測量醋酸格拉默功效的方法

2023-10-04 04:37:29 4

專利名稱：測量醋酸格拉默功效的方法
本申請要求在2001年12月4日提出的美國臨時申請60/338,767的利益，其內容結合於此作為參考。
貫穿本申請，在括號中使用縮短的引用，引用各種參考文獻。這些參考文獻的完整引用可以在說明書的結尾，緊接著權利要求之前發現。這些出版物它們整個被結合於本申請作為參考以更充分地描述本發明相關的發明領域本發明涉及標準化醋酸格拉默功效的測量的方法，其基於醋酸格拉默為T細胞特異性識別。
背景因為存在有效治療施用其的疾病的活性成分的最佳功效和質量，期望標準化藥物組合物的功效的測量。
醋酸格拉默(GA，也稱為共聚物-1(醫師辦公桌參考)，共聚物1，Cop-1或COPAXONE)，是批准的治療多發性硬化(MS)的藥物。醋酸格拉默由合成多肽的醋酸鹽組成，包含4種天然存在的胺基酸(醫師辦公桌參考)L-穀氨酸，L-丙氨酸，L-酪氨酸，和L-賴氨酸(醫師辦公桌參考)，平均摩爾份數分別為L-穀氨酸0.129-0.153；L-丙氨酸0.392-0.462；L-酪氨酸0.086-0.100；L-賴氨酸0.300-0.374。醋酸格拉默的平均分子量為4,700-11,000道爾頓(醫師辦公桌參考)。在化學上，醋酸格拉默被稱為含有L丙氨酸，L-賴氨酸和L-酪氨酸的L-穀氨酸聚合物，醋酸鹽(鹽)(醫師辦公桌參考)。它的結構式是(Glu，Ala，Lys，Tyr)x·XCH3COOH(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)X·XC2H4O2
CAS-147245-92-9(醫師辦公桌參考)。醋酸格拉默還寫成聚[L-Glu13-15，L-Ala39-46，L-Tyr8.6-10，L-Lys30-37]nCH3COOH。
醋酸格拉默顯示抑制實驗自身免疫性腦脊髓炎(EAE)--一種關於各種動物物種中多發性硬化(MS)的實驗模型(Lando等，1979；Aharoni，1993)。小鼠EAE的研究提示防止EAE的保護是通過T細胞活性介導的(Aharoni，1993)。通過注射醋酸格拉默特異性的T抑制細胞，可以將這種其中涉及幾種自身抗原的通過小鼠脊髓勻漿的EAE主動誘導的保護過繼轉移給正常接受者(Aharoni，1993)。在III期臨床試驗中，發現每日皮下注射醋酸格拉默減緩傷殘進展和降低惡化-減緩多發性硬化的復發率(Johnson，1987)。製備醋酸格拉默的方法在美國專利3,849,550和5,800,808和PCT國際公開號WO 00/05250中描述。
通常接受高水平的抗原特異性是T細胞激活的特徵。免疫系統的T細胞識別免疫原性肽，其與在抗原呈遞細胞(APC)上表達的主要組織相容性複合體(MHC)II類或I類分子複合。T細胞抗原識別的特異性由幾個參數確定1)T細胞受體對MHC肽複合體的親和力；2)抗原性肽的一級結構；和3)抗原性肽內部某些胺基酸組合的協同作用。基於當前關於醋酸格拉默作用機制的了解，認為在MS中的醋酸格拉默的生物活性受T細胞活性的免疫調節的介導。
發明概述本發明提供測量試驗批次的醋酸格拉默的功效(相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫8-12周齡的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫9-11天後製備來自步驟(a)小鼠的淋巴結細胞的原代培養物；c.分別溫育至少5個參考樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；
d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品18-21小時後在每個樣品中由細胞分泌的白細胞介素-2的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞數量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
本發明還提供測量試驗批次的醋酸格拉默的功效(相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫試驗動物；b.在免疫後預定時間製備來自步驟(a)試驗動物的細胞的原代培養物；c.分別溫育至少2個參考樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的醋酸格拉默；d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品預定時期後在每個樣品中由細胞分泌的細胞因子的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞數量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
附圖簡述

圖1用GARS(參考標準)。LN細胞的原代培養物。通過ELISA的IL-2檢測。
圖2GA-特異性T細胞的誘導。在增加濃度的GARS的存在下培養LN細胞的原代培養物，其來源於用250μg GARS+CFA或單獨用CFA免疫的小鼠。在37℃下溫育過夜後收集培養基並通過ELISA測定IL-2。
圖3血細胞計數器。
圖4免疫方案-培養源和GA參考標準(RS)劑量效應的優化。淋巴結(LN)和脾細胞的原代培養來源於用10或250μg GARS+完全弗氏佐劑(CFA)免疫的小鼠。在增加濃度的GARS的存在下培養細胞。在37℃下溫育過夜後收集培養基並通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定IL-2。
圖5免疫方案-佐劑和劑量效應的優化。LN細胞的原代培養物來源於用250Ag GARS+CFA或用10mg GARS+不完全弗氏佐劑(ICFA)免疫的小鼠，在增加濃度的GARS的存在下培養。在37℃下溫育過夜後，收集培養基並通過ELISA測定白細胞介素-2(IL-2)。
圖6免疫時期的影響。用CFA中的250Ag GARS免疫小鼠並在9，10和11天後去除LN。通過ELISA測量IL-2分泌體外檢測來自不同組的LN細胞對各種濃度GARS的反應。
圖7培養基對GA-特異性的T細胞反應的影響。用含有1％正常小鼠血清(NMS)，1％胎牛血清(FBS)或合成細胞培養基(DCCM1)的不同培養基培養LN細胞的原代培養物。在37℃下用增加濃度的GARS培養細胞21小時。隨後，收集培養基並通過ELISA測定IL-2。
圖8響應GARS的IL-2分泌的動力學。從用250μg GARS+CFA免疫的小鼠製備LN細胞的原代培養物。將細胞與0，0.5，2.5和5pg/ml GARS在37℃下溫育指示的時間間隔。在每個時間點，將5×106個細胞的等分試樣離心並將上清液保持在-20℃。通過ELISA同時測定所有樣品的IL-2。
圖9IL-2在培養基中的穩定性。從用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠製備LN細胞的原代培養物。在37℃下將細胞與不同濃度的GARS溫育。過夜溫育後，收集上清液並分成兩等分試樣。一等分試樣通過ELISA立即測定，第二個在測定前在-20℃下保持7天。
圖10GARS溶液在-20℃下的穩定性。製備1mg/ml的GARS溶液，分成等分試樣並保持在-20℃。在時間零點(日期1)和在-20℃下5個月後測定GA-特異性細胞對GARS溶液的劑量反應。
圖11平均分子量(MW)對GARS特異性T細胞反應的影響。從用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠製備LN細胞的原代培養物。在2種不同濃度的GARS和不同分子量的GA藥物物質(DS)的存在下培養細胞。在37℃下溫育過夜後，收集培養基並通過ELISA測定IL-2。
圖12(AB)GARS-特異性T細胞與GADS和藥物產品(DP)批次的交叉-反應性。從用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠製備LN細胞的原代培養物。將GARS-特異性T細胞對另一GADS批次(圖12A)，與GADP批次和與甘露糖醇(圖12B)的反應和對GARS批次的反應相比較。通過ELISA測量培養基中IL-2的水平。
圖13通過胰蛋白酶的GARS蛋白酶解的動力學。通過胰蛋白酶將GARS蛋白酶解指示的時刻。通過體外功效試驗檢測蛋白酶解的樣品的活性。
圖14在通過胰蛋白酶蛋白酶解之前和之後GA的反相高效液相色譜(RP-HPLC)。通過胰蛋白酶蛋白酶解GARS，通過RP-HPLC檢測樣品的色譜曲線。
圖15通過胰凝乳蛋白酶GARS蛋白酶解的動力學。通過胰凝乳蛋白酶蛋白酶解GARS指示的時刻。通過體外功效試驗檢測蛋白酶解的樣品的活性。
圖16在通過胰凝乳蛋白酶蛋白酶解之前和之後GA的RP-HPLC。通過胰凝乳蛋白酶蛋白酶解GARS，通過RP-HPLC檢測樣品的色譜曲線。
詳細描述本發明提供測量試驗批次的醋酸格拉默的功效(相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫8-12周齡的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫9-11天後製備來自步驟(a)小鼠的淋巴結細胞的原代培養物；c.分別溫育至少5個參考樣品，其中每個包含預定量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品18-21小時後在每個樣品中由細胞分泌的白細胞介素-2的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞數量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
在一個實施方案中，在步驟(d)中分別溫育6個參考樣品。
本發明還提供測量試驗批次的醋酸格拉默的功效(相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫試驗動物；b.在免疫後預定時間製備來自步驟(a)試驗動物的細胞的原代培養物；c.分別溫育至少2個參考樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的醋酸格拉默；d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品預定時期後在每個樣品中由細胞分泌的細胞因子的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，
其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞數量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
在一個實施方案中，細胞因子是白細胞介素。
在一個優選實施方案中，自細胞介素是白細胞介素-2。
在另一實施方案中，白細胞介素是白細胞介素-6。
在另一實施方案中，白細胞介素是白細胞介素-10。
在另一實施方案中，細胞因子是γ-幹擾素。
在一個實施方案中，哺乳動物生產對醋酸格拉默參考標準特異性的T細胞。
在另一實施方案中，哺乳動物是齧齒動物。
在還有另一實施方案中，齧齒動物是小鼠。
在另一實施方案中，小鼠是雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠。
在另一實施方案中，哺乳動物是約8至約12周齡。
在還有另一實施方案中，細胞是淋巴結細胞。
在一個實施方案中，細胞是脾細胞。
本發明另外提供製備一批作為藥用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.製備一批醋酸格拉默；b.按照權利要求1的方法測量批次的相對功效；和c.如果如此測量的相對功效是參考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使批次具有作為藥用可接受的資格。
另外，本發明提供製備藥用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.製備一批醋酸格拉默；b.按照權利要求3的方法測量批次的相對功效；和c.如果如此測量的相對功效是參考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使批次具有作為藥用可接受的資格。
因此，本發明提供GA功效的測量的標準化。功效試驗定量地測定GA的生物活性。這是至今第一次顯示這種試驗。為了顯示批次之間關於DS和DP的功效和質量的再現性，該標準化方法是關鍵的。在本申請的上下文中，DS是指活性成分，即GA。DP用來表示成品，即Copaxone。RS表示平均分子量約7000Da批次的醋酸格拉默。
本發明利用觀察即與細胞因子例如IL-2溫育的T細胞響應該細胞因子增殖(Lisak等，1974)。
以下實施例詳細描述本發明，其關於顯示如何可以製備其某些特定的代表性的實施方案，材料，裝置和處理步驟應當理解為僅意欲是說明性的實例。尤其是，本發明意欲不受限於本文具體引用的方法，材料，條件，工藝參數，裝置等。
實驗實施例常規方法概述用CFA中的250Ag GARS免疫小鼠。如美國專利5,800,808或PCT國際出版物WO 00/05250生產GARS。基於在上述Copaxonee的中列數(midrange)中的化學和生物性質選擇GARS。在9-11天後，製備LN細胞的原代培養物，將細胞與不同濃度的GARS和試驗樣品溫育。在37℃下在溼潤CO2培養箱中溫育18-21小時後，收集培養物並通過ELISA測量IL-2的水平。在2種濃度下測試T細胞對每個DS批次的反應(在線性範圍內)，相對於GARS批次計算DS批次的％功效。
實施例1標準方法目的本方法的目的是使用GARS-特異性T細胞體外測定GADS批次的相對功效。
裝置層流通風櫥，血細胞計數器，一次性蓋玻片，細胞計數離心機，溫控振蕩培養箱，溼潤、溫控5％CO2培養箱，ELISA讀出器(450nm濾色片)，冷凍機，冷凍機剪刀，鑷子，分檔器，pipettman 40-200μl，pipettman 200-1000μl，pipettman 5-40μl，powerpette，無菌玻璃注射器和luer橋(bridge)。
一次性用品Cryotubes，96-孔增強結合ELISA板(Nunc，目錄號442404)，96-孔未消毒微量培養板(Falcon目錄號3911)，24-孔平底無菌組織培養板(Nunc，目錄號143982)，培養皿，Eppendorf管(聚丙烯)，無菌移液管管頭200-1000μl，移液管2，510ml，實驗室外套，手套，0.2μ醋酸纖維素濾器，過濾的系統200ml(Corning，目錄號430767)，Kim抹布，支持平臺，10ml注射器，21Gxl 1/2″針，胰島素注射器和注射器式吸嘴(combitip)5ml。
材料和試劑用於免疫方法95％乙醇(Bio Lab，目錄號13680605，或等價物)，通過用蒸餾水稀釋從95％乙醇製備的70％乙醇，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)x1(SIGMA，目錄號3813，或等價物)，含有1mg結核桿菌(MT)的CFA(H37Ra，ATCC255177)，(SIGMA，目錄號F-5881，或等價物)，和GARS批次。
用於體外生物測定方法95％乙醇(Bio Lab，目錄號13680605，或等價物)，通過用蒸餾水稀釋從95％乙醇製備的70％乙醇，錐蟲藍(BDH，目錄號3407)，DCCM1(合成細胞培養基)(Beit Haemek，目錄號05-010-A或等價物)，RPMI 1640(Roswell Park記憶研究所)(Beit Haemek，目錄號01-100-1A)，無菌L-穀氨酸2mMx100(Bio Lab，目錄號13.015)，無菌MEM(極限基本培養基)-非必需胺基酸x100(Bio Lab，目錄號11.080)，無菌丙酮酸鈉1mMx100(Bio Lab，目錄號13.016)，抗生素/抗真菌溶液1(Bio Lab，目錄號13.020)，2-巰基乙醇(SIGMA，目錄號M-7154)，PBS(SIGMA，目錄號3813)，concavalin A(ConA)(SIGMA，目錄號C-5275)，MBP(髓磷脂鹼性蛋白)肽(87-99)(BACHEM，目錄號H-1964或等價物)，和GARS。
用於ELISA通過ELISA試劑盒測量IL-2OptEIATMSet小鼠IL-2(Pharmingen，目錄號2614KI，或等價物)。
動物使用8-12周齡的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠，儘管也可以使用來自其它來源的8-12周齡的雌性(BALB/C)F1小鼠。在無特定病原物(SPF)的條件下保持動物的住宿和養護條件。
表1製備溶液的方法
免疫在無菌條件下，即在層流通風櫥中使用無菌裝置和材料製備在CFA中的免疫GARS乳劑。
GARS溶液的製備準確稱量約15mg GARS並溶解在無菌PBS中至5mg/ml的濃度。
GARS乳劑的製備混合等體積的GARS溶液(5mg/ml)和CFA。將混合物轉移至通過luer橋與第二個玻璃注射器連接的無菌玻璃注射器中。通過從一個注射器轉移至另一注射器將混合物充分混合直至混合物充分乳化。當一滴乳劑漂浮在水上而不分散時證實穩定的乳劑。
注射將GA RS乳劑轉移至胰島素注射器。然後將100μl乳劑(每隻小鼠250Ag GA)注射到每隻稚鼠的4個腳墊中(每個腳墊中約25μl)。在免疫以後9-11天將免疫的小鼠用於體外試驗。
LN細胞原代培養物的製備在免疫以後9-11天按照下列方法製備LN細胞的原代培養物去除LB細胞的外科手術方法在層流通風櫥中開始工作之前將UV燈打開20分鐘，當工作開始時關掉。在放置任何試劑在通風櫥下之前，用70％乙醇溶液清洗工作表面。製備富集的DCCM1培養基。在使用前在37℃下預熱富集的DCCM1和RPMI培養基。通過頸椎脫臼處死小鼠。將每隻小鼠背向放置並固定在支架平臺上。用70％乙醇噴霧腹部，進行中切(2cm-長切口通常足夠)。將皮膚向後腿切割，從後腿和前腿定位LN。將LN轉移至無菌的含有約5ml無菌RPMI培養基的平皿，通過無菌注射器柱塞挑出LN細胞。將無菌注射器用來從平皿中收集細胞懸浮液(通過使用無菌針避免組織碎片的收集)。將細胞懸浮液轉移至50ml無菌管。
細胞計數用於計數來源於5隻免疫小鼠的LN細胞的方法實例用RPMI培養基裝滿細胞管至40ml。在200xg下在室溫(15-25℃)下離心LN細胞10分鐘。用40ml RPMI再懸浮沉澱。在微量試驗孔中用150μl 0.1％錐蟲藍稀釋4倍的細胞懸浮液中每個抽取50μl的兩個等分試樣。通過輕輕上下吸取充分混合等分試樣。用蓋玻片覆蓋血細胞計數器。使用50-200μl pipettman將兩個等分試樣加樣到血細胞計數器的上腔和下腔中，每腔一種懸浮液。使混合物靜置在腔中約2分鐘。小心不將氣泡引入腔中。使混合物(細胞懸浮液+錐蟲藍)覆蓋整個腔表面。如果氣泡存在腔中，或者如果它加樣過多，徹底清洗血細胞計數器並用抹布乾燥，將腔再次加樣。
在上下腔的中心正方形(每個由25個大正方形和16個小正方形組成，參見圖3)中對活細胞計數。活細胞不吸收錐蟲藍，因此特徵是清澈的外觀。然而，死細胞是錐蟲藍所能滲透的和顯藍色。出現在中心正方形邊上的細胞僅僅如果細胞的一部分確實在中心正方形中才計數。如果細胞在邊上，而根本不在中心正方形內部，不將它計數。使用下列方程計算細胞密度活細胞平均數(兩個腔)×4×104＝細胞/ml將細胞在200xg下在室溫下離心10分鐘。用富集的DCCM1將細胞再懸浮至1×107個細胞/ml。
體外生物測定在24-孔的平底組織培養試驗板中在1ml的終體積下進行體外生物測定。
GARS校準曲線的製備將1等分試樣的1mg/ml GARS貯存液解凍。用富集DCCM1培養基將GARS貯存液稀釋至100μg/ml(10倍)並過濾通過0.2μ醋酸纖維素濾器。如表2中實例所述，製備2-50μg/ml的使用富集DCCM1培養基的6個連續稀釋的GARS溶液。
表2製備GARS稀釋液的實例
GADS稀釋液的製備準確稱量來自待檢測批次的約10-20mg GADS並用ddH2O稀釋至1.2mg/ml。在275nm下測量減去溶液空白的OD。將樣品的OD用ddH2O調整至約1.03以獲得1mg/ml的GA貯存液。用富集DCCM1製備100μg/ml的貯存液並過濾通過0.2μ醋酸纖維素濾器。對於RS批次如表2所述將貯存液稀釋至10μg/ml和20μg/ml。
測定反應將下列各項加入24-孔平底組織培養板(參見以下平板模板的實例)GARS0.5ml LN細胞(終密度，例如，5×106個細胞/孔)。
0.5ml每種GARS稀釋液，因此在各孔中GARS的終濃度為25，15，10，5，2.5和1μg/ml。
GADS樣品0.5ml LN細胞(終密度，例如，5×106個細胞/孔)。
0.5ml每種樣品稀釋液，因此在孔中試樣的終濃度為5和10μg/ml。
每個測試包括下列對照1)陰性對照-與對照肽溫育的LN細胞
0.5ml LN細胞(終密度5×106個細胞/孔)0.5ml在富集DCCM1中的MBP肽溶液(20μg/ml)(終濃度10μg/ml)2)陽性對照-用ConA(非特異性T細胞刺激劑)刺激的LN細胞0.5ml LN細胞(終密度5×106個細胞/孔)0.5ml在富集DCCM1中的ConA(5μg/ml)(終濃度2.5μg/ml)平板模板的實例
GARS*-醋酸格拉默參考標樣根據它們對GA的反應改變細胞的密度。將培養物保持在37℃下在溼潤的5％CO2培養箱中18-21小時。在200xg下在室溫下將平板離心10分鐘。將上清液收集在cryotube中。將上清液分成工作等分試樣以避免樣品重複冷凍/解凍。將上清液保存在-20℃下達1周。用70％乙醇清洗通風櫥並用Kim抹布乾燥。去除手套，用立即消毒劑洗滌。
用於IL-2檢測的ELISA所有檢測的樣品一式三份。每次平板運行(run)包括下列各項1)IL-2標準曲線-包括至少6種非零IL-2濃度。
2)空白+第一抗體，無IL-2標樣，+第二抗體(零點)3)樣品如下用富集的DCCM1稀釋GARS，試樣和對照的培養基a)1和2.5μg/ml GARS樣品和陰性對照樣品的2-倍稀釋液；b)5-25μg/ml GARS樣品和試樣的5-10倍稀釋液；和c)陽性對照樣品(ConA)的15-20倍稀釋液。
按照製造商的推薦進行測量IL-2水平的ELISA方案。如果任何樣品的光密度到達平板讀出器的上/下限，分別在較高/較低稀釋度下重新分析樣品。
計算和驗收標準ELISA測量將平均吸光度從標樣，樣品和對照中減去空白樣品(零IL-2標準點)，對於每組三份計算平均值(吸光度-空白)，標準偏差(SD)，和相對標準偏差(RSD)。
樣品重複只要存在可疑的異常值，必需確保異常值基於統計學上的，以便闡明任何潛在的可能影響總結果的問題。如果一式三份測量之間的RSD高於10％並且平均OD-空白＞0.300，使用Dixon Q-檢驗實行異常值剔除。當在基於一式三份的測試中不滿足相關的驗收標準時使用Dixon Q-檢驗剔除可能的異常值。異常值檢驗僅可適用於相同標準溶液的重複測量。對於小於10次的觀察，僅能夠測定和排除1個異常值。該方法可能擴展Dixon Q-檢驗在從3-7之間任何數目的重複測量中剔除異常值中的使用，置信水平為95％。
方法將可疑的異常值稱為X1。參考可疑的異常值標記所有其它的測量值，例如X2是可疑異常值的下一個值，X3是離可疑異常值的第二個值，Xk離可疑異常值最遠，Xk-1可是第二離最遠的值等。
對於3-7次重複，使用下列方程X2-X1/Xk-X1。
表3k值
如果通過Dixon Q-檢驗未鑑定出異常值但是3次重複中的2次之間的差異不超過10％，將最靠近的2次重複用於計算％功效。否則，對該樣品重複ELISA試驗。
實行從OD＜0.300(空白，陰性對照和低標準點)的樣品中的樣品剔除。當確定異常值時，將它剔除和報告。將一式兩份測量用於％功效的計算。
空白樣品每個空白樣品的吸光度≤最高濃度的IL-2標樣的平均吸光度的10％。如果空白重複之一超過上述範圍，剔除它並使用一式二份樣品。
IL-2標準曲線按照製造商的推薦將IL-2標準曲線作圖。如果6個非零濃度的IL-2標樣的最小值保留在曲線中，可以剔除顯示差靈敏度或樣品處理誤差的IL-2標樣。後推-計算的(back-calculated)標準濃度對於較低的校準點具有大於20％的相對誤差(RE)，對於所有其它濃度15％。從覆蓋期望濃度的至少6個非零濃度的點(至少17個校準點)構建IL-2校準曲線。如果高或低濃度失敗，標準曲線範圍能夠被截短。線性回歸曲線的R2≥0.97。
測定對照使用線性回歸曲線的方程，從IL-2標準線性回歸曲線計算所有樣品中IL-2的濃度。通過乘以樣品稀釋因子計算在所有樣品中IL-2的終濃度。
陰性對照(MBP肽)
陰性對照樣品3次重複中至少2次中IL-2的終濃度低於對於GARS曲線最低校準點測量的IL-2水平。
陽性對照(ConA)陽性對照樣品3次重複中至少2次中IL-2的終濃度類似或高於GARS曲線最高校準點的IL-2的水平。
GADS批次相對功效的計算GARS曲線以對數-對數的標度，以對數IL-2濃度為y軸和以對數GARS濃度為x軸繪製GARS曲線。從至少5個非零濃度構建校準曲線(至少14個校準點)。如對於IL-2標準點所述剔除校準點。通過標準點計算最佳擬合回歸曲線。R2≥0.97。斜率(β)≥0.77。
平行性分析以對數-對數的標度，以對數IL-2濃度為y軸和以對數GADS濃度為x軸繪製每個試樣的劑量-反應曲線。通過樣品點計算最佳擬合回歸曲線。斜率(β*)在下列範圍內β×0.635≤β*≤β×1.365如果β*在範圍外，一式二份重複體外試驗(兩次分開的樣品製備)。如果在一次重複試驗中β*失敗，剔除該批次。如果在兩次重複試驗中β*在範圍內，測定％功效和95％的置信範圍。
％功效和置信範圍的評估通過使用ANOVA獲得用於確定置信範圍(其具有包括「真實功效「的95％概率)的隨機誤差的估計。該統計計數將觀察的反應的總差異分成獨立的部分，即
由於分別與線性和平行性的非顯著的偏差，部分3和4包括在隨機誤差項中。將總平方和分成3部分(SS-回歸，SS-製劑和SS-誤差)，適當的自由度數和顯著性的F-檢驗。
如下所述計算試驗批次的％功效和對於估計的功效的95％置信範圍計算相對功效和95％置信範圍的計算算法步驟1計算給定數據轉化成log10標度Yki＝log10(反應ki)；i＝1，...nkXki＝log10(劑量ki)；i＝1，...，nk其中k＝1，2分別是GA批次和GA.RS的製劑下標；n1和n2是分別對於GA批次和GA.RS進行的測量總數。
因此，N＝n1+n2是觀察的全部總數。
步驟2通過下式基於所有測量的數據點計算對於線性回歸的共同斜率=j=1N(Yj-Y)(Xj-X)j=1N(Xj-X)2;]]>其中Y是log10(反應)的總平均值；X是log10(劑量)的總平均值。
步驟3如下計算由於對log10(劑量)回歸導致的平方和SSREG=2j=1N(Xj-X)2;]]>步驟4如下計算隨機誤差的平方和SSERR=k=12i=1nk[Yki-Yk-(Xki-Xk)]2;]]>
其中Yk，Xk分別是製劑k的log10(反應)和log10(劑量)的平均值。
步驟5如下計算均方誤差項DF誤差(隨機誤差的自由度)＝N-3；MS誤差＝SS誤差/DF誤差。
步驟6使用t-分布統計表以便發現t-統計的適當值t＝t(0.975，DF誤差)。
步驟7如下計算相對功效的點估計 步驟8計算通過下式由C表示的表達式C=SSREGSSREG-MSERRt2;]]>步驟9計算95％置信區間的上限和下限的對數Log10(Lower Limit)=CY1-Y2-(X1-X2)-MSERRCt1n1+1n2+(Y1-Y2)2SSREG-MSERRt2]]>Log10(Upper Limit)=CY1-Y2-(X1-X2)+MSERRCt1n1+1n2+(Y1-Y2)2SSREG-MSERRt2]]>步驟10通過採用反對數獲得的對數範圍和乘以100％將在前述步驟中計算的值轉換成原有標度。
GADS批次的估計功效不小於表明功效的80％和不超過125％。估計功效的誤差置信範圍(P＝0.95)不小於表明功效的70％和不超過43％。如果批次在上述範圍外，一式兩份重複體外試驗。如果兩次重複試驗的結果都在說明書的範圍內，批次可接受。如果一次重複試驗失敗，剔除該批次。
記錄記錄LN細胞計數和ELISA平板模板。將原始ELISA讀出器記錄和結果表格歸檔。
實施例2實施例1的標準方法的發展實驗2A從GARS-特異性T細胞分泌的細胞因子的輪廓LN細胞來源於預先9-11天用在CFA中的250μg GARS免疫的雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠，其在各種濃度的GARS的存在下培養。將細胞在37℃下在5％CO2溼潤的培養箱中與GARS溫育18-24小時。隨後，將培養物離心並收集上清液和通過ELISA測定細胞因子。
使用細胞因子特異性的生物素化的抗體和用於檢測的偶聯的鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶(HRP)進行ELISA。每次板運行包括空白對照(不含細胞因子標樣的第一和第二抗體)。每次板運行還包括質量控制(QC)樣品(在測定線性範圍內3種濃度的細胞因子標樣)。每個體外試驗包括陽性對照(ConA，非特異性T-細胞刺激劑)和陰性對照(無GA或其它任何抗原)。所有細胞因子在溫育18-24小時後測量。在溫育72小時後再次檢測TGF-β，IL-10和IL-4的水平。結果在表4中顯示。
表4細胞因子輪廓
在表4中，對於每種細胞因子測量的最大水平以任意單位表示(-)＜檢測範圍；(+)高達大約400pg/ml；(++)＞400pg/ml。表4顯示響應培養物中的GARS，LN細胞分泌IL-2，INF-γ，IL-10和IL-6，而TNF-α，IL-4，IL-13和TGF-β在培養基中未檢測到。這些結果顯示通過GARS-特異性T細胞生產的細胞因子是屬於Th0類型。應當注意在不同免疫方案，即用IFA或用低劑量GA免疫中觀察到Th0輪廓。
因為IL-2是T細胞激活的好標記，並且因為響應GARS的IL-2分泌非常可重複，具有線性的劑量-反應關係，IL-2似乎是測量T細胞激活的最佳細胞因子。
實驗2B免疫方法的優化進行幾個實驗以確定最佳免疫方案。第一個實驗檢測在LN中和在脾中GARS(免疫抗原)劑量對T-細胞反應的影響。用CFA中的250μg GA(組1)(如在EAE封閉試驗中)或在CFA中的10μg GA免疫2組每組10隻小鼠。從免疫小鼠的LN和脾製備原代培養物。將培養物與各種劑量的GARS溫育過夜，之後如實驗2A收集培養基並測定IL-2。圖4中的結果清楚地表明在兩個免疫方案中，與從脾細胞分泌的那些相比從LN細胞分泌的IL-2的水平高。基於這些結果決定將LN細胞的原代培養物用於測定。另外，注射到小鼠中的GARS的劑量不影響培養物中的T細胞反應。無論GARS的免疫劑量，LN和脾細胞分泌相似數量的IL-2。這表明免疫方法是穩固的，甚至GARS免疫劑量的較大變化也不影響免疫結果。
為了進一步優化免疫方案，一組注射在CFA中的250μg GARS，第二組用ICFA中的10mg GA注射。因為使用ICFA，一種較弱的佐劑，第二組中GARS的劑量較高。10天後，體外檢測來自兩組的LN細胞對GARS的反應。圖5顯示儘管使用低得多的劑量，用在CFA中的250μg GARS免疫在培養物中誘導強得多的反應。
基於這些發現，和250μg/小鼠的CFA中的GA在阻斷EAE(在該小鼠品系中EAE的至少80％阻斷)方面非常有效的事實，250μg/小鼠的CFA中的GA似乎是最佳劑量。
在用CFA單次免疫後，通常在約10天內產生特異性的T細胞。圖6顯示在免疫後9，10和11天製備的培養物中LN細胞對GARS的反應。因為IL-2分泌的劑量-反應在所有各天類似，免疫周期可以持續9-11天。
實驗2C體外試驗條件的優化進行幾個實驗來確定體外反應的最佳方案。這些研究包括培養條件，溫育時間的優化，在試樣中IL-2的穩定性和GARS在-20℃下的穩定性。
i)培養基通常在補充1％正常小鼠血清的RPMI培養基中保養小鼠淋巴細胞的培養物。正常小鼠血清可以包含內源性IL-2，其可以通過在ELISA試劑盒中使用的抗-小鼠IL-2單克隆抗體檢測。另外，不同大量的正常血清的使用可能增加體外試驗的日間變化。為了避免與內源性IL-2的交叉感染，和為了減小該方法的日間變化，在4種不同培養基中檢測GA-特異性的T細胞反應1)RPMI+1％正常小鼠血清(NMS)；2)RPMI+1％胎牛血清(FBS)(牛IL-2不被在ELISA試劑盒中使用的抗小鼠IL-2識別)；3)Biotarget(由BeitHaemek，以色列專門生產的無血清培養基)；4)DCCM1(由不同製造商生產的無血清培養基)。
圖7顯示代表性實驗的結果，該實驗比較在不同培養基中LN細胞對GARS的反應。當使用無血清培養基時觀察到最好的反應。在缺少血清下劑量-反應範圍左移。這可以通過先前顯示GA與白蛋白和其它血清蛋白結合的研究解釋。該結合可以降低培養物中GA與APC相互作用的可用性，因此要求更高濃度的GA來刺激T細胞。基於這些結果，最佳培養基似乎是DCCM-1培養基。
ii)IL-2分泌的動力學IL-1是自分泌和旁分泌生長因子，其對於克隆T-細胞增殖和B細胞及巨噬細胞的功能性質是必需的。在用GARS刺激培養物以後，通過激活的GA-特異性T細胞分泌IL-2並隨後被LN細胞消耗。進行IL-2分泌的熱力學研究試圖確定在用GA刺激後收集上清液的最佳(峰)時間。在溼潤的CO2培養箱中在37℃下培養LN細胞並與不同濃度的GARS溫育。在圖8所示的時間間隔中，取樣等分試樣並通過離心去除細胞。將上清液保存在20℃，在實驗結束時用於通過ELISA測定。
圖8顯示在培養基中IL-2水平的峰在18-21小時之間。從24-48小時收集的樣品中的IL-2水平的降低可以通過LN細胞的IL-2消耗來解釋。因此，上清液收集的最佳時間似乎是在溫育18-21小時後。
iii)細胞因子的測量本方法依賴於GARS樣品和試樣中IL-2的準確測量。在實驗期間，通過OptEIA(Pharmingen，目錄號2614KI)-對於小鼠IL-2特異性的ELISA試劑盒來測量IL-2的水平。該ELISA試劑盒非常靈敏並且結果準確和可重現。
iv)在-20℃下試樣中IL-2的穩定性在大部分進行的實驗中，在通過ELISA分析之前收集培養基並保持在-20℃。IL-2在培養基中穩定性的初步研究表明細胞因子在-20℃下穩定1周(圖9)。因此，在測量IL-2之前體外試樣的培養基可以保持在-20℃下達1周。該試驗的結果還顯示ELISA結果是重現非常好的--在隔1周的不同兩天進行的兩次ELISA板運行中在樣品中測量的IL-2水平幾乎相同。
v)GARS溶液在-20℃下的穩定性為了檢驗GARS溶液在-20℃下的穩定性，在製備後即刻和在-20℃下貯存5個月後檢測GARS溶液的劑量-反應。圖10顯示在-20℃下貯存5個月之前和之後GARS溶液的劑量-反應曲線幾乎沒有差異。因此，可以製備GARS溶液的等份試樣並在使用前保存在-20℃下至少5個月。
實驗2D確定GARS校準曲線的線性範圍基於對於接受分析的21個板中的每一個分別計算和評估的GARS校準曲線進行統計學有效性檢查。這些21個樣品是在約4個月的期間內的不同時間收集。給定板的GA濃度範圍為0.25-50μg/ml。下列源於GARS校準曲線的有效性特徵構成分析的主要方面
1.最佳轉換以確保線性範圍的更寬範圍；2.測定線性範圍極限；3.接受校準曲線的總標準；4.評估測定準確度和精度；5.評估一式兩份的可靠性(參見以下段落)。
實驗性質如此以致在每個校準點典型地有3個重複(一式三份)。然而，在一些情形下，當不能提供一式三份的測量時，一式兩份的可靠性的評估變得關鍵。
GA劑量-反應關係的線性以下提供的有效性討論的大多數方面的基礎是將IL-2濃度(pg/ml)與GA濃度(μg/ml)相關聯的線性回歸模型。該關係的線性假設對於線性回歸模型的適當擬合是必需的。以線性-線性標度將數據作圖。將相同的關係轉化成對數-對數標度，以及對數-線性標度，和對數-平方根標度。對數-對數轉化顯示最適合的線性特徵。因此，選擇的回歸模型形式是對數-對數的一種Log10(IL-2濃度)＝α+β*Log10(GA濃度)+誤差反應變量是在每個校準點測量的3次重複的對數-轉換平均值。將該模型與每個校準樣品擬合併對於每個擬合曲線計算適當的統計學(R2，截距，和斜率)。R2值通過下式反映殘差平方和(RSS)與總平方和(TSS)的比率R2＝1-RSS/TSS線性範圍確定基於下列標準確定線性範圍1.繪製的Log10(IL-2濃度)比Log10(GA濃度)的目視檢查；2.回歸影響診斷，如在距離統計學(distance statistic)領域中已知的Cook’s；3.對於幾個潛在的線性範圍定義的校準曲線計算的精度和準確度值的差異評估提供線性關係的視覺評價。沒有在選擇的1-25μg/ml線性範圍內部非線性關係的證據。
實驗2EGARS標準曲線的測定在選擇的線性範圍極限(1-25μg/ml)擬合的源於GARS校準曲線的有效參數測定如下1.對於研究中每個板的Log10(IL-2濃度)對Log10(GA濃度)的線性回歸擬合的R2；2.這些直線擬合的斜率和截距；3.對於每個板對每個校準點計算的準確度；和4.對於每個板對每個校準點計算的精度。
為了計算準確度和精度，將每個校準曲線用於校準(後推計算)給定IL-2濃度值的GA濃度Xi-後推＝10(log10(IL-2Conc)i-α)/βi＝1，2，3-一式三份下標。
所用準確度的基本度量是一式三份樣品中濃度估計的平均值和真實濃度之間的差異百分比不準確度＝([平均值(Xi-後推)-GA濃度]/GA濃度)*100％。
所用精確度的基本度量是一式三份濃度估計的濃度的相對標準偏差(RSD或CV)精度＝CV(Xi-後推)＝[標準偏差(Xi-後推)/平均值(Xi-後推)]*100％。
分析的目標是為擬合校準曲線提議驗收標準，確保方法的準確度和精度是充分的。驗收標準是基於R2和GARS校準曲線的斜率。通過小的不準確度值(＜13％)和通過好的精度(1.1％-6.7％)可以表徵約80％的板。對於這些16條「表現良好」的標準曲線，獲得下列結果1.高R2值(＞0.98)；2.比較高的斜率值，反應劑量反應關係(在16個板中的15個中＞0.78)。
因為與具有較低R2值(平均值＝0.94)和相當平的斜率(平均值＝0.72)排除的板形成對比，大部分校準曲線的特徵在於比較高的R2值(平均值＝0.99)和比較陡的斜率(平均值＝0.87)，在R2和斜率方面考慮校準曲線的總驗收標準。確定接受參數的簡單規則是分別基於斜率和R2截止點的計算並將它們定位在拒絕曲線的最大值(最大R2＝0.95最大斜率＝0.77)和接受曲線的最小值(最小R2＝0.98最大斜率＝0.77)之間。因此，如下得出驗收標準1.R2≥0.97；2.斜率≥0.77。
將這些標準應用於在1-25μg/ml GA濃度範圍內擬合校準曲線的至少5個不同(一式三份)濃度。另外，截距值的範圍為1.42-1.78，平均值＝1.58。該範圍對於16個合格的和5個去除的平板類似。
對於每條曲線和對於板上那些中的各個濃度計算準確度和精度。這些單獨的值(對於每條曲線和每個濃度)也在以下各項上平均1.每條曲線的不同濃度；2.每個濃度的不同曲線；和3.在所有曲線和濃度上。
有關結論是對於基於在線性範圍1-25μg/ml內至少5個不同校準點的GARS校準曲線，當將校準曲線限制為具有R2≥0.97和斜率≥0.77，得到的平均準確度和精度估計如下1.方法的平均(±SD)準確度值是8.0％±2.3％；並且2.方法的平均(±SD)精度值是2.9％±1.7％。
基於一式兩份的GARS校準曲線的可靠性評估為了評估在每個校準點使用一式兩份測量擬合的GARS校準曲線的可靠性，進行測定的準確度和精度描述性統計的比較。另外，對於在給定一式三份中所有3種可能的一式兩份測量的選擇，研究單個的準確度和精度值(對於每條曲線和每個濃度)。當在滿足在先前部分中所述驗收標準並且在確定的線性範圍1-25μg/ml的極限內的那些曲線上集中時，明顯的是當由於某些原因不能提供一式三份測量時，可以成功地用一式兩份測量替代。
表5準確度和精度描述性統計總結
基於一式三份的方法的平均(±SD)準確度和精度分別是8.0％±2.3％和2.9％±1.7％(表5)。
基於一式兩份的方法的平均(±SD)準確度和精度是1.準確度8.1％±2.8％；精度2.5％±1.7％；2.準確度8.0％±2.5％；精度2.9％±2.1％；和3.準確度8.4％±2.8％；精度2.4％±1.5％。
實驗2F統計學關係的測定發現方法的平均(不)準確度為8.0％，SD＝2.3％。目標是發展用於新GA批次與GARS的兩條對數(劑量)-對數(反應)直線的斜率比較的可靠性檢驗。檢驗考慮上述方法的(不)準確度。方法平均(不)準確度的約95％個別容許區域的最高極限用作閾值平均值+2*SD＝12.6％。因此，在範圍±12.6％內的變化被認為是非顯著的。
如下是β*(批次直線的斜率)，β(標準直線的斜率)和最高允許(不)準確度值之間的關係的完整數學解釋。未失去一般性，將僅證明其中β*＞β的情形(由於存在對稱性，擴展到β*＜β的情形的證據是明顯的)。對於給定log(反應)的後推-計算劑量值為X後退＝10(Y-α)/β，其中Y＝log10(IL-2濃度)。
(不)準確度計算的式子為(不)準確度＝[(10(Y-α)/β-X真實)/X真實]*100％。
Y低和Y高是可容許的±12.6％(不)準確度允許的最低和最高log(反應)值。
因此，接受斜率相等的假設的區域是 因此，斜率相等的邊界是 直線的斜率計算如下β*＝(Y高-Y低)/(logX2-logX1)＝[β·log([X2/X1]·[1.126/08.74])]/log(X2/X1)β＝[β·log(1.288)]/log(X2/X1)＝β·(1+log(1.288)/log(X2/X1))假設在考慮X2/X1＝2(對於5和10μg/ml的劑量水平)下的特定情形，如下計算β*β*＝β·(1+log(1.288)/log2)＝β·1.365將該結果與對於其中β*＜β的對稱情形獲得的結果結合，如下計算範圍 在給定數據中，所有斜率在匹配的臨界範圍內，意味著未觀察到從平行行假設的偏差。
一旦接受批次為統計學有效(已經證明線性和平行性的存在)，估計試驗製劑相對於標樣的功效比率。這通過將平行直線與數據擬合和確定它們之間的水平距離在平行線測定中完成M=log=YT-YSB-(XT-XS);]]>其中ρ表示功效，Ys，YT，Xs，XT分別是標樣和試驗製劑的平均log(反應)和log(劑量)。B-是標樣和試驗log(劑量)-log(反應)直線的共有斜率。共有斜率-B的最小平方估值是分別來自標樣線和試驗線的兩個斜率的最小平方估值的加權平均。採用上述表達式的反對數，能夠獲得試驗製劑相對於它標樣的「真實％功效」的點估計 實施例3實施例1的標準方法的有效性以下顯示的分析的目的是確定GA批次相對功效的有效釋放規定。如果滿足基於統計推斷的下列標準，GA批次認為有效1.未違反包括在生物測定分析方法中的下列假設(a)log(反應)的獨立性和正態性；(b)log(反應)方差的均勻性；(c)無異常值；(d)平行性(斜率比率檢驗的非顯著性)2.相對功效的點估計在預先規定的範圍內80％-125％；並且3.「真實相對功效」值的95％置信範圍在更廣的預先限定的置信範圍內70％-143％。
該模型假設標樣和試驗製劑應當表現為似乎一個是另一個的簡單稀釋。這意味著對於兩種製劑的log(劑量)-反應線應當不顯著偏離線性和平行性。因此，這些直線之間的常數水平位移的反對數能夠作為功效比率的估值。這兩個要求，線性和平行性，構成測定有效性的概念。有效性的檢查是估計相對功效和它的置信範圍的前提。
為了計算相對功效真實值的置信範圍需要估計隨機誤差。這個度量是通過實行稱為「方差分析」(ANOVA)的統計技術而獲得。因此，必須已經滿足ANOVA的常規統計學假設。如下是平行線生物測定模型的統計學分析的要求1.關於它們的期望值反應是獨立正態分布；2.反應的方差不受反應平均值的影響；3.不存在異常值；4.log(劑量)和反應之間的關係能夠由跨越劑量範圍的直線表示；和5.試驗製劑的直線與標樣的直線平行。
批次分析數據獲自由不同操作者在不同天進行的不同實驗。通過一系列實驗進行實施例1的標準方法的有效性試驗，所述實驗每個包括1)用CFA中的250μg GARS免疫小鼠；2)在免疫後9-11天從LN細胞中製備原代培養物；3)將LN細胞與不同濃度的GARS和試樣溫育；4)收集培養基並通過ELISA分析IL-2水平；5)基於在1-25μg/ml的6個劑量水平進行的一式三份的IL-2測量繪製GARS曲線；和6)在線性範圍內的兩個濃度(5和10μg/ml)下比較對每個試樣的T細胞反應與對RS批次(一式三份)的反應。還對每個一式三份計算％CV以便檢測與一式三份之間的變異性有關的任何問題(通常，一式三份之間的％CV應當不超過10-15％)。對於給定數據，未檢測到違反條件。
用於提供分析方法能力的總的認識的有效性特徵是線性，範圍，準確度，精度，特異性和穩定性。有效性的標準和分析是基於ICH共同準則，「分析方法的有效性方法學」，1996年11月(CPMP/ICH/281/95)。為了分析目的將在「歐洲藥典」指南中推薦的統計學方法適用於給定數據。
實施例3A線性和範圍在每個體外試驗中，將GARS批次的劑量-反應曲線用於計算細胞對試樣的相對反應。每條校準曲線包括至少5個點(無零點)。從在發展和有效性檢查階段期間進行的不同體外試驗中收集21條校準曲線，對於每個板作圖和評估。
數據的統計學分析顯示log10(IL-2濃度)對log10(GARS濃度)的作圖提供最好的線性擬合。線性範圍主要通過目視檢查和校準點的準確度和精度評估而出現。對於每個一式三份計算％RSD以便檢測與一式三份之間變異性有關的任何問題(通常一式三份之間的％RSD應當不超過10-15％)。GARS曲線的範圍規定在1-25μg/ml之間。
基於這些分析，GARS曲線應當由至少6個校準點組成，一個濃度為零(陰性對照)，和在1-25μg/ml範圍內的至少5個GARS濃度。log10(IL-2濃度)對log10(GARS濃度)的線性回歸應當具有R2≥0.97和斜率≥0.77。
實驗3B準確度跨越GARS曲線的指定線性範圍確定方法的準確度。數據的統計學分析顯示方法的平均準確度為8.0％±2.3％。
實驗3C精度所用精度的基本度量是濃度重複(通常一式三份)估值的相對標準偏差(RSD)。
跨越GARS曲線的線性範圍確定RSD。數據的統計學分析顯示方法的平均精度是2.9％±1.7％。一式兩份測量的可靠性等同於一式三份。因此，當三次重複之一被鑑定為異常值，忽略異常值並接受來自一式兩份測量的結果。
實驗3D方法重現性在相同的體外試驗中重複3次測量對GADS批次的GA特異性T細胞應答。將相同批次的3個重量每個稀釋至5和10μg/ml並與GA-特異性T-細胞溫育。通過ELISA一式三份測量試樣和GARS樣品的培養基中IL-2的水平。相對於GARS計算細胞對每個一式三份的％功效和95％置信範圍。表6顯示對於每個一式三份計算的％反應。
製備有表1所示組成的液體，並評價沉澱的情況和鋁的腐蝕。所用表面活性劑是磷酸辛基苯氧基聚乙氧基乙酯(Triton QS-44(UnionCarbide))。
各測試液都調至pH＝13.5備用。
鋁腐蝕的測量方法使點塗於矽氧烷基體之上的2×2cm2尺寸的鋁試樣在35℃的50ml各測試液中浸泡5分鐘。通過ICP(感應式高頻等離子光譜測定法)測量溶於液體中的鋁量。
液體穩定性的測量方法將測試液在45℃下儲存規定的時間，目視評價沉澱的存在。
表1
由實驗數據可見Ca沉澱和鋁腐蝕取決於螯合劑的類型，1-羥基亞乙基-1，1-二膦酸酯產生良好結果。
實施例12中，用螯合劑B-G代替螯合劑A時，獲得與螯合劑A相同的良好結果。
實施例2用螯合劑A製備有表2所示組成的測試液，並評價沉澱的情況和鋁的腐蝕。
表8方法重現性
基於上述實驗，可以得出結論體外試驗是可重現的。
實驗3G特異性在3個水平上檢測方法的鑑別1)與/不與GARS(基體效應(matrixeffect))溫育的樣品間的鑑別；2)GARS和其它相關和非相關蛋白質以及肽，包括GARS之間的鑑別；和3)GARS和GA相關共聚物之間的鑑別，在所述共聚物中肽序列被精心修飾。
i)GARS被GARS-特異性的T細胞識別(基體效應)通過用CFA中250g GARS免疫雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠誘導GA-特異性的T細胞。該劑量的GA通常用於在該小鼠品系中使用EAE阻斷試驗檢測GA批次的生物活性。該實驗中的對照組僅用CFA注射。在免疫後10天，從兩組小鼠中取出LN細胞。將細胞與GARS在37℃下在5％CO2溼潤的培養箱中溫育18-24小時。
隨後，將培養物離心，收集上清液並通過ELISA測定白細胞介素-2(IL-2，從激活的T細胞分泌的細胞因子)，所述ELISA使用生物素化的對IL-2特異性的抗體和用於檢測的鏈黴抗生物素-辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物(圖1)。每次板運行包括空白對照(不含細胞因子標樣的第一和第二抗體)。每次板運行還包括質量控制(QC)樣品(在測定線性範圍內的3個細胞因子標樣濃度)。每個體外試驗包括陽性對照(ConA，非特異性T-細胞刺激劑)和陰性對照(無GA或其它任何抗原)。圖2顯示來自用GARS免疫的LN細胞依賴性地響應培養物中的GARS分泌IL-2劑量，而來自對照小鼠的LN細胞對培養物中的GARS無反應。陰性對照樣品中的IL-2水平通常低於或接近ELISA檢測極限(約3pg/ml)。這些IL-2水平通常低於GARS最低校準點(1μg/ml)分泌的水平。這些結果顯示GA特異性T-細胞的IL-2分泌是GA依賴性的。
ii)相關和非相關抗原之間的鑑別通過檢測GARS-特異性T細胞對不同抗原的體外反應證明相關和非相關抗原(蛋白質和單肽)之間的鑑別。LN細胞的原代培養物來源於提前9-11天用CFA中的250μg GARS免疫的雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠。將原代培養物與GARS和各種其它抗原在37℃下在5％CO2溼潤的培養箱中溫育過夜。然後，如實驗3G(i)將培養物離心，收集上清液並通過ELISA測定IL-2。
表9顯示在本實驗系統中GA-特異性T細胞對人MBP(髓磷脂鹼性蛋白)，MBP免疫顯性肽pp.87-99(致腦炎肽)，或它的類似物pp.87-99Ala96(EAE抑制肽)無反應。溶菌酶，一種非相關鹼性蛋白質，也不被GA-特異性的T細胞識別。TV-35和TV-109是肽分子量分別為3757和11727的肽(PCT國際公開號WO 00/18794)。這些肽含有由與GA相同的4種胺基酸(Ala，Glu，Lys，Tyr)以與GA相同的摩爾比組成的確定的序列。GARS特異性LN細胞對TV-35無反應，與TV-109具有極低的交叉反應性。這些結果可以通過觀察即用GARS免疫誘導具有針對GA中存在的多個T-細胞表位的不同特異性的T細胞的混合物形成來解釋。然而，TV-35和TV-109可以與GA共享共有序列，GA-特異性的T細胞與單肽的溫育可能僅導致培養物中小部分GA-特異性細胞的部分刺激。因此，總T-細胞反應(IL-2的分泌)低於或接近檢測極限。
表9GARS-特異性LN細胞的特異性
1％功效＝抗原培養基中IL-2濃度×100/GARS培養基中的IL-2濃度體外試驗對GA批次的平均分子量(MW)敏感。圖11顯示GARS特異性細胞對GARS(MW＝7900)和對平均MW不同的GADS各批次的反應。可以看出，反應通常與平均MW相關；平均MW越高，反應越大。然而，應當注意GADS平均MW的釋放規定是4700-10000，響應具有規定內的平均MW的DS批次分泌類似水平的IL-2(圖11)。這些結果說明方法對GA高度特異性並且對於GA平均MW的變化敏感。
iii)GARS-特異性T細胞對GA藥物物質(DS)和Copaxone藥物產品(DP)的識別在用CFA中250μg GARS免疫雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠之後9-11天，取出LN細胞並與不同劑量的GARS批次(免疫抗原)和與DS批次一起培養。
如實驗3G(i)測量IL-2。圖12A顯示LN細胞與兩個標樣批次交叉反應。兩個批次的IL-2分泌的劑量-反應曲線(如上通過ELISA測量)類似，說明試驗批次共有類似的T-細胞表位。GARS和Copaxone批次之間的比較顯示GARS-特異性T細胞也與DP批次交叉反應，甘露糖醇，Copaxone製劑中的賦形劑不影響或幹預T-細胞反應(圖12B)。因此，該方法提供批次之間重現性的指示。
v)GA和相關共聚物之間的鑑別在實驗3G(ii)中，使用它們平均分子量不同的GADS批次證明體外試驗對GA肽的平均MW敏感。因為實驗基於GA-特異性T細胞對GA的生物識別，其特異性地對線性序列反應，期望方法將對GA肽序列中的變異/修飾敏感。這通過使用下列各項證明1)由組成GA的4種胺基酸中的僅3種合成的共聚物；2)由在製備條件中精心修改得到的GA批次(XX)，即在合成期間將過量的游離胺基酸加入GA單體。該批次的平均MW高並超出規定(MW＝11150Da)；和3)通過用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶蛋白酶解獲得的GARS的降解產物。
表10顯示GA-特異性T-細胞對缺少賴氨酸，丙氨酸或酪氨酸的3種胺基酸共聚物不反應。另外，細胞對批次XX的％反應較高並超出方法規定(100±30％)，表明方法可能對生產方法的修改敏感。如所顯示，高％反應還可以通過試驗對GA肽的MW的敏感性來解釋。
表10方法特異性
通過胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的GARS蛋白酶解的動力學研究表明體外試驗對GA肽的降解敏感。圖13和15顯示經蛋白酶解時間後細胞的IL-2分泌減少，細胞對蛋白酶解的肽的％功效超出方法規定(100±30％)(表11)。降解樣品的重疊色譜圖(通過RP-HPLC)(圖14和16)分別顯示通過胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白酶解的動力學。所有特異性研究的累積結果顯示方法對於GA是高度特異性的並且在GA和緊密相關的抗原之間鑑別。
表11方法特異性-蛋白酶解的影響
實驗3G穩定性i)驗收標準的穩定性通過比較對於重複GA批次獲得的相對功效得到的估值檢驗確定驗收標準的一致性和穩定性。批次分析數據包括許多重複GA批次。由不同操作者在不同3天測量兩個批次。另外由不同操作者在不同2天檢測一個批次。
在對於重複GA批次的平行性檢驗中，所有GA批次的斜率值在對於平行性斜率比率檢驗的適當臨界範圍內。所有GA批次滿足具有95％置信範圍的相對功效值的點估計的驗收標準(估計的％功效在80％-125％的範圍內並且95％置信範圍在70％-143％的範圍內)。對於重複GA批次的分析數據，它們的有效性不依賴於實驗日或進行試驗的操作者。這數據支持確定的規定的穩定性。
ii)免疫方法和體外反應的關鍵參數的穩定性評估免疫方法和體外反應的關鍵參數的穩定性。簡短地，表明1)LN細胞的免疫反應不受GARS的免疫劑量的影響；2)免疫時期是9-11天；3)與脾細胞反應相比LN細胞對GARS的反應較高；4)用GARS+CFA免疫導致與用ICFA免疫相比具有更強反應的LN細胞；5)在培養基中血清的存在強烈影響GA-特異性的T細胞反應，因此體外反應在無血清培養基中進行；6)收集培養基的最佳期限是與GARS和試樣溫育18-21小時以後；和7)在ELISA檢測以前培養基可以保存在-20℃下達1周。因此，表明方法是穩定的。
對於相對功效的點估計和95％置信範圍的總結統計平均相對功效的95％容許極限為了評估估計的新批次相對功效的驗收範圍，計算單個log(功效)估值的平均值和標準偏差平均值(Mi)＝0.0074SD(Mi)＝0.0402基於分析的數據，相對功效平均值的約95％容許範圍是[10平均值(Mi±2*SD(Mi))]*100％＝[84％，122％]。
相對功效95％置信範圍的範圍對於單個相對功效估值，95％置信範圍的最小值和最大值是最小值(下限)＝79.3％最大值(上限)＝147.3％
驗收標準的滿足基於分析，確定驗收標準為1.滿足包括在生物測定分析方法中的假設，即(a)log(反應)的獨立性和正態性；(b)log(反應)方差的均勻性；(c)無異常值；和(d)平行性(斜率比率檢驗的非顯著性)2.估計的相對功效不小於標樣功效的80％並且不超過其125％；並且3.估計相對功效的誤差的95％置信範圍不小於標樣功效的70％並且不超過其143％。
實施例3的討論體外試驗的有效性顯示方法是可重現的並且平均值的準確度和精度在可接受的範圍內。方法對GA肽是高度特異性的，並且對活性物質的質量敏感。
總結和討論對於GADS和Copaxone批次發展了一種體外方法。該方法是基於GARS-特異性T細胞對T-細胞表位(線性序列)的生物識別。GARS-特異性的T細胞分泌響應於培養物中的GA的Th0細胞因子。在該方法中，通過ELISA測量培養基中IL-2的水平來監視T細胞對GA批次的識別。顯示GARS-特異性的T細胞與DS和DP批次交叉反應，表明這些批次與RS批次共有類似序列，並且甘露糖醇，DP製劑中的賦形劑不幹涉反應。
該方法對於GA肽非常特異性並且對肽混合物的平均MW敏感。GA-特異性T細胞不識別MBP。MBP免疫顯性肽(致腦炎的和抑制肽)，以及具有與GA類似的胺基酸組成的單肽，不刺激T細胞。在本實驗中優化免疫方法以及體外反應中的關鍵參數。本實驗顯示該方法非常具有非常好的可重現性和穩定性。
可以將方法修改以標準化在藥物組合物中使用的其它T細胞抗原。從針對抗原RS免疫的動物可以製備對於抗原RS，而不是GARS特異性的T細胞的原代培養物。可以測量該培養物響應抗原RS和響應樣品抗原的細胞因子生產。可以將響應抗原RS的細胞因子生產對抗原RS濃度作圖以產生標準曲線。可以將響應樣品抗原的細胞因子生產與標準曲線比較以確定抗原是否在可接受的功效範圍內。
如實驗2A可以測定對於監視器的最佳細胞因子。如實驗2B和C可以優化免疫和體外試驗的條件。
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權利要求
1.一種測量相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效的試驗批次的醋酸格拉默的功效的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫8-12周齡的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫後9-11天製備來自步驟(a)小鼠的淋巴結細胞的原代培養物；c.分別溫育至少5個參考樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品18-21小時後在每個樣品中由細胞分泌的白細胞介素-2的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的白細胞介素-2的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞數量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
2.權利要求1的方法，其中在步驟(d)中分別溫育6個參考樣品。
3.一種測量相對於參考批次的醋酸格拉默的已知功效的試驗批次的醋酸格拉默的功效的方法，其包含a.用預定量的來自參考批次的醋酸格拉默免疫試驗動物；b.在免疫後預定時間製備來自步驟(a)試驗動物的細胞的原代培養物；c.分別溫育至少2個參考樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自參考批次的醋酸格拉默；d.溫育至少2個樣品，其中每個包含預定數量的來自步驟(b)原代培養物的細胞和預定量的來自試驗批次的醋酸格拉默；e.對於步驟(c)和(d)中的每個樣品測定在溫育該樣品預定時期後在每個樣品中由細胞分泌的細胞因子的量；f.將由與試驗批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量與由與參考批次的醋酸格拉默溫育的樣品分泌的細胞因子的量關聯，以便測定試驗批次的醋酸格拉默相對於參考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步驟(c)和(d)的每個樣品中，預定的細胞量基本上相同，並且其中對於包含預定量的試驗批次的醋酸格拉默的每個樣品，存在相應的參考樣品，其含有基本上相同的預定量的來自參考批次的醋酸格拉默。
4.權利要求3的方法，其中所述細胞因子是白細胞介素。
5.權利要求4的方法，其中所述細胞因子是白細胞介素-2。
6.權利要求4的方法，其中所述細胞因子是白細胞介素-6。
7.權利要求4的方法，其中所述細胞因子是白細胞介素-10。
8.權利要求3的方法，其中所述細胞因子是幹擾素-γ。
9.權利要求3的方法，其中所述哺乳動物生產對醋酸格拉默參考標準特異性的T細胞。
10.權利要求3的方法，其中所述哺乳動物是齧齒動物。
11.權利要求10的方法，其中所述齧齒動物是小鼠。
12.權利要求11的方法，其中所述小鼠是雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠。
13.權利要求3的方法，其中所述哺乳動物是約8至約12周齡。
14.權利要求3的方法，其中所述細胞是淋巴結細胞。
15.權利要求3的方法，其中所述細胞是脾細胞。
16.一種製備一批作為藥用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.製備一批醋酸格拉默；b.按照權利要求1的方法測量批次的相對功效；和c.如果如此測量的相對功效是參考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使所述批次具有作為藥用可接受的資格。
17.一種製備藥用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.製備一批醋酸格拉默；b.按照權利要求3的方法測量批次的相對功效；和c.如果如此測量的相對功效是參考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使所述批次具有作為藥用可接受的資格。
全文摘要
本發明提供測量試驗批次的醋酸格拉默的相對功效的方法。另外，本發明提供製備一批作為藥用可接受的醋酸格拉默的方法。
文檔編號G01N33/68GK1618018SQ02827773
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月4日 優先權日2001年12月4日
發明者E·克林格爾 申請人:特瓦製藥工業有限公司