一種將抗根結線蟲的rna幹擾基因導入黃瓜的方法
2023-10-05 02:19:14 1
專利名稱：一種將抗根結線蟲的rna幹擾基因導入黃瓜的方法
技術領域：
本發明涉及黃瓜轉基因技術，特別是一種獲得表達幹擾線蟲MiMpkl基因的RNA幹擾片段的黃瓜轉基因方法。
背景技術：
近些年隨著保護地栽培大面積推廣，加之重茬嚴重，根結線蟲對黃瓜生產的危害日趨嚴峻。而現有資源中缺乏抗南方根結線蟲的種質資源，目前利用傳統育種手段尚無法解決此問題，因此需通過轉基因技術引入新的抗原，拓寬栽培黃瓜的遺傳基礎。在專利號為ZL200810118726.X，名稱為「一種RNA幹擾載體及其應用」的專利中公開了以南方根結線蟲的MiMpkl基因為靶標構建的MiMpkl RNA幹擾載體，並將該載體轉入蕃茄中，使蕃茄獲得了較好的對線蟲的抗性,體外飼餵實驗也證明該RNA幹擾載體能夠有效幹預線蟲體內的一個信號轉導酶MARK蛋白的合成，阻礙線蟲的生長和發育，從而達到防治線蟲的目的。可以預知，將載有該基因的RNA幹擾載體轉入黃瓜中獲得抗線蟲的轉基因黃瓜品系，將是一種緩解目前黃瓜受線蟲危害的有效方法，但是為順利實現此目的，須藉助高效的轉基因體系。雖然在蕃茄，大豆等作物上，都有轉基因轉化率高的報導，同時未有報導將幹擾載體轉化於黃瓜中，通過沉默線蟲自身基因達到防治線蟲的目的。黃瓜的遺傳轉化研究始於1986年，但在黃瓜抗線蟲的遺傳轉化方面的研究仍然很少，於玉梅(2008)從被根結線蟲侵染的黃瓜根系cDNA中擴增出根結線蟲的保守基因16D10，構建植物表達載體，通過花粉管通道法將16D10轉入黃瓜，得到的抗性苗經PCR檢測，I株擴增出特異條帶。朱妍妍(2008)採用相同的方法擴增得到基因16D10，構建了抗根結線蟲的RNAi植物表達載體，通過根癌農桿菌介導法和花粉管通道法轉化黃瓜，但最終未得到轉基因植株。魏愛民等(2006)用農桿菌介導法將抗蟲基因eqkam導入黃瓜，僅對抗蟲基因轉化黃瓜的影響因素進行了研究說明，未說明是否獲得再生植株，後其又採用花粉管通道法將抗蟲基因eqkam轉化黃瓜，經卡那黴素抗性篩選，獲得了再生植株，但轉化率僅為0. 14%。在植物遺傳轉化研究中，常通過使用乙醯丁香酮(AS)來輔助農桿菌轉化，因為AS是一種酚類物質，可誘導農桿菌內Ti或Ri質粒DNA上的Vir區基因的活化和表達，促進農桿菌T-DNA向宿主細胞核轉移，從而提高轉化效率。AS尤其對單子葉植物的遺傳轉化非常必要，而雙子葉植物由於在外植體受傷後會自行合成酚類物質，因此不必外加酚類物質就可以使Vir區基因活化，但實驗證明加入適量AS依然可以提高轉化率。AS被廣泛應用於目前的植物轉基因技術中，在黃瓜的遺傳轉化中利用AS輔助轉化的報導也較多，將IOOmg/LAS添加到共培養培養基中，再生頻率高達83. 3 %，但對轉化效率的影響並不大，有待進一步改進。因此隨著對雙子葉植物轉基因研究的深入和技術的改進，迫切需要開發輔助轉化效果更明顯、對外植體傷害更小的試劑。以往的研究曾發現抗氧化劑對促進植物外植體分化、緩解褐化有較好的作用，近些年硫辛酸(lipoic acid，下文簡寫為LA)作為一種超強型抗氧化劑被運用到植物組織培養研究中，並獲得了較好的試驗效果。而目前LA也被應用到大豆和番茄的遺傳轉化研究中，結果顯示轉化效率分別從0. 6%和29. 8%顯著增加到
3.7%和87%，並可顯著降低大豆和番茄的假陽性率；小麥的轉化率從2. 8%提高到5. 7% ;在棉花上，可以使草甘膦抗性芽率由41. 4%增長到61. 2%。而目前在黃瓜的遺傳轉化中利用AS輔助轉化的報導較多，將100mg/L AS添加到共培養培養基中，再生頻率高達83. 3%。
發明內容
本發明根據上述領域的需求和空白，提供一種改進的黃瓜遺傳轉化體系，使黃瓜的遺傳轉化率顯著提高，高效地獲得了能夠表達幹擾線蟲MiMpkl基因的轉基因黃瓜，該遺傳轉化體系能減少在遺傳轉化篩選過程中所耗費的時間和人力成本，提高遺傳轉化的工作效率。同時，通過黃瓜表達MiMpkl基因，可有效的沉默根結線蟲的MiMpkl基因，影響其正常發育，減少對黃瓜的危害。本發明的方案如下 一種將抗根結線蟲的RNA幹擾基因導入黃瓜的方法，包括以下步驟(I)預培養黃瓜外植體子葉或子葉節；(2)準備用於浸染的含有外源基因載體的農桿菌液；(3)將所述外植體置於所述農桿菌懸液中浸染15 20mins ；(4)浸染後的外植體接種於共培養培養基中，25°C黑暗條件下培養2 3d ; (5)共培養後的外植體置於初步選擇培養基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮黴素；(6)初步篩選出的外植體轉入到再次選擇培養基中再次篩選I周，篩選抗生素為
潮黴素；(7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0. 5mg/L GA的BPM培養基中伸長
培養；(8)生根培養獲得再生植株；其特徵在於所述含有外源基因載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，⑵中的農桿菌懸液中和共培養培養基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙醯丁香酮50mg/L。所述外植體為子葉，所共培養培養基為MS+2. Omg/L BA+1. 0mg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉節，所共培養培養基為MS+0. 5mg/L BA+2. 0mg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/l AS pH = 5. 4。所述外植體為子葉，(5)和(6)中用於篩選的潮黴素的濃度分別為10mg/L，25mg/L0所述外植體為子葉節，(5)和(6)中用於篩選的潮黴素的濃度分別為7mg/L，15mg/L0所述外植體為子葉，所述初步選擇培養基為MS+2. Omg/L BA+1. Omg/L ABA+10mg/L Hyg+400mg/L cef,pH= 5. 4,再次選擇培養基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4。
所述外植體為子葉節，所述初步選擇培養基為MS+0. 5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養基為MS+15mg/L Hyg+400mg/lcef pH = 5. 4。所述(I)中，所述預培養指外植體為子葉，經消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養基中生長I 2天後，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節，經消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養基中，種子萌發後轉入光下培養4 5天，當子葉呈直立狀態時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，並在預培養基PM上培養2天得到子葉節外植體。本發明為了獲得抗線蟲轉基因黃瓜，以專利號為ZL200810118726.X，名稱為「一種RNA幹擾載體及其應用」中公開的RNA幹擾載體pCAGC1341-dsMiMpkl為外源基因載體轉化黃瓜，希望獲得抗線蟲的轉基因黃瓜品種。鑑於目前報導的黃瓜遺傳轉化方法不夠高效難以獲得轉基因再生植株的現狀，發明人對於現有的黃瓜轉基因方法進行了改進。在外源基因載體轉化到外植體的階段，本發明在浸染菌液與共培養培養基中都加硫辛酸(LA)和乙醯丁香酮(AS),顯著提高了獲得轉化效率,轉化效率(％ ) = PCR或southern blot檢測為的陽性植株數/再生植株總數X 100%。本發明的實驗數據表明，在適當濃度的如50 100mg/L LA搭配適當濃度的如50mg/L AS的情況下，二者共同作用於農桿菌轉化時，抗性芽率相比對照或者單獨使用LA或AS時都有顯著提高，且Southern-blot檢驗下的轉化效率也有所增長，證明LA與AS協同作用更有利於黃瓜的遺傳轉化，其中LA可緩解自由基對細胞的傷害、減緩組織的氧化過程，而AS促進Vir區基因的活化，兩者共同作用下使轉化率得以提高。但是，本發明的實驗數據同時也表明，LA與AS之間的合作協調作用僅限於非常小的濃度範圍內，超過某些閾值，可能二者之間的作用存在相互拮抗，因為在一些情況下，如表3和表4所示，搭配使用的結果出人意料地比單獨使用AS或LA都低。本發明還提供了含有AS和LA的共培養培養基的配方，以使本發明的遺傳轉化體系得到整體上的優化和改進。本發明還研究了在對轉化體初步篩選及再次篩選中，採用潮黴素進行篩選的方案，現有技術中一般都採用從一而終的高濃度潮黴素篩選抗性轉化體。本發明的研究發現，採用梯度篩選即先低濃度後高濃度的潮黴素對初步轉化體進行選擇，與對照相比，能夠顯著降低假陽性率，提高獲得陽性再生植株的比例。本研究中發現，不同的外植體對於潮黴素的耐受力不相同，因此，不同的外植體採用不同的梯度設置，如以子葉為外植體時，潮黴素篩選梯度為10mg/L, 25mg/L。如以子葉節為外植體時,潮黴素篩選梯度為7mg/L, 15mg/L。
圖I黃瓜子葉節的遺傳轉化過程I :預培養；2 :選擇培養；3 :抗性植株；4 :對照。圖2不同選擇壓對子葉節遺傳轉化的影響每組柱形圖從左到右依次為對照、15mg/L Hyg篩選、梯度Hyg篩選。圖3黃瓜抗性植株的PCR檢測圖4黃瓜抗性植株的southern blot檢測圖5黃瓜MiMPKl轉化植株的根結線蟲田間接種試驗I對照；2黃瓜轉化植株圖6黃瓜轉基因植株田間接種根結線蟲鑑定結果縱坐標表示平均根結數(根結數/株)、
圖7不同LA/AS處理對黃瓜子葉節再生頻率的影響左縱坐標表示再生頻率(％ )，右縱坐標表示再生芽數/外植體(個)圖8PCR驗證黃瓜子葉節再生植株轉化效率
具體實施例方式以下通過實驗具體描述本發明的技術方案，但以下實驗不應被解釋為對本發明的限制。試驗材料本試驗所用的試驗材料是新泰密刺黃瓜，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所黃瓜育種課題組提供。根癌農桿菌菌株為EHA105。質粒載體為pCAGC1341_dsMiMpkl，含有潮黴素抗性基因和線蟲基因MiMPKl，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所植物病理實驗室惠贈。以上生物材料，本實驗室亦有保存，可自申請日起二十年內向公眾發放用於驗證實驗。其它試劑MS基本培養基(M5519)、硫辛酸(LA)和乙醯丁香酮(AS)購自Sigma (上海)生物技術公司，6-BA、ABA、IAA、AgN03、頭孢黴素(Cef)、卡納黴素(Km)、利福平(Rif)、潮黴素(Hyg)、NaCl、酵母粉、蛋白腖均購自北京拜爾迪生物技術公司。所配製的MS固體(液體)培養基和LB固體(液體)培養基高壓滅菌後常溫保存備用；試驗所需試劑配製為母液後用一次性過濾器(0. 22um)過濾除菌，-20°C保存備用，培養基配方如表I所不。表I本發明最終確定的黃瓜遺傳轉化用優化培養基
權利要求
1.一種將抗根結線蟲的RNA幹擾基因導入黃瓜的方法，包括以下步驟 (1)預培養黃瓜外植體子葉或子葉節； (2)準備用於浸染的含有外源基因載體的農桿菌液； (3)將所述外植體置於所述農桿菌懸液中浸染15 20mins； (4)浸染後的外植體接種於共培養培養基中，25°C黑暗條件下培養2 3d ; (5)共培養後的外植體置於初步選擇培養基中初步篩選2 3周，篩選抗生素為潮黴素； (6)初步篩選出的外植體轉入到再次選擇培養基中再次篩選I周，篩選抗生素為潮黴素； (7)再次篩選出的保持綠色的外植體接種到添加0.5mg/L GA的BPM培養基中伸長培養; (8)生根培養獲得再生植株； 其特徵在於所述含有外源基因載體為pCAGC1341-dsMiMpkl，(2)中的農桿菌懸液中和共培養培養基中含有硫辛酸50 100mg/L，乙醯丁香酮50mg/L。
2.根據權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，所共培養培養基為MS+2.Omg/LBA+1. Omg/L ABA+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
3.根據權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節，所共培養培養基為MS+0.5mg/LBA+2. Omg/L AgN03+50 lOOmg/L LA+50mg/L AS pH = 5. 4。
4.根據權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉，(5)和(6)中用於篩選的潮黴素的濃度分別為10mg/L, 25mg/L。
5.根據權利要求I所述的方法，所述外植體為子葉節，(5)和(6)中用於篩選的潮黴素的濃度分別為7mg/L, 15mg/L。
6.根據權利要求4所述的方法，所述初步選擇培養基為MS+2.Omg/L BA+1. Omg/LABA+1 Omg/L Hyg+400mg/L cef, pH = 5. 4,再次選擇培養基為MS+25mg/L Hyg+400mg/L cefpH = 5. 4。
7.根據權利要求5所述的方法，所述初步選擇培養基為MS+0.5mg/L BA+2. Omg/LAgN03+7mg/L Hyg+400mg/L cef pH = 5. 4,再次選擇培養基為MS+15mg/L Hyg+400mg/Lcef pH = 5. 4。
8.根據權利要求I 7任一所述的方法，(I)中所述預培養指外植體為子葉，經消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養基中生長I 2天後，切除胚根，子葉部分十字對切成4塊，獲得子葉外植體；或所述外植體為子葉節，經消毒滅菌的黃瓜種子在MS培養基中，種子萌發後轉入光下培養4 5天，當子葉呈直立狀態時切取，去除1/2子葉僅留2mm的下胚軸，並在預培養基PM上培養2天得到子葉節外植體。
全文摘要
本發明「一種將抗根結線蟲的RNA幹擾基因導入黃瓜的方法」，涉及黃瓜轉基因技術。其特徵在於在轉化過程中，利用含有外源基因載體pCAGC1341-dsMiMpkl，在農桿菌懸液中和共培養培養基中均添加硫辛酸100mg/L和乙醯丁香酮50mg/L以提高農桿菌轉化效率，此外本發明還採用了潮黴素梯度篩選的方法以及相應的培養基方案，進一步提高了獲得黃瓜陽性轉化體的效率。
文檔編號C12N15/82GK102634539SQ20121001685
公開日2012年8月15日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者張聖平, 王燁, 苗晗, 謝丙炎, 陳國華, 顧興芳 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所