一種銀杏葉提取物及該提取物高純度有效成分的分離新生產工藝的製作方法
2023-10-18 06:47:59 2
專利名稱：一種銀杏葉提取物及該提取物高純度有效成分的分離新生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從植物中提取並分離藥物有效成分的方法，尤其涉及一種採用大孔吸附樹脂色譜分離技術從銀杏葉或銀杏葉粗提物中提取和分離高純度銀杏內酯和銀杏黃酮的方法，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
銀杏(Ginkgo biloba L.)又名公孫樹，是最古老的中生代孑遺植物之一，素有裸子植物「活化石」之稱，為我國特產。我國銀杏資源擁有量約佔世界總量的70％。銀杏葉中主要有效成份為黃酮類(flavonoids)和萜內酯類化合物(terpene lactones)，具有擴張冠狀血管、改善腦循環、消除氧自由基、抑制血小板活化因子(PA F)等作用，臨床上用於治療冠心病、腦血栓、腦缺血、腦功能障礙、腦傷後遺症、神經系統疾病和哮喘等。
最近十年來的研究表明，銀杏內酯是PAF的高效拮抗劑，尤其是銀杏內酯B對PAF的拮抗作用最強。由於PAF與心腦血管疾病的發生發展密切相關，也與哮喘、休克、炎症、胃潰瘍、腎病等發生密切相關，故銀杏內酯目前被認為是最有臨床應用前景的天然PAF受體拮抗劑。新近提出的一種觀點是由於銀杏葉提取物中的黃酮、銀杏內酯和白果內酯三大成份藥理作用各不相同，為了更經濟合理地使用藥物，讓每種有效成份都充分發揮藥理作用，應區別不同病種分別給藥，當治療神經系統疾病如脊髓神經脫髓鞘症及老年痴呆症給白果內酯最好，而不必給予銀杏黃酮和銀杏內酯；當治療心腦血管疾病時則主要使用銀杏黃酮和銀杏內酯，對於PAF引起的疾病則只需要銀杏內酯就可。
目前國內外提取、分離銀杏葉及其提取物中主要有效成分銀杏內酯和銀杏黃酮的方法主要有大孔吸附樹脂法、酶法、超臨界CO2萃取法和高速逆流色譜技術提取法(High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC)等。但上述所有的方法製備而得的產品都是銀杏內酯和銀杏黃酮的混合物，其中兩種成分的含量相對較低，分別為約10％和30％。若要將兩種成分分離，則須較多步驟，操作繁瑣，有效成分種類和數量損失均較大。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種能夠快速、簡捷的從銀杏葉或銀杏葉粗提物中提取並分離高純度銀杏內酯和銀杏黃酮的方法，該銀杏葉粗提物可市售購買得到也可按照常規方法(參考文獻1、Klaus-Peter Schwabe，Karlsruhe.Extract from Leaves of Ginkgo Biloba for Intravenous Injection or Infusion.U.S.P.，5512286；2、李新崗，韋瑋，陳薇.富含銀杏內酯的銀杏葉幹浸膏製備工藝.中國醫藥工業雜誌，1998，29(1)8～9)製備得到。
本發明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種從銀杏葉或銀杏葉粗提物中提取並分離銀杏內酯和銀杏黃酮的方法，包括以下步驟(1)、將新鮮或乾燥銀杏葉用水煎煮或將銀杏葉粗提物用水溶解，將煎煮液或水溶液過濾，將所得濾液全部上大孔吸附樹脂柱後，依次用蒸餾水和5％～25％乙醇，煎煮液或水溶液過濾，洗脫雜質，接著用0.01％～10％鹼水洗脫樹脂柱至流出液無色，收集鹼水洗脫液，調pH 3～5後濃縮至幹，洗滌，烘乾，得銀杏黃酮；(2)、樹脂柱繼續以蒸餾水洗至流出液pH為中性，棄去水洗液；再以30％～95％乙醇溶液洗脫至流出液無色，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，萃取，減壓蒸除萃取溶劑，殘留物用乙醇溶解，向溶解液中加入吸附劑，攪拌吸附，過濾，濾渣棄去，濾液減壓回收溶劑，殘物在40～80℃(更優選為50～60℃)條件下乾燥，得銀杏內酯粗品；或進一步將銀杏內酯粗品採用常規方法精製為銀杏內酯精品。
上述製備方法中，步驟(1)中優選將銀杏葉藥材粉末加1～100倍藥材量(W/V)的水，煎煮1～3次，每次煎煮5min～3h；濾液上大孔吸附樹脂柱時，大孔樹脂用量與原藥材量之比(V/W)為1∶10～10∶1，更優選為1∶1～3∶1；控制濾液上柱的液體流速為0.5～10倍樹脂柱體積/h，優選為控制濾液上柱的液體流速為1～3倍樹脂柱體積/h；步驟(1)中用蒸餾水洗柱時，優選用3～50倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，更優選用5～8倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫；控制洗脫液的流速為0.5～10倍樹脂柱體積/h，優選為1～3倍樹脂柱體積/h；步驟(1)中用5％～25％乙醇洗脫雜質時，優選用20％乙醇進行洗脫，洗脫量為至流出液澄清透明為止；
步驟(1)中用0.01％～10％鹼水洗脫樹脂柱時，優選用0.1～1％NaOH進行洗脫，洗脫量為至流出液顏色淡或無色為止；步驟(2)中，用蒸餾水洗柱時，其洗脫量優選為洗脫至流出液pH值為中性時為止；步驟(2)中用30％～95％乙醇溶液洗脫樹脂柱時，優選用60％乙醇進行洗脫，洗脫量為至流出液顏色淡或無色為止；步驟(2)中將所收集的乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味後進行萃取時，優選用1～20倍重量的乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、正丁醇、戊醇或乙醚萃取2～10次，更優選用4倍重量的乙酸乙酯萃取5次；步驟(2)中減壓蒸除萃取溶劑後，殘留物優選用1/10～5倍重量的乙醇溶解，向溶解液中優選加入1/100～1/5倍重量的活性炭，攪拌吸附15min～5h；更優選的，減壓蒸除乙酸乙酯後，殘留物用1～3倍重量的乙醇溶解，向溶解液中加入1/10倍重量的活性炭，攪拌吸附1～2h；步驟(2)中將銀杏內酯粗品精製為銀杏內酯精品時，作為優選的，包括以下步驟將銀杏內酯粗品溶於甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述兩種或兩種以上以任意比例所組成的混合溶液中，加入蒸餾水，離心除去膠狀水液，減壓乾燥；將乾燥後的銀杏內酯固體溶於甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述兩種或兩種以上以任意比例所組成的混合溶液中，精濾，濾液在低於25℃(更優選為10～12℃)條件下放置過夜，析出白色結晶，過濾，乾燥，得銀杏內酯精品；更優選的，將銀杏內酯粗品溶於0.5～10倍重量的丙酮中，攪拌下慢慢加入2～20倍重量的蒸餾水；向乾燥後的銀杏內酯固體中加入0.5～5倍量(W/V)10％～60％甲醇，於40～80℃溶解，採用微孔濾膜精濾；最優選的，將銀杏內酯粗品溶於2～3倍重量的丙酮中，攪拌下慢慢加入8倍重量的蒸餾水；向乾燥後的銀杏內酯固體中加入等量(W/V)的30％甲醇，於50～60℃溶解。
本發明中所述的大孔吸附樹脂柱填料型號可選自AB-8、X-5、S-8、SIP-1300、MDA、NKA-II、D-101、HPD-100、HPD-400、ADS-17、或BS-55等大孔吸附樹脂柱；所述的大孔吸附樹脂柱的材質為玻璃、不鏽鋼或耐酸、鹼及有機溶劑的有機高分子；大孔吸附樹脂柱的徑高比為1∶1～1∶20。
本發明方法中所用到的鹼可以為任意一種強鹼，弱鹼或弱酸的鹼金屬鹽等，例如可以為NaOH、KOH、NaHCO3、Na2CO3、NH4OH等。
銀杏黃酮類成分化學結構的共同特徵是含有多個弱酸性的酚羥基，特別是都含有酸性最強的7位和4』位游離酚羥基。因此，此類結構的化合物都可溶於弱鹼 (R1～R4分別被H或糖基所取代)銀杏黃酮類化合物結構式性溶液，在大孔吸附樹脂上就可生成水溶性的鹽類被先洗脫，實現與銀杏內酯類成分的完全分離(如下所示)。銀杏內酯類成分化學結構中有3個內酯環，雖然 難溶於水 水溶性(R1～R4分別被H或糖基所取代)銀杏黃酮類化合物在酸、鹼溶液中的化學結構互變示意圖在鹼性環境中易開環，但只有在體系受熱情況下開環反應才易發生，在常溫下內酯環不易開環。本發明大孔吸附樹脂的洗脫過程都是在常溫下進行，在用稀鹼液洗脫黃酮類成分時不會使內酯類成分化學結構發生化學變化。同時，將銀杏葉水提液流經大孔吸附樹脂柱時，水提液中大量鞣質等酚性成分也被大孔吸附樹脂吸附，蒸餾水或低濃度醇對此類成分並無很好的洗脫作用；再以較高濃度醇洗脫有效成分時，此類物質也被大量洗脫，從而影響產品質量。因此，本發明方法採用在樹脂柱上進行稀鹼液洗脫操作步驟，可有效洗脫鞣質等酚性雜質，從而得到高純度的銀杏內酯。通過本發明方法製備而得的銀杏內酯和銀杏黃酮，二者既可以配伍使用，用於治療心腦血管病，也可以單獨使用銀杏內酯治療頑固性哮喘等PAF所致的疾患。如此不僅使原藥材得到更經濟合理地利用，也將有助於國內第四代銀杏製劑的研發。
現有技術從銀杏葉或其提取物中提取銀杏內酯和銀杏黃酮時，使用乙醇或丙酮等有機溶劑作為銀杏藥材提取溶劑，使用有機溶劑提取銀杏藥材後再減壓蒸除溶劑，殘液再上大孔吸附樹脂，銀杏藥材提取液上大孔吸附樹脂後，先用水及低濃度乙醇洗脫除去雜質，再用較高濃度乙醇洗脫有效成分，所得產品是黃酮和萜內酯的混合物，若要將兩者分離，則需極繁雜工藝，所製備的高純度銀杏總黃酮是以完全損失總萜內酯為代價，反之亦然。
本發明方法採用廉價且環保的水作為銀杏溶劑提取藥材，藥材中有效成分提取轉移率與現有方法相當，同時又避免了有機溶劑的使用導致生產成本上升以及所造成的環境汙染。提取液經過濾後直接過大孔吸附樹脂柱，避免了現有技術中需要採用的將有機溶劑提取液加熱、減壓濃縮等煩瑣步驟，所以本發明方法工藝簡單，能耗低，生產成本低。另外，本發明生產工藝中由於減少了加熱程序，可避免熱不穩定的萜內酯類成分受到破壞。銀杏藥材水提液上大孔吸附樹脂吸附後，本發明先用水及低濃度乙醇洗脫除去雜質，再用稀鹼液洗脫得到較高純度的弱酸性黃酮類成分，再用較高濃度乙醇洗脫得到較高純度的中性萜內酯類成分，經簡單的一步操作在大孔吸附樹脂柱上就可使銀杏黃酮和銀杏萜內酯得到較好分離(產品純度分別達80％和87％)，再經過簡單純化步驟就可使產品含量達95％以上，且中間體產品含量較高，避免了傳統提取方法對藥材資源所造成的極大浪費。
總之，本發明方法高效，簡捷，生產成本低，對人體和環境損害小，由本發明方法所製備的產品具有質量好、收率高等優點。
具體實施例方式
以下通過實施例來進一步描述本發明，應該理解的是，這些實施例僅用於例證的目的，決不限制本發明的保護範圍。
實施例1往12kg幹銀杏葉粉末中加入120L水，煮沸0.5h。過濾，濾渣中再依次加60L和36L水各煮沸0.5h，合併三次提取液。水提藥液上12kg預先處理好的AB-8大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠產品)，控制水提藥液上柱流速為1倍樹脂柱體積/h。待提取液全部上柱後，樹脂柱以8倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，控制洗脫液的流速為3倍樹脂柱體積/h，至流出液無色，再以20％乙醇洗脫至流出液無色。
樹脂柱繼續以1％NaOH溶液洗脫至流出液無色，收集稀鹼洗脫液，以6N HCl調pH至3。溶液噴霧乾燥，固體以適量蒸餾水洗滌，乾燥，得黃色粉末狀固體。
取上述黃色粉末狀固體2mg，加無水乙醇1ml使溶解，再加鹽酸液(2mol/L)1ml，置水浴中回流2小時，放冷至室溫，濾過，濾液蒸乾，殘渣加無水乙醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液；另取槲皮素對照品，加無水乙醇製成每1ml中含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液和對照品溶液各5μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，置氨蒸汽中燻約5min，供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的斑點，確定該黃色粉末狀固體含黃酮類成分。
取上述黃酮類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定黃酮醇苷含量，結果表明，該黃色粉末狀固體中黃酮類化合物的含量為83.2％。
樹脂柱經稀鹼洗脫後，以蒸餾水洗至流出液pH為中性，再以60％乙醇洗脫，至流出液無色，收集60％乙醇洗脫液，減壓回收至無醇味，殘液用3L乙酸乙酯萃取，共萃取5次，合併乙酸乙酯萃取液，用1％(V/W)Na2SO4脫水乾燥後，回收乙酸乙酯，殘渣60℃烘乾，研細，得350g白色粉末狀固體。
取上述白色粉末狀固體適量，加丙酮配製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點於同一以4％醋酸鈉的CMC-Na溶液製備的矽膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點，故確定該白色粉末狀固體含銀杏內酯類成分。
取上述銀杏內酯類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為87.6％。
用1000ml 95％的乙醇溶解銀杏萜內酯粗品，並加入100g活性炭粉，攪拌1h，抽濾，濾液回收乙醇後，60℃烘乾，得白色固體330g。將此固體溶於1000ml丙酮中，攪拌下慢慢加入3L蒸餾水，慢攪0.5h，離心除去膠狀水液，濾渣於60℃烘乾得210g乾粉。向此乾粉中加入210ml含量為30％的甲醇，在50℃水浴上使之溶化，微孔濾膜精濾，濾液轉放於4℃條件下，靜置8h，析出白色結晶，得銀杏內酯精品140g。
取上述銀杏內酯精品適量，加丙酮配製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點於同一以4％醋酸鈉的CMC-Na溶液製備的矽膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯精品適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為97.5％。
實施例2往10kg幹銀杏葉粉末中加入100L水，煮沸1h。過濾，濾渣中再依次加50L和30L水各煮沸1h，合併三次提取液。水提藥液上10kg預先處理好的D-101大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠產品)，控制水提藥液流速為2倍樹脂柱體積/h。待提取液全部上柱後，樹脂柱以5倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，控制洗脫液的流速為1倍樹脂柱體積/h，洗脫至流出液無色，再以25％乙醇洗脫至流出液無色。
樹脂柱繼續以0.5％NaOH溶液洗脫至流出液無色，收集稀鹼洗脫液，以6N HCl調pH至4。溶液噴霧乾燥，固體以適量蒸餾水洗滌，乾燥，即得黃色粉末狀固體。
取上述黃色粉末狀固體適量，加無水乙醇製成每1ml含0.5mg的溶液，照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液6μl，點於含4％醋酸鈉的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹乾，置紫外燈(365nm)下檢測。供試品色譜中顯黃酮類化合物特徵性的黃綠色螢光主斑點，故確定該黃色粉末狀固體含黃酮類成分。
取上述黃酮類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定黃酮醇苷含量，結果表明，該黃色粉末狀固體中黃酮類化合物的含量為80.3％。
樹脂柱經稀鹼洗脫後，以蒸餾水洗至流出液pH為中性，再以70％乙醇洗脫，至流出液無色，收集70％乙醇洗脫液，減壓回收至無醇味，殘液用2.5L甲酸乙酯萃取，共萃取3次，合併甲酸乙酯萃取液，用10％(V/W)Na2SO4脫水乾燥後，回收甲酸乙酯，殘渣55℃烘乾，研細，得320g白色粉末狀固體。
取上述白色粉末狀固體適量，加丙酮製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述供試品和對照品溶液各5μl，分別點於同一以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為86.3％。
用1000ml 95％的乙醇溶解銀杏萜內酯粗品，並加入100g活性炭粉，攪拌1h，抽濾，濾液回收乙醇後，55℃烘乾，得白色固體305g。將此固體溶於1000ml乙醇中，攪拌下慢慢加入3L蒸餾水，慢攪0.5h，離心除去膠狀水液，濾渣於60℃烘乾得195g乾粉。向此乾粉中加入195ml含量為30％的甲醇，在50℃水浴上使之溶化，微孔濾膜精濾，濾液轉放於4℃條件下，靜置8h，析出白色結晶，得銀杏內酯精品135g。
取上述銀杏內酯精品適量，加丙酮製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述供試品和對照品溶液各5μl，分別點於同一以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯精品適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該銀杏內酯精品中銀杏內酯類化合物的含量為96.3％。
實施例3往1kg市售銀杏葉粗提取物(浙江康恩貝製藥有限公司產品，商品名稱為「銀杏葉粗提取物」，該銀杏葉粗提取物含銀杏總黃酮約24％，銀杏總萜內酯約6％)中加入100L水，攪拌使溶解，過濾。水提藥液上50kg預先處理好的S-8大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠產品)，控制水提藥液上柱流速為1倍樹脂柱體積/h。待提取液全部上柱後，樹脂柱以5倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，控制洗脫液的流速為0.5倍樹脂柱體積/h，至流出液無色，再以18％乙醇洗脫至流出液無色。
樹脂柱繼續以0.5％KOH溶液洗脫至流出液無色，收集稀鹼洗脫液，以6N HCl調pH至5。溶液噴霧乾燥，固體以適量蒸餾水洗滌，乾燥，得黃色粉末狀固體。
取上述黃色粉末狀固體2mg，加無水乙醇1ml使溶解，再加鹽酸液(2mol/L)1ml，置水浴中回流2小時，放冷至室溫，濾過，濾液蒸乾，殘渣加無水乙醇0.5ml使溶解，作為供試品溶液。另取槲皮素對照品，加無水乙醇製成每1ml中含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，置氨蒸汽中燻約5min，供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的斑點，故確定該黃色粉末狀固體含黃酮類成分。
取上述黃酮類成分100mg，置於250ml燒瓶中，加入50ml的乙醇和20ml雙蒸水，超聲處理5min，加入8ml的濃鹽酸和沸石，回流2.25小時，冷卻至室溫。將溶液定量轉移至100ml的容量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，混勻，過濾，作為供試品溶液。另用甲醇製備0.6mg/ml槲皮素，0.6mg/ml山奈素和0.2mg/ml異鼠李素溶液，以甲醇稀釋成1∶5和1∶10的溶液作為對照品溶液。照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)測定黃酮醇苷含量，結果表明，該黃色粉末狀固體中黃酮類化合物的含量為90.2％。
樹脂柱經稀鹼洗脫後，以蒸餾水洗至流出液pH為中性，再以90％乙醇洗脫，至流出液無色，收集90％乙醇洗脫液，減壓回收至無醇味，殘液用3L乙醚萃取，共萃取3次，合併乙醚萃取液，用10％(V/W)Na2SO4脫水乾燥後，回收乙醚，殘渣50℃烘乾，研細，得650g白色粉末狀固體。
取上述白色粉末狀固體適量，加丙酮配製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點於同一以4％醋酸鈉的CMC-Na溶液製備的矽膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點，故確定該白色粉末狀固體含銀杏內酯類成分。
取上述銀杏內酯類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為92.6％。
用2000ml 95％的乙醇溶解銀杏萜內酯粗品，並加入200g活性炭粉，攪拌1h，抽濾，濾液回收乙醇後，60℃烘乾，得白色固體630g。將此固體溶於2000ml丙酮中，攪拌下慢慢加入6L蒸餾水，慢攪0.5h，離心除去膠狀水液，濾渣於60℃烘乾得610g乾粉。向此乾粉中加入610ml含量為30％的乙醇，在50℃水浴上使之溶化，微孔濾膜精濾，濾液轉放於10℃條件下，靜置8h，析出白色結晶，得銀杏內酯精品605g。
取上述銀杏內酯精品適量，加丙酮配製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5μl，分別點於同一以4％醋酸鈉的CMC-Na溶液製備的矽膠H薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-丙酮-甲醇(6∶3∶3∶0.1)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30min，置紫外燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，與對照品色譜在相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯精品適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為98.3％。
實施例4往100kg新鮮銀杏葉中加入200L水，煮沸1h。過濾，濾渣中再依次加100L和60L水各煮沸1h，合併三次提取液。水提藥液上20kg預先處理好的NKA-II大孔吸附樹脂(天津南開大學化工廠產品)，控制水提藥液流速為1倍樹脂柱體積/h。待提取液全部上柱後，樹脂柱以15倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，控制洗脫液的流速為3倍樹脂柱體積/h，洗脫至流出液無色，再以23％乙醇洗脫至流出液無色。
樹脂柱繼續以1％KOH溶液洗脫至流出液無色，收集稀鹼洗脫液，以6N HCl調pH至3。溶液噴霧乾燥，固體以適量蒸餾水洗滌，乾燥，即得黃色粉末狀固體。
取上述黃色粉末狀固體適量，加無水乙醇製成每1ml含0.5mg的溶液，照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述溶液6μl，點於含4％醋酸鈉的矽膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，展開，取出，晾乾，噴以三氯化鋁乙醇溶液，熱風吹乾，置紫外燈(365nm)下檢測。供試品色譜中顯黃酮類化合物特徵性的黃綠色螢光主斑點，故確定該黃色粉末狀固體含黃酮類成分。
取上述黃酮類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定黃酮醇苷含量，結果表明，該黃色粉末狀固體中黃酮類化合物的含量為82.3％。
樹脂柱經稀鹼洗脫後，以蒸餾水洗至流出液pH為中性，再以40％乙醇洗脫，至流出液無色，收集40％乙醇洗脫液，減壓回收至無醇味，殘液用5.0L甲乙酮萃取，共萃取3次，合併甲乙酮萃取液，用5％(V/W)Na2SO4脫水乾燥後，回收乙酸乙酯，殘渣60℃烘乾，研細，得603g白色粉末狀固體。
取上述白色粉末狀固體適量，加丙酮製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述供試品和對照品溶液各5μl，分別點於同一以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯類成分適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該白色粉末狀固體中銀杏內酯類化合物的含量為85.7％。
用2000ml 95％的乙醇溶解銀杏萜內酯粗品，並加入200g活性炭粉，攪拌1h，抽濾，濾液回收乙醇後，60℃烘乾，得白色固體585g。將此固體溶於2000ml丙醇中，攪拌下慢慢加入6L蒸餾水，慢攪0.5h，離心除去膠狀水液，濾渣於60℃烘乾得574g乾粉。向此乾粉中加入600ml含量為30％的丙酮，在50℃水浴上使之溶化，微孔濾膜精濾，濾液轉放於4℃條件下，靜置8h，析出白色結晶，得銀杏內酯精品565g。
取上述銀杏內酯精品適量，加丙酮製成每1ml含3.0mg樣品的溶液，作為供試品溶液。另取銀杏內酯A、B、C及白果內酯對照品，加丙酮製成每1ml各含0.5mg、0.5mg、0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述供試品和對照品溶液各5μl，分別點於同一以含4％醋酸鈉的羧甲基纖維素鈉溶液製備的矽膠G薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-丙酮-甲醇(10∶5∶5∶0.6)為展開劑，在15℃以下展開，取出，晾乾，在140～160℃加熱約30分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的螢光斑點。
取上述銀杏內酯精品適量，照高效液相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)及中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中「含量測定」法測定銀杏內酯含量，結果表明，該銀杏內酯精品中銀杏內酯類化合物的含量為95.6％。
試驗例1不同提取方法對銀杏葉藥材中銀杏總黃酮、銀杏總萜內酯轉移率的影響試驗一、試驗方法精密稱取銀杏葉藥材粉末9份，每份10g。3份採用25％乙醇提取，每份加10倍重量25％乙醇於60℃溫浸1小時，共提取3次，過濾，合併濾液；3份採用60％丙酮參照上法提取；另3份採用加10倍重量水，煮沸1小時，共提3次，過濾，合併濾液。
二、測定方法按照高效色相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)和中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中藥材「含量測定」項測定上述3種方法提取液種銀杏總黃酮和總萜內酯的含量。
以槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量計算總黃酮的含量，以銀杏內酯A、B、C及白果內酯的含量計算總萜內酯含量
測定結果見表1。
表1不同提取方法對銀杏葉藥材中銀杏總黃酮、銀杏總萜內酯轉移率的影響
由表1可知，採用本發明的水提法與傳統的25％乙醇或60％丙酮法相比藥材中有效成分提取轉移率無顯著性差異，說明採用本發明的水提法也可將藥材中的有效成分充分提出。
試驗例2大孔吸附樹脂不同富集方法對中間體中銀杏總黃酮、銀杏總萜內酯含量的影響試驗一、試驗方法1、試驗組將試驗例1所製備的銀杏藥材水提液上AB-8大孔吸附樹脂吸附後，先用水及25％乙醇洗脫除去雜質，再用1.0％NaOH洗脫得到弱酸性黃酮類成分，再用60～70％乙醇洗脫得到中性萜內酯類成分。
2、對照組藥材提取液上AB-8大孔吸附樹脂後，先用水洗脫至流出液無色，再用20％乙醇洗脫除去雜質至流出液無色，然後用60～70％乙醇洗脫有效成分，所得中間體產品是黃酮和萜內酯的混合物。
二、測定方法照高效色相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)和中華人民共和國藥典2005年版一部「銀杏葉」項中藥材「含量測定」項測定上述試驗組和對照組所得中間體中銀杏總黃酮和總萜內酯的含量。
以槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量計算總黃酮的含量，以銀杏內酯A、B、C及白果內酯的含量計算總萜內酯含量。
三、測定結果測定結果見表2。
表2大孔吸附樹脂不同富集方法對中間體中銀杏總黃酮、銀杏總萜內酯含量的影響
由表2可知，採用本發明的大孔吸附樹脂稀鹼洗脫富集法與對照組方法相比中間體產品中有效成分含量顯著提高，產品再經簡單純化可使含量均達95％以上。試驗例3不同製備方法對銀杏總黃酮精品、銀杏總萜內酯精品得率的影響試驗一、試驗方法1、試驗組將試驗例2中試驗組經大孔吸附樹脂富集所製備得到的銀杏總黃酮粗品以蒸餾水洗滌3次，乾燥，加熱溶於適量甲醇，過濾，濾液於10～12℃放置過夜，過濾析出的結晶，於60℃乾燥，得銀杏總黃酮精品。
將試驗例2中試驗組經大孔吸附樹脂富集所製備得到的銀杏總萜內酯粗品照本發明之實施例1方法純化，得到銀杏總萜內酯精品。
2、對照組將試驗例2中對照組經大孔吸附樹脂富集所製備得到的銀杏葉中有效成分中間體產品(總黃酮和總萜內酯混合物)加水溶解，以適量乙酸乙酯萃取3次。水相上聚醯胺色譜柱，水洗，再以10％乙醇洗脫，收集95％乙醇洗脫部分，減壓回收至幹，加熱溶於適量甲醇，過濾，濾液於10～12℃放置過夜，過濾析出的結晶，於60℃乾燥，得銀杏總黃酮精品。
乙酸乙酯萃取液減壓回收至幹，加適量乙醇溶解，再以蒸餾水稀釋至溶液中乙醇含量為15％，過濾，濾液上聚醯胺柱，再以5％乙醇洗柱，收集洗脫液，減壓回收至無醇味，以乙酸乙酯萃取，再按照本發明之實施例1方法純化，得到銀杏總萜內酯精品。
二、測定方法照高效色相色譜法(中華人民共和國藥典2005年版一部附錄VID)測定銀杏總黃酮、銀杏總萜內酯含量，按照以下公式計算藥材有效成分得率。
三、測定結果表3不同製備方法對銀杏總黃酮精品、銀杏總萜內酯精品得率的影響
由表3可知，採用本發明的製備方法所得銀杏總黃酮和銀杏總萜內酯精品得率均明顯高於對照組所採用的方法，故採用本發明方法可使銀杏葉藥材資源得到更充分利用。
權利要求
1.一種提取並分離銀杏內酯和銀杏黃酮的方法，包括以下步驟(1)、將新鮮或乾燥銀杏葉用水煎煮或將銀杏葉粗提物用水溶解，煎煮液或水溶液過濾，所得濾液全部上大孔吸附樹脂柱後，依次用蒸餾水和5％～25％乙醇洗脫雜質，接著用0.01％～10％鹼水洗脫樹脂柱至流出液無色，收集鹼水洗脫液，調pH3～5後濃縮至幹，洗滌，烘乾，得銀杏黃酮；(2)、大孔吸附樹脂柱繼續以水洗至流出液pH值為中性，棄去水洗液；再以30％～95％乙醇溶液洗脫大孔吸附樹脂柱至流出液無色，收集該乙醇洗脫液，減壓濃縮至無醇味，萃取，減壓蒸除萃取溶劑，殘留物用甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、戊醇、丙酮、甲乙酮或上述兩種或兩種以上以任意比例所組成的混合溶液溶解後加入吸附劑，攪拌吸附，過濾，濾渣棄去，濾液減壓回收溶劑，殘物在40～80℃環境中乾燥，得銀杏內酯粗品；或進一步將銀杏內酯粗品採用常規方法精製為精品。
2.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(1)中將銀杏葉藥材粉末加1～100倍藥材量(W/V)的水，煎煮1-3次，每次煎煮5min～3h。
3.按照權利要求1的方法，其特徵是所述的大孔吸附樹脂柱為AB-8、X-5、S-8、SIP-1300、MDA、NKA-II、D-101、HPD-100、HPD-400、ADS-17或BS-55大孔吸附樹脂柱。
4.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(1)中濾液上大孔吸附樹脂柱時，大孔樹脂用量與原藥材銀杏葉用量之比(V/W)為1∶10～10∶1，控制濾液液體流速為0.5～10倍樹脂柱體積/h。
5.按照權利要求4的方法，其特徵是大孔樹脂用量與原藥材銀杏葉用量之比(V/W)為1∶1～3∶1，控制濾液液體流速為1～3倍樹脂柱體積/h。
6.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(1)中用蒸餾水洗柱時，用3～50倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫大孔吸附樹脂柱，控制洗脫液的流速為0.5～10倍樹脂柱體積/h。
7.按照權利要求6的方法，其特徵是用5～8倍樹脂柱體積的蒸餾水洗脫，控制洗脫液的流速為1～3倍樹脂柱體積/h。
8.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(1)中用20％乙醇洗脫雜質，洗脫量為至流出液澄清透明為止；接著用0.1～1％NaOH進行洗脫，洗脫量為至流出液顏色淡或無色為止。
9.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(2)中用蒸餾水洗脫大孔吸附樹脂柱時，其洗脫量為至流出液pH值為中性為止；接著用60％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，洗脫量為至流出液顏色淡或無色為止；將所收集的乙醇洗脫液減壓濃縮至無醇味後進行萃取時，用1～20倍重量的乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、正丁醇、戊醇或乙醚萃取2～10次；減壓蒸除萃取有機溶劑後，殘留物用1/10～5倍重量的低炭醇或低炭酮或相互以任意比例所組成的混合溶液溶解，向溶解液中加入1/100～1/5倍重量的活性炭，攪拌吸附15min～5h，過濾，濾渣棄去，濾液減壓回收溶劑，殘物在50～60℃環境中乾燥，得銀杏內酯粗品。
10.按照權利要求9的方法，其特徵是將所收集的乙醇洗脫液減壓濃縮至無醇味後用4倍重量的乙酸乙酯萃取5次；減壓蒸除乙酸乙酯後，殘留物用1～3倍重量的乙醇溶解，向溶解液中加入1/10倍重量的活性炭，攪拌吸附1～2h。
11.按照權利要求1的方法，其特徵是步驟(2)中將銀杏內酯粗品精製為精品時，包括以下步驟將銀杏內酯粗品溶於甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述兩種或幾種溶劑以任意比例所組成的混合溶液中，加入蒸餾水，離心除去膠狀水液，減壓乾燥；將乾燥後的銀杏內酯固體溶於甲醇、乙醇、丙醇、丙酮或上述兩種或兩種以上以任意比例所組成的混合溶液中，精濾，濾液在25℃以下放置過夜，析出白色結晶，過濾，乾燥，得銀杏內酯精品。
12.按照權利要求11的方法，其特徵是將銀杏內酯粗品溶於0.5～10倍重量的丙酮中，攪拌下慢慢加入2～20倍重量的蒸餾水，離心除去膠狀水液，減壓乾燥；向乾燥後的銀杏內酯固體中加入0.5～5倍量(W/V)10％～60％甲醇中，於40～80℃溶解，採用微孔濾膜精濾，濾液在10～12℃放置過夜。
13.按照權利要求12的方法，其特徵是將銀杏內酯粗品溶於2～3倍重量的丙酮中，攪拌下慢慢加入8倍重量的蒸餾水；向乾燥後的銀杏內酯固體中加入等量(W/V)的30％甲醇中，於50～60℃溶解。
全文摘要
本發明公開了一種新的提取並分離高純度銀杏內酯和銀杏黃酮的方法。本發明採用大孔吸附樹脂色譜分離技術，將銀杏藥材用水提取，水提液直接上大孔吸附樹脂柱，再依次用蒸餾水，5％～25％乙醇，0.01％～10％鹼水，蒸餾水和30％～95％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，分別收集鹼水洗脫液和30％～95％乙醇洗脫液，再分別濃縮、純化可得到高純度的銀杏內酯或銀杏黃酮。本發明方法在大孔吸附樹脂柱上經簡單的一步操作使銀杏黃酮和銀杏萜內酯得到較好分離，只需簡單純化步驟就得到高純度的終產品，避免了傳統提取方法對藥材資源所造成的極大浪費。本發明方法高效，簡捷，生產成本低，對人體和環境損害小，所製備的產品具有質量好、收率高等優點。
文檔編號C07D493/00GK1847237SQ20061007243
公開日2006年10月18日 申請日期2006年4月13日 優先權日2006年4月13日
發明者郭東宇 申請人:廈門國宇智慧財產權研究有限公司