用於治療癌症的方法和藥物組合物的製作方法
2023-10-18 14:20:14 1
用於治療癌症的方法和藥物組合物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於治療癌症的包含胺基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO：1)的可溶肽或者其功能保守性變體。本發明還涉及一種用於治療癌症的藥物組合物，包含至少一種本發明的可溶肽，或者至少一種本發明的核酸，或者至少一種本發明的表達載體，或者至少一種本發明中的宿主細胞，和藥學上可接受的載體。
【專利說明】用於治療癌症的方法和藥物組合物
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用於治療癌症的包含胺基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO :1)的 可溶肽或者其功能保守性變體。
[0002] 本發明還涉及一種用於治療癌症的藥物組合物，包含至少一種本發明的可溶肽， 或者至少一種本發明的核酸，或者至少一種本發明的表達載體，或者至少一種本發明的宿 主細胞，和一種藥學上可接受的載體。
【背景技術】
[0003] 癌症是一種惡性腫瘤，是一組全部涉及失調的細胞生長的廣泛的各種疾病。2007 年，癌症引起的死亡佔全世界全部死亡人數的13% (7900000)。隨著越來越多的人更加長 壽以及發展中國家生活方式的巨大改變，比例將繼續上升。
[0004] 特別地，慢性淋巴細胞白血病（CLL)是西方國家中最常見的成人白血病，其特徵 在於外周血、骨髓和二級淋巴器官中單克隆⑶5+B-淋巴細胞的逐步累積。所形成的阻 塞導致免疫和造血系統的逐步失效。預測CLL進展的高風險標誌包括17pl3(TP53)和 llq22_q23(ATM)的細胞遺傳學特徵的突變/缺失、IGHV的未突變狀態、ΖΑΡ70的高表達、 CD38、可溶性CD23的增加，以及正在研宄但還沒有證實的N0TCH1，MYD88、BIRC3、XP01、 KLHL6、SF3B1 和 POTl 基因中的突變[Gribben JG，2010;Lanasa MC，2010 and Chiorazzi N.等，2005]。具有與ATM和TP53基因相關的機能障礙的患者預後最差，需要特定的積極治 療，包括異基因幹細胞移植[Pospisilova N，2012]。CLL的特徵是：（i)不可治癒，因為所 有的患者最終都會復發，強調該疾病對現有治療方案的抗性。（ii)對現有的但非最佳的治 療的響應而言是非常異質性疾病。（iii)耐藥性仍然是CLL治療失敗的一個主要原因，且由 於該疾病自然病程的延長和重複治療引起的其不可避免的命運產生了相關的社會和健康 問題。（iv)主要影響老年人，並且被認為是大部分年齡相關癌症的一個典型例子。（V)仍 然缺乏強大而特定的用於預測治療響應的標記物，儘管迫切需要這些標記物以實現與風險 相適應的個性化的治療，在最小化成本的同時使臨床獲益最大化。
[0005] 儘管導致這種惡性腫瘤發展的直接原因尚不完全清楚，但現在已經完全證實， CLL代表由增殖和細胞程序性死亡（PCD)之間的不平衡引起的人類惡性腫瘤的完美例子 [Chiorazzi N，2007]。所以，更好的了解調控白血病CLL細胞壽命的P⑶機制應該能夠對 治療性幹預這種白血病提供關鍵的進展。
[0006] PCD是細胞自我毀滅的過程，其特徵在於模式化的超微結構的變化，包括線粒體的 改變、細胞核和細胞質的濃縮、細胞膜出泡以及磷脂醯絲氨酸的外顯。過去十年進行的大量 研宄已經鑑定了多種PCD調控中涉及的酶和其他調控蛋白。這些研宄的結論是，在大多數 情況下，當半胱氨酸蛋白酶（也稱為半胱天冬酶）家族被激活時發生PCD。由於通過使用半 胱天冬酶活化劑誘導細胞凋亡在理論上可構成對癌症的治療，最初的促凋亡抗腫瘤實驗都 集中在半胱天冬酶的活性上。不幸的是，大部分這些研宄由於其低效率而仍處於臨床前研 宄階段。某種程度上，這可能是由於即使當半胱天冬酶級聯受阻，PCD仍可進行的事實。該 事實也揭示了定義為獨立於半胱天冬酶的替代通路的存在。因此，獨立於半胱天冬酶的PCD 通路的綜合分析對CLL和其他腫瘤性疾病的治療策略的設計提供了新的挑戰。
[0007] 如上所述，耐藥性仍然是CLL治療失敗的一個主要原因。事實上，目前的治療是形 成若干副作用的原因，增加了治療相關殘疾的發生，最終影響到大多數患者的健康，如果不 是生存率的話。至今為止，治療的目的是維持最佳生活質量，且只有當患者出現其疾病的症 狀時才開始治療。對大多數患者來說，這意味著用"觀望"的方法來確定疾病的發展速度以 及評估症狀的發展。對CLL患者的最初治療包括一種核苷類似物（氟達拉賓）或者一種烷 化劑（苯丁酸氦芥）。聯合治療方案，例如氟達拉賓和環磷醯胺（FC)，或者是目前公認的標 準一線治療的最近的在FC中添加利妥昔單抗（FCR治療），改進了最初的治療方案。對於耐 藥或復發的患者，也開發了一些替代治療，比如苯達莫司汀、蛋白酶抑制劑、或者單克隆抗 體（抗⑶52、優化的抗⑶20、抗⑶23等）。
[0008] 就目前的臨床試驗而言，更相關的是單克隆抗體（GA101，魯昔單抗、魯卡木單 抗）、BH3模擬物（obatoclax、ABT-263)、細胞周期蛋白依賴性的激酶抑制劑（黃酮吡醇、 SNS-032)，Lyn-激酶抑制劑（達沙替尼、巴非替尼）、低甲基化劑（氮胞苷、地西他濱）、組 蛋白去乙醯化酶抑制劑（parobinastat)、嗓呤類似物（8-氯腺甘、forodesine)和小分子 免疫藥物（TRU-016)的使用。抑制B細胞受體結合下遊信號的分子是新型的作用在不同的 靶標上的口服試劑，包括磷脂醯肌醇3-激酶抑制劑（CAL-101)、布魯頓酪氨酸激酶（BTK) (PCI-32765)和脾酪氨酸激酶（SYK)抑制劑（fostamitinib) 〇
[0009] 上述的大多數化療治療經由半胱天冬酶依賴性的機制誘導細胞毒性（見上，第2 頁），從而產生非常多變的結果：許多患者具有陽性反應，而其他患者仍然難治（15-25%的 CLL患者在疾病過程中變得難治）。事實上，由於白血病B細胞存在分子缺陷，使其能特別 地對抗半胱天冬酶依賴性的P⑶通路（P53失活，抗凋亡蛋白例如Mcl-I或Bcl-2的過表 達），因此很大一部分CLL患者用目前的化療治療很難治療。因此，引入能經由替代的獨立 於半胱天冬酶的PCD通路誘導PCD的新藥，能夠為改進目前的CLL治療中所使用的策略提 供新的手段。
[0010] ⑶47受體是一種廣泛表達的免疫球蛋白（Ig)超家族成員，同時作為凝血栓蛋 白-I(TSP-I)的受體和跨膜信號調節蛋白SIRPa和γ的配體[Brown EJ et al.，2001]。 這些分子調節免疫系統的各種生物現象，包括血小板激活、白細胞迀移、巨噬細胞多核化 和P⑶。TSP-I被證實經由其COOH端的細胞結合域特異性結合⑶47,相比而言，SIRP α和 SIRP γ均不涉及⑶47誘導的P⑶。許多癌症似乎通過上調⑶47作為免疫逃避機制，而最 近的研宄表明CD47是不同類型非霍金奇淋巴瘤（NHL)包括CLL中的預後因子和潛在治療 革巴標[Edris，B et al.，2012 ;Willingham，S. B 等，2012 ;Chao，M. P 等，2010 ;Jaiswal，S 等， 2009 and Chao，M. P等，2011]。本發明人和其他人最近證實，通過固定化的抗⑶47 mAb (不 通過可溶性的抗⑶47)與⑶47的結合，即使是在來自難治療患者的CLL細胞中，也能誘導 獨立於半胱天冬酶的P⑶。
[0011] 發明概述
[0012] 本發明闡述了通過4N1K(SEQ ID NO :1)(模擬TSP-I C端結構域的可溶性單價十 肽）與CD47的結合來誘導B-慢性淋巴細胞白血病（CLL)原代細胞中獨立於半胱天冬酶 的PCD。與需要固定來誘導PCD的抗CD47單抗相反，可溶性4N1K肽不需要包被於塑料制 品上來誘導獨立於半胱天冬酶的K：D。陰性對照肽4NGG(SEQ ID NO :2-兩個胺基酸突變的 4N1K)不能誘導P⑶，意味著4N1K誘導P⑶的特異性（圖1)。並且，4N1K及其衍生物PKHBl 與CD47的結合能特異性地清除白血病B細胞，而不會清除來自CLL患者的健康的B淋巴細 胞或者靜止的正常B細胞（圖2、圖5和圖6)，且代表好於半胱天冬酶依賴性PCD的誘導死 亡手段（這種死亡形式甚至在來自攜帶17pl3或Ilq22_q23缺失：ATM/TP53失活的難治性 個體的CLL細胞內也有效，圖2)。小鼠體內研宄充分證實了這種肽策略在白血病細胞中誘 導PCD的特異性（圖7和圖8)。
[0013] 因此，本發明涉及一種用於治療癌症的包含胺基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO : 1)的可溶肽或者其功能保守性變體。
[0014] 本發明還涉及一種用於治療癌症的藥物組合物，包含至少一種本發明的可溶肽， 或者至少一種本發明的核酸，或者至少一種本發明的表達載體，或者至少一種本發明的宿 主細胞，和一種藥學上可接受的載體。
[0015] 發明詳述
[0016] 肽及其用塗
[0017] 本發明的第一個目的涉及一種用於治療癌症的包含胺基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID NO :1)的可溶肽或者其功能保守性變體。
[0018] 本發明也涵蓋上述包含SEQ ID NO :1的可溶肽的功能保守性變體。
[0019] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽可與SEQ ID NO :1具有1、2或3個氨基 酸的差異。
[0020] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽可與SEQ ID NO :1具有4或5個氨基 酸的差異。
[0021] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽與SEQ ID NO :1具有至少75%的一致 性，甚至更加優選的，具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%的一致性， 並仍能降低腫瘤細胞增殖或者仍能在腫瘤細胞中誘導PCD。
[0022] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽在於SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列或 與 SEQ ID N0:1 具有至少 75%、優選至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 99. 5%或99. 9%-致性，並仍能降低腫瘤細胞增殖或者仍能在腫瘤細胞中誘導PCD的其變 體。
[0023] 為驗證新生成的可溶肽是否與最初表徵的肽4N1K -樣能誘導相同類型的獨立於 半胱天冬酶的PCD，可對每條肽進行流式細胞儀分析（例如如圖2所述）。包含和不包含半 胱天冬酶抑制劑Z-VAD. fmk的處理中所獲得的結果對比將支持由4N1K衍生肽誘導的細胞 死亡模式是獨立於半胱天冬酶的。此外，在不同腫瘤細胞中進行的時程和劑量響應將確定 每種肽和每種腫瘤細胞類型的最佳條件。
[0024] 在本發明的一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於50個胺基酸的胺基酸序列， 其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0025] 在本發明的另一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於45個胺基酸的胺基酸序 列，其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0026] 在本發明的另一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於40個胺基酸的胺基酸序 列，其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0027] 在本發明的另一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於30個胺基酸的胺基酸序 列，其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0028] 在本發明的另一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於20個胺基酸的胺基酸序 列，其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0029] 在本發明的另一個實施方案中，所述可溶肽是長度小於15個胺基酸的胺基酸序 列，其包含如上文所定義的胺基酸序列SEQ ID NO :1。
[0030] 如本文所用的，術語"功能保守性變體"是指在不改變肽的總體構造和功能的情況 下改變（插入、缺失或者替換）蛋白質或酶中給定的胺基酸殘基的那些。此類變體包括具 有胺基酸改變例如缺失、插入和/或替換的蛋白質。"缺失"是指蛋白質中一個或多個氨基 酸的缺少。"插入"是指蛋白質中一個或多個胺基酸的增加。"替換"是指蛋白質中用另一個 胺基酸殘基替代一個或多個胺基酸。典型地，給定的胺基酸被具有相似性質（例如極性、氫 結合可能性、酸性、鹼性、疏水性、芳香性等）的胺基酸所替代。所述給定的胺基酸可以是天 然胺基酸或非天然胺基酸。除了蛋白質中標明是保守性的胺基酸以外的其他胺基酸可以不 同，這樣任意兩個具有相似功能的蛋白質之間的胺基酸序列相似度可以不同且可以是，例 如通過如其中相似性是基於MEGALIGN算法的Cluster Method的比對方案測定，其相似度 為70 %到99 %。"功能保守性變體"還包括通過BLAST或FASTA算法測定與原蛋白或母蛋白 相比具有至少60 %胺基酸一致性、優選至少75%、更優選至少85%、仍然優選至少90%、甚 至最優選至少95%胺基酸一致性且具有相同或基本相似性質或功能的肽。當兩條胺基酸序 列具有大於80%、優選大於85%、優選大於90%的胺基酸相同，或者在較短序列全長內具 有大於約90%，優選大於95%是相似的（功能上一致），則該兩條胺基酸序列被認為是"基 本上同源"或"基本上相似"。優選，相似或同源序列可以通過比對採用例如GCG(Geneti CS Computer Group,Program Manual for the GCG Package,Version 7,Madison，Wisconsin) 累積程序，或其他任何序列比對算法如BLAST、FASTA等鑑定。
[0031] 典型地，本發明涵蓋與包含SEQ ID NO :1的可溶肽基本上一致的可溶肽，其中一個 或多個殘基被功能相似的殘基保守性替換，且具有上文描述的包含SEQ ID NO :1的可溶肽 的功能方面，即仍能基本上以由給定胺基酸序列組成的肽的相同方式降低腫瘤細胞增殖。
[0032] 保守性替換的例子包括用一個非極性（疏水性）殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸 或蛋氨酸替換另一個非極性殘基；用一個極性（親水性）殘基替換另一個極性殘基，如精氨 酸和賴氨酸之間、穀氨醯胺和天冬醯胺之間、甘氨酸和絲氨酸之間的替換；用一個鹼性殘基 如賴氨酸、精氨酸和組氨酸替換另一個鹼性殘基；或者用一個酸性殘基如天冬氨酸和穀氨 酸替換另一個酸性殘基。
[0033] 術語"保守性替換"還包括用化學衍生的殘基取代非衍生的殘基。"化學衍生物"是 指具有一個或多個通過側鏈官能團的反應化學衍生的殘基的主題肽。此類衍生物分子的例 子包括，例如其中游離氨基被衍生以形成胺鹽酸鹽、對甲苯磺醯基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、 氯乙醯基或甲醯基的那些分子。游離羧基可被衍生以形成鹽、甲酯和乙酯或其他類型的酯 或醯肼。游離羥基可被衍生以形成〇-醯基或〇-烷基衍生物。組氨酸的咪唑氮可被衍生以 形成N-咪挫-節基組氨酸（N-im-benzylhistidine)。化學衍生物還包括含有20個標準氨 基酸的一個或多個天然存在的胺基酸衍生物的肽。例如：可用4-羥脯氨酸替換脯氨酸，可 用5-羥賴氨酸替換賴氨酸，可用3-甲基組氨酸替換組氨酸，可以高絲氨酸替換絲氨酸，可 用鳥氨酸替換賴氨酸。術語"保守性替換"還包括用於控制和穩定肽或者蛋白質二級結構 的非天然胺基酸。這些非天然胺基酸是化學修飾的胺基酸，例如如下所述的prolinoamino acid、β-胺基酸、N-甲基胺基酸、環丙基胺基酸、α，α-取代的胺基酸。這些非天然氨基 酸可包括含氟化、氯化、溴化或碘化修飾的胺基酸。
[0034] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽可如實施例2中所描述。
[0035] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2和3中所描述的PKHB 1 肽。
[0036] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2中所描述的PKHB 3肽。
[0037] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2中所描述的PKHB 4肽。
[0038] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2中所描述的PKHB 9肽。
[0039] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2中所描述的PKHB 10肽。
[0040] 在另一個實施方案中，本發明所述的可溶肽是實施例2中所描述的PKHB 11肽。
[0041] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽可包含標籤。標籤是指可用於純化可溶 肽的包含表位的序列。它可以通過各種技術如親和層析連接，用於在細胞或組織樣品中採 用免疫標記技術定位所述肽或多肽，以及通過免疫印跡法等檢測所述肽或多肽。本領域常 用的標籤的例子包括GST (穀胱甘肽-S-轉移酶）標籤、FLAG?標籤、Strep ?標籤、V5標籤、 myc標籤、His標籤等。
[0042] 在一個實施方案中，本發明所述的可溶肽可能被螢光染料標記。染料標記的螢光 肽是細胞研宄中的重要工具。可將肽標記在N-端側或C-端側上。
[0043] 採用胺反應性螢光染料的N-端肽標記：
[0044] 胺反應性螢光探針被廣泛用於修飾肽的N端或賴氨酸殘基。已開發許多螢光胺反 應性染料來標記各種肽，且由此產生的結合物被廣泛用於生物應用。目前用於標記肽的三 種主要類型的胺反應性螢光試劑包括：琥珀醯亞胺酯（SE)、異硫氰酸酯和磺醯氯。
[0045] 採用包含胺的螢光染料的C-端標記：
[0046] 包含胺的染料用於採用水溶性碳化二亞胺（比如EDC)將肽的羧基轉化為醯胺基 來修飾肽。NHS或NHSS可用於提高EDC介導的蛋白-羧酸結合的耦合效率。
[0047] 4N1K衍生的標記肽具有以下通式：
【權利要求】
1. 一種用於治療癌症的包含胺基酸序列：KRFYVVMWKK(SEQ ID N0:1)的可溶肽或者其 功能保守性變體。
2. 根據權利要求1所述的可溶肽，其中所述可溶肽可與SEQ ID NO :1具有1、2或3個 胺基酸的差異。
3. 根據權利要求1所述的可溶肽，其中所述可溶肽為胺基酸序列SEQ ID NO :1。
4. 根據權利要求1-3任一項所述的可溶肽，其中所述癌症是白血病。
5. 根據權利要求4所述的可溶肽，其中所述白血病是B-慢性淋巴細胞白血病（CLL)。
6. 根據權利要求5所述的可溶肽，其中所述CLL是難治性CLL。
7. -種用於預防或者治療癌症的編碼權利要求1-6任一項所述的可溶肽的核酸。
8. -種用於預防或者治療癌症的包含權利要求7所述的核酸的表達載體。
9. 一種用於預防或者治療癌症的包含權利要求8所述的表達載體的宿主細胞。
10. -種用於治療癌症的藥物組合物，包含至少一種權利要求1-6任一項所述的可溶 肽，或至少一種權利要求7所述的核酸，或至少一種權利要求8所述的表達載體，或至少一 種權利要求9所述的宿主細胞，和藥學上可接受的載體。
11. 式（I)的可溶肽： I
β (I)
12. 式（II)的可溶肽：
13. 式（III)的可溶肽：
14. 一種用於治療癌症的根據權利要求11-13所述的可溶肽。
【文檔編號】A61K38/08GK104519898SQ201380029870
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年6月6日 優先權日:2012年6月6日
【發明者】桑託斯·蘇西, 皮埃爾·洛奈, 菲利普·卡羅揚, 埃萊納·梅爾-貝拉爾 申請人:國家健康與醫學研究院, 皮埃爾與瑪麗-居裡大學, 巴黎大學迪德羅特第七分校, 笛卡爾巴黎大學, 巴黎公共救濟院