應用bdnf/nt-3/ngf分子族成員治療運動神經元疾病的方法

2023-10-20 01:56:42

專利名稱：應用bdnf/nt-3/ngf分子族成員治療運動神經元疾病的方法
技術領域：
本發明涉及運動神經元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經營養因子，這種神經營養因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，並且支持運動神經元的存活、生長、和/或分化，尤選BDNF或NT-3。本發明也提供了運動神經元的培養方法，運動神經元疾病的診斷方法，用於鑑別對運動神經元有益或有害的因素的鑑別系統和運動神經元疾病的動物模型。
運動神經元和肌肉細胞之間的相互作用決定肌肉的緊張度，並引起肌肉有效地收縮，因此是所有自主性和非自主性運動的基礎。
運動神經元傳統分類為上位運動神經元或下位運動神經元。上位運動神經元位於大腦中央前回，並傳出長突往下到下位運動神經元上的突觸，下位運動神經元位於脊髓灰質體的腹側灰質區。脊髓的前側灰質區，下位運動神經元的軸突連合形成腹側根。這些軸突最後終止於一條或多條肌肉纖維。通過下位運動神經元的纖維末端的樹枝狀分枝，每條下位運動神經元與少則幾條多則100-200或更多肌肉纖維相連接形成一個「運動單元」。(Adams and Victor，1985，in「Principles of Neurology」Mc Graw-Hill，Inc，New York，P.37.)運動神經元疾病導致不同程度的肌肉無力，引起功能喪失，輕則難於完成繁重任務，重則到完全癱瘓。下位運動神經元疾病一般與弛緩癱瘓和肌肉張力下降相關。受單個神經或脊髓中與其鄰近的該運動神經元支配的相鄰肌肉會受到影響，引起程度很深的萎縮，整個肌肉組織的70-80%會受到影響。病態的運動神經元變得過敏，它控制的肌肉纖維與其它單元離散間隙放電，產生一種可見的顫搐或自發性收縮。相反，當上位運動神經元受損，一般結果是伴隨肌肉張力增加和腱反射亢進的痙攣癱瘓。通常是人體的整個肢體或半側軀體受到影響，而不是單個肌群受影響。萎縮是輕微的，典型的起因是廢用性痿縮，不出現自發性收縮。對代表上位或下位運動神經受損的臨床症狀進行鑑別有利於進行診斷和治療。
相當多的各種神經機能障礙影響運動神經元。例如，上位運動神經元主要受腦血管意外，腫瘤、感染和創傷影響。然後，下位運動神經元或前灰質角細胞才受這些因素影響，但除此之外它還易患許多機能失調，其中前灰質角細胞受損是最初症狀，包括肌萎縮性外側硬化，嬰兒或幼年脊柱肌肉萎縮，脊髓灰質炎和脊髓灰質炎後綜合症，遺傳性運動和感覺神經病變，和中毒性運動神經病變(如，長春花新鹼)。
在這些主要的前側灰質角細胞(AHC)機能失調中，肌萎縮性外側硬化(ALS或Lou Gehrig′s病)是最常見的(見Williams和Win-debank，1991，Mayoclin.Proc.6654-82 for yeview)。
ALS多數患者最初的不適是無力，上肢更為常見(Gubbay et al.，1985，J.Neurol.232295-300;Vejjajiva et al.，1967，J.Heurol.Sci.4299-314;Li et al.，1988，J.Neurol.Neuro-surg.Psychiatry 51778-784)。一般無力、萎縮、和其它神經病證狀是不對稱性的，並且經常是局部性的(Munsat et al.，1988，Neurol.38409-413)。肌肉痛性痙攣，感覺異常(刺麻感)和疼痛是常見的不適症狀(Williams and Windebank，supra)。分布廣的自發性收縮經常出現(id.)。這種疾病的發展快慢每個患者都不相同(Gubbay et al.，1985，J.Neurol，232295-300)，但實際上這種病所有情況的最終結果是完全功能喪失，廣泛性癱瘓(包括呼吸癱瘓)和死亡。
解剖學上，最顯著的改變是脊髓和相連的前側根萎縮和外側體的硬化(因此叫肌萎縮性外側硬化;Williams and Windebank，supra)。在ALS病中上位運動神經元也受到牽涉和變性。儘管由於受上位運動神經元的影響而經常出現運動和前運動皮質萎縮，但在顯微鏡下，大腦卻是正常的。中樞前皮質中的貝茨氏細胞和其他錐體細胞廣泛性的受損，伴隨發生反應性神經膠質增生(Hammar et al.，1979，Exp，Neurol 63336-346)。
流行病學的研究表明環境因素和遺傳因素在疾病發展過程中起重要作用(Williams and Windebank，supra)。有人曾認為ALS是一種中年疾病，近來更傾向於認為它是一種老年疾病(id.)。
目前的療法包括對症治療，減輕肌肉痛性痙攣、疼痛、易疲性。假體裝置用於補償肌肉無力，儘管如此，改變疾病進程的藥物療法還是極不成功的。促甲狀腺激素釋放激素的公認治療優點也已遇到矛盾性的結果(Brooks，1989，Ann，N.Y.Acad.Sci.553431-461)。服用神經節甙脂已經無效(Lacomblez.et al.，1989，Neurol.391635-1637)。血漿取出法無論單用還是與免疫抑制療法結合應用都已沒有治療上的優點(Olarte et al.，1980，Ann.Neurol，8644-645;kelemen et al.，1983，Arch，Neurol.40752-753。已報導抗病毒劑胍具有潛在的短期效果，但這種效果不能重現(Munsat et al.，1981，Neurol.311054-1055)在一個簡短的研究中報導服用支鏈胺基酸激活穀氨酸脫氫酶可降低患者衰退的速度(Platitakis et al.，1988，Lancet 11015-1018)。近來許多治療試驗，有些在進行之中，包括全身淋巴系統擴散，使用胺基酸N-乙醯半胖氨酸，N-乙醯蛋氨酸，L-蘇氨酸和長期鞘內輸入促甲狀腺激素釋放激素(Williams and Windeband，supra)。
與ALS監床和病理上相似的動物模型包括Mnd小鼠，它是一種常染色體支配的突變體，其表現是後加上的上位和下位運動神經元累進性變質(Messer and Flaherty，1986，J，Neurogen.3345-355);Wobble小鼠，由於肌肉失去神經支配而表現出早年前肢軟弱和萎縮，以及在Brittany獚中表現出犬遺傳性脊柱肌肉萎縮(Sack et al.，1984，Ann Neurol.15369-373;Sillevis et al.，1989，J.Neurol，Sci，91231-258;Bird et al.，1971，Acta Neuropathol 1939-50)。
在近來1991年4月4日公開的WO91/04316PCT申請中(本文引用了該參考文獻)已經表明睫狀神經營養因子(CNTF)能夠促進運動神經元在體內和體外存活，含CNTF明膠海綿植入物易使在分離出的新生小鼠面神經的運動神經元存活。CNTF是一種神經營養因子，它顯示的生物活性與包括BDNF，NT-3，和NGF在內的運動神經營養族因子所顯示的生物活性有很大差別。
本發明涉及肌萎縮性外側硬化(Lou Gehrig′s)等運動神經元疾病的治療方法，包括給需要這種治療的患者服用有效劑量的神經營養因子，這種神經營養因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員，並且支持運動神經元的存活、生長和/或分化。據不完全發現BDNF和NT-3兩者都能增加培養的運動神經元的膽鹼乙醯基轉移酶的活性，並且由坐骨神經向脊髓逆向轉運。在本發明優選的特定實施例中，BDNF或NT-3和第二種因子如CNTF一起用於運動神經元疾病治療。
本發明也提供了促進體外運動神經元的存活，生長和/或分化的方法，這種方法是給運動神經元培養物加入有效濃度的BDNF/NT-3/NGF基因族成員。
在另外的實施例中，本經明提供了一種鑑別體系，這種體系可以用來鑑別有BDNF或NT-3樣活性的因子，並且可應用於運動神經元疾病的治療。
本發明還提供了運動神經元疾病的動物模型，製備這些模型方法是給動物免疫接種BDNF/NT-3/NGF族成員或其衍生物，還可給動物服用抗BDNF/NT-3/NGF族成員的抗體或BDNF/NT-3/NGF的反義寡聚核苷酸。
BDNF 腦源性神經營養因子bFGF 基本纖維生長因子CAT 膽鹼乙醯基轉移酶NGF 神經生長因子NT-3 神經營養素-3

圖1.富含動物神經元的培養物在無血清，化學定義的培養基中生長兩天，測定膽鹼乙醯基轉移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。用磷酸鹽緩衝液(PBS)/0.5mg/ml BSA作稀釋劑平皿接種時以10pg/ml到100ng/ml濃度範圍加入BDNF。對照組只加入PBS/0.5mg/mlBSA。
圖2.富含運動神經元的培養物在無血清、化學定義的培養基中生長兩天，測定膽鹼乙醯基轉移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。在平皿接種時加入用PBS/0.5mg/ml BSA稀釋的GNTF，BDNF，bFGF，NGF和CNTF/BDNF濃度均為50mg/ml。對照組培養物加入PBS/0.5mg/ml BSA。
圖3.富含運動神經元的培養物在無血清，化學定義的培養基中生長兩天，測定膽鹼乙醯基轉移酶活性(cpm/hr/well+/-SEM)。以10pg/ml到100ng/ml的濃度範圍在平皿接種時加入NT-3。
圖4.按第8部分描述的方法純化的重組體BDNF在背側根神經節移出物生物測定中的劑量-反應曲線。
圖5.出生時單側面神經損害後7天齡小鼠腦幹面運動神經元形態學。a)BDNF治療後的損害一側;b)NT-3治療後的損害一側;c)NGF治療後的損害一側;d)作為對照BSA治療後的損害一側;e)a)中相同動物的未損害側作為對照;f)損害且用CNTF治療後作為對照。放大×400。
為了使公開更清楚，且不作為限定，本發明的詳細描述分為以下幾部分(ⅰ)根據本發明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員;
(ⅱ)治療應用;
(ⅲ)體內應用;
(ⅳ)診斷應用;
(ⅴ)檢測系統;和(ⅵ)動物模型。
5.1 本發明所使用的BDNF/NT-3/NGF分子族成員已發現BDNF或NT-3。可誘發運動神經元培養物中膽鹼乙醯基轉移酶活性增加，這表明神經營養因子家族中特定成分可用來促進運動神經元的存活，生長和/或分化(見後面的第6、7部分中例子)。觀察到的BDNF和NT-3逆向轉運到運動神經元的位置腹側脊髓，支持神經營養因子對運動神經元直接作用的觀點(見下面的第9部分舉例)。
本發明提供了促進運動神經元的存活、生長和/或分化的方法，這種方法是使用BDNF/NT-3/NGF分子族成員。
本發明優選實施例中，使用BDNF/NT-3/NGF族成分，相對於未處理的運動神經元而言，可導致用藥的運動神經元中膽鹼乙醯基轉移酶活性增加。
在本發明的最佳實施例中，BDNF或NT-3用於促進運動神經元的存活和/或分化，其中BDNF或NT-3已在1991年3月21日公開的WO91/03568PCT申請中和1991年3月21日公開的WO91/03569PCT申請中描述，本發明引用這兩篇文獻。如在下面第6和7部分舉例中所示，BDNF或NT-3可用來增加培養基中運動神經元膽鹼乙醯基轉移酶活性。另外，BDNF/NT-3/NGF分子族的其他成員可按PCT申請中所提出的方法分辨。
只要確定能夠支持運動神經元的生長和/或分化本文所參考引用的WO91/03568和WO91/03569參考文獻可以用於本發明。而且，合成的分子，儘管它不同於任何已知BDNF/NT-3/NGF分子族成員的基本結構，它能支持運動神經元的生長和/或分化，即可用於本發明。因為BDNF和NT-3比NGF更能增加運動神經元中膽鹼乙醯基轉移酶活性，這種合成分子最好更類似於BDNF和NT-3而不是NGF。
本發明中所用的BDNF/NT-3/NGF族成分，可用本領域中任何已知方法製得。它們可從天然組織中純提，化學合成，或重組DNA表達體系如在原核和真核生物表達體系中生成。例如，象COS細胞體系。生成這些分子的方法包括PCT申請WO91/03568和WO91/03569中所描述的方法。
在本發明的特定優選實施例中，BDNF或NT-3可從表達BDNF的真核細胞(如BDNF轉染的中國倉鼠卵巢細胞(CHO))的條件培養基中分離。採用兩個步驟陽離子交換和凝膠過濾色譜法。以BDNF為例，用表達BDNF的細胞接種從Opticell生物反應器中(Charles River)收集到的條件培養基，並用蒸餾水以1.25∶1比率稀釋，然後連續裝在S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱上。例如，稀釋總容量為10.6L經大約5天時間過15ml(1.6cm內徑)柱子。柱子用50ml 20mM MES緩衝液pH5.8洗滌，接著用含250mMNaCl的50ml相同緩衝液，再用不含NaCl的相同MES緩衝液洗滌直到在280nm處吸收值達到基線水平。然後用25ml 20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝液pH8.5洗滌，再用含100mM NaCl的15ml相同緩衝液洗滌。柱子依次用150ml，100mM到750mM NaCl梯度的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝液pH8.5洗脫。流速大約為2.5ml/分鐘，洗脫液吸收值在280nm處單位滿刻度0.20吸收率的靈敏度下進行測定。含重組體BDNF的餾分可用DRG移出物生物測定法來鑑別。具有最高特定活性的餾分與NaCl濃度在500至750nm相對應。合併這些餾分，並用3KDa Omega(Ω)型膜或一個可使BDNF低程度非特異性結合的等同膜進行高壓超濾濃縮。濃縮樣品然後上到例如一種120ml(1.6cm內徑)Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱上(pharmacia)。填充柱子並用含400mM NaCl的20mM HEPES緩衝液pH7.6平衡。以0.25ml/分鐘速度洗脫柱子。收集餾分並用DRG移出物生物鑑定法測定BDNF的活性。在80和90ml之間的洗脫餾分含有生物活性的大腦源性重組生長因子。合併這些餾分並用還原性SDS聚丙烯醯胺電泳分析，進行N-末端序列測定和胺基酸的定量分析。在適當處調節容量。
BDNF/NT-3/NGF分子族包括由具有與BDNF，NT-3和NGF基本同源的區域的基因編碼的分子。本發明所用的BDNF/NT-3/NGF族成員可通過測試促進運動神經元生存或分化的生物活性來選擇。舉例說明但不作為限定，表現出下列任何一作用的BDNF/NT-3/NGF族成員均可用於本發明(ⅰ)增加培養基中運動神經元的存活時間;
(ⅱ)增加在培養基或體內運動神經元的軸突生長;
(ⅲ)增加在培養基或體內運動神經元相關分子的生成如，膽鹼乙醯基轉移酶或乙醯膽鹼酯酶(見下面第6和7部分測定技術的舉例);
(ⅳ)減少體內運動神經元機能失調症狀。
以上這些作用可用本領域中任何已知方法測定。優選的非限定性實施方案，運動神經元存活時間的增加可用Arakawa等人提到的方法測定(1990，J，Neurosci，103507-3515);運動神經元軸突生長增加可用Pestronk等人(1980，Exp.Neurol，7065-82)或Brown等人(1981，Ann，Rev.Neurosci，419-42)提到的方法測定;運動神經元相關分子的生成增加可用生物測定法，酶測定法，抗體結合，Nor-thern印跡分析測定法，等來測定，選用什麼方法取決於所測定的分子;運動神經元機能失調可通過分析運動神經元功能紊亂的內科表現例如無力，運動神經元傳導速率，或功能喪失來確定。
在本發明的另一些實施例中，本發明的BDNF/NT-3/NGF族成員可與第二種因子聯合使用來支持運動神經元存活和/或分化。第二種因子最好也能有效地促進運動神經元的存活和/或分化。例如，在本發明中的較好實施例中，BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF結合使用以促進運動神經元的存活和/或分化。正如在下面第6部分討論的，BDNF與CNTF結合使用可觀察到對運動神經元CAT活性具有至少一種疊加作用。
5.2治療應用本發明提供了治療運動神經元疾病方法，包括給需要這種治療的患者服用有效量的神經營養因子，這種神經營養因子是BDNF/NT-3/NGF分子族成員並能支持運動神經元的存活，生長或分化。
如本文所用的，所定義的運動神經元紊亂指任何能影響運動神經元正常功能的狀況。這種失調可能或不能特異性地或甚至選擇性地影響運動神經元。例如，本發明可治療的運動神經元紊亂包括但不局限於下面這些功能紊亂。如梗塞、感染、中毒、創傷、外科損傷、退化性疾病或惡性病，這些可影響到運動神經元及神經系統的其他成分。本發明方法也直接用於選擇性影響神經元的疾病，如肌萎縮性外側硬化，並且包括但不局限於此，進行性脊柱肌肉萎縮，進行性延髓麻痺，初級外側僵化，嬰兒和幼年肌肉萎縮，童年進行性延髓麻痺(Fazia-Londe綜合症)，脊髓灰質炎和脊髓灰質炎後症候群和遺傳性運動感覺神經病變(進行性神經性腓骨肌萎縮)。
可用於本發明的BDNF/NT-3/NGF族成員在上文第5.1部分中已作描述。有效劑量可由本領域熟練技術人員已知的方法測得。可以對有效劑量和毒性劑量(如果有毒性的話)進行測定，任何一已知BDNF/NT-3/NGF族成分都沒有測定出毒付作用。最好在活體內測得，以分辨出最佳劑量範圍。(參見下文第5.3部分)在本發明各種特定的實施例中BDNF/NT-3/NGF族的神經營養因子可與至少一種有效劑量的其它藥劑一起使用，所說的這種其它藥劑本身也能促進運動神經元的存活、生長和/或分化。例如BDNF/NT-3/NGF族成員可與CNTF一起給藥。在本發明的一個優選實施例中BDNF和CNTF可一起給藥用於運動神經元的治療。
在提及BDNF/NT-3/NGF家族成員的同時，本發明也包括使用BDNF/NT-3/NGF族神經營養分子的片斷，衍生物、促效藥或拮抗藥。
本發明神經營養因子可用任何藥學上可接受的載體形式給藥。給藥途徑可以是本領域中任何已知的給藥方式，包括，但不局限於，靜脈給藥，鞘內給藥，皮下給藥，向相關組織內注射，動脈內，鼻內，口服給藥或使用一種植入物。本發明提供藥物組合物，它包含BDNF/NT-3/NGF族的成員如BDNF或NT-3，並含有CNTF，和某種藥學上可接受的載體。
給藥後可導致本發明的神經營養因子分散於整個人體或局部區域中。如在涉及到神經系統的相離區域情況下，適合採用靜脈內或鞘內給以神經營養因子。另外的情況下，但不限制本發明，當涉及到神經系統的局部區域時，如因創傷或外科手術引起的運動神經元疾病，適合採用局部給藥。在這種情況下，可以將一個含有神經營養因子的植入物理入損傷區或其附近。合適的植入物包括但不局限於，凝膠、海綿、蠟、或微小顆粒型植入物。
5.3 體外應用本發明提供了一種提高運動神經元存活、生長和/或分化能力的方法，包括露置運動神經元在有效濃度的一種神經營養性因子中，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員，這種方法可用於體內(見上)或體外，優選方案是，BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF或NT-3。
在體外試驗的情況下，神經營養性因子的有效量可根據具體情況按需要而定，因從不同的組織或不同種類得到的運動神經元對神經營養性因子顯示不同的敏感性。對任何特定的培養，最好建立一條神經營養性因子濃度和運動神經元反應性相關的劑量反應曲線，為估價運動神經元存活、生長和/或分化，使用例如活體染色估價存活。相對照顯微鏡和/或神經纖維染色測定軸突生長或測定運動神經元相關化合物如膽鹼乙醯轉移酶(CAT)活性的技術，來比較露置在BDNF/NT-3/NGF家族成員神經營養性因子中的運動神經元與未露置在該因子中的神經元是很有用的。測定CAT活性可用下述方法，例如，通過收集和溶解處理過或未處理過的運動神經元在20mM Tris-鹽酸(pH8.6)溶液中，該溶液含有約0.1% Triton X-100，取出幾微升的等分試樣，用含有0.2ml[1-rC]乙醯輔酶A，300mM NaCl，8mM溴化膽鹼、20mMEDTA和0.1mM新斯的明的50mM NaH2(pH7.4)緩衝液作為底物，運用micro-Fonnum方法測定CAT活性，該方法描述在Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409中，其完整的方法在此一併作為參考(也可參見下面的7.1.5節)。
在一個非限制本發明的具體實施例中，運動神經元可通過以下方法在體外製備和培養。從球狀物，感覺神經節和粘性的腦膜無菌獲得和分離至少一部分脊髓，特別是從胚胎生物例如小鼠獲得的脊髓。然後分離腹側的脊髓，因為運動神經元座落在脊髓的腹側(前側)角上。將腹側脊髓分成小塊和在37℃下接種在含約0.1%胰蛋白酶和0.01%I型脫氧核糖核酸酶的無鈣和鎂的磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)中20分鐘，然後移去胰蛋白酶溶液，漂洗細胞並將其置於新鮮的培養基中，培養基如45%的Eagle′s最小基本培養基(MEM)，45% Ham′s營養混合培養基F12，5%加熱失活的胎牛血清，5%加熱失活的馬血清，穀氨醯胺(2mM)，青黴素G(0.5U/ml)和鏈黴素(0.5μg/ml)。組織可通過巴斯德玻璃管輕輕搗碎機械地分解，收集上清液並用尼龍濾器(始Nitex，Tetko;40m)過濾，過濾細胞懸浮物可使用Schnaar and Schaffer(1981，J，Neurosc.L204-217)的修改方法進行分級。新有步驟在4℃進行合適。將甲泛影醯胺溶解在F12MEM培養基(1∶1)中，建立下列不連續梯度溶液包括18%甲泛影醯胺基液(如0.5ml)，3ml 17%甲泛影醯胺;3ml 12%甲泛影醯胺和3ml 8%甲泛影醯胺過濾細胞懸浮物(即2.5ml)，通過逐級梯度溶液分層，試管在2500g下用離心機(如Sorvall HB4)離心15分鐘，離心液將使細胞分為三層第一部分(在0-8%界面)，第二部分(在8-12%界面)和第三部分(在12-17%界面)。第一部分富集運動神經元，可取出小量(如約1ml)以無血清的定義培養基衝洗兩次，所說培養基可以是50% F12和50% MEM，加上谷醯胺(2mM)，胰島素(5μg/ml)，轉鐵蛋白(100μg/ml)，黃體酮(20nM)，腐胺(100μM)，亞硒酸鈉(30nM，參見Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)。可靠的細胞數量可通過在錐蟲蘭存在下以血球計計數獲得。富集運動神經元的懸浮物可以100，000細胞/cm2的密度接種在予先覆蓋有聚L-鳥氨酸(如10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin如10μg/ml)的組織培養孔板(優選的是6mm)上。然後加入神經營養性因子，如在具體實施例中，BDNF的加入可達到最終濃度約0.01-100ng/ml，較好是約50nm/ml，或NT-3的加入可達到最終濃度約.01-100ng/ml，較好是約50ng/ml，或上述濃度的BDNF與濃度至少1ng/ml，較好是10ng/ml的CNTF合用。然後，運動神經元培養物在95%空氣/5%CO2氣和相對溼度為100%37℃條件下保存在無血清的定義培養基中。
5.4 診斷應用本發明也提供了一種診斷病人運動神經元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中，是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經營養性因子水平，以測定出在病人中與運動神經元紊亂正性相關的神經營養性因子的異常水平。可由本方法診斷的運動神經元紊亂包括但不限於如上5.2節列出的那些。
神經營養性因子水平可由本領域的任何已知方法進行測定，這些方法包括但不限於酶聯免疫吸附「夾層」試驗或其它任何應用抗神經營養性因子抗體的試驗，包括Western印跡分析和原位雜交，生物活性研究，Northern印跡分析等。
病人樣品可取自任何正常組織或體液，包括但不限於神經和腦組織或腦脊髓液或血。
神經營養性因子水平異常可解釋為病人和正常人神經營養性因子水平在統計學上的顯著差異。異常可以是比正常水平增加或減少，病人可以是全身性的也可以僅是局部性的。使用神經營養性因子會特別有益於表現出這種因子減少的病人(參見上5.2節)。表現出神經營養性因子增加的病人可表達出非正常因子或可能患因子受體缺乏病。具有少量，或非正常因子受體的病人可通過檢測取自病人的細胞以檢查正常神經營養性因子受體來辨別，例如，通過比較這種細胞結合可測的標記的神經營養性因子的能力和正常細胞的結合能力。具有少數受體或非正常受體的病人可能會也可能不會得益於補充神經營養性因子治療，特別是得益於用神經營養性因子拮抗劑類似物治療。
此外，BDNF或NT-3顯示出被運動神經元逆行轉移的發現提供了一種診斷BDNF或NT-3相關性運動神經元紊亂的方法。包括用某種方式將可測標記的BDNF或NT-3注入，使得標記的BDNF進入一種運動神經，並測定標記的BDNF或NT-3是否逆向轉移，其中逆向轉移的失敗與運動神經元機能失調相關。這種方法可用於但不限於診斷肌萎縮性測索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質炎，後灰質綜合症，進行性神經性腓骨肌萎縮和神經創傷或損傷。
5.5檢測系統本發明提供了辨別那些可用於治療運動神經元紊亂的化合物的檢測系統，此試驗系統評價某種被測試劑阻礙BDNF或NT-3與運動神經元結合的能力。相應地，本發明提供了一種檢測某試劑提高運動神經元存活、生長或分化能力的方法，包括在標記的BDNF或NT-3能與運動神經元結合的條件下，露置的培養物中運動神經元於可測標記的BDNF或NT-3(或任何合適的BDNF/NT-3/NGF家族成員)。同時露置運動神經元在測試試劑中，其中測試試劑對標記BDNF或NT-3結合的抑制表明試驗試劑可應用於治療運動神經元紊亂。在這種試驗系統中為陽性的那些試驗試劑需要在體外或體內進一步估價其提高培養中的運動神經元存活生長或分化的能力。為陰性的試劑有些情況下可以是BDNF或NT-3樣活性的拮抗劑。
BDNF或NT-3可以用任何方法進行可測性標記，包括結合上放射性標記的胺基酸，和連接一個可測的「末端」到神經營養性因子分子上，這樣一個末端可以是螢光性的，可以有酶活性，可以是一個與神經營養性因子結合的抗體，可以是抗原性的，並能夠結合抗體(例如，部分myc抗原能與抗-myc抗體結合)。
按照本發明，可應用的試驗試劑包括，但不限於，是BDNF/NT-3/NGF家庭成員的神經營養性因子或其片斷的衍生物，其它肽類化合物、肽衍生物，和非肽類化合物。
在具體的，但非限定本發明的實施例中給出了一個例子，在允許BDNF結合的條件下，將放射性標記的BDNF與非標記的試驗試劑和運動神經元在培養基中培養。作為比較，將相同的運動神經元培養物露置於放射性標記的BDNF中(無試驗試劑)，如果試驗試劑能結合BDNF受體，它便可競爭性抑制標記BDNF的結合。當後來清洗細胞以除去未結合的BDNF時，包含試驗試劑的培養物可望較對照培養物具有較小的放射性。
5.6動物模型系統本發明進一步提供了運動神經元系亂的動物模型系統，包括那些系統或全部缺失BDNF或NT-3的動物。BDNF或NT-3的全部缺失可以通過產生一種能表達抗BDNF或NT-3抗體的動物而完成，這類動物可以是用取自其它動物種類的BDNF或NT-3或那些被化學修飾成有較強免疫性的BDNF或NT-3免疫動物產生的。局部缺失可通過在局部引入抗BDNF或抗NT-3抗體產生，例如，通過在中央前回附近植入雜交瘤產生。更進一步，可製備轉基因動物，這種動物的內源性BDNF或NT-3基因通過同源重組而且被「缺失」。
6實施例BDNF增加腹側脊髓運動神經元培養物中膽鹼乙醯轉移酶的活性6.1材料和方法6.1.1實驗動物所有試驗採用sprague-Dawleg小鼠(HSD或Zivic-Miller)胚胎(E14)，孕鼠用CO2窒息處死，然後迅速取出胚胎，置入冰凍的培養基中以備解剖用。
6.1.2.組織培養技術在無菌條件下，從孕14天的鼠胚胎中移出脊髓，脊髓從尾部和延髓(在第一脊神經節處)切斷，去除感覺神經節和粘性腦脊膜，然後將脊髓索部分分成腹側和中背部分分別培養。將腹側脊髓組織切成小塊，在0.1%胰蛋白酶(GIBCO)，0.01% I型脫氧核糖核酸酶(sigma)的無鈣鎂磷酸緩衝鹽液(PBS)中37℃培養20分鐘，然後去除胰蛋白溶液，衝洗細胞，然後加入到培養基中，培養基由45% Eagle′s最小必須培養基(MEM)，45% Ham′s營養混合物F12(F12)，5%熱失活胎牛血清(GIBCO)，5%熱失活馬血清(GIBCO)，穀氨酸(2mM)，青黴素G(0.5μ/ml)和鏈黴素(0.5μg/ml)組成。然後將組織用巴斯德管輕輕研磨機械分離，收集上清液，用尼龍過濾器(Nitex，Tetko;40μm)過濾。然後將過濾細胞懸浮液用於下述6.13部分所述的分餾步驟。
6.1.3對腹側脊髓細胞進行甲泛影醯胺密度梯度分級分離本分級分離的方法是Schnaar和Schaffner所述的方法(1981，J.Neurosci，1204-217)的改進方法。所有的步驟都在4℃溫度下進行。將甲泛影醯胺溶於F12MEM(1∶1)的培養基，建立一個不連續梯度液，包括18%甲泛影醯胺緩衝液(0.5ml)，3ml 17%甲泛影醯胺，3ml 12%甲泛影醯胺和3ml 8%甲泛影醯胺。由上述方法獲得的2.5ml過濾的腹側脊髓細胞懸浮液在梯度液中分層，試管用離心機(Sorvall HB4)2500g離心15分鐘，離心液分為三層細胞液第一部分(在0-8界面)，第二部分(在8-12%界面)，第三部分(在12-17%界面)，第一部分富含運動神經元。在這0-8%的界面移出一小部分體積(大約1ml)，用含有50%F12和50% MEM穀氨酸(2mM)，胰島素(5μg/ml)轉鐵蛋白(100μg/ml)，孕酮(20nM)，腐胺(100μM)和亞硒酸鈉(30mM)的無血清定義培養基洗滌兩次(Bottenstein and Sato，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76514-517)。在錐蟲藍存在的條件下用細胞計數器計數活細胞。然後將第一部分的細胞懸浮液(富含運動神經元)以密度為100，0000細胞/cm2接種到預先裝塗聚-L-鳥氨酸(Sigma，10μg/ml)和昆布氨酸(Laminin)(GIBCO;10μg/ml)的6mm培養孔中。接種的當天用生長因子(CNTF和BDNF)處理，在相對溼度近100%，溫度為37℃的95%空氣/5% CO2氣中將培養物保持在無血清定義培養基中。兩天後(48小時)採收細胞，測量膽鹼乙醯轉移酶(CAT;Fonnum，1975，J，Neurochem.24407-409)和參見下述7.1.5節。
6.1.4 腦源性神經營養因子(BDNF)BDNF用CHO細胞產生和從CHO細胞條件培養基中純化，均質度用丙烯醯胺凝膠和胺基酸序列分析評價(見下述8節)。
6.1.5.睫狀神經營養因子(CNTF)所有試驗所用的CNTF為在大腸桿菌中表達並純化的重組鼠CNTF。用Masiakowski et al.WO 91/04316中描述的方法。
6.1.6 其它因子研究中採用的NGF(2.55)用Mobley等，1976，Biochemistry 155543-5551)所述的方法從小鼠唾液腺中純化，基本的FGF從協作研究者獲得。
6.2 結果6.2.1 BDNF對膽鹼乙醯基轉移酶活性的效果與未處理的對照相比，用BDNF處理的富含運動神經元培養物48小時後CAT活性顯示出有4-5倍的最大激發。如圖1所示，CAT活性的增長似乎取決於BDNF劑量，其最大反應劑量為大約10ng/ml。
6.2.2.BDNF和CNTF合用對膽鹼乙醯轉移酶活性的影響。
由於睫狀神經營養因子(CNTF)顯示出提高小鼠運動神經元在體外的存活能力(Wong等，1990，Soc.Neurosci.Abst.)。我們尋求確定這兩種因子(BDNF和CNTF)所引起的CAT活性增加是有疊加作用。結果表明，飽和濃度的BDNF(50ng/ml)和CNTF 50ng/ml共同使用對培養物中的運動神經元的CAT活性不只是疊加增加(圖2)，表明兩種因子是協同作用並具有不同的調節通路。BDNF和CNTF的共同加入所得的最大相加效果比對照高出15倍。與對照培養物相比NGF或bFGF對CAT活性都不具顯著的影響(圖2B)。
脊髓腹側運動神經元的退化和壞死是肌萎縮性側索硬化(ALS;LouGehrig′s disease)，脊髓損傷和其它運動神經元疾病病理生理過程的主要方面。上述結果表明，BDNF單獨或與CNTF一塊使用治療上述疾病時可以促進膽鹼能表達。
7實施例NT-3處理增加脊髓運動神經元培養物中膽鹼乙醯轉移酶活性7.1 材料和方法7.1.1 實驗動物Sprague-Dawley鼠(HSD或Zivic-Miller)的胚胎(階段E14)用於所有的實驗，通過CO2窒息處死懷孕鼠迅速摘取胚胎並放置在冰冷的培養基中，以備進一步分離。
7.1.2 組織培養方法將脊髓從妊娠14天的小鼠胚胎中無菌地摘取並按在上面的6.1.2節中敘述的已有技術製備。
7.1.3.用甲泛影醯胺密度梯度分級分離腹側脊髓細胞分級分離方法是按在6.1.3節中所述進行，不同的是在接種當天用NT-3處理細胞。如圖3所示，與未處理的對照組相比，以NT-3處理能引起運動神經元CAT活性的3-4倍的最大激發。CAT活性的增長依賴於劑量，最大增長可達1ng/ml。
7.1.4 神經營養因子-3(NT-3)如下面第8節所述製備BDNF的方法，NT-3是由CHO細胞產生的，並是從CHO細胞條件培養基中純化得到的同種純化物。並由銀染色聚丙醯胺凝膠和胺基酸序列分析進行評價。
7.1.5.膽鹼乙醯轉移酶的分析通過溶解細胞於含有0.1% Triton X-100的20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-HCl)(pH8.6)溶液中得到培養物。取2微升的細胞溶解物按micro-Fonnum方法(Fonnum，1975，J.Neurochem.24407-409)進行膽鹼乙醯轉移酶活性分析。最後的底物組合物由0.2mM[1-14C]乙醯輔酶A(NEN，54.4mCi/mmol)，300mM氯化鈉，8mM溴化膽鹼，20mM EDTA和0.1mM新斯地明的50mM磷酸二氫鈉(pH7.4)緩衝液組成。在這種酶和底物濃度下，使酶反應連續進行90-120分鐘。膽鹼乙醯轉移酶誘導的特異性可通過在測定過程中加入一種特定的膽鹼乙醯轉移酶活性抑制劑來進行檢查。該抑制劑為N-羥乙基-4-(1-萘基乙烯基)苯基偶氮二氫基吡啶(HNP)(White and Cavallito 1970，J，Neurochem.171579-1589)。
7.2 結果如上述所討論的，在脊髓腹側運動神經元的衰退和死亡是肌萎縮性(脊髓)側索硬化(ALS，Lou Gehrig′s病)，脊髓損傷和其他運動神經元疾病病生理過程的主要因素。目前的結果表示NT-3處理的運動神經元中增強了膽鹼乙醯轉移酶的活性，這表明NT-3可用於治療這些疾病而促進膽鹼能的表達。
8實施例從中國倉鼠卵巢細胞的條件培養基中純化重組腦源性生長因子的步驟8.1 材料和方法通過由陽離子交換和凝膠過濾色譜法組成的兩個步驟，將重組BDNF從CHO細胞條件培養基中分離出來。
對從Opticell生物器(Charles River)中收集到的接種了可表達BDNF的CHO細胞的條件培養基 用蒸餾水稀釋(比例1.25∶1)。4℃下連續裝入15ml(1.6cm內徑)S-瓊脂糖快速S-Sepharose Fast Flow(pharmacia)柱中。10.6升(稀釋過的)總體積過柱五天。該柱用pH5.8和50ml的20mM MES緩衝液(4-嗎啉乙烷-磺酸溶液，用氫氧化鈉調pH到5.8)洗滌，再經50ml含有250mM氯化鈉的同樣的緩衝液洗滌，再經不含氯化鈉同樣的MES緩衝液洗滌直到在250nm處的吸收率達到基線水平。然後該柱用25ml pH8.5的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝液洗滌。再經15ml含有100mM氯化鈉的同樣緩衝液洗滌。接著，該柱用150毫升，100mM到750mM梯度氯化鈉的20mM N-二(羥乙基)甘氨酸緩衝液(pH8.8)進行洗脫，流速為2.5ml/分鐘，洗脫的吸收率在280nm，單位滿刻度0.2吸收率的靈敏度下進行檢測。含有重組BDNF的餾分經脊神經節(DRG)移出生物檢定進行鑑別。最高特異性活性的餾分與氫氧化鈉濃度在500和750mM之間相對應。這些餾分合併(45ml)並使用KDa Omega型膜高壓膜超濾出濃縮至2ml，選擇可使BDNF低非特異結合的膜。濃縮的樣品再置於120ml(1.6cm內徑)Sephaeryl S-100 HR凝膠過濾柱上(Pharmacia)。該柱填充後以pH7.6含有400mM氯化鈉的20mM HEPES緩衝劑平衡。該柱以0.25ml/分鐘的速度洗脫，收集2ml量的餾分並以DRG移植生物檢定法對BDNF活性進行檢定，發現在80到90毫升之間洗脫的流分含有生物活性重組BDNF，合併這些餾分並採用還原性SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳，N-末端序列測定和胺基酸定量分析法進行分析。凝膠電泳(18%聚丙烯醯胺)顯示兩條與細胞素C同時遷移的相近分離譜帶。N-末端分析和胺基酸定量分析使用標準的步驟來進行。
N-末端序列分析表明，分離出的物質由全長度BDNF(約66%)和缺少前6個胺基酸殘基的截斷BDNF組成。樣品的胺基酸定量分析顯示蛋白質濃度大約平均值為0.043mg/ml，根據這個值的計算，最終純生物活性BDNF的產量為0.430毫克，DRG移植生物檢定要求該材料半飽和量大約為1.2ng/ml。
8.2結果BDNF的胺基酸定量分析純化的BDNF的胺基酸定量分析在貝克曼(Beckman)6300胺基酸分析儀上完成，結果(表Ⅰ)表明，蛋白質的平均濃度約為0.043Mg/ml，圖4描繪了通過標準DRG移植生物檢定所得出的BDNF量數曲線。
表Ⅰ BDNF序列分析樣品1腦來源的神經營養性因子餾分＃23，BDNF＃2，100μl，20mM HEPES和400mM NaCl。
樣品用75%丙酮冰凍(-20℃)過夜沉澱，在13000rpm下離心10分鐘收集蛋白沉澱物，溶解在70%三氟乙酸中的蛋白質被測定序列周期 序列Ⅰ 序列Ⅱ 參照1 His 17.5pmol Arg 18.6pmol His2 Ser 14.1 Gly 8.5 Ser3 Asp 26.2 Glu 8.8 Asp4 Pro 25.0 Leu 10.8 Pro5 Ala 36.0 Ser 12.3 Ala6 Arg 54.6 Val 19.0 Arg7 Arg 44.1 - Arg8 Gly 16.9 Asp 8.2 Gly9 Glu 13.6 Glu10 Leu 10.7 Leu11 Ser 7.4 Ser12 Val 15.7 Val13 - Cys14 Asp 8.1 Asp15 Ser 4.0 Ser16 Ile 5.0 Ile估計量蛋白Ⅰ36.0×2.5＝90.1pmol(ALa-5)蛋白Ⅱ19.0×2.5＝47.7pmol(Val-6)蛋白Ⅰ和蛋白Ⅱ的比率為2.1。
9 實施例125I-BDNF和125I-NT-3向鼠腹側脊髓的逆向轉運。
9.1 材料和方法9.1.1 神經營養因子用前面第8節所述方法，在條件培養基中製備重組體。BDNF和NT-3用乳過氧化物酶方法對BDNF和NT-3進行放射性碘標記(Yipet al;1983，J.Neurosci.32172-2182)至3000-7800cpm/fmol的特定活性。在轉移研究前除去游離125I。
9.1.2.實驗動物雄性Sprague-Dawley鼠(250-300g)從Zivic Miller獲得，用於所有的逆向轉移研究。
9.1.3.逆向轉移研究以每公斤體重3ml的水合氯醛(4%)和戊巴比妥鈉(88%)混合物麻醉鼠。暴露坐骨神經並在閉孔內肌腱遠側0.4cm處弄破10秒鐘，損傷的目地是暴露最大數量的受體點以使BDNF接近。損傷後，在損傷位置注入2μl含有125I-標記的BDNF或NT-3的10mg/ml BSA的液或注入末標記的BDNF，NT-3或NGF(超過100倍)PBS/BSA緩衝液。16ng BDNF 14ng NT-3的總量被注入(分別為4×106和2.2×106cpm)。傷口被縫合，讓鼠恢復18小時。殺死鼠，取出腰4和腰5脊髓片斷並切成右(同側的)和左(對側的)兩半。樣品放置在4%仲甲醛磷酸鹽(pH7.4)緩衝液中，以gamma計數器計數。數據以每個右或左脊髓轉移的125I神經營養因子的渺摩爾(10-18摩爾)±S.E.M表示。
9.2 結果表Ⅱ顯示了在損傷坐骨神經部位注入125I-BDNF的鼠脊髓中有-BDNF的積累。在注射的一邊觀察到有計數(每分鐘300-400計數，相當於約50渺摩爾)，但是與在對測邊積累的背景計數相近。對測邊出現低的積累計數可能起源於通過系統循環從注射邊洩漏到有意義邊。對脊髓轉移研究來說這種背景計數通常是注射邊的15-25%，並在整個試驗中保持相對不變。超過100倍的BDNF明顯阻礙轉移，而NGF和NT-3(＞100倍)僅部分阻礙轉移。脊髓組織的乳液自動放射照片分析揭示有大的腹側角神經元(在腹側角的背外側四分體中)被標記，這種神經元形態上表現為運動神經元。在背側脊髓中，僅可見背景標記表Ⅱ125I-BDNF逆向轉移至鼠脊髓渺摩爾注射 R L125I-IBDNF+PBS 56±15 10±4125I-BDNF+BDNF 7±3* 3±1125I-BDNF+NT-3 35±1 6±3125I-BDNF+NGF 48±5 8±3所有試驗中BDNF注入右邊損傷的座骨神經。
結果用3-4隻動物的平均數±S.E.M表示。
R.右脊髓;L.左脊髓＊P.與125I-BDNF+PBS比較＜0.05
表Ⅲ揭示了NT-3也被轉移到脊髓中去，超過100倍的同源配位體明顯減少轉移，但NGF和BDNF對NT-3的轉移沒有明顯作用。
表Ⅲ125I-NT-3逆向轉移至鼠脊髓渺摩爾NT-3注射 R L125I-NT-3+PBS 37±3 14±9125I-NT-3+NT-3 16±7* 11±6125I-NT-3+BDNF 28±5 10±2125I-NT-3+NGF 32±6 18±4結果用3-4隻動物的平均數±S.E.M.表示。
R，右脊髓;L，左脊髓＊P與125I-NT-3+PBS比較＜0.0510.實施例 腦源性神經營養性因子和神經營養物-3支持新生鼠的損傷運動神經元存活下列數據由Max-Planck精神病學院神經化學和神經生物化學系的M.Sendtner，B.Holtmann，R.Kolbeck，H.Thoenen和Y.-A.Barche的手稿提供。
10.1材料和方法10.1.1 外科學和組織學方法按照Sendtner等人(1990，Nature，345440-441)描述的方法進行幼鼠右側面神經橫切實驗。概括地說，新生Wistar鼠通過低溫麻醉，直接在右耳後切出約3mm長的口子。面部神經在基突乳突處暴露，在距這個位置約1mm處橫切兩神經根。凝膠泡沫(Spongostan，Paesel，Frankfurt，Germany)被切成小塊(1×1×3mm)，浸入含有5μg BSA(Cohn Fraction V，Sigme，Deisenhofen，Germanoy)或營養因子的30μl PBS中。凝膠泡沫插於損傷部位，固定在覆蓋這個部位的韌帶下。皮膚以絲織物(Ethikon3-0)溼潤，並將該動物歸還給它們的母親。出生後七天，通過超劑量乙醚和經血管灌注50ml 4%甲醛處死動物。解剖腦幹，固定1小時後，以水衝洗，用遞增濃度的乙醇(70-100%)脫水，在石蠟打底後，將全部腦幹用系列切片機(Reichert-Jung 2050 Supercut)製成系列切片(7μm)，切片以羥甲苯基紫羅蘭(Sigma，Deisenhofen，Germany)染色，對比邊和損傷邊的面部運動神經元核仁在光學顯微鏡(放大125×)下計數，按Sendtnea等人描述的方法每隔5片計數，其計數沒有用分裂核進行校正。
10.1.2 NGF，BDNF和NT-3的產生和特性從成熟雄性鼠的頜下腺分離神經生長因子(2.5S)，重組鼠BDNF和NT-3均可通過重組牛痘病毒轉染的兔腎細胞產生，並可從上清液純化。
10.2 結果如果面部運動神經元軸突被切斷和損傷，則80%以上的損傷細胞可在幾天內變化退化。CNTF應用於損傷部位顯示出增加這種細胞的存活率將近100%，在相同的條件下，應用5μg NGF不能明顯提高運動神經元的存活能力。
與用NGF處理的動物相反，如果BDNF應用於切斷的面部神經，可觀察到較高的存活率。平均50%的損傷運動神經在損傷後一周仍然存活(表Ⅳ)。損傷部位神經元的存活率範圍為765至4580。在僅765個神經元可被測得的動物中，包含營養因子的凝膠泡沫已從損傷部位移位，這可能解釋這一個實驗中觀察到的BDNF的低存活作用。
和用BDNF的結果一樣，在NT-3處理後也能提高運動神經元的存活能力(表Ⅳ)。然而其作用小於BDNF的作用，平均27%的損傷運動神經元可在損傷部位被挽救，相比而言BSA可使18%的運動神經元被挽救，NT-3提高存活能力的作用在統計學上具有顯著意義(P＜0.05)。
形態上，以BDNF和NT-3處理動物的損傷運動神經元細胞體較小，顯示出典型的反應性變化(表5)。BDNF和NT-3處理的動物中，細胞核被移位，染色質溶解顯著，然而，當與用BSA-凝膠泡沫處理的對照動物比較時，細胞核體積顯得較大，(圖5)。
表Ⅳ新生鼠面神經損傷後運動神經元的存活能力神經營養因子的作用
10.3討論在本發明的研究中，我們發現BDNF能夠支持新生鼠大量面部運動神經元軸索切斷後的存活。此外，雖活性較低，NT-3似乎對這些細胞也有活性。相反NGF卻不支持這些細胞軸突切斷後的存活。這些數據說明，神經營養因子基因家族成員能以類似CNTF的方式在體內影響運動神經元的存活。
本文引用了幾篇對比文獻，其中所述內容全部一併引用作為參考。
權利要求
1.一種治療運動神經元紊亂的方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經營養性因子，該因子(ⅰ)是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員，(ⅱ)支持運動神經元的存活、生長或分化。
2.如權利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是BDNF。
3.如權利要求1所述的方法，其中BDNF/NT-3/NGF分子家族的成員是NT-3。
4.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由肌萎縮性側索硬化引起的
5.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由損傷引起的
6.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由進行性脊柱肌肉萎縮引起的。
7.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由嬰兒或幼年性肌肉萎縮引起的。
8.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由脊髓灰質炎或脊髓灰質炎後綜合症引起的。
9.如權利要求1所述的方法，其中的運動神經元紊亂是由進行性神經性腓骨肌萎縮引起的。
10.如權利要求1所述的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族的成員與有效量的至少一種能提高運動神經元存活，生長或分化能力的其它試劑共同使用。
11.如權利要求10的方法，其中的其它試劑是睫狀神經營養因子。
12.一種可用於治療運動神經元紊亂的藥物組合物，包括一種支持運動神經元存活、生長或分化的BDNF/NT-3/NGF家族成員與一種藥理上可接受的載體。
13.如權利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
14.如權利要求12的藥物組合物，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
15.一種提高運動神經元存活、生長和/或分化能力的方法，包括將運動神經元暴露在有效濃度的神經營養性因子中，該營養因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一種成員，它們能提高運動神經元的存活、生長或分化能力。
16.如權利要求15的方法，它是在體外進行的。
17.如權利要求15的方法，它是在體內進行的。
18.如權利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
19.如權利要求15的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
20.一種診斷病人運動神經元紊亂的方法，包括比較取自病人和取自正常人的樣品中的是BDNF/NT-3/NGF家族成員的神經營養性因子水平含量，以測定在病人中與運動神經元紊亂正性相關的神經營養性因子的異常水平。
21.如權利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是BDNF。
22.如權利要求20的方法，其中的BDNF/NT-3/NGF家族成員是NT-3。
23.如權利要求20的方法，其中的運動神經元紊亂是肌萎縮性側索硬化。
24.一種測試能提高運動神經元存活、生長或分化能力的試驗試劑的檢測方法，包括(a)在標記的BDNF能同運動神經元結合的條件下暴露運動神經元在可測的標記BDNF中，(b)同時暴露所說運動神經元在試驗試劑中，其中試驗試劑對標記BDNF結合的抑制作用表明該試驗試劑可用於治療運動神經元紊亂。
25.一種測試能提高運動神經元存活、生長或分化能力的試驗試劑的檢測方法，包括(a)在標記的NT-3能同運動神經元結合的條件下暴露運動神經元在可測的標記的NT-3中，(b)同時暴露所說運動神經元在試驗試劑中，其中試驗試劑對標記的NT-3結合的抑制作用標誌著試驗試劑用於治療運動神經元紊亂的實用性。
26.一種製備基本上純化的重組BDNF的方法，包括(ⅰ)在一種真核細胞中表達重組BDNF;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細胞產生的條件培養基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養基;(ⅳ)將稀釋的培養基上S-瓊脂糖(凝膠)柱(Sepharose)以約100-750mM的鹽梯度洗脫;(ⅴ)收集洗脫餾分;(ⅵ)合併具有BDNF活性的組分;(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱;和(ⅸ)以含有400mM NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
27.一種製備基本上純化的重組NT-3的方法，包括(ⅰ)在一種真核細胞中表達重組NT-3;(ⅱ)收集由步驟(ⅰ)的真核細胞產生的條件培養基;(ⅲ)用蒸餾水稀釋培養基;(ⅵ)將稀釋的培養基上S-瓊脂糖(凝膠)柱，以約100-750mM的鹽梯度洗脫，(ⅴ)收集洗脫物流出組分，(ⅵ)合併具有NT-3活性的組分，(ⅶ)濃縮步驟(ⅵ)的組分，(ⅷ)將步驟(ⅶ)的濃縮組分上Sephacryl S-100HR凝膠過濾柱，(ⅸ)以含有約400NaCl(PH7.6)的溶液洗脫步驟(ⅷ)的柱子。
28.一種診斷BDNF相關運動神經元紊亂的方法，包括注射可測的標記的BDNF，以使得標記的BDNF進入一種運動神經，測定標記的BDNF是否逆向轉移，如果逆向轉移失敗，說明運動神經元功能喪失。
29.如權利要求28的方法，其中的紊亂屬於下列一組疾病中的一種肌萎縮性側索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質炎，脊髓灰質炎後綜合症，進行性神經性腓骨肌萎縮，神經創傷或損傷。
30.一種診斷NT-3相關性運動神經元紊亂的方法，包括用某種方式將可測的標記的NT-3注入，使標記的NT-3進入一種運動神經，測定標記的NT-3是否逆向轉移，其中，逆向轉移的失敗與運動神經元機能失調相關。
31.如權利要求30的方法，其中的紊亂屬於下列一組疾病中的一種肌萎縮性側索硬化，進行性脊柱肌肉萎縮，嬰兒肌肉萎縮，脊髓灰質炎，脊髓灰質炎後綜合症，進行性神經性腓骨肌萎縮，神經創傷或損傷。
全文摘要
本發明涉及運動神經元紊亂例如肌萎縮性側索硬化(Lou Gehriy氏病)的治療方法，包括給需要該治療的病人使用有效量的神經營養性因子，該因子是BDNF/NT-3/NGF分子家族的一個成員。本發明部分地基於BDNF和NT-3均能增加運動神經元培養物中膽鹼乙醯轉移酶活性的發現。在本發明特定優選實施例中BDNF或NT-3和一種第二試劑如CNTF的聯合使用，可用於治療運動神經元疾病。本發明也提供提高運動神經元在體外存活，生長和/或分化能力的方法，診斷方法和檢測系統，該系統可被用於辨別具有BDNF或NT-3樣活性。
文檔編號A61KGK1071585SQ92105070
公開日1993年5月5日 申請日期1992年5月19日 優先權日1991年7月10日
發明者V·王, C·拉濟祖斯基, P·迪施特凡諾 申請人:裡珍納龍藥品有限公司, 馬克斯普朗克科學促進協會