同時檢測細胞增殖抑制活性和毒性的方法
2023-10-04 01:01:24
專利名稱：同時檢測細胞增殖抑制活性和毒性的方法
技術領域：
本發明提供一種同時檢測一種物質的細胞增殖抑制活性和毒性的方法，其可在篩選這種物質在增殖抑制中它的活性的過程中實施。
背景技術：
在藥物開發過程中，特別是在腫瘤學領域，對作為有效增殖抑制劑的物質進行鑑定是非常重要的。存在各種基於細胞的體外檢測來用於研究這類候選物質的抗增殖作用。這類檢測的實例是，例如，MTT比色檢測、[3H]胸苷攝取檢測和WST檢測(Johnston，P.，見Cellular Assays inHTS，Methods in Molecular Biology，110卷，Janzen W.P.(編輯)，HumanaPress，NJ，107-116頁；Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708)。對藥物開發來說，這類檢測能夠用於高通量篩選大量潛在的候選藥物，這是必需的。
為了確定造血細胞的增殖狀態，已知的是用待研究物質和一種試劑與細胞群接觸，所述試劑能夠在ATP存在的條件下產生螢光，並且檢測作為增殖狀態量度的螢光(US 2002/0 146680)。美國專利號5,972,639描述了一種通過螢光測量確定在細胞培養物中細胞數目的方法。
然而，這些檢測是耗時的，僅能提供有限的結果，而且不能區分抑制增殖和誘導細胞死亡。
因此，需要一種簡單並同時能夠檢測一種物質對增殖和誘導細胞死亡的影響的檢測方法。而且，也需要該檢測方法可以進行自動操作。
發明內容
發明概述本發明提供了一種以增殖的哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測一種物質的細胞增殖抑制活性和細胞毒性(誘導細胞死亡)的方法，其特徵在於a)用所述物質以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的所述細胞樣品；b)用對死細胞或活細胞特異染色的第一種螢光染料和任選地用染色所有細胞的第二種螢光染料處理所述細胞樣品；c)向所述細胞樣品中加入預定量的大小為約1-約20μm的膠乳顆粒至所述體積，並任選性地用第三種螢光染料對所述膠乳顆粒進行染色；d)測定所述樣品中細胞總數與膠乳顆粒數量的比例；e)用步驟d)的結果及通過對所述樣品進行流式細胞分析測定-死細胞或活細胞的數目，其通過由所述第一種螢光染料在第一個波長下激發的螢光測定；-每體積的細胞總數目，其通過在第一個角度下散射光或備選性地通過由所述第二種螢光染料在第二個波長下激發的螢光測定；-每體積的膠乳顆粒的數目，其通過在第二個角度下散射光或備選性地通過由所述第三種螢光染料在第三個波長下激發的螢光測定；f)用步驟d)和e)的結果測定所述物質的細胞增殖活性和毒性。
在本發明的一個優選實施方案中，死細胞用一種螢光染料進行特異染色，膠乳顆粒和細胞的數目通過不同的側向散射光和正向散射光進行測定。
在本發明的另一個優選實施方案中，細胞是人CD34+祖細胞。
在本發明的一個優選實施方案中，以所述待研究物質的至少五種不同濃度實施該方法，其優選可以計算增殖和誘導細胞死亡的IC50值。優選地，濃度範圍是一個大約1-10,000的係數。
細胞用待研究物質處理後，在允許細胞增殖的標準條件下培養細胞。在本發明的一個優選實施方案中，在多個裝置，優選地在多孔微量滴定板中平行培養細胞。另外，同樣將待研究物質以不同濃度加在這些裝置中，優選地是通過自動吸取方式加入。
發明詳述當存在推測為細胞抑制劑的物質時，在培養細胞過程中細胞生長的延遲可以通過細胞死亡和/或細胞增殖抑制造成的。因此，在培養後僅測定細胞的數量不可能直接推斷該物質的毒性和/或抑制活性。這種推斷需要知道活細胞和死細胞的數量及它們相對於細胞總量的比例。本發明提供了一種快速同時測定這些參數的方法。另外，依照本發明的方法可被自動實施，從而允許高通量地檢測某種物質的毒性和增殖抑制活性。
根據本發明，將確定的(預定的)等分試樣的膠乳顆粒加入到每個細胞培養裝置中。基於在流式細胞分析中對膠乳顆粒的計數，可以估測進行所有計數的液體體積。因此，本發明提供了一種當存在推測為檢測體系中的細胞的增殖抑制劑和/或對其有毒性的物質時，可同時測定培養後每體積的細胞總數(其是細胞增殖的量度)和每體積的活細胞數的方法。對不同濃度的物質比較細胞總數和死細胞或活細胞數提供了該物質抑制細胞增殖和毒性之間關係的信息。這一點可直接通過圖3推斷。如果死細胞相對於總細胞的比例顯著增加而細胞總數降低，則表明該物質毒性很高。但是，如果死細胞相對於總細胞的比例沒有隨該物質濃度增加而顯著增加，而細胞總數降低，則表明該物質具有低毒性。具有高毒性的物質的實例顯示在圖3中。5-氟尿嘧啶和阿黴素是同時表現出毒性和顯著的增殖抑制的物質。對5-氟尿嘧啶而言，在該物質增殖抑制活性大於50％的濃度範圍內，死細胞佔總細胞的比例範圍是0到25％之間。對阿黴素而言，在增殖抑制活性大約為80％時，死細胞的比例隨該物質濃度高達40％或甚至更高而增加。
增殖細胞，例如CD34細胞的培養過程按如下所述進行。在進行FACS分析前，向每個儲器裝置(優選微量滴定板或類似物質)中加入染色活細胞或死細胞的螢光染料和不同數量的膠乳珠，分別對活細胞或死細胞進行染色並對作為被分析的細胞培養基的體積的量度的膠乳顆粒進行計數。加入待研究物質並在不同裝置中進行細胞培養後，將微量滴定板放在自動吸取裝置上，其將來自每個儲器的細胞樣品的等分試樣送經FACS流體腔。對不同數目的膠乳珠進行分析(從而給出關於測定的培養基體積的信息)，停止測定，自動吸取裝置從下一個儲器中吸取等分試樣，並如前所述再次開始分析。
此處所用的術語「待研究物質」或「物質」描述的是任何推測具有增殖抑制活性或細胞毒性活性的物質。所述物質可以是例如，抗體、多肽、短肽、寡核苷酸或低分子量化合物。該化合物至少使用兩個不同的濃度，但優選地是更多個濃度，例如五個不同濃度或更多。其原因是基於這些不同濃度的結果，可能很容易地研究濃度依賴的增殖抑制和細胞死亡誘導，並且確定該物質是否誘導大量細胞死亡和/或抑制增殖。對這些數值進行比較，特別是對濃度依賴的增殖和細胞死亡誘導進行比較，可能鑑定潛在的顯示例如強的增殖抑制而不誘導大量細胞死亡的候選物質。另外，在不同濃度下實施本發明的方法，可計算出增殖(「增殖活性」)和誘導細胞死亡(「毒性」)的IC50值。濃度和濃度範圍依賴於待研究物質的所需效能，也依賴於研究中所用的細胞類型。通常，濃度範圍在微摩爾範圍，在約0.01μM/ml-100μM/ml之間。
此處所用的術語「細胞」描述的是這類在增殖檢測中用作檢測體系的增殖的哺乳動物細胞。這類細胞在本技術領域內是眾所周知的，是例如人CD34+祖細胞和幹細胞、淋巴細胞、正常成纖維細胞/角質細胞、正常內皮細胞和上皮細胞、人工轉化的哺乳動物細胞、白血病細胞和實體瘤細胞。這類細胞的增殖可被已知的抑制劑，例如紫杉醇、阿黴素或5-氟尿嘧啶抑制。
通常，將細胞接種到平行裝置中進行懸浮培養增殖。通常，例如，如果用96孔微量滴定板培養CD34細胞，每孔接種100-400細胞/200μl，並優選在標準條件下(無待研究物質)進行增殖培養直至它們達到每孔約10,000細胞/200μl。在培養細胞時，使用的是常規的培養基，優選加入生長因子。
此處所用的術語「膠乳顆粒」是指這類在用於細胞計數的自動計數儀的校準流體中廣泛使用的膠乳顆粒。例如，在美國專利號3,977,995中描述了這類膠乳顆粒。這類膠乳顆粒通常包括由聚苯乙烯聚甲基苯乙烯或苯乙烯二乙烯基苯共聚物製造的合成膠乳。顆粒大小通常在1-約20μm，加到細胞懸液中的顆粒數目是10,000顆粒/200μl。
通過在儀器中進行流式細胞分析，進行用於根據本發明的鑑定的參數的測定，其中在所述儀器中，在不同波長的螢光和在不同角度的散射光可被測定並與提供這類信號的細胞數相關。當來源於一種樣品的細胞流經儀器的分析裝置時，對參數進行平行地或一個接一個(同時)地測定。優選地，這種測定是通過分析型FACS設備進行。在不同角度測定散射光，優選地作為正向散射光(FSC)(最大散射光角度高達20°，優選地為更低)和側向散射光(SSC)(角度大約為90°)。雖然細胞和膠乳顆粒在大小上可能不存在很大差異，但它們的關於光散射行為卻相當不同，這可能是由於細胞的內部結構和形狀及其不同的折射率造成的。根據這些差異，可通過相當不同的散射光角度容易地區分細胞(活細胞/增殖細胞，捕獲的活細胞和死細胞)和膠乳顆粒。SSC與膠乳粒相關，而FSC與細胞相關(參見圖2a)。然而，也可以用螢光染料對所有細胞或所有膠乳顆粒進行染色，通過在不同波長下對螢光進行研究而區分膠乳顆粒和細胞。對測定參數的使用僅依賴於所用儀器提供的可能性和便利性。如果儀器能夠同時在三個或四個不同螢光波長下測定螢光，則膠乳顆粒、所有細胞和分裂細胞或死細胞均可用螢光染料進行特異標記。因此，散射光和螢光的所有組合可用於測量參數，條件是散射光參數不能用於直接區分膠乳顆粒和死細胞、活細胞和增殖細胞及活細胞和捕獲細胞。
此處所用的術語「特異染色死細胞或活細胞的螢光染料」是指染料僅進入死細胞(例如碘化丙錠)，或僅在活細胞中富集(例如二乙酸螢光素)。如果需要對所有細胞進行細胞計數，則需要使用對死細胞和活細胞均進行染色的染料(例如Hoechst 33342)。描述了多種用於選擇性標記活細胞或死細胞的螢光染料(如分子探針目錄；http//www.molecularprobes.com/)。螢光染料以合適的量加入，例如，終濃度為1μg/ml。
提供下述實施例、參考文獻列表和附圖以有助於理解本發明，其實際範圍在後附的權力要求中闡述。應理解在不偏離本發明的精神的情況下，可對所闡述的流程進行修改。
圖1是CD34細胞群中細胞生長和細胞死亡的顯微鏡分析。細胞因子刺激的CD34細胞在不用或用細胞毒性化合物處理條件下培養4天和7天。
圖2是標準珠粒、細胞因子刺激的CD34細胞在培養10天後的活細胞和死細胞的FACS分析。細胞或者不用(左列)或者用誘導不同細胞毒性水平的細胞毒性藥物進行處理。
圖3是由圖2所示的FACS分析定量的細胞數目和死細胞的比例。所示的是兩種典型的細胞毒性化合物，5-氟尿嘧啶(0.1-100μmol/l)和阿黴素(1-1000ng/ml)。5-氟尿嘧啶和阿黴素的細胞數目分析的IC50值分別為0.34μmol/l和0.67μg/ml。
具體實施例方式
實施例在一個典型的實驗設計中，通過免疫磁性細胞分選法分離高純度(＞90％)人臍帶血CD34+細胞，進行等分並冷凍在含有DMSO的培養基中。當進行細胞培養時，融化冷凍的CD34+細胞，並在每孔200μl完全培養基的96孔板中接種200個細胞/孔。基礎細胞培養基由補加20％人AB血清和抗生素(氨苄青黴素/鏈黴素)的IMDM培養基組成。通過加入下述細胞因子混合物hu-SCF(100ng/ml)、hu-1L6(10ng/ml)、hu-GM-GSF(100U/ml)、hu-TPO(25ng/ml)和hu-EPO(5U/ml)，活化CD34+細胞。在37℃、高溼度及7％CO2的培養箱中進行培養。
可使用兩個不同的實驗設計1)在向培養基中補加細胞因子前加入抑制劑化合物以優先處理靜息細胞，和2)在用細胞因子活化CD34後4天加入抑制劑化合物以優先處理活化的細胞。
如圖1所示，培養4天後，活化並成活的CD34細胞呈現為大的球狀細胞(組A)。當細胞再培養3天後，細胞數目顯著增加(組C)。培養4天後，細胞毒性藥物在CD34細胞中誘導細胞死亡，在顯微鏡圖象中呈現為碎片狀(組B)，和碎片狀細胞數目增加而細胞數目沒有任何顯著增加(組D)。
根據CD34+細胞的增殖速率，培養9-10天後收穫細胞，並分析細胞數目和細胞毒性。通過FACS技術分析細胞數目和細胞毒性。孔中的細胞數目通過與內部的珠粒標準物比較而進行計數。將10000個珠粒的一份等分試樣(FluoSpheres聚苯乙烯，15μm；Molecular Probes)加入到含有200μl培養基的每個孔中。如圖2所示，在典型的FACS儀器裝置中，活細胞出現在正向散射光(FSG)和低側向散射光(SSG)的中間/右邊位置，而加入的標準珠粒存在於更低的FSC和高SSC區域(組A)。將一個以矩形區域表示的口設置在標準珠粒上，對不同數目進行計數，停止分析，計算含有細胞的相應培養基的體積。組E顯示的是該測定方法對所分析的CD34細胞的存活檢測。活細胞再次出現在正向散射光(FSC)的中間/右邊位置，其顯示低的/無碘化丙錠標記。少量死細胞出現在相對於活細胞群左邊或上部/左邊位置。這時FACS測定法取一等分試樣數量的珠粒，並計算孔中的細胞數，而細胞毒性，死細胞的數目，在該測定中被平行記錄(加入碘化丙錠，終濃度為1μg/ml)。隨著細胞毒性化合物濃度的增加，死細胞簇中的細胞數目顯著增加(圖2，組F和G)。在最高抑制和細胞毒性濃度下，非常少的細胞還存在於活細胞簇中，大部分細胞已被殺死，證據是PI染色或碎片增加(組H)。
圖3中顯示的是對於兩種細胞毒性化合物，即5-氟尿嘧啶和阿黴素，計算每孔中CD34細胞數目和死細胞百分比的典型實例。對於每個檢測濃度，每孔的細胞數目顯示為柱形圖。對5-氟尿嘧啶而言，細胞數目在0.3和1.0μmol/l之間顯著降低，而阿黴素在1ng/ml最低濃度時，細胞數目已經更低了。應用IC50計算程序，計算出抑制劑化合物的IC50值，對於5-氟尿嘧啶和阿黴素分別是0.34μmol/l和0.67ng/ml。分析PI陽性的細胞部分而得到的死細胞比例的增加顯示為實線(圖2，組E-H)。
參考文獻Bellamy，W.T.，Drugs 44(1992)690-708.
Johnston，P.，inCellular Assays in HTS，Methods in Molecular Biology，Vol.
110，Janzen W.P.(ed.)，Humana Press，NJ，pp.107-116.
US Patent No.3,977,995.
US Patent No.5,972,639.
US 2002/0146680.
權利要求
1.一種以增殖的哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測一種物質的細胞增殖抑制活性和細胞毒性(誘導細胞死亡)的方法，其特徵在於g)用所述物質以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的所述細胞樣品；h)用對死細胞或活細胞特異染色的第一種螢光染料和任選地用染色所有細胞的第二種螢光染料處理所述細胞樣品；i)向所述細胞樣品中加入預定量的大小為約1-約20μm的膠乳顆粒至所述體積，並任選地用第三種螢光染料對所述膠乳顆粒進行染色；j)測定所述樣品中細胞總數與膠乳顆粒數量的比例；k)用步驟d)的結果及通過對所述樣品進行流式細胞分析測定-死細胞或活細胞的數目，其通過由所述第一種螢光染料在第一個波長下激發的螢光測定；-每體積的細胞總數目，其通過在第一個角度下散射光或備選地通過由所述第二種螢光染料在第二個波長下激發的螢光測定；-每體積的膠乳顆粒的數目，其通過在第二個角度下散射光或備選地通過由所述第三種螢光染料在第三個波長下激發的螢光測定；l)和用步驟d)和e)的結果測定所述物質的細胞增殖活性和毒性。
2.權利要求1的方法，其特徵在於所述死細胞用螢光染料進行特異染色，所述膠乳顆粒和細胞的數目通過不同側向散射光和正向散射光測定。
3.權利要求1或2的方法，其特徵在於所述細胞是人CD34+祖細胞。
4.權利要求1-3的方法，其特徵在於在多個裝置中平行培養所述細胞，並且通過自動吸取將所述樣品轉移到流式細胞分析儀中。
全文摘要
以增殖哺乳動物細胞樣品為檢測體系，同時檢測物質的細胞增殖抑制活性和細胞毒性的方法，特徵在於a)用物質以至少兩個不同的預定濃度處理預定體積的作為細胞懸液或作為貼壁細胞的細胞樣品；b)用第一螢光染料和任選用第二螢光染料處理細胞樣品；c)向細胞樣品中加入預定量的大小為約1－約20μm的膠乳顆粒至所述體積，並任選用第三螢光染料對膠乳顆粒進行染色；d)測定樣品中細胞總數與膠乳顆粒數的比例；e)用步驟d)的結果及對樣品進行流式細胞分析測定－死細胞或活細胞數；－每體積細胞總數；－每體積膠乳顆粒數；f)用步驟d)和e)的結果測定物質的細胞增殖活性和毒性。
文檔編號G01N21/77GK1530643SQ20041003965
公開日2004年9月22日 申請日期2004年3月12日 優先權日2003年3月12日
發明者伯恩哈德·戈勒, 曼弗雷德·庫貝斯, 伯恩哈德 戈勒, 德 庫貝斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司