具有活性重組腫瘤特異性凋亡因子的製備方法及其製品的應用的製作方法

2023-10-18 10:02:59 1

專利名稱：具有活性重組腫瘤特異性凋亡因子的製備方法及其製品的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物製藥的製備方法及應用，尤其是具有活性的重組腫瘤特異性 凋亡因子的製備方法、及該方法獲得的製品在抗腫瘤治療中的應用。
背景技術：
癌症治療是世界性難題，癌症的生物治療是手術、放療、化療等方法的重要補充， 尋找更有效的生物製劑已成為21世紀重點研究領域之一。目前國內外已上市的用於腫 瘤治療的生物製劑主要有白細胞介素-2 (IL-2)、幹擾素(IFN)和單核細胞集落刺激因子 (GSM)幾種，不僅可供臨床選擇的品種較少，而且均為免疫增強劑或調節劑，所以研發具有 治療作用的新型生物製劑具有重要的社會意義和經濟意義。來源於雞貧血病毒的雞貧血病毒蛋白-3(vp3)對人的各種腫瘤細胞和異常轉化 細胞具有特異性殺傷作用。由於vp3能夠選擇性地誘導腫瘤細胞和轉化細胞的凋亡，而不 誘導正常細胞的凋亡，被命名為腫瘤特異性凋亡因子(Apoptin)。研究結果表明，Apoptin 誘導腫瘤細胞凋亡不依賴於抑癌基因_53(p53)作用途徑，也不被抑制細胞凋亡基因 (Bcl-2)過量表達所抑制，因此有希望成為有效治療癌症的新型生物製劑。與現有的抗腫瘤藥物相比Apoptin具有如下特點(I)Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡不依賴P53途徑，對那些P53基因突變的腫瘤細胞 仍能誘導其凋亡，此點優於那些依靠P53發揮作用的抗腫瘤藥，因為後者對P53突變的腫瘤 細胞無效；(2) Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡不僅不受bcl_2過表達的抑制，反而bcl_2過表達 能夠增強apoptin誘導腫瘤細胞凋亡的作用，此點優於那些被bcl-2過表達抑制的抗腫瘤 藥；(3)現有的抗腫瘤藥物儘管數量繁多，也不乏療效較好者，如紫杉醇、砷製劑等，但 多數藥物毒副作用大，且反覆用藥後多產生耐藥性，而使腫瘤復發，所以研製毒副作用小、 療效顯著的抗腫瘤藥物是十分必要的。與紫杉醇相比，Apoptin具有獨特優勢①不受自然 資源的限制，可根據市場需求無限量的生產；②抗腫瘤作用機理獨特，效果明顯，無或低毒 副作用；③Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡是通過激活胱天蛋白酶、釋放細胞色素C和激活氨基 末端激酶完成的，作用機理清楚。但是由於Apoptin為來源於雞貧血病毒的蛋白質，所以在Apoptin規模化生產和 應用中存在兩個重要的技術瓶頸，一是由於種屬間的差異，人體細胞膜表面沒有其相關的 蛋白受體，所以，Apoptin不能與人的細胞結合，進入細胞，引起細胞凋亡。而Apoptin誘導 細胞凋亡的原理是進入細胞，激活與細胞凋亡相關的酶(主要為caspase)引起細胞凋亡。 其二是原核表達的Apoptin在體外難溶解、不穩定，很難獲得大量高純度的蛋白質。所以盡 管對Apoptin已經研究了十餘年，但上述兩個技術難題嚴重限制了 Apoptin的產業化和臨 床應用，至今仍未應用於臨床。所以解決這兩個技術難題是使Apoptin實現產業化的關鍵，亦是國內外的研究熱點。針對這兩個難題，目前國內外學者主要在以下兩個方面開展研究①以病毒為載 體，將Apoptin基因帶入腫瘤細胞，發揮Apoptin誘導腫瘤細胞發生凋亡作用。此種方法的 優點是方法比較簡單、易於操作、效果肯定；其缺點是不易產業化、病毒基因作為外源基因 有潛在的引起基因重組發生突變的危險、病毒作為外援抗原反覆應用，會刺激機體產生抗 體，減弱其作用。②採用顯微注射的方法將重組Apoptin蛋白直接注射到腫瘤細胞內。此 種方法因其技術要求和設備要求很高，只適合實驗室研究，不可能規模化應用，所以不能產 業化。

發明內容
為能實現產業化，本發明的目的在於提供一種在大腸桿菌中高效表達、穩定好、純 度高、且有高活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的製備方法，及該方法獲得的製品在抗腫瘤 治療中的應用，以激活GST-Apopti誘導腫瘤細胞凋亡的活性，使GST-Apoptin融合蛋白能 夠與腫瘤細胞發生結合，用於誘導腫瘤細胞凋亡，以達到能夠滿足臨床治療腫瘤的目的。本發明的技術方案是在構建穀胱肽轉移酶-腫瘤特異性凋亡因子 (GST-Apoptin)融合蛋白原核表達載體(pGEX_A)的基礎上，建立一種純化GST-Apoptin融 合蛋白的技術方法，使其在體外易溶解、穩定、純度高；建立了 GST-Apoptin融合蛋化學修 飾方法，即用化學方法將葉酸連接到GST-Apoptin融合蛋白上，使GST-Apoptin融合蛋白能 夠與腫瘤細胞發生結合，使其成為一種新型重組腫瘤特異性凋亡因子。本發明提供的新型重組腫瘤特異性凋亡因子具有序列表中序列1所示的胺基酸 序列；本發明提供的新型重組腫瘤特異性凋亡因子基因具有序列表中序列2所示的核 苷酸序列；本發明提供的重組腫瘤特異性凋亡因子的製備方法，包括以下步驟(1)通過人工合成的方法直接獲得Apoptin的基因片段，構建含GST-Apoptin基因 的原核表達載體PGEX-A ；(2) GST-Apoptin融合蛋白的發酵，高效表達，溶解，復性及純化；(3)GST-Apoptin融合蛋白的化學修飾，將上步驟後的GST-Apoptin與葉酸連接， 使GST-Apoptin獲得活性，誘導腫瘤細胞凋亡作用。(1)中所說的構建含GST-Apoptin基因的原核表達載體pGEX_A的方法見文獻 《雞貧血病毒vp3基因融合表達載體的構建及表達》(www.cqvip.com)；(2)中所說的GST-Apoptin融合蛋白的發酵，高效表達，溶解，復性及純化的步驟 是將前述(1)表達GST-Apoptin融合蛋白的工程菌接種到含氨苄青黴素(AP)的液體肉 湯培養基(LB)中，37°C搖床內培養，將菌液按比例轉種到含AP的LB培養基中擴增，37°C 搖床內培養，菌液濃度達到光密為1.0時按比例接種到發酵罐內，待菌液濃度達到光密為 2.0後，加入異丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加 填料液，氨水自動調節PH7. O值，收集上述發酵液；離心收集菌體，高壓勻漿破碎菌體，離 心收集沉澱，即為包涵體；取包涵體，加入包涵體溶解液磁力攪拌溶解4h ；離心收集上清 液；按比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h ；4°C復性12h以上；超濾濃縮；將上述濃縮的復性液通過用平衡液平衡的瓊脂糖凝膠(Separose-12)層析柱，收集目的峰；將目 的峰再上用平衡液平衡好的去內毒素親和層析柱(FF層析柱)，收集洗脫峰即為純化的 GST-Apoptin (_20°C保存備用)。(3)中所說的GST-Apoptin融合蛋白化學修飾步驟是採用戊二醛法按下列比例 配製GST-Apoptin融合蛋白與葉酸連接體系，具體是體積相同的0. 2mg/ml GST-Apoptin融 合蛋白和1. Omg/ml葉酸，再加入微量的戊二醛(原液125倍)，將配製好的連接體系，置於 室溫(25°C以上)避光放置3h ；將連接液對磷酸鹽緩衝液透析，4°C，12h以上；過濾除菌，即 為新型重組腫瘤特異性凋亡因子(-20°C保存備用)。將上述製品用於誘導腫瘤細胞凋亡，以體外培養細胞為例將腫瘤細胞接種到 96孔細胞培養板內，培養過夜；加入新型重組腫瘤特異性凋亡因子，繼續培養72小時，用 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法測定細胞凋亡，試驗設正常細胞 對照，未激活GST-Apoptin融合蛋白對照。結果10 μ g/mL新型重組腫瘤特異性凋亡因子可 使50%以上的腫瘤細胞發生凋亡。將上述製品用於抗腫瘤治療，以動物實驗為例將小鼠皮下接種腫瘤細胞，使腫瘤 長至5mm3左右時，將小鼠隨機分組，分別皮下注射高、中、低三種不同計量的新型重組腫瘤 特異性凋亡因子及生理鹽水(對照組)，連續注射20天，實驗結果表明新型重組腫瘤特異性 凋亡因子對多種腫瘤細胞具有明顯的抑瘤作用，腫瘤組織明顯萎縮。


下面結合附圖進一步說明本發明。圖1為GST-Apoptin融合蛋白原核表達載體構建方案。圖2為表達載體的酶切圖譜及結果，圖中標示分別為。M 分子量標準，從大到小依次為 2000，1000, 750，500，250，IOObp ；1 為質粒酶切對照；2、3、4 為表達載體pGEX-A酶切圖譜。圖3為發酵菌體表達的重組腫瘤特異性凋亡因子(7. 5%膠)，圖中標示分別為M 分子量標準，從大到小依次為 97. 0，66. 2，43. 0，31. 0，14. 3kDa，1 菌體蛋白對照；2、3 發酵表達的GST-Apoptin融合蛋白。圖4為分步純化的重組腫瘤特異性凋亡因子(16%膠)。圖中標示分別為M 分子量標準，從大到小依次為 97. 0，66. 2，43. 0，31. 0，14. 3kDa，1、2、3、4、5 為分布收集的純化的GST-Apoptin融合蛋白。圖5為新型重組腫瘤特異性凋亡因子對A375細胞的凋亡誘導作用。圖6為新型重組腫瘤特異性凋亡因子對S180荷瘤小鼠的治療作用。圖中A 為鹽 水對照組瘤體；B 為治療組瘤體。
具體實施例方式(1)通過人工合成的方法直接獲得Apoptin的基因片段；構建含GST-Apoptin基 因的原核表達載體pGEX-A;(2) GST-Apoptin融合蛋白的發酵，高效表達，溶解，復性及純化，具體是(2. 1)工程菌的活化、發酵及包涵體的回收取-70°C保存的工程菌種接種到含AP的營養瓊脂平板培養基上，37°C培養12h以上；挑取單個菌落接種到含AP的LB液體培養基 中，37°C搖床內培養12h以上，將菌液按1 10比例接種到發酵罐內，37°C條件下培養；待 菌液濃度達到2. OOD後，加入IPTG誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加填料液，氨水自 動調節PH7.0值。離心收集菌體，菌體用磷酸鹽緩衝液(PB，pH7.2)懸浮，冰浴條件下，高壓 勻漿破碎菌體，反覆4次。離心破碎後的菌體，收集沉澱，即為包涵體(圖3)；(2. 2)包涵體的溶解和復性稱取適量包涵體，加入包涵體溶解液(2% )，室溫條件 下，磁力攪拌溶解4h ；離心4°C，9000rpm, 15min,收集上清液；按1 8比例緩慢加入復性液， 室溫磁力攪拌溶解4h ；4°C復性12h以上；超濾濃縮20倍以上，立即純化或-20°C保存備用。(2. 3)腫瘤特異性凋亡因子純化用平衡液平衡S印ar0Sel2層析柱；將上述濃縮 的復性液按床體積的3%比例上樣，流速為2ml/min ；分步收集第2個峰；十二烷基硫酸鈉 (SDS)電泳鑑定後，取分子量為39kD純度高的蛋白質部分；將上述樣品再上用平衡液平衡 好的FF層析柱(或-20°C保存備用)，按床體積75%比例上樣，樣品在柱內留置Ih後，用平 衡液洗脫；收集洗脫峰，-20°C保存待鑑定。(2. 4)純化的腫瘤特異性凋亡因子鑑定採用SDS電泳法或高效液相法測定蛋白質 純度，純度在95%以上(圖4)，採用紫外分光光度計測定蛋白質含量，大約在0. 5mg/ml ； 採用鱟試劑法測定蛋白質樣品內的內毒素含量，1 200合格。上述各液體配方範圍及準備如下營養瓊脂培養基平皿是，按1. 5%的濃度稱取營養瓊脂，加適量的注射用水，高壓 滅菌，待培養基冷卻到45°C時，加入氨苄青黴素(AP)，終濃度為100yg/ml)，然後將瓊脂倒 入平皿，待瓊脂凝固後，4°C保存備用，(可用1 2周)。LB液體培養基是，以IOOOml為單位按下列比例配製；溶解後高壓滅菌。
蛋白腖IOg
酵母提取物5g
NaClIg
發酵液是，以20L為單位按下列比例配製，發酵罐內高壓滅菌。
蛋白腖200g
酵母提取物IOOg
NaCl20g
CaCl2g
NH4Cl30g
葡萄糖IOOg(單獨高壓，8磅)
磷酸二氫鈉.2H2030g
磷酸氫二鈉.12H20120g
補料液是，以1000ml為單位按下列比例配製。
蛋白腖IOOg
酵母提取物IOOg
葡萄糖200g (700ml水溶解單獨高壓，6《磅)
Imol IPTG(1000 倍)是，過濾除菌，_20°C保存。
IPTG0. 48g
8
水20ml氨苄青黴素(AP，5000倍)，應用濃度為100 μ g/mlAP500mg水5ml20mmol PB緩衝液(pH7. 2)以1000ml為單位按下列比例配製。磷酸二氫鈉.2H203. 12g磷酸氫二鈉.12H207. 16gEDTA0. 37g20mmol PB緩衝液(ρΗ8· 0)以1000ml為單位按下列比例配製。磷酸二氫鈉.2Η203. 12g磷酸氫二鈉.12H207. 16gEDTA0. 37g包涵體溶解液，以IOOml為單位按下列比例配製。20mmol PB 緩衝液(ρΗ8· 0) IOOml肌酸鈉(1.0%-3.0%)1.0 3.(^，取1.58三乙醇胺(10-30mM)0. 13 0. 66ml，取 0. 33mlDTT (10-30mM)0. 15 0. 45g,，取 0. 31g復性液，以IOOOml為單位按下列比例配製。20mmol PB 緩衝液(ρΗ8· 0) 1000mlDTT (10-30mM)1· 5 4. 5g平衡液，以IOOOml為單位按下列比例配製。20mmol PB 緩衝液(ρΗ7· 2) 1000ml肌酸鈉(0.-1. 0% )0. 1 1. 0g，取 1. Og三乙醇胺(ImM)0. 132ml包涵體洗滌液以IOOOml為單位按下列比例配製。20mmol PB 緩衝液(ρΗ7· 2) 1000mlTritonX-IOO (0. 1% )0. Iml尿素(2mol)120g(3)GST-Apoptin融合蛋白的化學化修飾，即GST-Apoptin融合蛋白的激活。(3. 1)實驗材料醫用葉酸，上述純化的重組腫瘤特異性凋亡因子，戊二醛，(3. 2)實驗方法採用戊二醛法將重組腫瘤特異性凋亡因子與葉酸連，用偶聯緩 衝液按下列比例配製重組腫瘤特異性凋亡因子與葉酸連接體系，0. 2mg/ml重組腫瘤特異性凋亡因子Iml1. Omg/ml 葉酸Iml戊二醛(原液125 倍)16 μ 1(0. 2%)將配製好的連接體系，置於室溫(25°C以上)避光放置3h ；將連接液對IOOOml磷 酸鹽緩衝液衝液透析，4°C，12h以上；(3.3)過濾除菌，4°C保存備用。進行下列活性鑑定。(4)新型重組腫瘤特異性凋亡因子體外誘導腫瘤細胞凋亡作用
(4. 1)實驗材料(4. 1. 1)重組腫瘤特異性凋亡因子PB溶液20mmol PB緩衝液(ρΗ7· 2)，0· 肌 酸鈉，ImM三乙醇胺；(4.1.2)人黑色素瘤細胞Α375細胞株(引自軍事醫學科學院)；(4. 2)試驗方法採用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法 測定apoptin誘導腫瘤細胞發生凋亡的活性。(4. 2. 1)常規傳代培養A375細胞；(4. 2. 2)取生長良好的細胞，配製成4 X IO3個/ml的細胞懸液；(4. 2. 3)將細胞懸液加入96孔細胞培養板，0. Iml/孔，37°C，5% CO2培養過夜；(4.2.4)加入上述激活的apoptin，0. Iml/孔，以50 μ g/ml為起點，2倍稀釋，每個 滴度作4孔；(4. 2. 5)37°C，5% CO2 培養 72h ；(4. 2. 6)吸棄培養上清夜，用磷酸鹽緩衝液洗細胞2次；(4. 2. 7)加入用無酚紅 RPMI1640 配製的 MTT(lmg/ml)，50y 1/孔，37°C，5% CO2 培 養3h;(4. 2. 8)吸棄培養上清夜，用磷酸鹽緩衝液洗細胞2次；(4.2.9)加入二甲基亞碸(DMSO)，50 μ 1/孔，37°C，IOmin ；(4.2. 10)用EL340560nm波長，檢測各孔A值。試驗設正常細胞對照，未激活 apoptin 對照。(4.3)結果10 μ g/mL活化的apoptin可使50%以上的腫瘤細胞發生凋亡(圖5)。 而未激活apoptin組細胞與正常對照組細胞沒有差異。(5)新型重組腫瘤特異性凋亡因子體內抗腫瘤作用(5.1)實驗材料雄性BALB/c小鼠(體重18 20g)購於中國醫科大學動物部。小鼠S-180肉瘤 細胞引自瀋陽軍區總醫院醫學實驗科，小鼠腹腔傳代以保證其致瘤性。重組腫瘤特異性凋 亡因子PB溶液20mmol PB緩衝液(pH7. 2)，0. 1 %肌酸鈉，ImM三乙醇胺；(5. 2)實驗方法將S-180腹水肉瘤細胞用生理鹽水配製成2 X 109/L的細胞懸液，接種於小鼠右側 腋部皮下，0. 2ml/只。所有動物常規飼養M。小鼠腫瘤包快長到5mm後，隨機分為重組腫瘤 特異性凋亡因子治療組、GST-Apoptin融合蛋白對照組和生理鹽水組，每組8隻。治療組 小鼠右側腋部皮下注射，50yg(0. ImL)/只；對照組和生理鹽水組分別注射等量、等體積的 GST-Apoptin融合蛋白和生理鹽水。每組小鼠每天注射1次；小鼠常規飼養，每日觀察小鼠 一般生活狀況，腫瘤大小，每6d測量體重，於接種後3wk脫頸椎處死，分離腫瘤組織稱重。(5. 3)結果(5.3. 1)實驗小鼠的一般狀況，小鼠接種S-180肉瘤細胞後，各組小鼠正常餵養， 接種Iwk內一般生理狀況沒有明顯變化。Iwk後，與治療組相比較，GST-Apoptin融合蛋白 對照組和生理鹽水組小鼠進食減少、消瘦、體重下降、皮毛失去光澤，腫瘤包塊明顯增大；到 第2wk時，生理鹽水組小鼠開始出現死亡；而治療組小鼠一般狀況良好。(5. 3. 2) 3wk後活殺小鼠，取腫瘤組織稱瘤重，治療組的瘤重為(0. 56 士0. 41) g，抑瘤率為60. 06%;GST-Apoptin融合蛋白對照組的瘤重為(1. 36 士0. 55) g，抑瘤率為4. 22%。 以生理鹽水組的瘤重為基數，計算出的治療組和GST-Apoptin融合蛋白對照組的抑瘤率差 異顯著(ρ <0.01)(圖6)。 本發明的有益效果是在大腸桿菌中高效表達、穩定好、純度高且有高活性，治療 效果顯著，特別是實施本發明對生產設備沒有特殊的要求，適合規模化和產業化，對於人類 攻克腫瘤、延長人類壽命具有重要意義。
權利要求
一種製備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特徵是(1)通過人工合成的方法直接獲得Apoptin的基因片段，構建含GST Apoptin基因的原核表達載體pGEX A；(2)GST Apoptin融合蛋白的發酵、高效表達、溶解、復性及純化，具體是將(1)表達GST Apoptin融合蛋白的工程菌接種到含氨苄青黴素的液體肉湯培養基中，37℃搖床內培養，將菌液按比例轉種到含AP的LB培養基中擴增，37℃搖床內培養，菌液濃度達到光密為1.0時按比例接種到發酵罐內，待菌液濃度達到光密為2.0後，加入異丙基 β D硫代半乳糖苷誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加填料液，氨水自動調節pH7.0值，收集上述發酵液；離心收集菌體，高壓勻漿破碎菌體，離心收集沉澱，即為包涵體；取包涵體，加入包涵體溶解液磁力攪拌溶解4h；離心收集上清液；按比例緩慢加入復性液，室溫磁力攪拌溶解4h；4℃復性12h以上；超濾濃縮；將上述濃縮的復性液通過用平衡液平衡的瓊脂糖凝膠層析柱，收集目的峰；將目的峰再上用平衡液平衡好的去內毒素親和層析柱，收集洗脫峰即為純化的重組腫瘤特異性凋亡因子；(3)GST Apoptin融合蛋白的化學修飾，將上步驟後的GST Apoptin與葉酸連接，使GST Apoptin獲得活性，誘導腫瘤細胞凋亡作用。
2.—種權利要求1所述的製備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法獲得的制 品，其特徵是它用於抗腫瘤治療。
3.按照權利要求1所述的製備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特徵 是所說的(2)GST-Apoptin融合蛋白的發酵、高效表達、溶解、復性及純化是(2. 1)工程菌的活化、發酵及包涵體的回收，取_70°C保存的工程菌種接種到含AP的營 養瓊脂平板培養基上，37°C培養12h以上；挑取單個菌落接種到含AP的LB液體培養基中， 37°C搖床內培養12h以上，將菌液按1 10比例接種到發酵罐內，37°C條件下培養；待菌液 濃度達到2. OOD後，加入IPTG誘導劑；誘導培養4h，同時小量持續補加填料液，氨水自動調 節pH7. O值。離心收集菌體，菌體用PB緩衝液懸浮，冰浴條件下，高壓勻漿破碎菌體，反覆 4次。離心破碎後的菌體，收集沉澱，即為包涵體；(2. 2)包涵體的溶解和復性稱取適量包涵體，加入包涵體溶解液，室溫條件下，磁力攪 拌溶解4h ；離心4°C，9000rpm, 15min,收集上清液；按1 8比例緩慢加入復性液，室溫磁力 攪拌溶解4h ；4°C復性12h以上；超濾濃縮20倍以上，立即純化或-20°C保存備用；(2. 3)腫瘤特異性凋亡因子純化用平衡液平衡S印ar0Sel2層析柱；將上述濃縮的復性 液按床體積的3%比例上樣，流速為2ml/min ；分步收集第2個峰；SDS電泳鑑定後，取分子 量為39kD純度高的蛋白質部分；將上述樣品再上用平衡液平衡好的FF層析柱或-20°C保 存備用，按床體積75%比例上樣，樣品在柱內留置Ih後，用平衡液洗脫；收集洗脫峰，-20°C 保存待鑑定；(2.4)純化的腫瘤特異性凋亡因子鑑定採用SDS電泳法或高效液相法測定蛋白質純 度，純度在95%以上，採用紫外分光光度計測定蛋白質含量，大約在0. 5mg/ml ；採用鱟試劑 法測定蛋白質樣品內的內毒素含量，1 200合格；上述各液體配方範圍及準備如下營養瓊脂培養基平皿是，按1. 5%的濃度稱取營養瓊脂，加適量的注射用水，高壓滅菌， 待培養基冷卻到45°C時，加入氨苄青黴素(AP)，終濃度為100 μ g/ml)，然後將瓊脂倒入平氫二 糖二氫 萄酸酸 葡磷磷2Η20 12Η90皿，待瓊脂凝固後，4°C保存備用，(可用1 2周)。LB液體培養基是，以IOOOml為單位按下列比例配製溶解後高壓滅菌。 蛋白腖 IOg 酵母提取物5g NaClIg發酵液是，以20L為單位按下列比例配製，發酵罐內高壓滅菌。 蛋白腖200g酵母提取物IOOgNaCl20gCaCl2g30gIOOg(單獨高壓，8磅) 30g 120g補料液是，以IOOOml為單位按下列比例配製。 蛋白腖IOOg酵母提取物IOOg葡萄糖200g(700ml水溶解單獨高壓，8磅)Imol IPTG(1000倍)是，過濾除菌，_20°C保存。 IPTG0.48g水20ml氨苄青黴素(AP，5000倍)，應用濃度為100 μ g/ml AP500mg水5ml20mmol PB緩衝液(pH7. 2)以1000ml為單位按下列比例配製。 磷酸二氫鈉.2H203. 12g磷酸氫二鈉.12H207. 16gEDTA0.37g20mmol PB緩衝液(pH8. 0)以1000ml為單位按下列比例配製。 磷酸二氫鈉.2H203. 12g磷酸氫二鈉.12H207. 16gEDTA0.37g包涵體溶解液，以IOOml為單位按下列比例配製。 20mmol PB 緩衝液(pH8. 0) IOOml 肌酸鈉(1. 0%-3. 0% ) 1.0 3. Og 三乙醇胺(10-30mM)0. 13 0. 66mlDTT(10-30mM)0. 15 0. 45g復性液，以IOOOml為單位按下列比例配製。 20mmol PB 緩衝液(pH8. 0) 1000mlDTT(10-30mM)1. 5 4. 5g平衡液，以IOOOml為單位按下列比例配製。 20mmol PB 緩衝液(pH7. 2) 1000ml 肌酸鈉(0. -1. 0% ) 0.1 l.Og 三乙醇胺(ImM)0. 132ml包涵體洗滌液以IOOOml為單位按下列比例配製。 20mmol PB 緩衝液(pH7. 2) 1000ml TritonX-IOO (0. 1% )0. Iml尿素(2mol)120g。
4.按照權利要求1所述的製備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特徵 是所說的(3)GST-Apoptin融合蛋白的化學化修飾步驟是，採用戊二醛法按下列比例配製 GST-Apoptin融合蛋白與葉酸連接體系，具體是體積相同的0. 2mg/ml GST-Apoptin融合蛋 白和1.0mg/ml葉酸，再加入微量的戊二醛，將配製好的連接體系，置於室溫25°C以上避光 放置3h ；將連接液對磷酸鹽緩衝液透析，4°C，12h以上；過濾除菌。
5.按照權利要求4所述的製備具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子的方法，其特徵 是所說的GST-Apoptin融合蛋白與葉酸連接體系是，用磷酸鹽緩衝液按下列比例配製重 組腫瘤特異性凋亡因子與葉酸連接體系，.0.2mg/ml重組腫瘤特異性凋亡因子 Iml.1.Omg/ml 葉酸Iml 戊二醛(原液125倍) 16 μ 1將配製好的連接體系，置於室溫25°C以上避光放置3h ；將連接液對IOOOml磷酸鹽緩衝 液透析，4°C，12h以上。
全文摘要
本發明提供了一種具有活性重組腫瘤特異性凋亡因子的製備方法及其製品的應用，其要點是(1)通過人工合成的方法直接獲得Apoptin的基因片段，構建含GST-Apoptin基因的原核表達載體pGEX-A；(2)GST-Apoptin融合蛋白的發酵，高效表達，溶解，復性及純化；(3)GST-Apoptin融合蛋白的化學化修飾，得到具有活性的重組腫瘤特異性凋亡因子，誘導腫瘤細胞凋亡，用於抗腫瘤治療。本發明的有益效果是在大腸桿菌中高效表達、穩定好、純度高且有高活性，適合規模化和產業化。
文檔編號C07K1/107GK101921820SQ20101010767
公開日2010年12月22日 申請日期2010年2月10日 優先權日2010年2月10日
發明者趙洪禮 申請人:趙洪禮