一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法

2023-10-04 16:20:19

專利名稱：一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法。
背景技術：
水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)是水稻普通矮縮病的病原，1883年首次 在日本被發現，廣泛分布於中國、日本、朝鮮、菲律賓、尼泊爾等東南亞水稻產區。此病在水 稻秧田和本田期均能發生，為系統性侵染病害。植株感病後，所有分櫱均能發病。症狀為植 株顯著矮縮，分櫱增多，葉色濃綠，葉片粗而僵直，沿葉脈出現白色小斑點，形成斷續的點線 狀(老葉不出現斑點)；如在孕穗後期發病，只在劍葉及其葉鞘上表現清晰的條點病斑；若 在抽穗後發病，僅在劍葉葉鞘上表現病斑。病株根系發育不良，多老朽根，早期發病(苗期 到分櫱期)一般不能抽穗，後期發病呈包莖穗或半包穗，穗小秕谷多。因此，水稻感染該病 後能夠造成大面積減產，嚴重威脅水稻的生產。RDV是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員 (Boccardo G，1984)。呼腸孤病毒科病毒有一些共同特點，例如病毒粒子呈球狀，有雙層衣 殼，每個衣殼均呈現20面體對稱，直徑為60-80nm，沒有脂蛋白外膜，外殼由3種蛋白質組 成，核心有4-6種蛋白，核心內含有線狀dsRNA，有10-12個基因組分。RDV病毒粒子為無 刺突、無脂蛋白外膜的二十面體，病毒粒子直徑為69. 3nm，具有雙層外殼蛋白，內殼直徑為 53nm。RDV病毒粒子內有單拷貝基因組12條雙鏈RNA，RNA基因組分以超捲曲形式包裝在 病毒粒子內，與蛋白質組成複合體。依照dsRNA在聚丙烯醯胺凝膠電泳中的遷移率，由慢到 快，依次命名為Sl到S12。RDV基因組編碼6-7種結構蛋白(包括Pl，P2，P3，P5，P7，P8和 P9)，和至少五種非結構蛋白(包括Pns4, Pns6, PnslO, Pnsl 1，Pnsl2)。Pnsll的編碼序列有兩個0RF，這兩個ORF的讀碼框相同，但第二個ORF的AUG密 碼子滿足Kozak保守轉錄的要求，在感病的植株和昆蟲體內表達量較高。其編碼一個181 個胺基酸組成的20KD蛋白。Sll的3，非編碼區很長，佔整個片段的46.4%，遠遠高於RDV 其他片段3'非編碼區的相對長度(約佔3.1%-17.7%)。

發明內容
本發明的目的是提供一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法。本發明提供了一種具有細胞核和/或葉綠體定位功能的多肽，其胺基酸序列如序 列表的序列1所示。編碼所述多肽的DNA片段也屬於本發明的保護範圍。所述DNA片段的核苷酸序列可如序列表的序列2所示。含有所述DNA片段的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發 明的保護範圍。所述重組表達載體可為將編碼所述多肽的DNA片段插入載體PRTL2的多克隆位點 得到的重組質粒。
本發明還保護一種在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方 法，是用所述多肽作為信號肽引導外源蛋白在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表 達。所述 方法可通過將含有所述DNA片段和所述外源蛋白的編碼基因的融合DNA導入 植物細胞實現；所述融合DNA中，編碼所述多肽的DNA片段位於所述外源蛋白的編碼基因 的上遊。具體來說，所述融合DNA通過如下重組表達載體導入所述植物細胞骨架質粒為 PRTL2，在35S啟動子後依次插入編碼所述多肽的DNA片段和外源蛋白的編碼基因。所述植物細胞為可菸草細胞，如菸草BY2細胞。所述外源蛋白可為GFP蛋白。所述GFP基因具體可為GENBANK ACCESS 10NNUMBER U55761中自5，末端第97至816位核苷酸序列所示的DNA。所述融合DNA具體可為序列表 的序列6所示的DNA。本發明通過實驗證實了水稻矮縮病毒的非結構蛋白Pnsll的C端132-180多肽 (第二個0RF)具有將外源蛋白特異定位到細胞核和葉綠體中的功能。不僅為在細胞核中特 異表達抗逆，抗病害相關基因，提高植物生存能力提供了良好技術路線，同時也為在葉綠體 中表達激活光合作用反應的相關基因，提高農作物生物產量提供了新的技術支持。本發明 在實際生產中有重要的應用價值。


圖1為pRTL2-Sll: :eGFP在菸草表皮細胞中的瞬時表達；A :pRTL2_Sll: :eGFP熒 光；B :pRTL2-Sll: :eGFP 可見光；C :pRTL2_Sll eGFP 螢光和可見光疊加；D :pRTL2_eGFP 熒 光；E，F :pRTL2-Sll::eGFP在菸草表皮細胞核中定位的放大圖。圖2為pCambial301_Sll: :eGFP轉基因菸草中，Pnsll: eGFP在葉肉細胞和保衛 細胞中的細胞定位情況。圖3為免疫電鏡顯示Pnsll在RDV宿主細胞中的定位；A :RDV感病水稻細胞的細 胞核(標尺表示250nm) ；B =RDV感病水稻細胞的葉綠體；C 健康水稻的細胞，Nu-細胞核， Ch-葉綠體；D 細胞中金膠體顆粒密度統計；紅色箭頭示膠體金顆粒所在位置。圖4為Pnsll序列及核定位信號分析模式圖。圖5為Sll (132-181) eGFP在菸草BY2細胞核中的瞬時表達。圖6為Sll (132-181) eGFP在菸草BY2葉綠體中的瞬時表達。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。pRTL2、大腸桿菌 DH5a 和 EHA105 北京大學；參見文獻Cao，X. S.，Zhou，P.， Zhang, Χ. Μ. , Zhu, S. F. , Zhong, Χ. H. , Xiao, Q. , Ding, B. , and Li, Y. (2005). Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-strandedRNA virus. J Virol 79，13018-13027。菸草BY2細胞北京大學；參見文獻:Howard EA, Zupan JR, Citovsky V, ZambryskiPC(1992)The Vird2 protein of A. tumefaciens contains a C-terminalbipartite nuclearlocalization signal-implications for nuclear uptake ofDNA in plant-cells. Cell 68:109—118。PCR引物(由上海生工生物工程技術 服務有限公司合成)見表1。表1實施例中用到的PCR弓丨物
權利要求
1.一種多肽，其胺基酸序列如序列表的序列1所示。
2.編碼權利要求1所述多肽的DNA片段。
3.如權利要求2所述的DNA片段，其特徵在於所述DNA片段的核苷酸序列如序列表 的序列2所示。
4.含有權利要求2或3所述DNA片段的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體是將權利要求2 或3所述DNA片段插入載體pRTL2的多克隆位點得到的。
6.一種在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法，是用權利要求 1所述多肽作為信號肽引導外源蛋白在植物細胞的細胞核和/或葉綠體中定位表達。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於所述方法是通過將含有權利要求2或3所 述DNA片段和所述外源蛋白的編碼基因的融合DNA導入植物細胞實現的；所述融合DNA中， 權利要求2或3所述DNA片段位於所述外源蛋白的編碼基因的上遊。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述融合DNA通過如下重組表達載體導入 所述植物細胞骨架質粒為PRTL2，在35S啟動子後的多克隆位點依次插入權利要求2或3 所述DNA片段和外源蛋白的編碼基因，得到的重組質粒。
9.如權利要求6至8中任一所述的方法，其特徵在於所述植物細胞為菸草細胞。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述植物細胞為菸草BY2細胞；所述外源 蛋白為GFP蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種在細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法。本發明提供了一種具有細胞核和/或葉綠體定位功能的多肽，其胺基酸序列如序列表的序列1所示。本發明還提供了編碼權利要求1所述多肽的DNA片段以及含有所述DNA片段的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。本發明提供的在植物細胞核和/或葉綠體中定位表達外源蛋白的方法，是所述多肽作為信號肽引導外源蛋白在植物細胞核和/或葉綠體中定位表達。本發明不僅為在細胞核中特異表達抗逆，抗病害相關基因，提高植物生存能力提供了良好技術路線，同時也為在葉綠體中表達激活光合作用反應的相關基因，提高農作物生物產量提供了新的技術支持。本發明在實際生產中有重要的應用價值。
文檔編號C12N1/00GK102040655SQ20091023540
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月13日 優先權日2009年10月13日
發明者李毅, 高鋒, 魏春紅 申請人:北京大學