有機磷農藥消解酶、其編碼基因和生產方法

2023-10-04 14:55:59

專利名稱：有機磷農藥消解酶、其編碼基因和生產方法
技術領域：
本發明涉及一種有機磷農藥消解酶，編碼這種酶的基因，含有該基因的表達載體和生產這種酶的方法。本發明還涉及清除農產品上殘留的有機磷農藥的方法。
有機磷是當今農藥中的主要類別，一直在國內外大量生產和廣泛使用，目前世界上的有機磷農藥商品已達上百種，我國使用的有機磷農藥約有30種，包括殺蟲劑、除草劑、殺菌劑等，1999年的使用量為20萬噸，佔整個農藥的57％，其中80％以上是劇毒有機磷農藥如甲胺磷、甲基對硫磷、對硫磷、久效磷、敵敵畏等，僅甲胺磷的使用量一年就高達6.5萬噸，其它大噸位的有機磷農藥還有樂果、氧化樂果和辛硫磷等。根據目前狀況，我國有機磷農藥佔據農藥主導地位的局面難以在短期內改變，還將長期使用(華小梅等，環境科學進展，Vol.4，No2，p33～45，1996；張一賓等，農藥，Vol38，No7，p1～3，1999)。隨著人們生活質量的提高和環境意識的加強，有機磷農藥的殘留毒性問題越來越受到人們的關注。
有機磷農藥均具有抑制人體乙醯膽鹼酯酶的功能，對人均存在著程度不同的毒性，急性中毒可引起人肌肉痙攣、瞳孔收縮、呼吸困難直至死亡(陳茹玉等，有機磷農藥化學，上海科學技術出版社，1995)。殘留在蔬菜、水果等食品上的低劑量有機磷農藥對人可產生慢性毒性，會誘導多發性神經病、中風等。
有機磷農藥消解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有機磷農藥分子而使其脫毒。由於各種有機磷農藥都有類似的結構，只是取代基不同，所以一種有機磷農藥消解酶往往可降解多種有機磷農藥。有機磷農藥消解酶目前已被公認為是淨化農藥汙染的最有潛力的新方法(虞雲龍等，環境科學進展，Vol.4，No.3，28～36，1996)。多種微生物都能產生有機磷農藥消解酶，如假單胞菌、麴黴等，但在這些微生物中含量太低，難以大量生產，生產成本高昂，到目前為止國內外均還沒有商品化生產和實際應用。
早在七十年代就發現有些土壤微生物對農藥具有降解作用，目前發現的農藥降解微生物包括細菌(Munnecke，Appl.Microbiol.，Vol.28，No.2，p212～217，1974；Brown，Soil Biol.Biochem.，Vol.12，p105～112，1979；)、真菌(Bujacz，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.61，No.8，p2905～2910，1995；Omar，Biodegradation，Vol.9，p327～336，1998)、放線菌和藻類，細菌中包括假單胞菌、節細菌、黃桿菌等二十餘種，真菌中有麴黴、青黴、木黴等。進一步研究發現這些微生物之所以能降解有機磷農藥是因為它們能分泌一種能水解磷酸酯鍵的酶(有機磷農藥消解酶)。八十年代Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)發現有機磷農藥消解酶比產生這類酶的微生物菌體更能忍受異常環境條件，如來源於假單胞菌的消解酶在10％的無機鹽、1％的有機溶劑、50℃下都能保持高活性，而該酶的產生菌在同樣的條件下卻不能生長。而且，酶的降解效果遠遠勝於微生物本身，特別是對低濃度的農藥。因此，人們的思路從應用微生物菌體淨化農藥汙染轉向利用有機磷農藥消解酶。
目前有機磷農藥消解酶的研究已成為世界性的研究熱點之一。隨著分子生物學的發展，對機磷農藥消解酶的研究目前已進入到分子水平，數種微生物來源的機磷農藥消解酶已得到分離純化並進行了較深入的生理生化研究，如Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)分離到的機磷農藥消解酶對試驗用的甲基對硫磷、二嗪農、毒死蜱等7種有機磷農藥均能有效降解，在22℃時降解效率比化學降解快1000～2450倍，且該酶不為農藥及農藥製劑中溶劑所抑制，對環境條件有較寬的忍受範圍。
應用有機磷農藥消解酶就必須解決一個關鍵性的問題—如何工業化廉價生產有機磷農藥消解酶。有機磷農藥消解酶在原始天然菌株中含量太低，難以大量生產、生產成本高昂。這也是目前世界上還未有商品化生產的有機磷農藥消解酶產品及在生產實踐上推廣應用的關鍵原因。近年來，隨著基因工程技術的飛速發展，人們意識到利用基因工程技術是解決這一問題最有效的方法，具體思路是通過基因工程的手段克隆有機磷農藥消解酶編碼基因，然後在重組微生物生物反應器中高效表達有機磷農藥消解酶基因，使有機磷農藥消解酶的單位表達量比原始天然菌株成百上千倍的提高，從而大幅度降低生產成本。
到目前為止，僅從細菌中分離到了3個有機磷農藥消解酶的編碼基因，一種是來源於假單胞菌(Mcdaniel，J Bacterol.，Vol170，No.5，p2306～11，1988；Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)或黃桿菌(Mulbry，J Bacteriol，Vol.171，No.12，p6740～46，1989)的消解酶基因opd，在這兩種菌中，opd的序列是一樣的(Chaudhry，Appl.Environ.Microbiol.Vol.54，No.2，p288～293，1988)。另一個是來源於節桿菌(Arthrobacter sp.)的消解酶基因oph(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)。還有一個是來源於單胞菌(Alteromonas sp.)的有機磷農藥消解酶基因oph(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)。真菌來源的有機磷農藥消解酶基因還未曾分離到。
1985年Sendar等(Bio/technol.，Vol.3，p567～568，1985)首次嘗試在大腸桿菌中表達有機磷農藥消解酶，表達產物雖具有生物學活性，但表達量還未到原始天然菌株的十分之一。隨後Sendar等(1989)將此酶基因前的SD序列及信號肽編碼序列去除後再在大腸桿菌中表達，使表達量有所提高(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)。九十年代許多科學家都進行了機磷農藥消解酶編碼基因的克隆和高效表達的工作，如Cheng等(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)從Alteromonas sp.中克隆到一個機磷農藥消解酶編碼基因並在大腸桿菌中嘗試表達，Ohshiro等(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)從Arthrobacter sp.B-5中分離到機磷農藥消解酶基因oph，也在大腸桿菌中進行了表達。以上的這些表達研究，從總體上看，其表達水平還較低，只比原始天然菌株高十幾倍，一般都不超過100□g酶蛋白/mL發酵液，還達不到廉價生產機磷農藥消解酶的要求，但卻證實了利用基因工程手段來提高有機磷農藥消解酶的表達、批量生產這一途徑的有效性。
本發明的一個目的是提供一種新的有機磷農藥消解酶。
本發明的另一個目的是提供一種編碼本發明的消解酶的基因。
本發明的又一個目的是提供一種含有本發明的基因的表達載體。
本發明的再一個目的是提供一種生產本發明的消解酶的方法。
本發明的還一個目的是提供一種消除農產品上的有機磷農藥的方法。
土樣從農藥生產廠的生產場地和排汙口採取。以不含C、N、P的無機鹽培養基為基礎培養基，基礎培養基中加入不同的農藥，並作加入或不加入N源的組合，進行初篩，初篩出的菌株進一步在農藥含量逐漸增高的培養基上連續馴化和分離。對分離出的菌株進行有機磷農藥消解酶的酶活性測定，並進一步對所產酶進行生理生化性質研究，篩選出具有高活性的廣譜、穩定的有機磷農藥消解酶產生菌株Psedomonos sp.92。此菌株所產生的有機磷農藥消解酶具有優良的性質。這種酶的胺基酸序列如圖7所示。這種有機磷農藥消解酶必須在常溫下對多種有機磷農藥有較高的活性，即好的廣譜性，同時酶本身具有很好的穩定性。本發明篩選到的假單孢菌Psedomonos sp.92所產生的有機磷農藥消解酶最適pH值為8～10，最適溫度為50℃，加入酶保護劑後在常溫中存放6個月，其酶活性喪失不超過15％。此酶對多種有機磷農藥都有降解作用，尤其是具有P-O-C鍵的農藥，如對硫磷、敵敵畏、甲基對硫磷、亞胺硫磷、久效磷，降解率在80～98％，對具有P-S-C的農藥如樂果、馬拉硫磷、甲胺磷、甲拌磷、氧化樂果等降解率也在60％以上。目前國內外報導的有機磷農藥消解酶一般僅能對P-O-C和P-S-C這兩種鍵型的有機磷農藥中的一種有高活性，如Serdard等(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)報導的來源於細菌的有機磷農藥消解酶、劉玉煥等(微生物學報，Vol.40，No.4，p430～434，2000)報導的來源於真菌的有機磷農藥消解酶對P-O-C鍵型的農藥有較高活性，而對P-S-C鍵型的農藥無活性。而另一些有機磷農藥消解酶則反之，對P-S-C鍵型的某些農藥有活性，而對P-O-C鍵型的農藥及另一些P-S-C鍵型的農藥則極低。我們分離到的這一有機磷農藥消解酶對P-O-C和P-S-C鍵型的兩類有機磷農藥均有高活性。
本發明的分離克隆到此有機磷農藥消解酶的編碼基因，為此基因的改造並在各種外源基因表達系統中高效表達提供優良的基因材料。通過Inverse PCR的方法分離克隆了這一有機磷農藥消解酶基因opdA.DNA全序列分析結果表明，此基因全長1098個核苷酸，編碼365個胺基酸，根據信號肽序列的結構規則推斷及成熟蛋白N端序列的胺基酸序列測定結果，N-端的29個胺基酸為信號肽，信號肽的切割位點在+29位的Gly之後。基因的G+C含量為50.8％。此基因與Serdar等報導的從Pseudomonasdiminuta MG中分離的有機磷農藥消解酶基因(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)有同源性，但核苷酸同源性僅為76.5％，胺基酸同源性為僅83.6％，說明這是一個新基因。本發明的有機磷農藥消解酶基因優選具有如圖6所示的核苷酸序列。
本發明提供了一種高效表達本發明的有機磷農藥消解酶的方法，包括使用權利要求1或2所述的基因構建表達載體；使用含有有機磷農藥消解酶基因的表達載體轉化宿主細胞；使有機磷農藥消解酶基因表達並分離所表達的有機磷農藥消解酶。
在對本發明的有機磷農藥消解酶基因進行表達時可以對該基因進行改造。基因的改造可利用PCR技術、定點突變技術、基因設計後化學合成等技術來實現。可選擇的表達系統包括低等真核表達系統如酵母、絲狀真菌等；原核表達系統大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌、杆狀病毒等。例如，可以通過PCR的方法將有機磷農藥消解酶基因原有的信號肽序列除掉，將改造後的有機磷農藥消解酶基因在畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達，以解決有機磷農藥消解酶在原始天然菌株中產量太低、難以獲得大量產品、生產成本過高的問題，使其能在實際生產實踐中推廣應用。別的真核表達系統如杆狀病毒-昆蟲表達系統、黴菌表達系統、植物表達系統等也適合於此有機磷農藥消解酶基因的高效表達。
本發明提出一種新思路，即在蔬菜、水果等農產品的清洗及食品原料的淨化中應用有機磷農藥消解酶，使殘留的農藥能被降解而脫毒，避免殘留農藥引起的急性、慢性中毒，提高人們的生活質量；同時，也可在農藥汙染的水體和土壤等環境中應用有機磷農藥消解酶，減輕環境的農藥汙染。
採用畢赤酵母(Pichia.pastoris)做為有機磷農藥消解酶基因的表達受體，其優點是1.表達量大，有機磷農藥消解酶在其中的表達量可達到5mg/mL發酵液；2.發酵所需原料單一、便宜、易得，均為工業原料，碳源為工業葡萄糖，氮源為工業氨水，另只需一些微量無機鹽，發酵成本低廉；3.畢赤酵母本身具有很好的安全性，曾作為單細胞蛋白廣泛應用，酵母培養基中不含有毒物質和致熱源；4.表達的有機磷農藥消解酶在信號肽的引導下會分泌到培養基中，這使有機磷農藥消解酶直接暴露出來而無需破碎酵母菌體，有利於有機磷農藥消解酶的純化及降低後加工成本。
本發明提供了重組的有機磷農藥消解酶基因工程菌株的高密度發酵、酶蛋白大量產生的方法，為有機磷農藥消解酶工業化發酵生產奠定基礎。本發明提供的以葡萄糖為碳源、氨水為氮源(均為廉價的工業原料)的菌體高密度發酵方法，使用通用的發酵裝置即可。
本發明分離到的具有優良特性的有機磷農藥消解酶基因為此基因在各種生物反應器如杆狀病毒表達系統、麴黴表達系統、酵母表達系統中高效表達、大量生產有機磷農藥消解酶提供了優良的基因源。本發明可用來工業化廉價生產有機磷農藥消解酶。


圖1.Pseudomonas sp.92所產有機磷農藥消解酶經純化後的SDS-PAGE分析1.純化後的酶蛋白；2.HPLC；3.標準蛋白分子量圖2.有機磷農藥消解酶的最適pH圖3.有機磷農藥消解酶的酸鹼穩定性圖4有機磷農藥消解酶的最適反應溫度圖5.有機磷農藥消解酶的熱穩定性圖6.來源於Pseudomonas sp.92的有機磷農藥消解酶結構基因核苷酸序列圖7.來源於Pseudomonas sp.92的有機磷農藥消解酶的胺基酸序列圖8.酵母重組轉移質粒pPIC9X的物理圖譜圖9.在5L發酵罐中連續3批次的有機磷農藥消解酶的表達積累曲線圖10.重組酵母中表達的有機磷農藥消解酶的SDS-PAGE分析
1.標準蛋白分子量；2-9.誘導0，12，24，48，72，96，108，120小時積累的酶蛋白四、實施例實驗一一、菌株與載體大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質粒pUC18等購自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS115(His-Mut+)、質粒pPIC9由加拿大Alberta大學D.Luo博士惠贈。
二、酶與試劑盒限制性內切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產品。T7DNA sequence kit購於Pharmacia公司。隨機引物標記Kit和PCR Kit均購於Promega公司。
三、生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS為Sigma公司產品。TEMED、過硫酸銨、丙烯醯胺及甲叉雙丙烯醯胺為Promega公司產品。
四、培養基1.篩選培養基PS培養基KCl，0.5g/L；MgSO4.7H2O，0.3g/L；CaCl，0.04g/L；MnCl，2mg/L；ZnCl，2mg/L；FeSO4.7H2O，2mg/L；pH7。培養基中各種農藥的加入量為0.01％(V/V)。
PSN培養基PS培養基中加入0.05％的NaNO3作N源2.大腸桿菌培養基LB1％蛋白腖、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.03.酵母完全培養基為YPD1％酵母提取物、2％蛋白腖、2％葡萄糖4.酵母轉化培養基RDB18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O aminoacids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％穀氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖5.酵母選擇培養基MM
34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖6.酵母選擇培養基MD34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖7.酵母誘導培養基BMGY1％酵母提取物、2％蛋白腖、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)8.酵母誘導培養基BMMY1％酵母提取物、2％蛋白腖、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甲醇(V/V)9.重組酵母發酵培養基為10×Basal Salts67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖10.發酵中所用的微量鹽溶液PTM10.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸實驗二本實施例說明產生有機磷農藥消解酶的天然菌株的篩選程序。土樣按常規稀釋後塗布於分別含有0.01％對硫磷的PS平板，30℃培養5～10天待菌落出現，長出的菌落可分解對硫磷為菌株生長提供C、N和P源，挑取菌落在含有0.01％對硫磷的PS平板上劃線分離單菌落，重複3輪，共分離到283個菌落。菌落轉接到含0.01％敵敵畏的PSN平板上，30℃培養至菌落出現，長出的菌落可分解敵敵畏為菌株生長提供C和P源(敵敵畏分子中不含N)，共分離到199個菌落。接著將菌落轉接到含0.01％氧化樂果的PS平板上，分離到28個菌落，進一步將這28個菌落轉接到含有0.01％甲拌磷的PSN平板上，分離到7個菌落。有機磷農藥主要分為P-O-C鍵和P-S-C鍵2類，對硫磷和敵敵畏屬於前者，而氧化樂果和甲拌磷屬於後者，按上述方法分離到的菌株能同時水解這2類鍵的農藥。經初步鑑定，分離到的這7株菌有3株為假單胞菌，分別命名為Pseudomonas sp.90、91、92，另4株為黃桿菌，分別命名為Flavobacteriumsp.66、67、68、69。
進一步對篩選到的菌株進行馴化，將菌株在同時含上述4種農藥、但濃度逐漸提高的PS平板上依次轉接，每種農藥濃度依次為0.0025％、0.0027％、0.003％、0.0035％、0.004％、0.005％。經馴化後，Pseudomonassp.92在含4種農藥濃度分別為0.005％的PS平板上生長良好，而其餘菌株只能在農藥較低的平板上正常生長。Pseudomonas sp.92被用來進行進一步的研究。
挑取Pseudomonas sp.92菌株接種於5mL液體培養基PS(分別含0.004％的上述4種農藥)中，30℃搖振培養3天，按1％接種量轉接到50mLPS培養基(分別含0.005％的上述4種農藥)中繼續培養5天。離心後去上清，收集菌體，懸於含有0.1mmol/L ZnCl2的50m mol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.5)中，超聲波破碎菌體，15000g離心20分鐘去細胞殘渣，上清液用來進行酶活性測定。測定方法為0.1mL的酶稀釋液中加入0.005mL10mg/mL的對硫磷和0.9mL Tris-HCl緩衝液(pH8.5)，37℃保溫10min，加入1mL 1％NaCO3顯色，415nm測定水解產物對硝基酚含量。一個酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1mol對硝基酚所需酶量為一個酶活性單位。Pseudomonas sp.92所產的有機磷農藥消解酶活性為3.2U/mL發酵液。
實驗三本實驗說明有機磷農藥消解酶的純化程序。
Pseudomonas sp.92菌株在1000mL PS培養基(分別含0.005％的上述4種農藥)中培養5天後，收集菌體，懸於100mL含有0.1mmol/L ZnCl2的50m mol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.5)中，超聲波破碎菌體，15000g離心20分鐘去細胞殘渣，上清液緩衝液中緩慢加入硫酸銨至飽和度85％，4℃過夜，9000g離心60min，棄上清液，沉澱溶於1mL含0.1mmol/L ZnCl2的Tris-HCl(pH8.5)緩衝液中。酶蛋白進一步用HPLC純化(KTA FPLC，Pharmacia公司)純化。含酶的濃縮液首先用HiPrep-26/10-Desalting柱脫鹽，緩衝液為20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速為5mL/min，收集洗脫峰，接著用離子交換柱Hitrip-SP-Sepharose-XL(5mL)分離，A泵為20mmol/LTris-HCl(pH7.0)，B泵為1mol/L NaCl、20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)高鹽緩衝液，流速為2mL/min，高鹽緩衝液從0～100％梯度洗脫10個柱床，分部收集洗脫峰，通過酶活性測定後的洗脫峰進一步用凝膠柱Superdex-75-HR-10/30純化，緩衝液同樣為20mmol/L Tris-HCl(pH7.0)，流速為0.5mL/min，收集洗脫峰得到純蛋白。
在純化過程中的85％硫酸銨沉澱、HPLC純化等各步驟中進行酶活性測定，結果(表1)表明酶蛋白的回收率分別為65.5％、22.5％。純化完成後酶蛋白的含量為1440U/mL，比活性為3200U/mg。SDS-PAGE結果(圖1)表明，純化後的有機磷農藥消解酶蛋白僅有一條單一的條帶，酶的分子量約為38KD。
表1 純化有機磷農藥消解酶的比活性

實驗四本實驗說明有機磷農藥消解酶的酶學性質的測定方法。
最適pH和pH穩定性的測定方法如下經純化的有機磷農藥消解酶在不同的pH值下進行酶促反應以測定其最適pH。酶促反應的緩衝液為不同pH的含0.1mmol/L ZnCl2的50mmol/L緩衝液(pH2.0為HCl-KCl緩衝液；pH3.0為HCl-甘氨酸；pH4.0、5.0為HAc-NaAc緩衝液；pH6.0為Tris-Maleate緩衝液；pH7.0、7.5、8.0、8.3、8.5、8.8、9.0為Tris-HCl緩衝液；pH9.5、10、11、12為甘氨酸-NaOH緩衝液)，37℃測定酶活性。有機磷農藥消解酶於上述各種不同pH的緩衝液中37℃處理30min，再在Tris-HCl(pH8.5)緩衝液體系中37℃下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。純化的有機磷農藥消解酶在不同pH的緩衝體系37℃下測定的pH適性結果(圖2)表明，最適pH峰寬且平，為8～10；酶在一系列不同pH緩衝液中37℃處理30min後，再在標準條件下測定其酶活性，結果表明(圖3)，在pH4～12的範圍內，剩餘酶活性維持在80％以上，這說明此酶具有很好的耐酸鹼性。
有機磷農藥消解酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下最適溫度的測定為在Tris-HCl(pH8.5)緩衝液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為酶在不同溫度下處理60min和120min，再在37℃下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖4)表明，其最適溫度為50℃。酶的熱穩定性性試驗表明(圖5)，70℃處理30min和60min後，剩餘酶活還分別有80％和50％以上，60℃下處理60min後，剩餘酶活還有70％以上，說明此酶具有較好的熱穩定性。
有機磷農藥消解酶的Km值測定方法如下用不同的對硫磷底物濃度，在Tris-HCl(pH8.5)緩衝液體系中，37℃下測定酶活性，計算出其在37℃下的km值。經測定，此酶在37℃下以對硫磷為底物的km之為0.24mmol/L。
有機磷農藥消解酶對不同農藥的降解率測定如下以1％不同的有機磷農藥作為底物，37℃下酶水解1小時，測定農藥被降解的量。結果見表2，結果表明，其對佔有機磷農藥主體的P-O-C鍵型的有機磷農藥如對硫磷、DDV、甲基對硫磷、亞胺硫磷等降解率可高達80～98％，對P-S-C鍵型的農藥也有60～72％的降解率。研究結果說明此酶有很好的廣譜性，可降解多種有機磷農藥。
表2.有機磷農藥消解酶對不同農藥的降解率

陽離子和化學試劑對有機磷農藥消解酶活性的影響測定方法為在酶促反應體系中加入不同的陽離子或化學試劑，研究它們對酶活性的影響。酶反應體系中加入不同濃度的Zn2+，結果表明，反應體系中無Zn2+時，酶活性極低，隨著Zn2+濃度的提高，酶活性逐步提高，Zn2+濃度達到1mmol/L時，酶活性達到最高值，此時酶活性提高了約30倍，再增加Zn2+濃度，酶活性無顯著變化。這一結果說明此酶的生物學活性依賴Zn2+存在。
在含有Zn2+存在的情況下，再加入別的金屬離子和試劑，其結果表明(表3)，金屬離子對酶活性沒有顯著影響，而金屬離子螯合劑可使酶活性急劇下降，暗示此酶是一種金屬蛋白。表面活性劑SDS對酶活性基本沒有影響。
表3.各種金屬離子和化學試劑對有機磷農藥消解酶活性的影響

有機磷農藥消解酶蛋白的N端胺基酸序列經胺基酸序列測定，純化後的有機磷農藥消解酶蛋白的N端胺基酸序列為Ser-Ile-Gly-Thr-Gly-Asp-Arg-Ile-Asn。通過酶解將酶蛋白水解，對其一條內肽的N端序列測定結果為Asp-Asp-Thr-Asp-Asp-Leu。
實驗五本實施例說明從中克隆有機磷農藥消解酶基因opdA的程序。
首先進行質粒消除實驗，以確定有機磷農藥消解酶基因是在Pseudomonos sp.92的染色體上還是質粒上。將菌株接種到LB培養基上30℃培養過夜，按10％接種量轉接到含有30□g/mL絲裂黴素C的培養基中培養36小時，稀釋後塗布於LB平板上培養至菌落出現。挑取單菌落培養進行有機磷農藥消解酶酶活性檢測。結果表明，質粒消除後，檢測不到酶活性，說明有機磷農藥消解酶基因是由質粒攜帶的。
攜帶有機磷農藥消解酶基因的質粒提取按以下方法進行。菌株培養後取1mL菌液離心收集菌體，加入200□L 25mmol/L Tris-HCl緩衝液(pH8.0)(內含50mM葡萄糖，10mM EDTA，2mg/mL溶菌酶)，28℃下保溫30分鐘，加0.2mL裂解液(0.2N NaOH、2％SDS)，搖動5分鐘，用等體積的酚、酚-氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉澱後溶於雙蒸水中備用。
有機磷農藥消解酶基因的分離克隆採用Inverse PCR的方法。根據酶成熟蛋白N端胺基酸序列和蛋白內肽N端的胺基酸序列，合成一對引物P15』ATTGGTACTGGTGATAGA 3』P25』CAAGTCGTCAGTATCGTC 3』以質粒DNA為模板，PCR出來一條約600bp的條帶，並進行序列測定。這600bp為有機磷農藥消解酶基因的部分序列，在其上336bp處發現一單一酶切點BglII。根據酶切點BglII前的已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物P35』GCTGCTGGTGTTAGAACTATT 3』P45』TCTAGCTCTTCTCAATCCTCT 3』同樣，根據酶切點BglII後的已測定序列合成一對分別向兩端擴增的引物P55』GAGCAGCAAGCCGCCATTTTC 3』P65』GTCTCTTTGAGAGGCAGCAGT 3』質粒DNA經BglII酶切後進行連接環化，以此為模板，分別用上兩對引物進行擴增。P3、P4引物擴增出的是酶前段的部分基因，P5、P6擴增出的是後段的部分基因。進行序列測定後即可拼接出完整的基因序列，再根據此完整序列的兩端設計引物，分離出完整的有機磷農藥消解酶基因。
分離克隆到的有機磷農藥消解酶結構基因opdA(核苷酸序列見圖6，胺基酸序列見圖7)全長1098個核苷酸，編碼365個胺基酸，根據信號肽序列的結構規則推斷及成熟蛋白N端序列的胺基酸序列測定結果，N端的29個胺基酸為信號肽，信號肽的切割位點在+29位的Gly之後。基因的G+C含量為48.2％。此基因與Serdar等報導的從Pseudomonas diminutaMG中分離的有機磷農藥消解酶基因有同源性，但核苷酸同源性為僅76.5％，胺基酸同源性僅為83.6％。
實驗六本實施例說有機磷農藥消解酶結構基因opdA的改造程序。為了使opdA能在酵母中順利異源表達，我們去掉了opdA中信號肽編碼序列，具體方法為，參照信號肽編碼序列之後的核苷酸序列合成一個22個鹼基的寡聚核苷酸片斷引物，另一引物參照opdA的3』端序列合成。用這對引物通過PCR的方法擴增到的opdA基因就是除去信號肽編碼序列後的完整有機磷農藥消解酶結構基因編碼序列。
實驗七本實施說明opdA在酵母表達載體上的構建過程。用於構建酵母表達載體的質粒是pPIC9(帶有α-因子分泌信號)。首先將opdA基因插入到上述表達載體的信號肽序列的下遊，與信號肽形成正確的閱讀框架，然後通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩定整合到酵母染色體上。具體的過程是將改造後的opdA通過EcoRI位點插入到載體pPIC9上的EcoRI位點，得到了一個用於酵母轉化的表達載體-pPIC9X(圖8)。這樣就將帶有分泌信號的目的基因克隆到了AOX啟動子下遊。
實驗八本實施例的目的是說明酵母轉化及篩選重組酵母株系的過程。質粒pPIC9X的DNA經電擊轉化酵母細胞後，通過體內重組，目的基因可以整合到受體酵母基因組中。在外源誘導物存在的條件下，AOX1啟動子可以啟動其下遊基因的表達，並且信號肽可以指導表達產物進入酵母的分泌途徑，經過切割，外源蛋白產物最終分泌至胞外，所產生的有機磷農藥消解酶的胺基酸序列與天然存在的成熟有機磷農藥消解酶完全相同。外源蛋白經過這樣的代謝途徑，可以進行翻譯後修飾，例如糖基化、形成二硫鍵等，從而得到具有生物活性的蛋白產物。
首先用2～3倍過量的內切酶DraI消化質粒pPIC9X的DNA(經PEG法純化)，使之線性化，電泳檢測酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉澱，70％乙醇洗兩次，冷凍乾燥，無菌水溶解，一20℃保存備用。
酵母菌株GS115接種於5mLYPD中30℃培養過夜，取0.5mL接種於500mLYPD中30℃培養使O.D.600＝1.3～1.5，1500×g離心5分鐘，用500mL冰預冷的無菌水洗滌沉澱，如上離心，以20mL冰預冷的1mol/l山梨醇懸浮沉澱，如上離心，以0.5mL冰預冷的1mol/l山梨醇懸浮沉澱。取40μl酵母細胞液加入線性化DNA1～5μg，轉移到冰預冷的無菌電擊杯中冰浴5分鐘。在國產電擊儀LN-101上進行電擊轉化酵母受體菌hisGS115，電擊參數為0.8kv，11.5μF。電擊後立即向電擊杯中加入0.5mL冰預冷的1mol/l山梨醇，然後將電擊杯中的溶液轉移到無菌的Eppendorf管中在RDB固體培養基上塗板，每板塗0.1mL，將培養皿倒置30℃培養至轉化子出現。轉化子可在基本培養基(不含His)生長，由於載體中沒有酵母複製子，所以his4基因必須整合進酵母基因組中才能表達。另外，由於轉化的酵母細胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養基上轉化子就不會生長(或者生長極緩慢)，表現為甲醇利用缺陷型(Mut-)。
用無菌牙籤從轉化平板上挑取His+重組子，首先接種到MM固體培養基上，在接種到MD固體培養基上，如此挑取His+重組子，30℃培養2天。尋找在MD平板上生長正常但在MM平板上有一點生長或完全不生長的克隆子。
為了篩選得到高表達的重組酵母菌株，直接檢測誘導培養基中有機磷農藥消解酶的表達情況。將His+Mut-轉化子首先在BMGY培養基(以甘油為碳源)中培養，待其生長至飽和狀態，移去BMGY，換入誘導培養基BMMY(以甲醇作為誘導物)，在誘導培養36小時後取上清液進行酶活性分析。通過表達酶的酶活性測定，篩選到3株高水平表達有機磷農藥消解酶的重組子，分別定名為P.Pastoris pPIC9X-12，67，99。其中P.Pastoris pPIC9X-99的表達量最高，用來進一步進行5L發酵罐中的產酶研究。
實驗九本實施例是說明重組酵母在5升發酵罐中高密度發酵生產有機磷農藥消解酶的程序。
優化後的重組酵母發酵方法如下5％接種Basal Salts培養基C源4％葡萄糖菌體生長階段N源氨水無機鹽↓24h流加25％葡萄糖碳源飼餵階段流量36mL/h/L↓4h流加25％葡萄糖∶誘導劑(8∶1)，碳源—誘導劑流量9ml/h/L 混合飼餵階段↓4h誘導 誘導表達階段(誘導劑維持終濃度為0.3％左右)發酵過程分為四個階段。具體如下1)菌株培養階段。發酵培養基10×Basal Salts接種前先加入28％氨水使培養基的pH達到5.0(氨水同時也做為菌株生長的氮源)，再按每升培養基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養18～24h，在培養過程中隨著菌株的生長，培養基中的溶氧量由100％逐漸降低，當碳源消耗完後溶氧量將再度升高至80％以上，此時菌體溼重達到90～110g/L。2)碳源飼餵階段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量為36mL/h/L，培養4h。調整通氣量使溶氧量始終大於20％。此步結束時菌體溼重達到180～220g/L。3)碳源-誘導劑混合飼餵階段。流加50％葡萄糖∶誘導劑(8∶1)培養4h，流加量為9mL/h/L，控制溶氧量始終大於20％。4)誘導表達階段。加入誘導劑(每升中含12mLPTM1)，使誘導劑終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大於20％。在誘導過程中每12h取樣一次測定表達的有機磷農藥消解酶的積累量並進行表達蛋白的SDS-PAGE。
從連續3批次的誘導時間與表達產物積累量的關係(圖9)來看，隨著誘導時間的增加，單位體積發酵液中的酶的活性隨之增加，直到直到誘導120小時左右達到高峰，此時酶活性達到1.5～1.8×104U/mL發酵液，隨後產物積累量不再隨誘導時間的增加而顯著增加。三批次發酵之間，表達產物隨時間積累的曲線基本一致，說明酶的表達具有很好的穩定性和可重複性。隨誘導時間增加發酵液中表達積累的有機磷農藥消解酶的SDS-PAGE分析見圖10。結果表明，表達的有機磷農藥消解酶分子量大小約為38kD，與酶的理論分子量大小相當，這證明有機磷農藥消解酶基因得到了表達、有效分泌。酶積累高峰時的表達量約為5～6mg/mL。
在重組P.pastoris生長、誘導表達的一個發酵周期結束後，直接取這種經誘導表達後的菌液做為種子液(接種量為1％)進行下一輪的發酵過程，累計共進行5輪，在每輪中均對菌株生長的生物量和酶表達量進行測定。另外，取每輪發酵完的菌體鋪完全培養基平板，挑取10個單菌落提取基因組DNA進行opdA的PCR檢測。結果表明(表1)，菌株生長的生物量、速度及酶的表達量在各輪中基本保持穩定。PCR的結果也證明，經過5輪的連續培養，opdA3依然穩定整合在P.pastoris基因組中，這些結果證明重組P.pastoris不僅具有良好的遺傳穩定性而且具有良好的酶表達的穩定性。
表1.重組畢赤酵母的遺傳穩定性及酶表達的穩定性

權利要求
1.一種有機磷農藥消解酶，它具有如下所示的胺基酸序列1 M Q R R R D V R K S A G A A A T L H G G L A G S A S V A G S31 I G T G D R S N I V I G P I S I S V A G F T R T H E Y L C G61 S S A G Y W R A W P K F I G S L E A L A G K A D R G L R R A91 R A A G V R T I V D D S S Y D I G R D V S L L A E V S R A A121 D V H I V A A T G L W F H P P H S M R L R S V E E L T Q Y F151 R R G I Q D G S E D T G I R A G I I K V A T T G K A T P F R181 G L V L K D A A K A S L A T G V P D T T D T A A S Q R D G E211 Q Q A A I F E C G G L S P S R V C I G H S D D T D D L S Y L241 T A L A A R G Y L I G L D H I P R S A I G L E D N A S A S A271 L L G S R Y W R S R A L S I R A L I D Q G Y M K Q I L V S N301 D W L F G F S S Y V T N I M D V M D R V N P G A K A F I P L331 R V N P F L R E K G D P R V S Q A A I T V T N Q V R F L S P361 T L R A S
2.一種編碼權利要求1所述的有機磷農藥消解酶的基因。
3.按照權利要求2所述的基因，它具有如下所示的核苷酸序列。1 ATGCAAAGGA GAAGGGATGT GCGCAAGTCT GCGGGCGCCG CAGCAACTCT GCACGGCGGC61 CTGGCTGGGT CGGCGAGCGT GGCTGGATCC ATTGGTACTG GTGATAGAAG TAACATCGTT121 ATAGGTCCTA TCAGCATCTC TGTAGCTGGT TTCACTCGGA CTCACGAGTA CCTCTGTGGT181 TCTTCCGCTG GATACTGGCG TGCTTGGCCA AAGTTCATCG GTTCTCTTGA AGCCTTGGCT241 GGAAAGGCTG ATAGAGGATT GAGAAGAGCT AGAGCTGCTG GTGTTAGAAC TATTGTTGAC301 GATTCCAGTT ACGACATTGG TAGAGACGTC TCCTTGTTGG CCGAGGTCTC CAGAGCTGCC361 GACGTTCATA TCGTTGCTGC TACCGGATTG TGGTTTCACC CTCCACATTC CATGAGATTG421 AGATCTGTTG AGGAACTTAC TCAATACTTC CGTCGTGGGA TTCAAGACGG TAGTGAAGAC481 ACCGGAATTA GAGCTGGTAT TATCAAGGTC GCTACCACTG GTAAGGCTAC CCCATTTCGA541 GGGTTGGTCT TGAAGGATGC CGCTAAAGCC TCCTTGGCCA CCGGTGTTCC TGATACCACT601 GACACTGCTG CCTCTCAAAG AGACGGTGAG CAGCAAGCCG CCATTTTCGA GTGTGGAGGT661 TTGTCTCCAT CCAGAGTTTG TATTGGTCAC TCTGACGATA CTGACGACTT GTCCTACTTG721 ACCGCCTTGG CTGCTAGAGG ATACTTGATC GGTCTTGATC ACATCCCACG CTCTGCTATT781 GGTCTTGAAG ACAACGCTTC TGCTTCTGCC CTTCTGGGTA GCCGTTACTG GCGAAGTAGA841 GCTTTGTCGA TTAGGGCTTT GATCGACCAA GGTTACATGA AGCAAATCTT GGTTTCCAAC901 GACTGGTTGT TCGGTTTCTC TTCCTACGTC ACCAACATCA TGGACGTCAT GGATAGAGTT961 AACCCTGGCG CTAAGGCCTT CATTCCACTG AGAGTCAACC CATTCTTGAG AGAGAAGGGT1021 GACCCACGGG TAAGTCAGGC AGCTATCACT GTTACTAACC AAGTTAGATT CTTGTCTCCA1081 ACCTTGAGAG CTTCCTAG
4.一種表達載體，它含有權利要求2或3所述的基因。
5.一種生產權利要求1所述的有機磷農藥消解酶的方法，包括a.使用權利要求1或2所述的基因構建表達載體；b.使用含有有機磷農藥消解酶基因的表達載體轉化宿主細胞；c.使有機磷農藥消解酶基因表達並分離所表達的有機磷農藥消解酶。
6.按照權利要求5所述的方法，其中所述的表達載體是pPIC9，所述的宿主細胞是酵母細胞。
7.按照權利要求6所述的方法，其中，有機磷農藥消解酶基因的表達是在酵母的高密度發酵條件下進行的。
8.按照權利要求6或7所述的方法，其中，所述的酵母為畢赤酵母。
9.一種清除農產品上有機磷農藥的方法，包括使用權利要求1所述的有機磷農藥消解酶的步驟。
全文摘要
本發明提供了一種具有優良性質的有機磷農藥消解酶,編碼它的基因和生產該酶的方法。使用本發明的方法,有機磷農藥消解酶的表達量可達到每毫升發酵液中5mg酶蛋白,比原始菌株的單位表達量高5000倍。重組酵母可用來大規模工業化廉價生產有機磷農藥消解酶。有機磷農藥消解酶可用於:新鮮蔬菜、水果等農產品上殘留農藥的清洗脫毒;食品加工工程中農產品原料上殘留農藥的脫毒;和農藥汙染的水體、土壤的淨化。
文檔編號C12N15/63GK1381574SQ0111072
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月17日 優先權日2001年4月17日
發明者孫躍軍, 姚斌, 孫齊軍 申請人:安徽固源生物工程有限責任公司