一種快速定量檢測igfbp-7和timp-2的免疫螢光試紙條的製作方法

2023-10-05 04:48:09 2

一種快速定量檢測igfbp-7和timp-2的免疫螢光試紙條的製作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條，它包括支撐片以及支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，所述樣品墊片和檢測膜之間設有偶合物墊片，所述檢測膜上設有檢測線，所述檢測線包被有抗IGFBP-7和/或抗TIMP-2單克隆抗體或多克隆抗體，所述IGFBP-7抗體和/或TIMP-2抗體設在同一位置或設在相鄰位置，所述檢測線另一邊設有控制線，控制線包被有抗鏈黴親和素（SAV）抗體，所述偶合物墊片上塗布有含有不同螢光標記的IGFBP-7抗體和TIMP-2抗體偶合物。該試紙具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優點，適於臨床快速診斷。
【專利說明】—種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條

【技術領域】
[0001]本實用新型屬於臨床醫學診斷領域，具體涉及一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條。

【背景技術】
[0002]急性腎衰竭(AKI)是一個由多種病因引起的臨床症候群，是因腎循環衰竭或腎小管的變化而引起的一種突發性腎功能喪失，因此腎臟無法排除身體的代謝廢物。當腎臟無法行使正常功能時，會導致毒素，廢物和水分在體內堆積，而引起急性腎衰竭。
[0003]與急性腎衰竭(AKI)檢測相關的標誌物有許多種，如KM-UL-FABP都最引人注目的作為AKI診斷生物標誌物。研究表明，在AKI中，島素樣生長因子結合蛋白(insulin-likegrowth factor-binding protein-7,胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7))和組織金屬蛋白酶抑制劑_2 (tissue inhibitor of metalloproteinases_2,金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2))是細胞周期阻滯是一個關鍵的機制，可用於檢測AKI。而且IGFBP7和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2) AUC (曲線下面積)分別為0.76和0.79，兩者聯合胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2) AUC為0.80。而其它標誌物AUC ( 0.72。因此兩者聯合比現有檢測標誌物可早12-36小時檢測到AKI。
[0004]免疫突光技術(FluorescenceImmunoassay technique)是以突光分子作為示蹤標誌物應用於抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。生物素一親合素系統(B1tin-Avidin — System，BAS)是一種非常有效的生物反應放大系統。生物素一親合素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素一親合素與標記試劑高親合力的牢固結合及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用於微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。BAS在實際應用中所具有的巨大優越性，主要表現在以下幾個方面。
[0005](I)生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合，形成的生物素衍生物，不僅保持了大分子物質的原有生物活性，而且比恬度高，具多價性。因此，BAS具有多級放大作用，使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。
[0006](2)親和素與生物素間的結合具有極高的親和力，其反應呈高度專一性。因此，BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時，並不增加非特異性幹擾。而且，BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響，使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。
[0007](3)親和素結合生物素的親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，二者結合形成複合物的解離常數很小，呈不可逆反應性；而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。因此，BAS在實際應用中，產物的穩定性高，提高測定的精確度。(4)生物素和親和素均可製成多種衍生物，不僅可與酶、螢光素和放射性核素等各類標記技術結合，用於檢測體液、組織或細胞中的抗原-抗體、激素一受體和核酸系統以及其他多種生物學反應體系，而且也可製成親和介質，用於分離提純上述各反應體系中的反應物。
[0008]目前，IGFBP-7和--ΜΡ-2的方法目前主要是酶聯免疫技術(ELISA)，ELISA技術存在以下缺點:檢測設備要求高，成本高；幹擾因素較多，重複性不好；檢測時間長。因此酶聯免疫技術檢測IGFBP-7和TIMP-2不適合臨床快速診斷。如何能夠製作出快速的定量檢測設備成為需要迫切解決的問題。


【發明內容】

[0009]本實用新型的一個目的是提供一種快速定量檢測胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫螢光試紙條。
[0010]本實用新型的技術方案是:一種快速定量檢測IGFBP-7和--ΜΡ-2的免疫螢光試紙條，它包括試紙條支撐片以及試紙條支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片、檢測膜和吸水墊片，所述樣品墊片和檢測膜之間設有偶合物墊片，偶合物墊片一端上方設有第一層玻璃纖維墊片，其一端下方設有第二層玻璃纖維墊片或者偶合物墊片一端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片或者不設有任一墊片，所述檢測膜上設有檢測線，所述檢測線包被有抗胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和/或抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體或金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體設在同一位置或設在相鄰位置，所述檢測線另一邊設有控制線，控制線包被有抗鏈黴親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片上塗布有含有不同螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物。
[0011]在試紙條支撐片由下而上依次粘附檢測膜、吸水墊片偶合物墊片，在偶合物墊片上設有第一層玻璃纖維墊片、第二層玻璃纖維墊片或者僅設第一層玻璃纖維墊片或者不設有任一墊片，最上一層為樣品墊片；
[0012]將上述材料組裝後，切成小條，即制的所述定量檢測胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫螢光試紙條。
[0013]採用如上技術方案後，其有益效果為:
[0014]本實用新型所述的快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條的工作原理是:採用免疫側流反應原理,通過雙抗體夾心法製備而成。檢驗時樣本中的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗原首先分別與偶合墊上的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物發生免疫反應，形成免疫複合物。其後免疫複合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當免疫複合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(IGFBP-7和--ΜΡ-2檢測線)時，分別與預先包被在硝基纖維素膜上的抗胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體發生反應從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。樣本中的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)越多，檢測線上的複合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時，在檢測過程中，未結合的螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白? (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物也會隨樣本在檢測膜上層析，當層析至檢測膜的控制線時，螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)會與預先包被在檢測膜上的抗SAV抗體發生反應從而被固定在對照區(控制線)上。樣本中胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)濃度分別與檢測線中兩種不同波長的螢光的光密度值成正比關係。
[0015]當反應結束後，利用檢測儀將控制線和檢測線的光密度進行分析，並將所分析得到的結果進行運算，從而得到相對光密度值(RI)。然後檢測儀根據已預先設置在檢測儀內的標準曲線對胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2(TIMP-2)的濃度進行計算並顯示結果，以ng/mL為單位表示，其反應結果如下表I所示:
Hg細I I 蛋白 7 (16FBP-?) (W)
1:TO
standard: strip-1 strip-2 strip-3
;值偏差 CV
0I 0.00560.0058 0.0OSG0.0060.0002.2%
0.25I 0.00940.0083 0,01020..0090.001103%
05! 0,01390.0148 0,01410,0140.0003.4%
1I 0.02820,0301 0.03290.0300.0027.8%
2! 0.0615590.0562760.0522130.05?0.00583%
[0016]4! 0,1148360,0974020.1056S90,1068,2%
8I §.2269020.2076020.1963420.2100.01573%
16! ?,3750960.399980.39845203910.0143.6%
32! §.7612240.8899240.8407110,8310.0657.8%
64； 1,4748071.4729S41.5773061.5030.0604.0?
128I 3.7135413.7833273.6314953.7090.0762.0%
25δI 6.2327166.892966 6,02働I6,3830.4547.1%
512! 9,2279758,6672329,2634739,0530 3343,7%
800I 11,4733212.8415911.1838711.8330.8857.5%
1000I 17.7615119,8726920.3094619.5151.6048.2%.........................................................1.突光2:金滅蛋白酶?織抑制因..j
ng/miψ 2 (nMP-2)(Ri)
standardslrip-1strip-2strip-3 值偏差 CV
00,0056080.0060750.0038580.0050.腳122,6%
0.250.0088060.0073810.0087950.0080.0019.8%
0.50.0159310.0159360.013532.0,015OJOl9.2%
10.0197730.0202810.0237530.0210.00210.2%
20.0408920.0389280,的37820.0BJ0.0049.6%
40.0769150.0--560.0789620.0780.0011.3%
8a 1863110.1717730.1636510,1740.0116.6%
160.4062250.3502430.3528110.3700.0328.5%
320.7055330.7333150.7314410.7230,0162.1%
6413965961.251123 1.1861.2780.1088.4%
1282.1761231.8950091.9069061.9930.1598.0?
ISO3.9628443.8713823.3234383.7190.3469.3%
3005,73.3353275295.87114S5.6430,2825.0%
M)09.9136?8.9569848.7803579.2170.6106.6%
120016,3267616.9816717.12284l1.8100.4252.5%
[0017]本實用新型新型所述快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條，具有方便快捷、操作簡單、結果準確等優點，適於臨床快速診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是本實用新型快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條的結構示意圖。
[0019]其中:1_樣品墊片、2-檢測膜、3-吸水墊片、4-支撐片、5偶合物墊片、6-1第一層玻璃纖維墊片、6-2第二層玻璃纖維墊片、7-1、7-2檢測線、8-控制線。

【具體實施方式】
[0020]下面結合附圖和【具體實施方式】對本實用新型進行詳細說明，不能理解為是對本實用新型的限制。
[0021]實施例1。
[0022]如圖1所示一種快速定量檢測IGFBP-7的免疫螢光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片上順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，偶合物墊片5 —端上方設有第一層玻璃纖維墊片6-1，其一端下方設有第二層玻璃纖維墊片6-2或者偶合物墊片5 —端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片6-1或者不設有任一墊片，所述檢測膜2上設有檢測線7-1，所述檢測線7-1包被有抗胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)單克隆抗體或多克隆抗體，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈黴親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上塗布有螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物。
[0023]所述偶爾物墊片5中螢光標記的IGFBP-7抗體偶合物的製備包括如下步驟。
[0024](I) B1tin-1GFBP-7 抗體的製備:
[0025]胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，活化的生物素(B1tin)溶解於二甲基亞碸(DMSO)中保證其活化度，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體加入準備好的活化的生物素(B1tin)溶液中，攪拌反應，反應完成後，將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成B1tin-1GFBP-7抗體原液，並計算每個胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體可能結合的生物素(B1tin)平均個數。
[0026](2)螢光分子-SAV的製備:
[0027]抗鏈黴親和素(SAV)粉末溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中活化，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的抗鏈黴親和素(SAV)加入螢光分子粉末中反應,反應完成後,將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成螢光分子-SAV原液，並計算每個螢光分子可能結合的抗鏈黴親和素(SAV)的平均個數。
[0028](3)螢光I標記的IGFBP-7抗體偶合物的製備:
[0029]將B1tin-1GFBP-7抗體原液稀釋，按照計算的比例加入螢光I分子-SAV反應，並在合適的條件下停止反應，形成螢光I標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物；
[0030]其中，檢測膜2在免疫螢光試紙條中用於固定包被抗體，同時也是免疫反應的發生處；檢測線7-1是將抗胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上；然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；
[0031]其中，所述控制線8是將抗鏈黴親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上，然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；
[0032]其中，製備偶合物墊；所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用於製備偶合物墊片5的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩衝液中浸泡後取出，充分乾燥後，用包膜儀器將螢光I標記的-胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物塗布在偶合物墊片5上，充分乾燥即得；
[0033]製備樣本墊片；所述樣本墊片I可對液態樣品起到初步過濾作用，將樣本墊片用封閉液浸泡後，充分乾燥即得；
[0034]試紙條的組裝；將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片4上，獲得快速定量檢測胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)的免疫螢光試紙條。
[0035]按以下步驟進行檢測:1)抽取的病人尿液樣本，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片I上，反應。3)判讀，將所述免疫螢光試紙條置於(瑞萊)免疫螢光檢測儀以及其相關儀器中判定結果。其結果如下表所示:
[0036]
I螢光1:胰島藤生長因子結含j..............................................................................................................................................................................................................................................................1ig/ιιι丨蛋白 7 G6FBP-7) (W).....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................suncJard stiip-1 stri|)-2 slrip-1

僮偏差 CV
00,0056 O,側 W 0.0056 0,006 0,000 2.2%
0.25 0,0094 0.側 S3 0.0102 0.009 0,001 103%
0.5 0,0139 0.0148 0.0141 0.014 0,000 3.4%
10.0282 O, §301 0^0329 0.CBO 0.002 7,8%
I0.061559 0,056276 0.052213 0,057 0.005 8.3%
4 0.114836 0.097402 0.105659 0,106 0,009 8.2%
8 0.226902 0.207602 0.196342 0.210 0.015 73%
16 0375096 0,39998 0398452 0.391 0.014 3.6%
32 0.761224 0.889924 0-840711 0.831 0,065 7.8%
64 1.474807 1.472984 1.577306 L 508 0.060 4,0%
128 3.713541 3,783327 3.631495 3.709 0.076 2.0%
256 8.232.716 6.892966 6.02401 6.3SS 0.4S4 7.1%
512 9.227975 8.6672.32 9.263473 9.053 0334 3.7%
800 11.47332 12.84159 11.18387 11J33 §.885 7.5%
1000 17.76151 19.872.S9 20.5094& 19.515 1..604 8.2%
[0037]實施例2。
[0038]一種快速定量檢測TIMP-2的免疫螢光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片4上順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，偶合物墊片5 —端上方設有第一層玻璃纖維墊片6-1，其一端下方設有第二層玻璃纖維墊片6-2或者偶合物墊片5 —端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片6-1或者不設有任一墊片，所述檢測膜2上設有檢測線7-2，所述檢測線7-2包被有抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈黴親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上塗布有螢光標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物。
[0039]所述偶爾物墊片5中螢光標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物的製備包括如下步驟:
[0040](I) B1tin- --ΜΡ-2 抗體的製備:
[0041]金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，活化的生物素(B1tin)溶解於二甲基亞碸(DMSO)中保證其活化度，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2 )抗體加入準備好的活化的生物素(Biοtin )溶液中，攪拌反應，反應完成後，將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成B1tin- TIMP-2抗體原液，並計算每個金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體可能結合的生物素(B1tin)平均個數；
[0042](2)螢光分子-SAV的製備:
[0043]抗鏈黴親和素(SAV)粉末溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中活化，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的抗鏈黴親和素(SAV)加入螢光分子粉末中反應,反應完成後,將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成螢光分子-SAV原液，並計算每個螢光分子可能結合的抗鏈黴親和素(SAV)的平均個數；
[0044](3)螢光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物的製備:
[0045]將金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體原液稀釋，按照計算的比例加入螢光2分子-SAV反應，並在合適的條件下停止反應，形成螢光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子
2(--ΜΡ-2)抗體偶合物；
[0046]其中，檢測膜2在免疫螢光試紙條中用於固定包被抗體，同時也是免疫反應的發生處；檢測線7-2是將抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上，然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；
[0047]步驟二:製備控制線；所述控制線8是將抗鏈黴親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上，然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；
[0048]步驟三:製備偶合物墊；所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用於製備偶合物墊片5的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩衝液中浸泡後取出，充分乾燥後，用包膜儀器將螢光2標記的-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物塗布在偶合物墊片5上，充分乾燥即得；
[0049]步驟四:製備樣本墊片；所述樣本墊片I可對液態樣品起到初步過濾作用，將樣本墊片用封閉液浸泡後，充分乾燥即得；
[0050]試紙條的組裝；將上述各組成部件按圖1所示結構粘貼在支撐墊片4上，獲得快速定量檢測金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)的免疫螢光試紙條。
[0051]按以下步驟進行檢測:1)抽取的病人尿液樣本，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片I上，反應。3)判讀，將所述免疫螢光試紙條置於(瑞萊)免疫螢光檢測儀以及其相關儀器中判定結果。其結果如下表所示:
[0052]
黃Λ 2-金屬蛋白酶組織抑制因
ng/mfψ I (TIMP-2) (RI)

TO
standard strip-1 strip-2 strip-3 值 ?差 CV
00.005608 0.006075 0.003858 0.005 0.001 22.6%
0.25 0,008806 0,007381 0,008795 0,008 0-001 9,8%
0.5 0.015931 0.015936 0.013S32 0.015 0.001 9.2%
10.019773 0.020281 0,023753 0.021 0,002 10.2%
I0,040892 0.05692S 0,033782 0.03? 0.004 9,6%
4 0.07691S 0Λ7756 0.078962 0.078 0.001 13%
8 0,186311 0.171773 0.163651 0.174 0.011 6.6%
16 0.406225 0.350243 0.352811 0370 0.032 8.5%
32 0.705533 0,733315 0.731441 0,723 0,016 2,1%
64 1396596 1.251123 1.186 1,278 0.108 8.4%
128 2.176123 1.835009 1.906306 1.993 0.153 8.0%
150 3.962844 3.871382 3 323438 3.719 0.346 9.3%
300 5.730933 5.327529 5.871143 5.643 0.282 5.0%
600 9.913686 8.956984 8.780357 9.217 0.610 6.6%
1200 1632676 16.98167 17.12284 16.810 0.425 2.5%
[0053]實施例3。
[0054]一種快速定量檢測IGFBP-7和ΤΙΜΡ-2的免疫螢光試紙條，它包括試紙條支撐片4以及試紙條支撐片4上順次搭接粘貼的樣品墊片1、檢測膜2和吸水墊片3，所述樣品墊片I和檢測膜2之間設有偶合物墊片5，偶合物墊片5 —端上方設有第一層玻璃纖維墊片6-1，其一端下方設有第二層玻璃纖維墊片6-2或者偶合物墊片5 —端上方僅設有第一層玻璃纖維墊片6-1或者不設有任一墊片，所述檢測膜2上設有檢測線7-1、檢測線7-2，所述檢測線7-1、檢測線7-2包被有抗胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)或抗金屬蛋白酶組織抑制因子2(ΤΙΜΡ-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP-7)抗體或金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體設在同一位置或設在相鄰位置，所述檢測線7另一邊設有控制線8，控制線8包被有抗鏈黴親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片5上塗布有含有不同螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物。
[0055]所述偶爾物墊片5中螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物的製備包括如下步驟:
[0056](I) B1tin-1GFBP-7 抗體以及 B1tin- --ΜΡ-2 抗體的製備:
[0057](1.1) B1tin-1GFBP-7 抗體的製備:
[0058]胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，活化的生物素(B1tin)溶解於二甲基亞碸(DMSO)中保證其活化度，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體加入準備好的活化的生物素(B1tin)溶液中，攪拌反應，反應完成後，將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成B1tin-胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體原液，並計算每個胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體可能結合的生物素(B1tin)平均個數；
[0059](1.2) B1tin-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體的製備:
[0060]金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中，活化的生物素(B1tin)溶解於二甲基亞碸(DMSO)中保證其活化度，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2 )抗體加入準備好的活化的生物素(Biοtin)溶液中，攪拌反應，反應完成後，將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成B1tin-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體原液，並計算每個金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體可能結合的生物素(B1tin)平均個數；
[0061](2)兩種螢光分子-SAV的製備:
[0062]為了同時監測兩種抗體，兩種不同波長的螢光分子使用在本申請中。由於製作過程一致，製備方法中只提一種；
[0063]抗鏈黴親和素(SAV)粉末溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中活化，然後把溶於磷酸鹽緩衝液(PBS)中的抗鏈黴親和素(SAV)加入螢光分子粉末中反應,反應完成後,將溶液超濾離心濃縮，並多次衝洗，形成螢光分子-SAV原液，並計算每個螢光分子可能結合的抗鏈黴親和素(SAV)的平均個數；
[0064](3)螢光I標記的IGFBP-7抗體偶合物以及螢光2標記的--ΜΡ-2抗體偶合物的製備:
[0065]將B1tin-胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體原液稀釋，按照計算的比例加入螢光I分子-SAV反應，並在合適的條件下停止反應，形成螢光I標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物；
[0066]螢光2標記的金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物標記過程和螢光
I標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物過程相同。
[0067]其中，檢測膜2在免疫螢光試紙條中用於固定包被抗體，同時也是免疫反應的發生處；檢測線7-1是將抗胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP-7)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上；檢測線7-2是將抗金屬蛋白酶組織抑制因子2(--ΜΡ-2)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上，然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；檢測線7-1、檢測線7-2位於同一位置或不同位置，若為不同位置，則檢測線7-1、檢測線7-2均位於控制線8同一側，即液體首先接觸的位置；
[0068]其中，所述控制線8是將抗鏈黴親和素(SAV)抗體使用1*PBS、甲醇等緩衝液稀釋，劃線於所述檢測膜2上，然後將檢測膜2充分乾燥並烘烤數日後即得；
[0069]其中，所述偶合物墊片5的原材料為玻璃纖維濾膜，將用於製備偶合物墊片5的玻璃纖維濾膜放入預封閉緩衝液中浸泡後取出，充分乾燥後，用包膜儀器將螢光I標記的-胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體偶合物和螢光2標記的-金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體偶合物塗布在偶合物墊片5上，充分乾燥即得；
[0070]另外，所述樣本墊片I可對液態樣品起到初步過濾作用，將樣本墊片用封閉液浸泡後，充分乾燥即得；
[0071]按以下步驟進行檢測:1)抽取的病人尿液樣本，如低溫保存樣本需恢復至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片I上，反應。3)判讀，將所述免疫螢光試紙條置於(瑞萊)免疫螢光檢測儀以及其相關儀器中判定結果。其結果如下表所示:..........................................................[蘇1:涵涵...............................................................................................................................1
ng/ml蛋白 7 (丨GFBP-7；MW}_
平均I
standard strip-1 strip-2 strip-3
____值偏差 CV
00.00560.00580.00560,0060.0_ 2.2%
0.250.00940.00830.01020,0090.001 103?[
0.50.01390.01480.01410.0140,000 —3:4?.......[
10.02820.03010.03290.0300.002 -1,,?^8% ,11
20,0615590,05&2760.0522130.0570,005 8.3?
[0072]40.1148360.0974020.1056590.1060.009 8.2% [
80.2269020.2076020.1963420.2100.015 7.3% [
160 37509603999803984520.3910.014~ 3:6% [
320.7612240.8899240.8407110.8310.065 7.8% [
641.4748071.47298413773061,5080.060......4:0?...|
128 3.7135413.7833273,6314953,7090.076 2.0?
256 6,2327166.8929666,024016.3830.454 7.1%
512 9.2279758.6672329.2634739,0530334.3.7% ]
800 11.4733212.8415911.1838711.8330.885
1000 17.76151 19.87269 20.90946 19.515 1.604 8.2% [.....1
ng/ml ψ 2 (TIMP-2)(RI)J

￥1
standard strip-1strip-2strip-3值偏差CV |
00.聽》080.0060750.0038580.0050.00122.6%
iii|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|ii^^^^^^^^^maaaaaaaaaaaaam imaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagi|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|ii 1111111111111M mi taaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaai|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|ii 111111111111111 mMaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaai|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|i|iigggggggm unnnnnn^^^^maaaaaaaaaaaaaTO maaaaaaaaaaaa^^^^miiiiiiiiiiiiiiii uunnnnn^^^^Mmaaaaaaaaamagi
0.25 0.0088060.0073810.0087950.0080.0019.S% |
0.5 0.0159310.0159360.0135320.0150.0019.2?
10.0197730.0202810.0237530.0210.00210.2% |
20.0408920.0369280,033782?,03?0,0049.6?
4 §.076915 0.077560.0789620.0780.001....L3%...|
8 0-1863110.1?1--S0.1636?0.1740.0116.6? |
16 0.4062250350243035281103700.0328.5% |
W 0.7055330,7333150,7314410J230.016■■■■■■■■■2:1?:■■■■■■■|
64 1.3965961.2Sim1.1861.2780.1088.4%
128 2.17612S1.8950091,9069061.9930,159—8.0%......|
ISO 3.9628443.871382332S4S83.7190346■■■■■■■■■■9:3;■■■■■■■
300 5.73093353275295.8711435.6430.2825.0% |
§00 9.9136868.9S6984S.780SS79.21?0.6106.6? |
1200 16.3267616.9816717.1228416.8100.4252.5% |
【權利要求】
1.一種快速定量檢測IGFBP-7和TIMP-2的免疫螢光試紙條，它包括試紙條支撐片(4)以及試紙條支撐片(4)上順次搭接粘貼的樣品墊片(I)、檢測膜(2)和吸水墊片(3)，所述樣品墊片(I)和檢測膜(2)之間設有偶合物墊片(5)，其特徵在於:所述檢測膜(2)上設有檢測線(7-1)、(7-2)，所述檢測線(7-1)、(7-2)包被有抗胰島素樣生長因子結合蛋白7(IGFBP-7)和/或抗金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)單克隆抗體或多克隆抗體，所述胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和/或金屬蛋白酶組織抑制因子2 (TIMP-2)抗體設在同一位置或設在相鄰位置，所述檢測線(7)另一邊設有控制線(8)，控制線(8)包被有抗鏈黴親和素(SAV)抗體，所述偶合物墊片(5)上塗布有含有不同螢光標記的胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)抗體和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)抗體偶合物，在試紙條支撐片由下而上依次粘附檢測膜(2)、吸水墊片(3)和偶合物墊片(5)，在偶合物墊片(5)上設有第一層玻璃纖維墊片(6-1)、第二層玻璃纖維墊片(6-2)或者僅設第一層玻璃纖維墊片(6-1)或者不設有任一墊片，最上一層為樣品墊片(1)，將上述材料組裝後，切成小條，即制的所述定量檢測胰島素樣生長因子結合蛋白7 (IGFBP-7)和金屬蛋白酶組織抑制因子2 (--ΜΡ-2)的免疫螢光試紙條。
【文檔編號】G01N33/533GK203965444SQ201420148778
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】劉紅劍, 威廉姆.努特, 何小紅, 劉麗萍, 張丹 申請人:瑞萊生物科技（江蘇）有限公司