一種複合微生物除臭劑及其製備方法與流程
2023-10-04 20:46:44 1
本發明屬於生物除臭技術領域，具體涉及一種複合微生物除臭劑及其製備方法。
背景技術：
惡臭是指一切刺激嗅覺器官引起人們不愉快及損害生活環境的氣體物質，它是大氣汙染的一種形式。惡臭已成為當今世界七種典型公害中的一種並且已引起世界各國和人們的廣泛關注。惡臭氣體的種類主要有H2S、SO2、硫醇、氨、胺類、滷代烴等。惡臭氣體主要來源有生活源與工業源。生活源是指日常生活中產生的惡臭，如家用衛生間、公廁、汙水處理廠、垃圾轉運站等；工業源是指工業生產中產生的惡臭，如造紙廠、化工廠、製藥廠、農藥廠、養殖廠、屠宰場、畜牧場汙水處理廠等。不同的惡臭氣體對周邊環境造成極大的危害，嚴重影響了周邊居民的身體健康因此，迫切需要加強對惡臭氣體的治理。
目前除臭研究工作主要集中在物理除臭、化學除臭和生物除臭三方面，生物除臭以除臭效率高、無二次汙染、操作簡單、成本低廉，成為目前治理惡臭環境的一個重要研究方向。
申請號為201310442504.4的發明專利公開了一種生產除臭微生物製劑的方法，該方法通過將嗜熱鏈球菌、惡臭假單胞菌、沼澤紅假單胞菌、短小芽抱桿菌和屎腸球菌進行發酵，然後冷凍乾燥，按比例混合後製成除臭劑，可消除不同環境中的惡臭氣體。但是由於該生物除臭劑需要將五種不同微生物單獨分別發酵後再混合製備而成，因此生產過程複雜，增加了生物除臭劑的生產成本。申請號為01129774.3的發明專利公開了一種微生物除臭劑及其製備方法與應用，該生物除臭劑僅由酵母菌屬中的產朊酵母和小橢圓酵母兩種酵母混合發酵製備而成，因此限制了該生物除臭劑的應用範圍。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有技術中存在的缺陷和不足，利用從江西撫州市生活垃圾填埋場的土壤中分離選育而得到的一株解澱粉芽孢桿菌，提供一種除臭效果好、應用範圍廣、生產成本低的複合微生物除臭劑及其製備方法。
本發明採用如下技術方案，來實現發明目的。
一種複合微生物除臭劑，為微生物發酵液，所述的微生物由解澱粉芽孢桿菌、膠紅酵母、糞腸球菌和巴氏醋桿菌組合而成的混合菌；混合菌的活菌總數不少於3.0×1010cfu/mL。
所述的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，從江西撫州市生活垃圾填埋場的土壤中分離選育而得，菌株號為SQ-001，菌株SQ-001已於2016年8月30日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號樓，郵編100101，菌株保藏編號為CGMCC No.12917。
所述的膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)，來源併購買於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，膠紅酵母菌的菌株保藏編號為CGMCC No.2.4008。
所述糞腸球菌(Enterococcus faecalis)，來源併購買於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，糞腸球菌的菌株保藏編號為CGMCC No.1.2024。
所述巴氏醋桿菌(Acetobacter pasteurianus)，來源併購買於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，巴氏醋桿菌的菌株保藏編號為CGMCC No.1.2830。
本發明還同時提供了一種複合微生物除臭劑的製備方法，包括以下步驟：
(1)種子的擴大培養：將解澱粉芽孢桿菌，膠紅酵母，糞腸球菌，巴氏醋桿菌分別接種於含碳源和氮源的種子培養基中，經攪拌培養得到適用於發酵接種的種子液，分別為巴氏醋桿菌種子液、解澱粉芽孢桿菌種子液、膠紅酵母種子液和糞腸球菌種子液；
(2)混菌液體的發酵培養：將步驟(1)中獲得的巴氏醋桿菌種子液，接種於含碳源、氮源、無機鹽的發酵培養基中，經攪拌培養後，再分別接入步驟(1)中獲得的解澱粉芽孢桿菌種子液、膠紅酵母種子液和糞腸球菌種子液，繼續發酵培養，得到混菌發酵液；
(3)複合微生物除臭劑的獲得：調整步驟(2)得到的混菌發酵液的pH值至2.5～3.5並抽真空，得到含有休眠活菌的液體複合微生物除臭劑。
步驟(1)所述的含碳源和氮源的種子培養基，其碳源選自葡萄糖、麥芽糖、甘油、可溶性澱粉的一種或幾種，碳源含量為1～5g/100mL；其氮源選自酵母膏、蛋白腖、玉米漿、大豆粉、硫酸銨的一種或幾種，氮源含量為0.5-～5g/100mL，種子培養基的pH優選範圍為pH5.5～7.0。
步驟(2)所述的含碳源、氮源、無機鹽的發酵培養基，其碳源選自葡萄糖、麥芽糖、甘油、可溶性澱粉、糖蜜的一種或幾種，碳源含量為2～5g/100mL；其氮源選自酵母膏、蛋白腖、玉米漿、大豆粉、玉米粉、蠶蛹粉的一種或幾種，氮源含量為1～6g/100mL；其無機鹽包含鎂鹽、磷酸鹽，無機鹽含量為0.001～0.2g/100mL；鎂鹽選自硫酸鎂或氯化鎂；磷酸鹽選自磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉中的一種或幾種。
優選地，發酵培養基配方為：葡萄糖2.5～3.5g/100mL、酵母膏0.2～0.5g/100mL、玉米漿2.5～5.0g/100mL、磷酸二氫鉀0.02～0.08g/100mL、硫酸鎂0.01～0.05g/100mL，餘量為水，pH為5.5～7.0。
步驟(1)和(2)所述的攪拌培養，其參數優選為：攪拌轉速120-200rpm、培養溫度28-37℃，培養時間12-36h。
步驟(3)所述的抽真空為：在0.05～0.088MPa真空度下，將發酵液保持15～20min，以去除發酵液中的空氣和部分水份。
步驟(3)所述的液體複合微生物除臭劑，其混合菌活菌總數不少於3.0×1010cfu/mL。
本發明中解澱粉芽孢桿菌菌株SQ-001經中國科學院微生物研究所檢測鑑定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列如下：
16S rRNA基因序列:
TCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCA
atpA基因序列:
GGCGACGCTTCAGTTCACGGTATGAAGCCAGGTCAAGACGCAATGTTCCAGCTACCTTTTTCATCGCTTTGATTTGGGCTGATCCGCCGACACGGGATACGGATAATCCGGCATTGATCGCAGGACGCACGCCTGAGAAGAATAGGTCGGATTGAAGGAAAATCTGTCCGTCAGTAATGGAAATGACGTTTGTCGGGATATAAGCGGAGATATCTCCTGCTTGTGTTTCGACGAACGGCAGCGCCGTAATTGATCCTGCGCCTTTTGCGTCACTCAGCTTGGCTGCGCGCTCAAGCAGACGGGAGTGAAGATAGAATACATCCCCAGGGAATGCTTCACGGCCCGGCGGACGGCGAAGAAGCAATGACAGCTCACGGTAAGCGGCCGCTTGTTTGGATAAATCATCATATACGACGAGAACGTGCTTGCCGTTGTACATGAATTCTTCACCCATTGTCACCCCTGCATACGGTGCAAGGTAAAGAAGCGGAGCCGGCTGTGAAGCGGACGCCGTCACGACAATCGTGTAATCAAGCGCGCCATGCTTACGAAGTGTTTCCACCACGCCGCGCACTGTAGATTCTTTTTGACCGATCGCTACGTACACACAGATCATGTCTTGATCTTTTTGGTTTAAGATTGTATCAATCGCAACAGATGTTTTACCTGTCTGACGGTCACCGATAATCAGCTCACGCTGTCCGCGGCCGATCGGAATTAACGCGTCAATCGCTTTGATACCCGTTTGCAGCGGCTCATGTACCGATTTACGGTCCATTACGCCTGGAGCCTGGCTTTCGATCGGACGTGTTTTGCTTGTCAGAATCGGACCCAGTCCGTCTACCGGCTGTCCTAACGGGTTGACGATACGTCCGATTAATTCTTCACCTACAGGAACTTCCATGATGCGGCCCGTTCTTTTGACCTCATCACCTTCACGGATATCTCTGTAAGGTCCTAAGATAACGATACCTACGTTGGATTCTTCAAGGTTTTGAGCCATACC。
有益效果：
本發明所得到的液體複合微生物除臭劑，可以有效分解產生臭味的生物有機質，協同吸收利用各種惡臭氣體，除臭效果好，應用範圍廣。這是因為本發明將解澱粉芽孢桿菌CGMCC No.12917，膠紅酵母CGMCC No.2.4008，糞腸球菌CGMCC No.1.2024，巴氏醋桿菌CGMCC No.1.2830分別接種於種子培養基進行擴大培養，然後再接種於發酵培養基進行發酵培養，通過混菌發酵技術得到具有除臭功能的微生物組合物，並且該複合微生物菌種活菌總數不少於3.0×1010cfu/m數量級，使發酵液同時可以分解蛋白質、脂肪和澱粉這些產生臭味的生物有機質中的主要成分。同時，由於解澱粉芽孢桿菌、膠紅酵母、糞腸球菌和醋酸菌之間的協同作用，能夠將H2S、SO2、硫醇、氨、胺類等惡臭氣體作為營養物質利用或者通過吸附作用將不同惡臭氣體給吸附。
本發明所得到的液體複合微生物除臭劑，貨架期長，保藏方便。在本發明中，我們通過抽真空的方法使發酵液中的微生物菌株處於休眠，大幅增加了微生物除臭劑的貨架期，便於保藏。
本發明生產工藝簡單，活菌總量高，生產成本低，有利於大規模推廣應用。本發明由於採用了混菌發酵工藝，使得在液態發酵體系中由於不同菌株間的協同生長作用，大幅度提高了發酵液中總菌數量；另一方面，因為採用了混菌發酵工藝，一次發酵就可以得到不同微生物組合物，縮短了生產周期、提高生產設備的利用率，降低了生產成本，有利於大規模推廣應用。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。
實施例1
解澱粉芽孢桿菌的菌株來源、菌株分離、基因序列測定：
菌株來源：從江西撫州市生活垃圾填埋場的土壤中分離選育而得，菌株號為SQ-001，經中國微生物菌種保藏中心鑑定為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amgloliquefaciens)，並於2016年8月30日保藏於北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，該株解澱粉芽孢桿菌的菌株保藏編號為CGMCC No.12917。菌株SQ-001所述的菌株SQ-001，菌體呈杆狀，革蘭氏染色陽性，形成芽孢，不膨大；常規生理生化實驗表明，是好氧菌，接觸酶，氧化酶，VP試驗呈陽性，在7％的NaCl中生長，PH5.7生長，水解澱粉，還原硝酸鹽成亞硝酸鹽。
所述的菌株SQ-001是通過下列具體分離步驟而獲得的：
A標本採集：從江西撫州市生活垃圾填埋場的土壤中，採集土壤標本，保存備用；
B菌株分離：稱取採集的土壤標本約10g放在已滅菌的研缽內，在無菌操作臺上研磨至土壤顆粒較均一為止；稱取1g研磨好的土樣置於無菌試管中，加入9mL無菌水充分震蕩30分鐘製成1：10的土壤稀釋液，從上述溶液中取出1mL加入9mL無菌水充分震蕩成10-2的土壤稀釋液，依此類推至10-3、10-4、10-5的土壤稀釋液後備用，採用塗抹法或混菌法進行平板接種；所述的塗抹法為：分別吸取上述5個濃度的土壤稀釋液0.05mL，分別加入已制好的含有NA培養基的無菌平板上，用滅菌和玻璃刮刀將稀釋液均勻塗布開，設三個重複；所述的混菌法為：分別吸取上述5個濃度的土壤稀釋液各1mL，分別加入無菌空白培養皿中，將已熔化的45-50℃的NA培養基倒入，輕輕搖轉使樣品和培養基混合均勻，待培養基凝固，設三個重複。
C純化培養：將上述分離平皿，放入30℃培養箱中恆溫培養3-7天至單菌落長出，將具有解澱粉芽孢桿菌菌落形態特徵進行標記並及時挑取單菌落至NA培養基平板上，採用劃線分離的方法進行純化併入30℃培養箱中恆溫培養，將純化培養後的單菌落再轉接至含有NA培養基的斜面管內，繼續於30℃培養箱中恆溫培養3-7天，得到單菌落斜面管；
D液體培養：從單菌落斜面管內逐一挑取解澱粉芽孢桿菌，接種於液體培養基中，在旋轉式搖床150rpm轉速下，32℃培養24h，活菌孢子數達到6×108左右，得到適於保存的種子；
E菌株保存：將上述經液體培養後的解澱粉芽孢桿菌種子加入經過高溫滅菌的甘油，使甘油在種子液中的濃度為35％(V/V)，製成解澱粉芽孢桿菌甘油凍存管，放在-80℃冰箱保存，或放在-196℃液氮罐中進行超低溫保存。
基因序列測定：將解澱粉芽孢桿菌甘油凍存管送外進行基因序列測定，經中國科學院微生物研究所檢測鑑定，其16S rRNA基因序列和atpA基因序列，具體見SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
實施例2
複合微生物除臭劑的製備
(1)種子製備
種子培養基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，玉米漿2.5g/100mL，水，調pH為6.5。將解澱粉芽孢桿菌CGMCC No.12917、膠紅酵母CGMCC No.2.4008、糞腸球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋桿菌CGMCC No.1.2830菌接種於上述種子培養基中，在旋轉式搖床150rpm轉速下，32℃培養24h，即得適於接種的種子。
(2)混菌液體發酵培養
發酵培養基：葡萄糖2.5g/100mL，酵母膏0.3g/100mL，玉米漿,4g/100mL，磷酸二氫鉀0.03g/100mL，硫酸鎂0.03g/100mL。將(1)中獲得的醋酸菌種子按照發酵液體積的6％接種於發酵培養基中，在旋轉式搖床150rpm轉速下，32℃培養12h後，再分別按照發酵液體積2％接入(1)中獲得的解澱粉芽孢桿菌、膠紅酵母和糞腸球菌種子，繼續發酵培養30h即可獲得混合微生物組合物。
(3)發酵結束後調整發酵液的pH值至3.0，然後將發酵液在0.06MPa真空度下保持
15min以去除發酵液中的空氣，得到含有處於休眠狀態活菌的微生物除臭劑。
實施例3
複合微生物除臭劑的製備
(1)種子製備
種子培養基：葡萄糖5g/100mL，酵母膏1g/100mL，玉米漿3g/100mL，水，調pH為6.0。將解澱粉芽孢桿菌CGMCC No.12917、膠紅酵母CGMCC No.2.4008、糞腸球菌CGMCC No.1.2024和巴氏醋桿菌CGMCC No.1.2830菌接種於上述種子培養基中，在旋轉式搖床180rpm轉速下，30℃培養24h，即得適於接種的種子。
(2)混菌液體發酵培養
發酵培養基：葡萄糖3g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，黃豆粉4g/100mL，磷酸二氫鉀0.05g/100mL，硫酸鎂0.04g/100mL。將(1)中獲得的巴氏醋桿菌種子按照發酵液體積的5％接種於發酵培養基中，在旋轉式搖床170rpm轉速下，30℃培養24h後，再分別按照發酵液體積6％接入(1)中獲得的解澱粉芽孢桿菌、膠紅酵母和糞腸球菌種子，繼續發酵培養30h即可獲得混合微生物組合物。
(3)發酵結束後調整發酵液的pH值至3.5，然後將發酵液在0.07MPa真空度下保持20min以去除發酵液中的空氣，得到含有處於休眠狀態活菌的微生物除臭劑。
實施例4
複合微生物除臭劑的應用
在1L燒杯中加入200g新鮮牛糞，加入10mL本發明的複合微生物除臭劑，和糞便混勻後，用保鮮膜密封燒杯，同時以不加菌劑做對照，每組實驗設置三個重複，5天後測定氨氣、硫化氫和、吲哚等惡臭強度濃度。測定結果表明，加入複合微生物除臭劑組的惡臭去除率達到95％以上，而對照組對惡臭的去除率僅為10％左右。說明本發明的微生物製劑對牛糞具有很好的除臭效果，能有效的改善空氣品質。
實施例5
複合微生物除臭劑的應用
取100g新鮮垃圾平攤於5個培養皿中後，加入20mL本發明的複合微生物除臭劑，放於塑膠袋中，充氣50L後紮緊密封。分別設置投複合微生物除臭劑和自來水作為對照。每個處理設3個重複。7天後測定氨氣、硫化氫和、吲哚等惡臭強度濃度。測定結果表明，加入複合微生物除臭劑組的惡臭去除率達到90％以上，而對照組對惡臭的去除率僅為15％左右。說明本發明的微生物製劑對垃圾具有很好的除臭效果，能有效地改善空氣品質。
以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都涵蓋在本發明範圍內。
SEQUENCE LISTING
江西順泉生物科技有限公司
一種複合微生物除臭劑及其製備方法
12
2
PatentIn version 3.3
1
1416
DNA
16S rRNA基因序列
1
tcagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120
ggttgtttga accgcatggt tcaaacataa aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg 180
acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc 240
gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300
cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360
tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg ttcaaatagg 420
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taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc gcaggcggtt 540
tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga aactggggaa 600
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2
1006
DNA
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2
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gcgccgtaat tgatcctgcg ccttttgcgt cactcagctt ggctgcgcgc tcaagcagac 300
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agataacgat acctacgttg gattcttcaa ggttttgagc catacc 1006