所有腫瘤細胞生長和增殖，不論是惡性的或良性的，以及所有癌前期和癌細胞和組織。
[0110]術語「癌症」和「癌的」指或描述哺乳動物中通常以未經調節的細胞生長為特徵的
生理病症。
[0111]在本發明的上下文中，提及任何特定基因集中所列的基因的「至少一個」、「至少兩個」、「至少五個」等表示所列基因的任何一個或任何組合和所有組合。
[0112]術語「表達閾值」和「限定的表達閾值」被可交換地使用，並且指所討論的基因或基因產物的水平，在該水平之上的基因或基因產物用作不具有癌症復發的患者存活的預測標誌物。閾值由臨床研究諸如以下實施例中描述的那些實驗性地限定。可針對最大敏感度或針對最大選擇性或針對最小誤差選擇表達閾值。針對任何情況的表達閾值的確定完全在本領域技術人員的知識之內。
[0113]縮寫詞
[0114]HCC，肝細胞癌；TRE，四環素反應元件；Luc，螢光素酶；0RF，開放閱讀框；BLI，生物發光成像；LAP-tTA，肝臟特異性反式激活因子；GSEA，基因集合富集分析；H&E，蘇木精和伊紅；EMT，上皮間質轉化；MET，轉移；CTC，循環腫瘤細胞；Dox，多西環素；
[0115]hbegf:編碼人肝素結合EGF-樣生長因子的基因；aldoa:編碼醛縮酶A的基因；lgalsl:編碼半乳凝素-1的基因；plp2:編碼蛋白脂質蛋白2的基因；kifcl:編碼驅動蛋白-樣蛋白I的基因；limk2:編碼UM域激酶2的基因；SCCpdh:編碼酵母氨酸脫氫酶的基因corolc:編碼冠蛋白-1C的基因；ndrgl:編碼NDRGl (N-myc下遊調節I)的基因；uaplll:編碼UDP-N-乙醯葡糖胺焦磷酸化酶I的基因；iqgapl:編碼Ras GTP酶-活化-樣蛋白(P195)的基因；afp:編碼甲胎蛋白(不同地，AFP、a-胎蛋白、a-1-胎蛋白，甲種胎兒球蛋白)的基因；tbcldl:編碼TBClDl (Rab家族蛋白的假定的GTP酶-活化蛋白)的基因，eno2:編碼烯醇酶2的基因；lpl:編碼脂蛋白脂肪酶的基因；pygb:編碼腦糖原磷酸化酶(phosphorylase, glycogen;brain)的基因；map3k6:編碼促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶6的基因；acp2:編碼酸性磷酸酶2的基因；cyp4v2:編碼細胞色素P450，家族4，亞家族V，多肽2的基因；gstm6:編碼穀胱甘肽S-轉移酶mu6的基因。
[0116]描述
[0117]為了直接質詢(interrogate)Twistl貢獻於轉移的可能的作用和所通過的機理，產生了 Twistl/MYC-誘導的HCC的新的條件式轉基因小鼠模型。該模型已被用於確認Twistl可給予體內侵入性和轉移性表型。重要地，本公開的非轉移性和轉移性HCC的轉基因小鼠模型可被用於鑑定在患有HCC的人患者中是高度預後的基因標籤。
[0118]除非另外表明，否則本公開內容的實踐採用了本領域技能之內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學和生物化學的常規技術。此類技術在諸如以下文獻中被充分解釋:「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」，第二版(Sambrook 等人，1989) ^iOligonucleotide Synthesis」(M.J.Gait 編，1984) ;「Animal Cell Culture」(R.1.Freshney 編，1987) ;「Methods in Enzymology^(Academic Press, Inc.) ；^Handbook ofExperimental Immunology」,第4版(Weir&Blackwell編，Blackwell Science Inc., 1987)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (Miller&Calos 編，1987) ；uCurrentProtocols in Molecular Biology」(Ausubel 等人編，1987) j[I「PCR:The PolymeraseChain Reaction」, (Mullis 等人編,1994)。
[0119]—般來說，基 因表達譜分析的方法可分為兩大類:基於多核苷酸的雜交分析的方法，和基於多核苷酸的測序的方法。本領域已知的用於定量樣品中mRNA表達的最常用的方法包括northern印跡法和原位雜交(Parker&Barnes (1999) Methodsin Molecular Biology 106:247-283) ； RNAse protect ion assays(Hod, (1992)Biotechniquesl3:852-854)； 和 reverse transcription polymerase chainreaction(RT-PCR) (Weis 等人,(1992)Trends in Genetics8:263-264。可選地，可利用能夠識別特定雙鏈體的抗體，包括DNA雙鏈體，RNA雙鏈體，和DNA-RNA雜化雙鏈體或DNA-蛋白雙鏈體。基於測序的基因表達分析的代表性方法包括基因表達的系列分析(SerialAnalysisof Gene Expression, SAGE)和通過大規模平行標籤測序(MPSS)的基因表達分析。
[0120]最靈敏的且最靈活的定量方法是RT-PCR，其可被用於比較正常組織和腫瘤組織、用藥物治療或未用藥物治療的不同樣品群體中的mRNA水平，以表徵基因表達的模式、區別密切相關的mRNA、以及分析RNA結構。
[0121]第一步是從靶樣品中分離mRNA。起始材料通常是從人腫瘤或腫瘤細胞系分離的、並分別對應於正常組織或細胞系的總RNA。在本公開的實施方案中，可從具有轉移性HCC或非轉移性HCC或兩者的細胞中分離總RNA樣品。因此可從原發性腫瘤中分離RNA。如果mRMA的來源是原發性腫瘤，則可從例如冷凍的或存檔的石蠟包埋及固定的(例如，福馬林-固定的)組織樣品中提取mRNA。
[0122]用於mRNA提取的一般方法是本領域熟知的並公開於分子生物學的標準教科書中，所述標準教科書包括 Ausubel 等人，Current Protocols of Molecular Biology, Johnffiley&Sons (1997)。從石蠟包埋的組織中提取RNA的方法公開於例如Rupp&Locker (1987)Lab.1nvest.56:A67 和 DeAndres 等人，(1995) BioTechniquesl8:42-44 中。具體地，可根據生產商的說明書，利用來自商業生產商諸如Qiagen的純化試劑盒、緩衝液組合和蛋白酶執行RNA分離。例如，可利用QIAGEN RNEASY.RTM迷你柱分離來自培養的細胞的總RNA。其它市售可得的RNA分離試劑盒包括MASTERPURE.RTM。使用完整的DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE.RTM.，Madison, ffis.)和石蠟塊 RNA 分離試劑盒(Ambion, Inc.)。可利用 RNAStat-60 (Tel-Test)分離來自組織樣品的總RNA。可例如通過氯化銫密度梯度離心分離從腫瘤製備的RNA。
[0123]因為RNA不能用作PCR的模板，通過RT-PCR的基因表達譜分析的第一步是將RNA模板逆轉錄成cDNA，然後是其在PCR反應中的指數式擴增。兩個最常用的逆轉錄酶是禽成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV-RT)。通常根據表達譜分析的情況和目標，利用特異性引物、隨機六聚體或寡-dT引物引導(prime)逆轉錄步驟。例如，可利用GeneAmp RNA PCR試劑盒(Perkin Elmer, Calif., USA)按照生產商的說明書逆轉錄提取的RNA。然後，得到的cDNA可被用作後續PCR反應中的模板。 [0124]雖然PCR步驟可使用多種熱穩定的DNA-依賴的DNA聚合酶，但其通常採用具有5』-3』核酸酶活性但缺乏3』-5』校對核酸內切酶活性的Taq DNA聚合酶。因此，TAQMAN.RTMPCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5』 -核酸酶活性以水解與其靶擴增子結合的雜交探針，但具有等效的5』核酸酶活性的任何酶都可被使用。兩條寡核苷酸引物被用於產生典型的PCR反應的擴增子。第三寡核苷酸或探針被設計以檢測位於兩條PCR引物之間的核苷酸序列。探針是通過TaqDNA聚合酶不可延伸的，並被報告螢光染料和猝滅螢光染料標記。當兩種染料在探針上實際定位靠近在一起時，來自報告染料的任何雷射誘導的發射都被猝滅染料猝滅。在擴增反應過程中，Taq DNA聚合酶以模板依賴的方式裂解探針。所產生的探針片段在溶液中分離，且來自釋放的報告染料的信號免受第二螢光團的猝滅作用。針對每個合成的新的分子，釋放一個分子的報告染料，且未猝滅的報告染料的檢測提供了用於數據的定量解釋的基礎。
[0125]可利用市售可得的設備諸如例如ABI PRISM7700.RTM序列檢測系統(Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA)或 LIGHTCYCLER.RTM(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)執行 TAQMAN.RTM RT-PCR0 可在實時定量PCR裝置諸如ABI PRISM7700.RTM序列檢測系統上運行5』核酸酶程序。該系統由熱循環儀、雷射器、電耦合裝置(CCD)、照相機和計算機組成。該系統在熱循環儀上的96-孔形式中擴增樣品。在擴增過程中，雷射誘導的螢光信號通過用於所有96孔的光纖電纜被實時地收集，並在CXD中被檢測。該系統包括用於運行儀器及用於分析數據的軟體。
[0126]為了使誤差和樣品間變化的影響最小化，通常利用內標執行RT-PCR。理想的內標在不同組織間以恆定的水平表達，並不受實驗處理的影響。最頻繁用於標準化基因表達的模式的RNA是管家基因甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(GAPDH)和β -肌動蛋白的mRNA。
[0127]RT-PCR技術的較新的變化形式是實時定量PCR，其通過雙重標記的螢光探針(即，TAQMAN.RTM.探針)測量PCR產物累積。實時PCR與定量競爭性PCR和定量比較性PCR均是相容的，在定量競爭性PCR中，每個靶序列的內部競爭者(competior)被用於標準化，定量比較性PCR則利用樣品中包含的標準化基因或用於RT-PCR的管家基因。關於進一步的詳細信息，參見例如 Held 等人，(1996) Genome Research6:986-994。
[0128]利用固定的、石蠟包埋的組織作為RNA來源的、包括mRNA分離、純化、引物延伸和擴增的用於分析基因表達譜的代表性方案的步驟在各種出版的期刊文章中給出(例如:Godfrey 等人，(2000) J.Molec.Diagnostics〗:84-91 ；Specht 等人，(2001)Am.J.Pathol.158:419-29)。簡言之，代表性過程始於切割約10 y m厚的石蠟包埋的腫瘤組織樣品切片。然後提取RNA，並除去蛋白和DNA。在RNA濃度的分析之後，如果需要的話，可包括RNA修復步驟和/或擴增步驟，和利用基因特異性啟動子及隨後的RT-PCR逆轉錄RNA。
[0129]可基於存在於待擴增的基因中的內含子序列設計PCR弓丨物和探針。在該實施方案中，引物/探針設計的第一步是基因中的內含子序列的描繪(delineation)。這可通過公開可用的軟體諸如由Kent, W.J.(2002)Genome Res.12: v656_664開發的DNA BLAT軟體或由BLAST軟體、包括其變化形式進行。後續步驟按照PCR引物和探針設計的良好確立的方法。
[0130]為了避免非特異性信號，在設計引物和探針時掩蔽(mask)內含子中的重複序列是重要的。這可通過利用通過Baylor College of Medicine在線可得的Repeat Masker程序而容易地實現，所述程序針對重複元件的文庫篩選DNA序列並返回其中重複元件被掩蔽的查詢序列。然後，掩蔽的內含子序列可被用於利用諸如以下的任何市售的或另外公開可得的引物/探針設計包設計引物和探針序列:Primer Express.RTM(Applied Biosystems)；MGB assay-by-design(Applied Biosystems) ；Primer3(Rozen&Skaletsky(2000)於:Krawetz&Misener (編)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods inMolecular Biology.Humana Press, Totowa, N.J.,第 365-386 頁)。
[0131]在PCR引物設計中考慮的最重要的因素包括引物長度、解鏈溫度(Tm)、和G/C含量、特異性、互補引物序列和3』-端序列。一般來說，最優的PCR引物通常的長度是17-30個鹼基，並含有約20%-80%，諸如例如約50%-60%的G+C鹼基。在50°C和80°C之間的Tm，例如約50°C至70°C的Tm通常是優選的。
[0132]關於PCR引物和探針設計的進一步的指南，參見例如Dieffenbach等人，「General Concepts for PCR Primer Design」 於:PCR Primer, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,1995,第 133-155 頁；Innis 和 Gelfand, 「Optimization of PCRs」 於:PCR Protocols,A Guide toMethods and Applications, CRC Press, London, 1994,第 5-11 頁；和 Plasterer, T.N.Primerselect: Primer and probe design.Methods Mol.Biol.70:520-527 (1997),在此通過引用將其全部公開內容清楚地併入。
[0133]還可利用根據本公開的方法的微陣列技術鑑定或確認差異基因表達。因此，可利用微陣列技術在新鮮的或石蠟包埋的腫瘤組織中測量轉移性或非轉移性HCC-相關的基因的表達譜。在這些方法中，感興趣的多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)在微晶片基質上被鍍層或排列。然後將排列的序列與來自感興趣的細胞或組織的特異性DNA探針雜交。正如在RT-PCR方法中，mRNA的來源通常是從人腫瘤或腫瘤細胞系以及對應的正常組織或細胞系的總RNA中分離的。因此，可從多種原發性腫瘤或腫瘤細胞系中分離RNA。如果mRMA的來源是原發性腫瘤，則可從例如日常臨床實踐中常規製備並保存的冷凍的或存檔的石蠟包埋並固定的(例如，福馬林-固定的)組織樣品中提取mRNA。
[0134]在微陣列技術的特定實施方案中，但不預期限制地，cDNA克隆的PCR擴增的插入片段被應用於密集陣列中的基質。優選地，至少10，OOO個核苷酸序列可被應用於基質。以10，000個兀件每個微晶片被固定在微晶片上的微陣列基因適於在嚴格條件下雜交。突光標記的CDNA探針可通過螢光核苷酸的摻入、通過從感興趣的組織中提取的RNA的逆轉錄而產生。應用於晶片的標記的cDNA探針與陣列上DNA的每個點特異性雜交。在嚴格洗滌以除去非特異性結合的探針之後，通過共聚焦雷射顯微術或通過另外的檢測方法諸如CCD照相機掃描晶片。每個排列的元件的雜交的定量允許評價對應mRNA的豐度。利用雙色螢光分別標記的、從兩種來源的RNA產生的cDNA探針成對地與陣列雜交。因此，來自對應於每個特定基因的兩種來源的轉錄物的相對豐度同時被確定。小型化規模的雜交給予了對大量基因的表達模式的方便且快速的評價。此類方法已顯示具有檢測其以幾個拷貝每細胞表達的稀少轉錄物，以及可重現地檢測表達水平中至少約兩倍差異所需的靈敏度(Schena等人，(1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:106-149)。可通過市售可得的設備，按照生產商的方案諸如通過利用AfTymetrixGenChip技術或Incyte的微陣列技術執行微陣列分析。
[0135]Twistl誘導體內HCC侵入和轉移
[0136]為了直接質詢Twistl是否在HCC的侵入和轉移中起作用，四環素可誘導的系統(Tet系統)被用於產生轉基因小鼠，所述轉基因小鼠以組織特異性的方式同等地調節小鼠 Twistl 和螢火蟲螢光素酶(Luc) (Kistner 等人,(1996) Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.93:10933-10938)。Tet系統被選擇以僅在成年宿主中模擬HCC進展以避免由於在發育過程中Twistl的組成型表達的可能的致死性。將TRE-MYC轉基因小鼠與具有或不具有 Twist 1/Luc (TRE-Twistl)的 LAP_tTA27 交配。在 LAP-tTA/TRE-MYC/TRE-Twist 小鼠中，MYC和Twistl均僅在除去多西環素時才表達，如圖1A中所示的。[0137]LAPtTA/TRE-MYC (MYC)小鼠死於約13.2周的中值腫瘤潛伏期的HCC，如先前所描述的(Beer 等人，(2004)PLoSBiol2, e332 ;Shachaf 等人，(2004)Nature431:1112-1117)。然而，LAP-tTA/TRE-MYC/TRE-Twist I (MYC/Twi st I)小鼠形成約19.1周的腫瘤發作的衰減潛伏期的HCC (p〈0.0001)。LAPtTA/TRE-Twi st I (Twistl)小鼠在長達18個月的觀察期間內未死於腫瘤，它們也未呈現大體病理學或微觀病理學(圖1C和1D)。因此,產生MYC/Twistl-誘導的HCC的條件式小鼠模型，並且發現Twistl適當地延長了腫瘤發作的潛伏期。
[0138]為了檢查Twistl是否誘導轉移性HCC，比較了 MYC和MYC/Twi st I小鼠的轉移的大體或微觀跡象的證據。MYC小鼠未呈現轉移的跡象，如圖1B和IC中所示的。然而，相比之下，MYC/Twistl小鼠則呈現高頻率的轉移(52%)，包括淋巴結、脾和腹膜(38%)以及肺中的大轉移(macrometastase),如圖1B和IC中所示的。原發性和轉移性病灶的大體病理學和微觀病理學是相同的(圖1D)。同樣，來自MYC/Twistl病灶的原發性和轉移性腫瘤表達類似水平的MYC蛋白(圖1D)。類似地，在源自MYC-誘導的HCC腫瘤的細胞系中或在來自人HCC的細胞系中的異位的Twistl過量表達呈現增加的體外能動性和侵入和至多個器官部位，包括腎和肺的增加的體內轉移(圖11)。因此，Twistl與轉基因小鼠模型中的及當在鼠和源自人HCC的細胞系中過量表達時的轉移的顯著增加相關。
[0139]Twistl 已被認為是 ENT 的調苄基因(Lee 等人，(2006)Clin.Cancer.Res.12:5369-5376 ;Ansieau 等人，0ncogene29:3173-3184)且 E-鈣粘蛋白和 3 -連環蛋白兩者的連接(junctional)表達被保持在MYC/Twi st I原發性和轉移性HCC中，如圖1E中所示的。[0140]類似地，比較MYC對MYC/Twistl原發性HCC時，許多間質標誌物(NCad、FSp1、Fn、Vm、SMA、FoxC2、MMP2、MMP3、MMP9、MT1-MMP)(圖 17A)、上皮標誌物(ECad、Ck8、Ckl8、Plako2、Cx32)(圖 17B)和 EMT-誘導因子(Snaill、ZebU SIPU Snail2)(圖 17C)是未改變的。然而，在轉移中，表明 EMT 的這些標誌物(FoxC2、MMP9、Ck8、Ckl8、0cc、Plako2、Cx32、SIPl)中的許多存在改變。另外，MYC/Twistl原發性和轉移性病灶的微陣列表達譜與如由來自MeSH術語途徑分析(MeSH term pathway analysis)的基因集合富集分析(GSEA預排序)所確定的EMT—致(參見以下和表2)。因此，雖然不存在MYC/Twistl-誘導的原發性HCC，但是由Twistl表達誘導的轉移確實呈現EMT的跡象。
[0141]在轉基因失活時Twistl-誘導的HCC轉移是可逆的
[0142]血行轉移(hematogenous metastasis)需要腫瘤細胞內滲到血管中，其可檢測為循環腫瘤細胞(CTC)(Chaffer&Weinberg(201I)Science331:1559-1564 ；Maheswaran&Haber (2010) Curr.0pin.Genet.Dev.20:96-99)。通過針對 Luc 或人MYC 轉基因(hMYC)的qRT-PCR分析測量MYC對MYC/Twistl轉基因小鼠的外周血中的CTC。與MYC小鼠相比，來自MYC/Twistl小鼠外周血的Luc和hMYC分別增加2000倍和19倍(p=0.0119，圖2A、圖2B和圖17A-17C)。因此，Twistl引起進入血流中的可促進轉移的明顯增加的內滲。
[0143]MYC和Twistl表達的抑制誘導Luc的170倍下降(p=0.0121)、hMYC的165倍下降(p=0.0159)的CTC的顯著下降(圖2A和2B)。通過微型CT的成像說明在轉基因失活之後，原發性和轉移性HCC經歷直至10個月的完全的且持續的腫瘤消退(n=4，圖2C)。致癌基因的再活化與原發性和轉移性腫瘤的快速腫瘤再度出現相關(n=4，圖2D)，類似於先前的描述(Shachaf 等人，(2004) Nature431:1112-1117)。因此，MYC 和 Twistl 誘導原發性和轉移性HCC腫瘤兩者的可逆的致瘤表型。
[0144]MYC/TwistlHCC可被用於模擬人肝癌
[0145]單基因Twistl的加入足以引起非轉移性MYC-誘導的HCC腫瘤立刻轉移。因此，本公開的非轉移性HCC對轉移性HCC的轉基因小鼠模型提供了鑑定預測人HCC的轉移和差的結果的基因的手段。
[0146]對MYC 原發性 HCC(MYC HCC, n=2)、MYC/Twistl 原發性 HCC(MYC/TwistlHCC,n=6)、MYC/Twistl轉移性病灶(MYC/TwistIMET，n=8)、和正常肝臟(正常，n=2)執行表達微陣列。然後將數據分組並聚類(圖3 ;AN0VA，p=0.05，FC>2，與正常比較)。通過使用GSEA排序的列表分析，比較了小鼠和人HCC基因表達並發現MYC/Twistl原發性和轉移性腫瘤高度類似於與MYC過量表達和不良預後相關的人HCC腫瘤(Boyault等人，(2007)H印atology45:42-52 ;Hoshida 等人，(2009) Cancer Res.69:7385-7392)(圖 4)。因此，本公開的MYC和MYC /Twistl轉基因模型具有對應於人HCC的基因表達程序。
[0147]還鑑定了 MYC/Twistl原發性HCC或MYC/TwistIMet中特有地並統計顯著地表達的基因。通過將這些結果與來自Cytoscape中的MeSH術語途徑分析的基因集合比較，這些基因與EMT (p=0.0243)、轉移(p=0.0747)和侵入(p=0.0973)相關，如表2和表3中所示的。因此，MYC/Twistl誘導的HCC的小鼠模型的分析鑑定了與侵入和轉移相關的基因。
[0148]來自轉移性小鼠HCC的基因標籤在人患者中的預後
[0149]檢查本公開的MYC/Twistl轉基因動物模型以確定其是否可被用於鑑定可預測患有HCC的患者中的臨床結果的基因。將來自非轉移性的MYC-誘導的HCC原發性腫瘤的微陣列數據與MYC/Twi st I誘導的HCC原發性腫瘤和MYC/Twi st I誘導的轉移性HCC比較。通過這些比較，鑑定了僅在MYC HCC(154個基因)、MYC/TwiStlHCC(3948個基因)或MYC/Twistl MET(197個基因)中差異調節的基因或在以下組之間重疊表達的基因:MYC/TwistlHCC+MYC/Twist MET (在此被稱為 MYC/TwistlHCC+MET ;592 個基因)；MYCHCC+MYC/TwistlHCC(189 個基因)；MYC HCC+MYC/TwistlMET (18 個基因)，及 MYC HCC+MYC/Twist 1HCC+MYC/TwistIMET (99 個基因；圖 3C)。
[0150]通過在具有微陣列和包括總共273名患者的存活數據的人HCC的4個在先研究的背景下分析它們，針對它們是否與臨床結果相關評價了這些標籤。檢驗了這些基因集合的成員是否偏向於表達水平與良好或不良預後有關的基因，如通過它們在Cox回歸中的Z-分數所評估的。MYC/Twistl HCC+MET基因標籤與人HCC患者的差的存活最密切相關(對於215 個上調基因，p〈0.00001，NES=L 749，FDR=0.0132 ;對於 84 個下調基因，p〈0.00001，NES=-2.018，FDR=6.33E-04)(表 2)。 [0151]Z-分數分析被用於比較這些新的標籤與被報導對HCC轉移和存活預後的五個先前公布的基因標籤(Coulouarn等人，(2009) 0ncogene28:3526-3536 ；Coulouarn 等人，(2008)Hepatology47:2059-2067 ；Kapos1-Novak 等人，(2006) J.Clin.1nvest.116:1582-1595 ；Roessler 等人，Cancer Res.70:10202-10212 ；Ye 等人，(2003)Nat.Med.9:416-423)(表2和圖18和圖19)。在人HCC定群的存活預測時，MYC/TwistlHCC+MET標籤與先前限定的人HCC轉移標籤表現同樣好或比先前限定的人HCC轉移標籤好(Coulouarn 等人，(2008) Hepatology47:2059-2067)。
[0152]研究了使患有人HCC的患者的存活分層(stratify)的MYC/TwistlHCC+MET滑鼠籤的基因的表達。為了該分析，利用個體數據集是有必要的，因為隨訪時間段和排除的存活標準使所有定群分層在一起。Kaplan-Meier分析表明，具有本公開的MYC/Twi stlHCC+MET標籤基因的較聞表達的患者具有比在先如公布的91個HCC樣品的定群中具有標籤基因的較低表達的患者差的總存活(Lee等人，(2004)Nat.Genet.36:1306-1311)。
[0153]與低標籤患者的70個月的中值存活相對，高MYC/Twi stlHCC+MET標籤患者的中值總存活是10個月(圖6A和圖6B ;對數秩p=0.002 ;圖20 ;表4)。Kaplan-Meier分析確認，17基因-滑鼠籤對386名患者的獨立定群中的患者的不良預後是高度預測性的(Roessler等人，Cancer Res.70:10202-10212)，與非標籤匹配的患者的未限定的(沒有達到的)中值存活相對，高MYC/Twi stlHCC+MET標籤患者的中值總存活是42.2個月(圖6B ;對數秩P=0.0001)。重要地，利用第三獨立的人HCC定群(Ye等人，(2003) Nat.Med.9:416-423)確定了鼠MYC/Twi stlHCC+MET標籤可基於原發性腫瘤的表達譜預測人HCC的轉移的發生率(圖6C，t-檢驗方法，p〈0.00001)。因此，通過由單獨的Twistl在體內轉基因小鼠模型中誘導的基因表達變化的分析，產生了預測患有HCC的人患者的轉移和總存活的標籤。
[0154]對人HCC轉移和總存活預後的20-基因標籤的鑑定
[0155]為了鑑定我們的MYC/Twi st 1HCC+MET標籤中的與HCC的惡性進展相關的最關鍵的基因，將該標籤中的368個上調基因與五個先前表徵的本公開的滑鼠籤先前已與其比較的人HCC轉移標籤中包括的591個上調基因進行比較(Coulouarn等人，(2009)0ncogene28:3526-3536 ；Coulouarn 等人，(2008)Hepatology47:2059-2067 ;Kapos1-Novak 等人，(2006)J.Clin.1nvest.116:1582-1595 ;Roessler 等人，CancerRes.70:10202-10212 ;Ye 等人，(2003)Nat.Med.9:416-423)(在下文中，該 591 個基因被稱為人HCC總轉移上調標籤)。這種比較意在查明本公開的高度預測性小滑鼠籤中對HCC轉移是如此重要以致它們在由不同的遺傳畸變(genetic aberration)驅動的至少一個其他轉移標籤中被上調的任何基因。當將MYC/TwistlHCC+MET標籤基因列表與人HCC總轉移上調標籤的基因列表比較時，顯示了 17個此類上調基因(圖7、18和19 ;表2)。這些上調基因是包括本公開的基因標籤的 hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
[0156]檢查了該17個鑑定的上調基因的集合預測患者結果和疾病進展的能力。通過Z-分數存活分析，17-基因轉移標籤比來自本公開的或先前報導的小鼠轉基因模型的其它個體或編譯的HCC標籤具有對HCC總存活大的預後能力(表2 ；p=0.0079，NES=L 774，FDR=0.0125)。在Z-分數存活分析中，17-基因標籤也比其所源自的MYC/Twist 1HCC+MET標籤表現的好(表2)。[0157]本公開的17-基因標籤基於來自如在(Ye等人，(2003)Nat.Med.9:416-423 ；Lee等人，(2004)Nat.Genet.36:1306-1311)中所描述的兩個定群的存活分層人HCC患者，如通過Kaplan-Meier分析評估的。17-基因標籤與人HCC患者中差的存活相關(圖8A ;對數秩P=0.004，未達到中值存活；圖20 ;表4)。利用獨立的人HCC定群進一步確認了結果(Roessler等人，Cancer Res.70:10202-10212)，如與未達到的非標籤匹配的患者相對，MYC/TwistlHCC+MET標籤患者的中值存活是32.6個月(圖8B，對數秩p=0.0012)。而且，17-基因標籤還能夠預測原發性人HCC的轉移能力(圖8C，t-檢驗方法，p〈0.00001)。因此，17-基因標籤具有以人患者中的轉移和總存活的形式預測疾病進展的能力。
[0158]與包括以下的其他臨床分期方法相比並與包括以下的其他臨床分期方法結合，通過單變量和多變量Cox回歸分析檢查了我們的17-基因標籤對人HCC中的總存活/臨床結果的預後倉泛力:Cancer of the Liver Italian Program(CLIP) > Classification ofMalignant Tumors (TNM)和 Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) (Pons 等人，(2005)HPB (Oxford) 7:35-41)。在單變量Cox回歸分析中，17-基因標籤比性別、年齡、AFP、硬化和腫瘤大小的臨床變量表現的好(圖4D左側；p=0.001, HR2.11)。在單變量分析中，17-基因標籤確實與 CLIP (ρ=0.003，HR2.29)、ΤΝΜ(ρ=0.001，HR2.21)和 BCLC (ρ〈0.001，HR3.02)的臨床分期方法可比較地表現。通過多變量Cox回歸，發現17-基因標籤甚至當與CLIP、TMN和BCLC分期系統結合時也是具有顯著能力的獨立的預後因素。表2顯示了多變量分析，顯示17-基因標籤獨立預後人HCC-特定存活中的總存活(HR2.27，p=0.006)，在與全部三個已知分期系統結合時，因此增加了其個體的預後能力(--Μ、CLIP和BCLC)。顯示的是多變量模型中每個變量的HR和95%CI，以及P-值(對數似然)。
[0159]表1
[0160]
【權利要求】
1.一種對患者的肝細胞癌預後的基因標籤，其中來自所述基因標籤的差異基因表達預測患有轉移性肝細胞癌的患者的存活，且其中所述基因標籤包括選自由以下組成的組的多個基因:hbegf、aldoa、lgalsl、plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
2.如權利要求1所述的對患者的肝細胞癌預後的基因標籤，其中所述基因標籤基本上由以下基因組成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
3.如權利要求1所述的對患者的肝細胞癌預後的基因標籤，其中所述基因標籤由以下基因組成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
4.如權利要求1所述的對患者的肝細胞癌預後的基因標籤，其中所述基因標籤由以下基因組成:hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
5.一種確定患者的肝細胞癌的轉移狀態的方法，所述方法包括:從來自患有肝細胞癌的受試者的癌樣品獲得第一差異基因表達譜，其中所述第一差異基因表達譜包括選自由以下組成的組的多個基因的表達信息的數據集:hbegf、aldoa、IgalsU plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uapll1、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6 ;及創建概述通過所述第一基因表達分析獲得的標準化數據的報告，其中所述報告包括肝癌的轉移狀態的確定。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述患者的所述肝細胞癌的所述轉移狀態提供了所述患者中的所述癌的發展的預後。
7.如權利要求5所述的方法，其中所述第一基因標籤基本上由以下基因組成:hbegf、aldoa、IgalsKplp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp>tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
8.如權利要求5所述的方法，其中所述第一基因標籤由以下基因組成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6。
9.如權利要求5所述的方法，其中所述第一基因標籤由以下基因組成:hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb 和 map3k6。
10.如權利要求5所述的方法，所述方法包括以下步驟: (i)從懷疑患有轉移性肝細胞癌的患者獲得第一生物樣品； (?)從所述生物樣品中分離RNA ;以及 (iii)確定所述第一基因標籤的表達的差異水平。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述第一基因標籤包括基因hbegf、aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2和gstm6,其中如果當與非轉移性組織中的水平相比時所述基因標籤的基因 hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl>uaplll、iqgapl、afp、tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6 的表達的差異水平提高且基因 acp2、cyp4v2和gstm6的表達的差異水平降低，則所述水平指示所述癌的轉移，從而提供所述患者中的所述癌的發展的預後。
12.如權利要求10所述的方法，所述方法還包括以下步驟: 從未患有肝細胞癌或懷疑未患有發展的轉移性肝細胞癌的受試者獲得第二生物樣品; 從所述生物樣品中分離RNA ； 石角定包括基因 hbegf> aldoa、IgalsK plp2、kifcl、limk2、sccpdh、corolc、ndrgl、uaplll、iqgapl、afp> tbcldl、eno2、lpl、pygb、map3k6、acp2、cyp4v2 和 gstm6 的第二基因標籤的差異表達的水平； 比較所述第一基因標籤和所述第二基因標籤的表達的差異水平，其中來自所述第一基因標籤和所述第二基因標籤的表達的相對差異水平指示懷疑患有轉移性肝細胞癌的患者中的轉移性肝細胞癌細胞的存在或不存在；以及 創建概述通過所述基因表達分析獲得的標準化數據的報告，其中所述報告包括患有肝細胞癌的所述患者的長期存活的可能性的預測。
13.如權利要求12所述的方法，其中所述第一和所述第二生物樣品來自相同的患者，從而指示所述患者中的所述肝細胞癌的進展。
14.如權利要求12所述的方法，其中確定所述基因標籤的所述基因的表達的差異水平的步驟包括從所述第一生物樣品和所述第二生物樣品中分離RNA ;以及檢測源自所述基因標籤的所述基因的RNA的水平。
15.一種誘導動物或人受試者中的肝細胞癌的消退的方法，所述方法包括降低Twistl基因的表達水平或其產物的量，從`而降低所述癌的轉移的水平。
【文檔編號】C12N15/11GK103687963SQ201280034774
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年7月11日 優先權日:2011年7月12日
【發明者】迪安·W·費爾舍, 福·特朗, 斯泰西·亞當, 大衛·I·貝勞文 申請人:小利蘭·史丹福大學理事會