高親和力PD‑1藥劑以及使用方法與流程

2023-10-04 15:18:04 3

交叉參照本申請要求2014年8月8日提交的美國臨時專利申請第62/035,316號以及2015年4月21日提交的美國臨時專利申請第62/150,789號的權利，該等申請各自通過全文引用結合在此。作為文本文件提供的序列表通過引用結合在此序列表在此作為文本文件「stan-1136wo2_seqlist_st25.txt」提供，所述文本文件於2015年8月7日創建且具有119kb的大小。所述文本文件的內容通過全文引用結合在此。
背景技術：
：t細胞活化取決於提供給t細胞受體的抗原特異信號。額外信號(例如共刺激(陽性)及/或共抑制(陰性)信號)微調這種反應，從而有助於確定其強度、性質以及持續時間。共刺激相互作用增強了t細胞的活化以及增殖，而共抑制相互作用促進了調節。舉例而言，cd28與ctla-4共受體均結合到b7-1(cd80)以及b7-2(cd86)分子。cd28充當強陽性共刺激性受體且ctla-4充當強共抑制性受體。一種稱為程序性死亡-1(pd-1)受體的受體表達於t細胞、b細胞以及骨髓細胞上且結合到程序性死亡配位體(pd-l)。這種受體-配位體對的主要作用是提供抑制信號(例如通過將磷酸酶(如shp-2)募集到pd-1細胞質尾區的免疫受體酪氨酸轉換基序(itsm))。pd-1信號傳導在誘導以及維持周邊耐受性方面起著重要作用。抗原呈遞細胞上的pd-1配位體(pd-l)已經表明可抑制自體反應性t細胞且誘導周邊耐受性，而實質細胞上的那些配位體通過遏制效應子t細胞以維持耐受性來防止組織毀壞。依據遺傳學背景，出現各種自體免疫疾病的pd-1缺乏小鼠的表型突顯了pd-1的抑制作用。pd-1/pd-l路徑頻繁地充當腫瘤細胞和廣泛病原體逃避免疫的標靶。舉例而言，pd1：pd-l路徑可以被腫瘤和病毒(例如引起慢性感染的病毒)利用(例如超活化)，腫瘤和病毒可以表達pd-l蛋白質以刺激pd-1(例如t細胞上的pd-1)，藉此減少免疫細胞(例如t細胞)反應而躲避免疫系統的殲滅。本發明提供高親和力pd-1模擬多肽，其通過特異性結合到pd-l1、阻斷/減少pd-l1與細胞(例如免疫細胞，如t細胞)表面上的pd-1的相互作用且藉此阻斷/減少pd-l1刺激性pd-1活性來模擬pd-1。還揭露了使用高親和力pd-1模擬多肽減少pd-1活性的方法。技術實現要素：提供高親和力pd-1變異型(模擬)多肽。所述多肽是野生型pd-1蛋白質(例如野生型人類pd-1蛋白質)的序列變異體，且應用於阻斷野生型pd-1蛋白質與其配位體pd-l(pd-l1和/或pd-l2)之間相互作用的活體內以及活體外方法中。高親和力pd-1模擬多肽相對於野生型pd-1蛋白質來說含有至少一個胺基酸變化，相對於野生型pd-1蛋白質來說對pd-l(pd-l1和/或pd-l2)的親和力增加，且缺少野生型pd-1蛋白質的跨膜域。使得親和力增加的胺基酸變化可以定位於pd-1與pd-l之間的胺基酸接觸位置，且/或可以定位於其來源的pd-1蛋白質的免疫球蛋白域中。高親和力pd-1模擬多肽可以進行轉譯後修飾，例如糖基化、聚乙二醇化等。高親和力pd-1模擬多肽可以是融合蛋白(即，可以含有額外的胺基酸序列)，例如與抗體fc序列和/或抗體可變區融合，所述抗體可變區向所關注的抗原提供特異性結合；以及類似物。高親和力pd-1模擬多肽可以是單體或多聚體，即二聚體、三聚體、四聚體等。在一些實施例中，提供調節免疫細胞(t細胞、nk細胞等)活性的方法。在哺乳動物中，通過投與治療劑量的包含高親和力pd-1模擬多肽的醫藥組合物來阻斷pd-1與其配位體pd-l1和/或pd-l2之間的生理學結合相互作用。本發明還包括醫藥配製物，其具有高親和力pd-1模擬多肽與醫藥學上可接受的賦形劑的組合。此類配製物可以作為單位劑量提供，例如有效阻斷個體內的第一細胞上的pd-1與第二細胞上的pd-l(pd-l1和/或pd-l2)相互作用的劑量。醫藥配製物還包括高親和力pd-1模擬多肽的凍幹製劑或其他製劑，其可以復原後使用。在一些實施例中，提供刺激針對靶細胞的免疫反應(例如靶向免疫系統摧毀活的癌細胞)的方法。在此類方法中，使表達pd-l1的細胞和有效阻斷內源pd-1(例如第一細胞上的pd-1)與pd-l(pd-l1和/或pd-l2，例如第二細胞上的pd-l)之間相互作用的劑量的高親和力pd-1模擬多肽接觸。阻斷這種相互作用可以基於免疫來摧毀在高親和力pd-1模擬多肽不存在的情況下未被毀壞的靶細胞。接觸可以在活體內進行(例如出於治療性目的)以及在活體外進行(例如用於篩選分析及其類似分析)。用於這些目的的高親和力pd-1模擬多肽可以是多聚體或單體。單體試劑特別適用於與選擇性結合到靶細胞的抗體組合投與。可以用高親和力pd-1模擬多肽治療的罹病個體包括患有癌症的個體、有感染(例如慢性感染、病毒感染等)的個體、患有免疫病症(例如與免疫抑制相關的病症)的個體、患有發炎病症的個體，和/或患有其他超增生病狀(例如硬化、纖維化及其類似病狀等)的個體。在一些情況下，通過使免疫系統的細胞與有效阻斷或遮蔽pd-1與pd-l相互作用的劑量的高親和力pd-1模擬多肽接觸以便增強對免疫系統的刺激來靶向用於排除的癌細胞，例如腫瘤細胞。在一些情況下，靶細胞(例如罹病細胞，如癌細胞、腫瘤細胞、感染細胞等)表達pd-l1和/或pd-l2，且高親和力pd-1模擬多肽阻斷靶細胞上的pd-l與免疫細胞(例如t細胞、nk細胞等)上的pd-1相互作用，從而可以阻斷靶細胞抑制針對靶細胞的免疫反應的能力。將有效劑量的高親和力pd-1模擬多肽投與患者阻止了pd-1與pd-l1之間的相互作用，從而可以提高腫瘤細胞和/或感染細胞(例如慢性感染的細胞)的清除率。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽可以與針對一或多種腫瘤細胞標記物的單克隆抗體組合，相較於作為單一實體投與的任一種藥劑，所述組合療法在增強癌細胞的排除方面可以是協同性的。在其它實施例中，高親和力pd-1模擬多肽包含可檢測標記。這種經標記的試劑可以用於活體外或活體內成像目的，例如腫瘤成像。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽可以作為診斷工具用於檢測pd-l(例如表達pd-l1的細胞)，且可以作為伴隨診斷手段用於評估特定治療方案是否已經成功。提供了高親和力pd-1模擬多肽。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是野生型pd-1序列的變異體，但缺乏pd-1跨膜域，且相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說包含一或多個胺基酸變化，其中相較於相應野生型pd-1多肽對pd-l1的親和力，所述一或多個胺基酸變化使所述多肽對pd-l1的親和力增強。在一些情況下，pd-1模擬多肽針對pd-l1的kd是1×10-7m或更小。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力是相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說不具有胺基酸變化的所述pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力的5倍或更大。在一些情況下，與相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說不具有胺基酸變化的所述pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力相比，高親和力pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力降低。在一些情況下，一或多個胺基酸變化位於pd-1中接觸pd-l1的胺基酸位置。在一些情況下，一或多個胺基酸變化位於相對於seqidno：2中所述的蛋白質片段來說選自以下的胺基酸位置：v39、n41、y43、m45、s48、n49、q50、t51、d52、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、p105、k106以及a107；相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置。在一些情況下，一或多個胺基酸變化位於相對於seqidno：2中所述的蛋白質片段來說選自以下的胺基酸位置：v39、l40、n41、y43、r44、m45、s48、n49、q50、t51、d52、k53、a56、q63、g65、q66、v72、h82、m83、r90、y96、l97、a100、s102、l103、a104、p105、k106以及a107；或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置。在一些情況下，一或多個胺基酸變化是5個或更多個胺基酸變化。還提供高親和力pd-1模擬多肽，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，其包含一或多個選自以下的胺基酸變化：(1)v39h或v39r；(2)l40v或l40i；(3)n41i或n41v；(4)y43f或y43h；(5)r44y或r44l；(6)m45q、m45e、m45l或m45d；(7)s48d、s48l、s48n、s48g或s48v；(8)n49c、n49g、n49y或n49s；(9)q50k、q50e或q50h；(10)t51v、t51l或t51a；(11)d52f、d52r、d52y或d52v；(12)k53t或k53l；(13)a56s或a56l；(14)q63t、q63i、q63e、q63l或q63p；(15)g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v；(16)q66p；(17)v72i；(18)h82q；(19)m83l或m83f；(20)r90k；(21)y96f；(22)l97y、l97v或l97i；(23)a100i或a100v；(24)s102t或s102a；(25)l103i、l103y或l103f；(26)a104s、a104h或a104d；(27)p105a；(28)k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t；以及(29)a107p、a107i或a107v；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。還提供高親和力pd-1模擬多肽，相對於seqidno：2中所述的蛋白質片段，其包含位於選自以下的胺基酸位置的胺基酸變化：(a)v39、n41、y43、m45、s48、n49、q50、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、k106以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(b)v39、n41、y43、m45、s48、q50、t51、d52f、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、k106以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(c)v39、l40、n41、y43、r44、m45、n49、k53、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(d)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、q66p、m83、l97以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(e)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、q66p、h82、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(f)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；(g)v39、l40、n41、y43、r44、m45、n49、k53、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置；以及(h)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說的相應胺基酸位置。還提供高親和力pd-1模擬多肽，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，其包含選自以下的胺基酸變化：(a){v39h或v39r}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{s48d、s48l、s48n、s48g或s48v}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{q50k、q50e或q50h}、{k53t或k53l}、{a56s或a56l}、{q63t、q63i、q63e、q63l或q63p}、{g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v}、{q66p}、{l97y、l97v或l97i}、{s102t或s102a}、{l103i、l103y或l103f}、{a104s、a104h或a104d}、{k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(b){v39h或v39r}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{s48d、s48l、s48n、s48g或s48v}、{q50k、q50e或q50h}、{t51v、t51l或t51a}、{d52f、d52r、d52y或d52v}、{k53t或k53l}、{a56s或a56l}、{q63t、q63i、q63e、q63l或q63p}、{g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v}、{q66p}、{l97y、l97v或l97i}、{s102t或s102a}、{l103i、l103y或l103f}、{a104s、a104h或a104d}、{k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(c){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{r44y或r44l}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(d){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{q66p}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(e){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{q66p}、{h82q}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(f){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(g){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{r44y或r44l}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；以及(h){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。還提供高親和力pd-1模擬多肽，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，其包含選自以下的胺基酸變化：(a)v39r、n41v、y43h、m45e、s48g、n49y、q50e、k53t、a56s、q63t、g65l、q66p、l97v、s102a、l103f、a104h、k106v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(b)v39r、n41v、y43h、m45e、s48n、q50h、t51a、d52y、k53t、a56l、q63l、g65f、q66p、l97i、s102t、l103f、a104d、k106r以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(c)v39h、l40v、n41v、y43h、r44y、m45e、n49g、k53t、m83l、l97v、a100i以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(d)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49g、k53t、q66p、m83l、l97v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(e)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49s、k53t、q66p、h82q、m83l、l97v、a100v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(f)v39h、l40i、n41i、y43h、m45e、n49g、k53t、m83l、l97v、a100v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(g)v39h、l40v、n41i、y43h、r44l、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(h)v39h、l40v、n41i、y43h、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；以及(i)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i，或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽包括融合搭配物(例如與其融合)。在一些情況下，融合搭配物是人類免疫球蛋白多肽序列片段(例如片段是選自：(a)ch3域；以及(b)fc區的一部分或全部)。在一些情況下，融合搭配物是選自：多聚域；細胞激素；減弱的細胞激素；41bb-促效劑；cd40-促效劑；btla和/或cd160抑制劑；以及tim3和/或ceacam1抑制劑。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多聚體(例如二聚體)。在一些此類情況下，高親和力pd-1模擬多肽包括融合搭配物(例如與之融合)且融合搭配物包括多聚(例如二聚)域。舉例而言，在一些情況下，融合搭配物是ch3域(來自免疫球蛋白多肽序列，例如人類免疫球蛋白多肽序列)。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括對應於r87c、n91c和/或r122c的一個或多個突變。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括seqidno：3-25以及39-46中的任一個所述的胺基酸序列。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽包括可檢測標記(例如正電子發射斷層掃描(pet)成像標記)。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括對應於r87c、n91c和/或r122c的一或多個突變，且還包括可檢測標記(例如正電子發射斷層掃描(pet)成像標記)。還提供包含本發明高親和力pd-1模擬多肽的醫藥配製物。還提供核酸。本發明核酸包括編碼高親和力pd-1模擬多肽的核苷酸序列。在一些情況下，核酸進一步包括(i)編碼tcr的核苷酸序列(例如編碼tcr的tcrα多肽和tcrβ多肽的核苷酸序列)；和/或(ii)編碼嵌合抗原受體(car)的核苷酸序列。在一些情況下，核酸是表達載體(例如線性載體、圓形載體、質體、病毒載體等)。還提供含有此類核酸的細胞(例如人類細胞、靈長類動物細胞、小鼠細胞、哺乳動物細胞)(例如免疫細胞、白細胞、t細胞、cd8t細胞、cd4t細胞、記憶/效應子t細胞、b細胞、抗原呈遞細胞(apc)、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞、幹細胞、造血幹細胞、多能幹細胞、多潛能幹細胞、組織限制性幹細胞等)。在一些情況下，細胞是免疫細胞。在一些情況下，細胞是幹細胞或祖細胞。在一些情況下，細胞是造血幹細胞。在一些情況下，細胞是t細胞(例如含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞，例如嵌合抗原受體(car)t細胞)。還提供成像方法。在一些情況下，所述方法包括使表達pd-l1的細胞與本發明高親和力pd-1模擬多肽接觸(例如活體外、離體、活體內)。在一些情況下，所述接觸包含向個體投與高親和力pd-1模擬多肽。在一些情況下，所述方法是一種診斷和/或預後個體癌症的方法。因此，在一些情況下，成像是用於診斷和/或預後個體癌症。還提供抑制第一細胞上的pd-1與第二細胞上的pd-l1和/或pd-l2相互作用的方法。在一些情況下，所述方法包括使第二細胞與高親和力pd-1模擬多肽接觸。在一些情況下，第二細胞是癌細胞或慢性感染細胞。在一些情況下，接觸是活體外接觸。在一些情況下，接觸是離體接觸(例如一或多個細胞相對於一或多個細胞將引入其中的個體來說可以是自體細胞)。在一些情況下，接觸是活體內接觸。在一些情況下，所述方法包括使第二細胞與選自以下的藥劑接觸：免疫刺激劑、慢性感染治療劑、細胞毒性劑、化學治療劑、細胞特異性抗體、對於腫瘤細胞標記物具選擇性的抗體，以及含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞。在一些情況下，所述方法包括使第二細胞與腫瘤特異性抗體接觸。還提供治療患有癌症、患有慢性感染或患有與免疫抑制相關的免疫病症的個體的方法。舉例來說，方法可包括向所述個體投與本發明的高親和力pd-1模擬多肽(例如按有效減少第一細胞上的pd-1與第二細胞上的pd-l1結合的量)。在一些情況下，投藥包括將編碼pd-1模擬多肽的核酸引入第三細胞。在一些情況下，第三細胞是活體內細胞。在一些情況下，將編碼pd-1模擬多肽的核酸活體外或離體引入第三細胞中，且接著將第三細胞引入個體中。在一些情況下，第三細胞是免疫細胞。在一些情況下，免疫細胞是含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞。在一些情況下，工程化tcr是嵌合抗原受體(car)。在一些情況下，個體患有晚期腫瘤。在一些情況下，所述方法包括將選自以下的藥劑投與個體：免疫刺激劑、慢性感染治療劑、細胞毒性劑、化學治療劑、細胞特異性抗體、對於腫瘤細胞標記物具選擇性的抗體，以及含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞。附圖說明本發明依據以下詳細說明，結合附圖閱讀會得到充分了解。應強調的是，根據慣例，附圖的各種特徵未按比例繪製。相反，為了清晰起見，各種特徵的尺寸經過任意擴大或縮小。附圖中包括以下諸圖。圖1a-1b.(圖1a)示意性圖解說明腫瘤細胞表面上的pd-l1特異性結合到t細胞表面上的pd-1以抑制t細胞活化，藉此讓腫瘤細胞躲避免疫系統的摧毀。(圖1b)示意性圖解說明本發明的高親和力pd-1模擬多肽特異性結合到癌細胞表面上的pd-l1，藉此降低癌細胞抑制t細胞活化的能力，這又降低癌細胞躲避免疫反應的能力。圖2a-2b.(圖2a)pd-1(右上方)與pd-l1(左下方)相互作用的結構圖示。位於與pd-l1接觸的位點的pd-1殘基用球形表示。(圖2b)使得pd-1模擬多肽(包含野生型胺基酸殘基)在接觸pd-l1的殘基上發生突變以產生第一代文庫(第1代)，在酵母上呈現。然後使用生物素化人類pd-l1(100nm)進行基於結合的選擇。產生集中於匯聚位置的第二代文庫(第2代)，以篩選出對pd-l1具有甚至更大親和力的pd-1模擬多肽(使用1nm生物素化人類pd-l1)。圖3.表格反映出工程化變異體(本發明的高親和力pd-1模擬多肽)的序列。「g1」變異體來自第1代，而「g2」變異體來自第2代(參見圖2a-2b)。每一個編號欄呈現每個所示殘基相對於seqidno：2中所述pd-1多肽的胺基酸位置(seqidno：2多肽是包括野生型pd-1序列、但缺乏跨膜域且缺乏野生型pd-1的前25個胺基酸的pd-1模擬多肽)。與野生型胺基酸殘基的歧異是用單字母碼表示每種變異體中所產生的突變。表面等離子體共振(spr)所測量的針對pd-l1的親和力是在右側指出(測量時)。hac：高親和性共同序列。圖4.圖示是兩個代表性表面等離子體共振(spr)圖。原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)的解離半衰期小於一秒。相比之下，高親和性共同序列pd-1變異體hac-i(本發明的高親和力pd-1模擬多肽)的解離半衰期是42.4分鐘。圖5a-5c.本發明的高親和力pd-1模擬多肽強有力地且特異性地拮抗pd-l1。酵母呈現：(圖5a)人類pd-l1、(圖5b)人類pd-l2或(圖5c)小鼠pd-l1用經標記的原生pd-1模擬多肽抗生蛋白鏈菌素四聚體(具有野生型人類pd-1序列且與alexa647結合的對照pd-1模擬多肽)染色。經標記的原生pd-1模擬多肽與可變濃度的未標記高親和力pd-1模擬多肽(濃度指示於x軸上)競爭結合到pd-l1。(圖5a)未標記的原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)拮抗pd-1/pd-l1相互作用。高親和力pd-1模擬多肽(hac-vpd-1、g24-1以及g24-2)強有力地拮抗pd-1/pd-l1相互作用。(圖5b)高親和力pd-1模擬多肽對pd-1：pd-l2相互作用未顯示任何拮抗現象，而原生pd-1模擬多肽拮抗pd-1：pd-l2相互作用。(圖5c)本發明的高親和力pd-1模擬多肽還能夠競爭結合到小鼠pd-l1。圖6a-6b.高親和力pd-1模擬多肽拮抗人類癌細胞上的pd-l1。(圖6a)人類黑色素瘤細胞系skmel28上的pd-l1表達。skmel28細胞上的pd-l1表達是通過用2000u/ml人類幹擾素-γ(ifnγ)刺激24小時來誘導。在誘導(加ifnγ)相對於非誘導(減ifnγ)條件下，通過流式細胞術來評估pd-l1染色。(圖6b)ifnγ刺激的skmel28細胞用經標記的原生pd-1模擬多肽抗生蛋白鏈菌素四聚體(一種對照pd-1模擬多肽，其具有野生型人類pd-1序列且與alexa647結合)以及濃度可變的未標記高親和力pd-1模擬多肽(濃度指示於x軸上)染色。未標記的原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)沒有能力阻止經標記的原生pd-1模擬多肽結合到skmel28細胞(ic50＝8.2μm)。相比之下，hac-v(一種高親和力pd-1模擬多肽)強有力地抑制經標記的原生pd-1模擬多肽結合(ic50為210pm)。hac-mbh(hac-v，一種高親和力pd-1模擬多肽，其與人類igg1的ch3域融合)以額外增強的效力(ic50為55pm)抑制經標記的原生pd-1模擬多肽結合。圖7a-7c.高親和力pd-1通過酵母表面呈現法進行的定向演化。(圖7a)hpd-1與hpd-l1複合的模型，其通過mpd-1：hpd-l1複合物(pdbid3bik)與hpd-1(pdbid3rrq)的結構比對所建構。隨機分布的pd-1殘基中的pd-l1接觸殘基描繪為「藍色球形」且核心殘基描繪為「紅色球形」。(圖7b)直方圖覆疊圖，其評估每一輪選擇時的酵母hpd-l1染色。第一代選擇時(左圖)，所有輪均用100nm生物素化hpd-l1染色。第二代選擇時(右圖)，酵母用1nm生物素化hpd-l1染色。(圖7c)所選pd-1變異體的序列和hpd-l1親和力的概述。野生型pd-1中的每個突變位置和相應殘基的位置指示於表格頂部。斜體字指示發生於非隨機分布位點的突變。標示為39、41、43、45、49、53、97以及107的殘基是匯聚於hac共同序列中的pd-l1接觸位置(「接觸共同位點」)，而標示為40以及100的殘基是匯聚核心位置(「核心共同位點」)。一些序列對hpd-l1的親和力是通過表面等離子體共振(spr)測定(如最右側的一欄所指出)。圖8a-8b.hac-pd-1結合且拮抗人類以及鼠類pd-l1，而非pd-l2。(圖8a)結合到所固定hpd-l1的野生型pd-1(左圖)以及hac-vpd-1(右圖)的代表性表面等離子體共振(spr)感測圖譜。(圖8b)野生型hpd-1、hac-vpd-1或hac『微體』(hacmb)針對人類sk-mel-28細胞(左圖)、小鼠b16-f10細胞或呈現hpd-l2的酵母的競爭結合分析。100nmhpd-1/抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647四聚體用作探針配位體。誤差條表示s.e.m.。圖9a-9d.hac-pd-1可以增強腫瘤滲透且不耗乏周邊t細胞。(圖9a)腹膜內注射抗hpd-l1-alexafluor488(用顏色呈現時是綠色)以及hac-alexafluor594(用顏色呈現時是紅色)後四小時，pd-l1缺乏(頂圖)或hpd-l1轉基因(底圖)的ct26腫瘤切片的代表性螢光顯微圖像。細胞核(用顏色呈現時是藍色)用dapi標記。比例尺表示500μm。(圖9b)對圖9a的解離腫瘤進行的代表性流式細胞術繪示了相對hac-alexafluor594染色相對於抗hpd-l1-alexafluor488染色。百分率是在每個正象限中給定。(圖9c)對4個pd-l1缺乏腫瘤以及4個hpd-l1轉基因腫瘤進行流式細胞術研究的概述。n.s.，不顯著。***，p＜0.0001，雙向方差分析(two-wayanova)。誤差條表示s.e.m.。(圖9d)媒劑(pbs)、抗mpd-l1或hacmb投與移植有ct26腫瘤的小鼠3天後，周邊cd8+t細胞(最左圖)、周邊cd4+t細胞(左側第二圖)、淋巴結cd8+t細胞(右側第二圖)以及淋巴結cd4+t細胞(最右圖)的相對豐度。ns，不顯著；*，p＜0.05；***，p＜0.001，單向方差分析。圖10a-10d.hacmb以及抗pd-l1抗體在小型以及大型ct26同基因腫瘤模型中的抗腫瘤功效。(圖10a)示意性圖解說明小型腫瘤實驗的實驗設計。所有群組在腫瘤移植後第7天開始治療。小鼠用日劑量的媒劑(pbs)、250μg抗pd-l1(純系10f9g2)或250μghacmb注射14天。(圖10b)所移植腫瘤的相對生長速率，其按個別腫瘤所顯示的倍數變化(左側三個圖)計算或按治療期期間的概要數據(最右圖)計算。誤差條表示s.e.m.。n.s.，不顯著。***，p＜0.0001。(圖10c)示意性圖解說明大型腫瘤實驗的實驗設計。將ct26腫瘤移植到小鼠中，且每日監測。當個別腫瘤超過150mm3時，將小鼠隨機分入治療組。每日測量腫瘤，且每日接受媒劑(pbs)、250μg抗pd-l1(純系10f.9g2)或250μghacmb治療14天。抗ctla4(純系9d9)是以250μg單一劑量投與。(圖10d)14天治療期期間的平均腫瘤生長的概要數據。誤差條表示s.e.m.。左圖和右圖上的經pbs治療的腫瘤生長(黑色)與經抗ctla4治療的腫瘤生長(紫色)相同；為了清晰起見，其圖示兩次。n.s.，不顯著。***，p＜0.001，雙向方差分析。治療後第14天的完全統計分析繪示於表4中。圖11a-11b.利用64cu-dota-hac對hpd-l1進行的micropet成像。(圖11a)將64cu-dota-hac(230μci/25μg/200μl)注射到具有皮下hpd-l1(+)或hpd-l1(-)ct26腫瘤的nsg小鼠後一小時的pet-ct圖像。使用pet示蹤劑之前的2小時，用500μg/200μl未標記hac-pd1進行阻斷。t-腫瘤，l-肝臟，k-腎臟，b-膀胱，sg-唾液腺。(圖11b)注射後一小時的腫瘤吸收率通過感興趣區域(roi)分析來量化，其按每克組織所注射劑量的百分比(％id/g)表示。*，p＜0.05。圖12a-12b.「第一代」pd-1文庫的設計。(圖12a)表格中示出了隨機分布的hpd-1位置的表格，表格中有相應的簡併密碼子以及每個位點上可能的潛在胺基酸。(圖12b)「第一代」文庫的結構描繪；hpd-1呈綠色(當用顏色呈現時)，其中隨機分布的側鏈以填滿空間的球形表示。圖13a-13b.「第二代」pd-1文庫的設計。(圖13a)表格中示出了隨機分布的hpd-1位置的表格，表格中有相應的簡併密碼子以及每個位點上可能的潛在胺基酸。(圖13b)「第二代」文庫的結構描繪；hpd-1呈綠色(當用顏色呈現時)，其中隨機分布的側鏈以填滿空間的球形表示。圖14.與個別hacpd-1單體和抗pd-l1抗體相比，hac「微體」(hacmb)設計的示意圖。hacmb是與人類igg1的ch3域融合的hac-v，此融合是通過含有二硫化物的鉸鏈序列來連接。圖15a-15b.表達hpd-l1的細胞的活體外以及活體內染色。(圖15a)未染色、經以下各物染色的ct26-tg(hpd-l1)-δ(mpdl1)的facs圖：經alexafluor594標記的hac單體，或經alexafluor488標記的抗pd-l1抗體(純系29e.2a3，生物聯想公司(biolegend))。(圖15b)從如圖9a中所描繪的相同腫瘤取得的組織學切片，但是從腫瘤中心而非周邊取得。圖像來自腹膜內注射抗hpd-l1-alexafluor488(當用顏色呈現時為綠色)以及hac-alexafluor594(當用顏色呈現時為紅色)後第四小時所解剖的腫瘤。細胞核(用顏色呈現時是藍色)用dapi標記。比例尺表示500μm。圖16.ct26移植小鼠中的初始周邊血液t細胞上的pd-l1表達。點陣圖繪示了皮下ct26腫瘤移植後第14天，balb/c宿主的周邊血液中的pd-l1陽性cd4+t細胞和cd8+t細胞的百分率。圖17a-17b.dota-hacpet示蹤劑的驗證。(圖17a)人類sk-mel-28細胞上的野生型hpd-1、hac-v或dota-hac的競爭結合分析。100nmhpd-1/抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647四聚體用作探針配位體。誤差條表示s.e.m.。(圖17b)抗hpd-l1放射性示蹤劑的免疫反應性。對添加示蹤劑之前經過量hac-n91c阻斷的hpd-l1(+)、hpd-l1(-)以及hpd-l1(+)細胞的結合特異性進行測試。5nm64cu-dota-hac容易結合到hpd-l1(+)細胞(80.5％±1.9％)，而對照hpd-l1(-)細胞僅展現最小的免疫反應性(8.3％±0.5％)。通過添加hac-n91c直到1μm來阻斷hpd-l1(+)細胞的結合(8.9％±0.1％)。n.s.，不顯著。****，p＜0.0001，雙向方差分析。圖18a-18e.64cu-dota-hacmicropet成像動力學。(圖18a)通過感興趣區域(roi)分析所計算的24小時腫瘤吸收率。(圖18b)通過roi分析所評估的具有hpd-l1(+)以及(-)腫瘤的小鼠的腎吸收率。(圖18c)64cu-dota-hac(230μci/25μg/200μl)注射後第24小時，具有雙重皮下hpd-l1(+)(虛線)以及hpd-l1(-)(實心)ct26腫瘤的nsg小鼠的pet-ct圖像。(圖18d)利用感興趣區域(roi)所計算的腫瘤吸收率。(圖18e)24小時期間的腎清除率。吸收率值是按每克組織所注射劑量的百分率(％id/g)示出。圖19a-19b.64cu-dota-hac的24小時生物分布。(圖19a)微型pet/ct成像完成後，將小鼠無痛處死且解剖以獲得生物分布。指定器官和組織中的吸收率是按每克組織所注射劑量的百分率(％id/g)示出。(圖19b)hpd-l1(+)腫瘤放射性示蹤劑吸收率相較於血液和肌肉的相對量。圖20a-20e.編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽以及(i)異源tcr(結合到抗原)(例如編碼tcr-α以及tcr-β多肽)或(ii)嵌合抗原受體(car)的病毒載體構築體實例的示意性繪圖。圖20a提供圖20b-20e的圖例。圖21a-21d.編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的實例核酸(dna載體)的示意性繪圖。具體實施方式提供了高親和力pd-1模擬多肽以及其使用方法。高親和力pd-1模擬多肽是野生型pd-1蛋白質(例如野生型人類pd-1蛋白質)的序列變異體，且應用於活體內以及活體外方法中以阻斷野生型pd-1蛋白質與其配位體pd-l(pd-l1和/或pd-l2)之間的相互作用。高親和力pd-1模擬多肽相對於野生型pd-1蛋白質來說含有至少一個胺基酸變化，相對於野生型pd-1蛋白質來說對pd-l(pd-l1和/或pd-l2)的親和力增加，且缺少野生型pd-1蛋白質的跨膜域。使得親和力增加的胺基酸變化可以定位於pd-1與pd-l之間的胺基酸接觸位置，且/或可以定位於其來源的pd-1蛋白質的免疫球蛋白域中。描述本發明方法和組合物之前，應了解本發明不限於所述特定方法或組合物，因為這當然可變化。還應了解，本文中所使用的術語僅出於描述特定實施例的目的，而不希望具有限制性，原因是本發明的範圍僅由所附權利要求書限定。在提供數值範圍的情況下，應了解還特別地揭露那個範圍的上限與下限之間的每個中間值，直到下限單位的十分之一(除非上下文另外明確規定)。所述範圍內的任何所述值或中間值與那個所述範圍內的任何其他所述值或中間值之間的每個更小範圍涵蓋於本發明中。這些更小範圍的上限和下限可以獨立地包括或不包括於這個範圍內，且本發明內還涵蓋其中任一限值包括於更小範圍內、兩個限值都不包括於更小範圍內或兩個限值均包括於更小範圍內的每個範圍(除了所述範圍內特別排除的的任何限值之外)。在所述範圍包含一個或兩個限值的情況下，本發明中還包括排除所包括的那些限值中的任一個或兩個的範圍。除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。儘管與本文所述的類似或等效的任何方法和材料可以用於本發明的實施或測試中，但是現在描述一些潛在的優選方法和材料。本文提及的所有公開通過引用結合在此，以揭露且描述與所列公開相關的方法和/或材料。應了解，在存在牴觸的範圍內，本發明取代了所結合公開的任何揭露內容。如所屬領域的技術人員在閱讀本發明之後將顯而易見，本文中所描述和說明的每個個別實施例具有離散的組件和特徵，所述特徵可容易與其它若干實施例中的任一個的特徵分離或與其組合而不脫離本發明的範圍或精神。任何所述方法均可以按所述事件的順序或按邏輯上可能的任何其它順序來進行。必須指出，除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附權利要求書中所使用，單數形式「一(a/an)」和「所述(the)」包括複數個提及物。因此，舉例來說，提及「細胞」包括多個此類細胞且提及「肽」包括提及一或多種肽以及其等效物，例如所屬領域的技術人員已知的多肽等。提供本文中討論的公開案僅僅針對其在本申請案的申請日之前的披露內容。不應將本文中的任何內容理解為承認本發明無權先於憑藉先前發明的此類公開。另外，所提供的公開日期可以不同於可能需要獨立確認的實際公開日期。定義在下文描述中，利用所述領域中慣常使用的多個術語。為了明確且一貫地了解說明書和權利要求書以及針對此類術語所指定的範圍，提供以下定義。術語pd-1與其配位體pd-l1之間相互作用的「抑制劑」、「阻斷劑」以及「遮蔽劑」是指阻止pd-1與pd-l1結合的分子。出於研發目的，可以在實驗條件下進行結合，例如使用經分離的蛋白質作為結合搭配物、使用蛋白質的一部分作為結合搭配物、使用酵母呈現的蛋白質或蛋白質的一部分作為結合搭配物及其類似物。出於生理學相關目的，pd-1與pd-l1的結合通常是兩個細胞之間的事件，其中每個細胞表達結合搭配物之一。在一些情況下，pd-1表達於免疫細胞(例如t細胞)表面上，且pd-l1表達於可能成為免疫系統摧毀的標靶的細胞(例如腫瘤細胞、具有感染(如慢性感染)的細胞及其類似細胞)上。抑制劑可以使用受體或配位體結合或信號傳導的活體外以及活體內分析加以鑑別。術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換地使用以指胺基酸殘基的聚合物。這些術語適用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基是天然存在的相應胺基酸的人工化學模擬物，且適用於天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。術語「胺基酸」是指天然存在和合成的胺基酸、以及以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來被修飾的那些胺基酸，例如羥基脯氨酸、γ-羧基穀氨酸以及o-磷酸化絲氨酸。胺基酸類似物是指基本化學結構與天然存在的胺基酸相同(即α碳與氫、羧基、氨基以及r基團結合)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲基鋶。此類類似物具有被修飾的r基團(例如正亮氨酸)或被修飾的肽主鏈，但基本化學結構保持與天然存在的胺基酸相同。胺基酸模擬物是指結構與胺基酸的一般化學結構不同、但以與天然存在的胺基酸類似的方式起作用的化合物。術語「接受者」、「個體」、「受檢者」、「宿主」以及「患者」在本文中可互換地使用且是指需要診斷、治療或療法的任何哺乳動物受檢者，特定地說，人類。出於治療目的的「哺乳動物」是指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人類、家養和農耕動物，以及動物園、運動型或玩賞動物，如狗、馬、貓、牛、綿羊、山羊、豬等。在一些實施例中，哺乳動物是人類。術語「癌症」、「腫瘤」和「腫瘤」在本文中可互換地用於指細胞，其展現不受調控的自發生長，以致其展現以細胞增殖控制明顯喪失為特徵的異常生長表型。本申請中供檢測、分析或治療的感興趣細胞包括癌變前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性以及非轉移性細胞。幾乎每種組織的癌症已為人所知。短語「癌症負荷」是指受檢者中的癌細胞數量或癌症體積。減少癌症負荷相應地是指減少受檢者中的癌細胞數目或癌症體積。如本文中所用，術語「癌細胞」是指作為癌細胞或衍生自癌細胞(例如癌細胞純系)的任何細胞。許多類型的癌症已為所屬領域的技術人員所知，包括實體腫瘤，如癌瘤、肉瘤、膠質母細胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、骨髓瘤等；以及循環癌症，如白血病。如本文中所用，「癌症」包括任何癌症形式，包括(但不限於)實體腫瘤癌症(例如肺、前列腺、乳房、膀胱、結腸、卵巢、胰臟、腎臟、肝臟、神經膠母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、平滑肌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、神經內分泌等)以及液體癌症(例如血液癌症)；癌瘤；軟組織腫瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；以及腦癌，包括微小殘留病，且包括原發性和轉移性腫瘤。任何癌症均是適於用本發明方法和組合物治療的癌症。在一些情況下，癌細胞表達pd-l1。在一些情況下，癌細胞不表達pd-l1(例如在此類情況下，所治療的個體的免疫系統細胞表達pd-l1)。癌瘤是源於上皮組織中的惡性病。上皮細胞覆蓋身體的外表面，形成內部空腔的內襯且形成腺組織的內襯。癌瘤實例包括(但不限於)：腺癌(始於腺(分泌性)細胞的癌症)，例如乳房、胰臟、肺、前列腺以及結腸的癌症可以是腺癌；腎上腺皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巢癌；原位癌；導管癌瘤；乳癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多室囊性腎細胞癌；燕麥細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；及其類似癌瘤。癌瘤可以發現於前列腺、胰臟、結腸、腦(通常為繼發性轉移)、肺、乳房、皮膚等。軟組織腫瘤是來源於結締組織的一組高度多樣化罕見腫瘤。軟組織腫瘤實例包括(但不限於)：腺泡狀軟組織肉瘤；血管瘤樣纖維組織細胞瘤；軟骨粘液樣纖維瘤；骨骼軟骨肉瘤；骨外粘液樣軟骨肉瘤；透明細胞肉瘤；促結締組織增生小圓形細胞腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤；子宮內膜間質瘤；尤文氏肉瘤(ewing′ssarcoma)；纖維瘤病(硬纖維瘤)；嬰兒纖維肉瘤；胃腸道間質瘤；骨巨細胞瘤；腱鞘巨細胞瘤；發炎肌纖維母細胞腫瘤；子宮平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂母細胞瘤；典型脂肪瘤；梭形細胞或多形性脂肪瘤；非典型脂肪瘤；軟骨狀脂肪瘤；高分化型脂肪肉瘤；粘液樣/圓形細胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；粘液樣惡性纖維組織細胞瘤；高分級惡性纖維組織細胞瘤；粘液纖維肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤；間皮瘤；神經母細胞瘤；骨軟骨瘤；骨肉瘤；原始神經外胚層瘤；腺泡狀橫紋肌肉瘤；胚胎橫紋肌肉瘤；良性或惡性神經鞘瘤；滑膜肉瘤；伊凡氏腫瘤(evan′stumor)；結節性筋膜炎；硬纖維瘤型纖維瘤病；孤立性纖維性腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤(dfsp)；血管肉瘤；上皮狀血管內皮瘤；腱鞘巨細胞瘤(tgct)；色素沉著絨毛結節性滑膜炎(pvns)；纖維性結構不良；粘液纖維肉瘤；纖維肉瘤；滑膜肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤；神經纖維瘤；以及軟組織多形性腺瘤；以及來源於纖維母細胞、肌纖維母細胞、組織細胞、血管細胞/內皮細胞以及神經鞘細胞的贅瘤。肉瘤是一種罕見的癌症類型，其產生於間葉起源的細胞，例如骨骼或身體軟組織，包括軟骨、脂肪、肌肉、血管、纖維性組織或其它結締組織或支持組織。肉瘤的不同類型是基於癌症形成之處。舉例來說，骨肉瘤形成於骨骼，脂肪肉瘤形成於脂肪，且橫紋肌肉瘤形成於肌肉。肉瘤實例包括(但不限於)：阿斯金氏腫瘤(askin′stumor)；葡萄狀肉瘤；軟骨肉瘤；尤文氏肉瘤(ewing′ssarcoma)；惡性血管內皮瘤；惡性神經鞘瘤；骨肉瘤；以及軟組織肉瘤(例如腺泡狀軟組織肉瘤；血管肉瘤；乳腺葉狀囊肉瘤性皮膚纖維肉瘤(dfsp)；硬纖維腫瘤；促結締組織增生小圓形細胞腫瘤；上皮狀肉瘤；骨外軟骨肉瘤；骨外骨肉瘤；纖維肉瘤；胃腸道間質瘤(gist)；血管外皮瘤；血管內皮瘤(通常被稱為「血管肉瘤」)；卡波西氏肉瘤(kaposi′ssarcoma)；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤(mpnst)；神經纖維肉瘤；滑膜肉瘤；未分化多形性肉瘤及其類似肉瘤。畸胎瘤是一種類型的生殖細胞腫瘤，其可以含有若干不同類型的組織(例如可以包括來源於三種胚層：內胚層、中胚層以及外胚層中的任一種和/或全部的組織)，包括例如毛髮、肌肉以及骨骼。畸胎瘤大部分發生於女性卵巢、男性睪丸以及兒童尾骨中。黑色素瘤是始於黑色素細胞(產生色素黑色素的細胞)的癌症形式。其可以始於胎塊(皮膚黑色素瘤)，而且可以始於其它著色組織，如眼睛中或腸中。白血病是始於血液形成組織(如骨髓)的癌症，且導致大量的異常血細胞產生且進入血流中。舉例來說，白血病可以源於通常在血流中成熟的骨髓源細胞。白血病是根據疾病快速產生和進展的程度(例如急性相對於慢性)且根據所感染的白血球的類型(例如骨髓相對於淋巴)來命名。骨髓白血病也稱為骨髓性或骨髓母細胞性白血病。淋巴白血病也稱為淋巴母細胞性或淋巴細胞性白血病。淋巴白血病細胞可以聚集於淋巴結中，所述淋巴結可以變得腫脹。白血病實例包括(但不限於)：急性骨髓性白血病(aml)、急性淋巴母細胞白血病(all)、慢性骨髓性白血病(cml)以及慢性淋巴細胞性白血病(cll)。淋巴瘤是始於免疫系統細胞的癌症。舉例來說，淋巴瘤可以源於通常在淋巴系統中成熟的骨髓源細胞。淋巴瘤存在兩個基本類別。一種是霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma，hl)，其標誌為存在一種稱為裡德-斯騰伯格細胞(reed-sternbergcell)的細胞類型。當前認可的hl類型存在6種。霍奇金淋巴瘤實例包括：結節性硬化經典霍奇金淋巴瘤(chl)、混合細胞性chl、淋巴細胞耗乏型chl、淋巴細胞富集型chl以及結節性淋巴細胞主導性hl。另一類別的淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(nhl)，其包括一大組多種多樣的免疫系統細胞癌症。非霍奇金淋巴瘤可以進一步分成具有頑固性(緩慢生長)過程的癌症以及具有侵襲性(快速生長)過程的癌症。當前認可的nhl類型存在61種。非霍奇金淋巴瘤的實例包括(但不限於)：aids相關淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴瘤、母細胞性nk細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(burkitt′slymphoma)、伯基特樣淋巴瘤(小非裂解細胞淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚t細胞淋巴瘤、瀰漫性大b細胞淋巴瘤、腸病型t細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、肝脾γ-δt細胞淋巴瘤、t細胞白血病、淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、鼻t細胞淋巴瘤、兒科淋巴瘤、周邊t細胞淋巴瘤、初始中樞神經系統淋巴瘤、轉型淋巴瘤、治療相關t細胞淋巴瘤以及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(waldenstrom′smacroglobulinemia)。腦癌包括腦組織的任何癌症。腦癌的實例包括(但不限於)：神經膠質瘤(例如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡突神經膠質細胞瘤、室管膜瘤及其類似癌症)、腦膜瘤、腦垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤(神經管胚細胞瘤)等。癌症的「病理學」包括有損於患者健康的所有現象。這包括(不限於)異常或不可控制的細胞生長、轉移、幹擾鄰近細胞的正常功能發揮、細胞激素或其它分泌性產物在異常水平下的釋放、發炎或免疫反應的抑制或加重、贅瘤、前癌病變、惡性疾病、對周圍或遠端組織或器官(如淋巴結)的侵入等。如本文中所用，術語「癌症復發」和「腫瘤復發」以及其語法變化形式是指癌症診斷後的贅生性或癌變細胞的進一步生長。特定地說，當癌症組織中發生進一步的癌症細胞生長時，可能存在復發。「腫瘤擴散」類似地在腫瘤細胞散播到局部或遠端組織和器官中時發生；因此，腫瘤擴散涵蓋腫瘤轉移。當腫瘤生長從局部向外擴散而通過擠壓、摧毀或阻止正常器官功能損害所累及組織的功能時，「腫瘤侵入」發生。如本文中所用，術語「轉移」是指癌性腫瘤在與原始癌性腫瘤的器官不直接相連的器官或身體部位中的生長。應了解轉移包括微轉移，其是與原始癌性腫瘤器官直接相連的器官或身體部位中存在數量檢測不到的癌細胞。轉移也可以定義為一種過程中的若干步驟，如癌細胞離開原始腫瘤位點以及癌細胞遷移和/或侵入身體的其它部分中。關於患者的術語「樣品」涵蓋生物來源的血液和其它液體樣品、實體組織樣品(如活檢試樣)或組織培養物或來源於其的細胞以及其後代。定義還包括在採購之後已經以任何方式(如通過用試劑處理、洗滌或針對某些細胞群(如癌細胞)富集)操控的樣品。定義還包括已經針對特定類型的分子(例如核酸、多肽等)富集的樣品。術語「生物樣品」涵蓋臨床樣品，並且還包括通過手術切除獲得的組織、通過活檢獲得的組織、培養中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、組織樣品、器官、骨髓、血液、血漿、血清及其類似樣品。「生物樣品」包括獲自患者癌細胞的樣品，例如包含獲自患者癌細胞的聚核苷酸和/或多肽的樣品(例如包含聚核苷酸和/或多肽的細胞裂解物或其它細胞萃取物)；以及包含患者癌細胞的樣品。包含患者癌細胞的生物樣品也可以包括非癌性細胞。術語「診斷」在本文中用於指鑑別分子或病理狀態、疾病或病狀，如鑑別乳癌、前列腺癌或其它癌症類型的分子亞型。術語「預後」在本文中用於指預測疾病進展的可能性(例如可歸因於癌症的死亡或進展)，包括癌症的復發、轉移性擴散以及抗藥性。術語「預測」在本文中用於指基於觀察結果、經驗或科學推理來預示或估計的行為。在一個實例中，醫師可以預測患者在手術除去原發腫瘤和/或化學治療一定時間段之後存活而無癌症復發的可能性。術語「特異性結合」、「特異性地結合」及其類似術語是指在溶液或反應混合物中，相對於其它分子或部分來說非共價或共價地優先結合到一種分子(例如相對於其它可利用的多肽，抗體特異性結合到一種特定多肽或抗原決定基)。在一些實施例中，一種分子對其特異性地所結合的另一種分子的親和力的特徵是kd(解離常數)為10-5m或更小(例如10-6m或更小、10-7m或更小、10-8m或更小、10-9m或更小、10-10m或更小、10-11m或更小、10-12m或更小、10-13m或更小、10-14m或更小、10-15m或更小，或10-16m或更小)。「親和力」是指結合強度，增強的結合親和力與較低kd相關。如本文中所用，術語「特異性結合成員」是指特異性結合對(即兩個分子，通常為兩個不同分子，其中分子之一(例如第一個特異性結合成員)通過非共價方式特異性結合到另一分子，例如第二特異性結合成員)中的成員。術語「共投藥」、「共投與」以及「組合」包括同時、並行或在非特定的時間範圍內依序投與兩種或超過兩種治療劑。在一個實施例中，所述藥劑同時存在於細胞或受檢者體內或同時發揮其生物學或治療效果。在一個實施例中，治療劑存在於同一組合物或單位劑型中。在其它實施例中，治療劑存在於單獨的組合物或單位劑型中。在某些實施例中，可以在第二治療劑的投與之前(例如之前數分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同時或之後(例如之後5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時、96小時、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)，投與第一藥劑。舉例來說，癌症治療藥物、治療感染的治療藥物或針對腫瘤的抗體與本發明的醫藥組合物「伴隨投與」意味著在使得藥物/抗體與本發明的組合物均具有治療效果的時間，聯合高親和力pd-1模擬多肽投與。此類伴隨投藥可以包括和本發明化合物的投與並行(即在同一時間)、之前或之後投與藥物/抗體。所屬領域的技術人員不難確定特定藥物和本發明組合物的適當投與時機、順序和劑量。在一些實施例中，治療是通過將本發明的高親和力pd-1模擬多肽與另一藥劑(例如免疫刺激劑、慢性感染治療劑、細胞毒性劑等)組合投與來完成。一類示例性細胞毒性劑是化學治療劑。示例性化學治療劑包括(但不限於)阿地介白素(aldesleukin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、天冬醯胺酶、博萊黴素(bleomycin)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、克拉屈濱(cladribine)、西沙必利(cisapride)、順鉑(cisplatin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)(dtic)、放線菌素d(dactinomycin)、多西他賽(docetaxel)、阿黴素(doxorubicin)、屈大麻酚(dronabinol)、多卡米辛(duocarmycin)、依託泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟達拉賓(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、格拉司瓊(granisetron)、羥脲(hydroxyurea)、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、幹擾素α、伊立替康(irinotecan)、蘭索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑(levamisole)、甲醯四氫葉酸、甲地孕酮(megestrol)、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、絲裂黴素(mitomycin)、米託坦(mitotane)、米託蒽醌(mitoxantrone)、奧美拉唑(omeprazole)、昂丹司瓊(ondansetron)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(taxoltm)、匹魯卡品(pilocarpine)、丙氯拉嗪(prochloroperazine)、利妥昔單抗(rituximab)、皂素(saproin)、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉醇(taxol)、拓樸替康鹽酸鹽(topotecanhydrochloride)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)以及長春瑞賓酒石酸鹽(vinorelbinetartrate)。其它組合療法包括聯合細胞特異性抗體(例如對腫瘤細胞標記物具有選擇性的抗體)、輻射、手術和/或激素去除來投藥(科凡(kwon)等人，《美國科學院院刊(proe.natl.acad.sciu.s.a.)》96：15074-9，1999)。還可以將血管生成抑制劑與本發明的方法組合。當前有多種抗體正臨床用於治療癌症，且其它處於臨床研發的不同階段。舉例來說，存在多種抗原以及相應單克隆抗體用於治療b細胞惡性病。一種靶抗原是cd20。利妥昔單抗是針對cd20抗原的嵌合未結合單克隆抗體。cd20在b細胞活化、增殖以及分化方面具有重要的功能角色。指定用於治療慢性淋巴細胞性白血病的單克隆抗體阿侖單抗(alemtuzumab)靶向cd52抗原。多種抗體靶向cd22，且最近已經證明其與毒素組合用於抗化學療法毛細胞白血病的功效。兩種靶向cd20的新單克隆抗體(託西莫單抗(tositumomab)和異貝莫單抗(ibritumomab))已經提交給食品和藥物管理局(foodanddrugadministration，fda)。這些抗體與放射性同位素結合。阿侖單抗(坎帕斯(campath))用於治療慢性淋巴細胞性白血病；吉妥珠單抗(麥羅塔(mylotarg))用於治療急性骨髓性白血病；異貝莫單抗(澤娃靈(zevalin))用於治療非霍奇金淋巴瘤；帕尼單抗(維克替比(vectibix))用於治療結腸癌。適用於本發明方法中的已經用於實體腫瘤的單克隆抗體(包括人源化和嵌合變異體)包括(但不限於)依決洛單抗(edrecolomab)和曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀(herceptin))。依決洛單抗靶向結腸和直腸癌中所見的17-1a抗原，且在歐洲已經核准用於這些適應症。曲妥珠單抗靶向her-2/neu抗原。這種抗原發現於25％到35％的乳癌上。西妥昔單抗(愛必妥(erbitux))也令人關注地用於本發明的方法中。所述抗體結合到egf受體(egfr)，且已經用於治療實體腫瘤，包括結腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌(scchn)。因而，在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽是與特異性地結合除pd-l1之外的抗原(例如cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd123、cd279(pd-1)、egfr、her2、cd117、c-met、pthr2、havcr2(tim3)等)的藥劑(例如抗體)共投與。具有向癌細胞標記物提供特異性結合(並且因此可以用於組合療法(與本發明的高親和力pd-1模擬多肽共投與))的cdr的抗體實例包括(但不限於)：西妥昔單抗(結合egfr)、帕尼單抗(結合egfr)、利妥昔單抗(結合cd20)、曲妥珠單抗(結合her2)、帕妥珠單抗(結合her2)、阿侖單抗(結合cd52)以及貝倫妥單抗(結合cd30)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽與含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞(此類細胞在本文中亦稱為「tcr工程化t細胞」)共投與。tcr工程化t細胞的非限制性適合實例是：(i)含有嵌合抗原受體(car)的t細胞；以及(ii)含有結合到抗原(如癌症抗原)的異源tcr的t細胞。(tcr工程化t細胞更詳細地描述於下文關於引入核酸的章節中)。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以與任何適宜的免疫調節劑(例如抗ctla4抗體、抗pd-1抗體、cd40促效劑、4-1bb調節劑(例如41bb促效劑)及其類似物)共投與。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽與btla和/或cd160的抑制劑共投與。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽與tim3和/或ceacam1的抑制劑共投與。如本文中所用，短語「無疾病存活」是指不存在此類腫瘤復發和/或擴散以及診斷後的就癌症對患者壽命的影響來說的患者結局。短語「總體存活」是指診斷後的患者結局，儘管引起患者死亡的可能性並非直接是由於癌症的影響。片語「無疾病存活可能性」、「復發風險」以及其變化形式是指癌症診斷之後的患者中的腫瘤復發或擴散的概率，其中所述概率是根據本發明的方法測定。如本文中所用，術語「相關」或「相關聯」和類似術語是指兩個事件情形之間的統計關聯，其中事件包括數量、數據集及其類似事件。舉例來說，當事件涉及數量時，正相關(在本文中亦稱為「直接相關」)意味著當一者增加時，另一者也增加。負相關(在本文中也稱為「逆相關」)意味著當一者增加時，另一者減少。「劑量單元」是指實體上不連續的單元，其適合作為單一劑量用於所治療的特定個體。每個單元可以含有經計算以產生所期望治療效果的預定量的活性化合物，以及所需的醫藥載劑。單位劑型的規格可以根據以下決定：(a)活性化合物的獨特特徵和欲達成的特定治療效果，以及(b)所屬領域中混配此類活性化合物的固有局限性。「醫藥學上可接受的賦形劑」意指適用於製備通常安全無毒且所期望的醫藥組合物的賦形劑，且包括對於獸用以及對於人類藥用來說可接受的賦形劑。此類賦形劑可以是固體、液體、半固體，或在氣溶膠組合物的情況下可以是氣態。術語「醫藥學上可接受」、「生理學上可耐受」以及其語法變化形式在其指組合物、載劑、稀釋劑以及試劑時可互換使用，並且表示所述物質能夠投與人類而不產生會引起組合物投與受禁的程度的非期望生理學影響。「治療有效量」意味著投與受檢者治療疾病時足以對那種疾病實現治療的量。如本文中所用，術語「靶細胞」是指投與本發明的高親和力pd-1模擬多肽後，免疫系統的摧毀作用所靶向的細胞。在一些情況下，靶細胞表達pd-l蛋白質(例如pd-l1和/或pd-l2)。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以藉助於結合到靶細胞表面上所表達的pd-l蛋白質來結合到靶細胞。因此，術語「靶細胞」可以指pd-l1表達細胞，因為本發明的高親和力pd-1模擬多肽是通過抑制pd-l1表達細胞與pd-1表達細胞之間的相互作用來促進pd-1表達細胞中的pd-1信號傳導減少。然而，靶細胞不一定表達pd-l1。在一些情況下，靶細胞(例如被感染的細胞、癌細胞等)不表達pd-l1。在一些此類情況下，投與本發明的高親和力pd-1模擬多肽能夠刺激免疫系統，藉此摧毀靶細胞。在一些情況下，靶細胞是「罹病」細胞(例如來自「罹病」個體的細胞)，其中術語「罹病」在本文中用於指患有可以用本發明高親和力pd-1模擬多肽治療的症狀、病痛或疾病的受檢者。「罹病」個體可以患有癌症，可以患有感染(例如慢性感染)，可以患有免疫病症(例如與免疫抑制相關的病症)，可以患有發炎病症，且/或可以患有其它超增生病狀，例如硬化症、纖維化及其類似病狀。「罹病細胞」可以是引起症狀、病痛或疾病的那些細胞。作為非限制性實例，罹病患者的罹病細胞可以是pd-l1表達癌細胞、被感染的細胞、發炎細胞及其類似細胞。在一些情況下，病痛或疾病可以用本發明的高親和力pd-1模擬多肽治療的一種指示是所累及的細胞(即，罹病細胞，例如癌細胞、感染的細胞、發炎細胞、免疫細胞等)表達pd-l1。在一些情況下，罹病細胞(例如癌細胞)不表達pd-l1，但所述疾病(例如癌症)又可以使用本發明的高親和力pd-1模擬多肽治療。術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」、「治療(treat)」及其類似術語在本文中通常用於指獲得期望的藥理學和/或生理學效果。效果就完全或部分地預防疾病或其症狀來說可以是預防的且/或就部分或完全穩定化來說可以是治療的或就疾病和/或可歸因於所述疾病的不良影響來說可以是治癒的。術語「治療」涵蓋哺乳動物(特定地說，人類)疾病的任何治療，且包括：(a)預防可能易患疾病或症狀、但尚未診斷出患有所述疾病或症狀的受檢者發生疾病和/或症狀；(b)抑制疾病和/或症狀，即，阻滯其發展；或(c)緩解疾病症狀，即，促使疾病和/或症狀消退。需要治療者包括已罹病者(例如癌症患者、感染患者、免疫病症患者等)以及期望預防者(例如更易患癌症者、感染可能性增加的患者、疑似癌症患者、疑似感染患者等)。治療性治療是其中受檢者在投藥之前罹病的治療且預防性治療是其中受檢者在投藥之前未罹病的治療。在一些實施例中，受檢者罹病的可能性增加或在治療之前疑似罹病。在一些實施例中，懷疑受檢者罹病的可能性增加。詞語「標記」在本文中使用時是指與本發明pd-1模擬多肽直接或間接結合的可檢測化合物或組合物。標記本身可以是可檢測的(例如放射性同位素標記或螢光標記)，或者在酶標記情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物發生化學變化。「固相」意指本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以粘附的非水性基質。本文中所涵蓋的固相實例包括部分地或完全地由玻璃(例如受控微孔玻璃)、多醣(例如瓊脂糖)、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇以及矽酮形成的固相。在某些實施例中，視背景而定，固相可以包含分析板中的孔；在其它實施例中，固相是提純柱(例如親和性色譜柱)。這個術語還包括不連續的離散顆粒固相。術語「抗體」是在最廣泛的意義上使用且具體地說，涵蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，以及抗體片段(只要其展現期望的生物活性)。「抗體(abs)」以及「免疫球蛋白」(ig)是具有相同結構特徵的醣蛋白。雖然抗體對特定抗原展現結合特異性，但免疫球蛋白包括缺乏抗原特異性的抗體與其它抗體樣分子。後一種多肽例如是由淋巴系統在低水平上產生且由骨髓瘤在提高的水平上產生。如本文中所用，「抗體片段」以及其所有語法變化形式定義為完整抗體的一部分，所述部分包含完整抗體的抗原結合位點或可變區，其中所述部分不含完整抗體fc區的重鏈恆定域(即ch2、ch3以及ch4，此視抗體同型而定)。抗體片段實例包括fab、fab′、fab′-sh、f(ab′)2以及fv片段；雙功能抗體；任何抗體片段，其為初始結構由一個不間雜的鄰接胺基酸殘基序列組成的多肽(在本文中稱為「單鏈抗體片段」或「單鏈多肽」)，包括(但不限於)(1)單鏈fv(scfv)分子，(2)含有僅一個輕鏈可變域的單鏈多肽或其含有輕鏈可變域的三個cdr的片段而無相關重鏈部分，(3)含有僅一個重鏈可變區的單鏈多肽或其含有重鏈可變區的三個cdr的片段而無相關輕鏈部分，以及(4)包含來自非人類物種的單一ig域或其它特定單域結合模塊的納米抗體；以及由抗體片段形成的多特異性或多價結構。在包含一或多個重鏈的抗體片段中，所述重鏈可以含有完整抗體的非fc區中所發現的任何恆定域序列(例如igg同型中的ch1)，且/或可以含有完整抗體中所發現的任何鉸鏈區序列，且/或可以含有與重鏈的鉸鏈區序列或恆定域序列融合或定位於重鏈的鉸鏈區序列或恆定域序列中的亮氨酸拉鏈序列。「原生抗體和免疫球蛋白」通常是約150,000道爾頓(dalton)的雜四聚體醣蛋白，其由兩條相同的輕(l)鏈和兩條相同的重(h)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接到一條重鏈，而在不同免疫球蛋白同型的重鏈之間二硫鍵的數目不同。每條重鏈和輕鏈還具有規則間隔的鏈內二硫橋。每條重鏈在一個末端具有可變域(vh)，繼之為多個恆定域。每條輕鏈在一個末端具有可變域(vl)且在其另一末端具有恆定域；輕鏈的恆定域與重鏈的第一恆定域對齊，且輕鏈可變域與重鏈可變域對齊。人們認為是特定胺基酸殘基形成了輕鏈與重鏈可變域之間的界面(科西亞(clothia)等人，《分子生物學雜誌(j.mol.biol.)》186：651(1985)；諾瓦特尼(novotny)和哈伯(haber)，《美國國家科學院院刊》82：4592(1985))。術語「可變」是指如下事實：可變域中的某些部分在序列上、在抗體之間廣泛不同且用於每種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性在整個抗體可變域中的分布並非均勻的。其集中於三個稱為互補決定區(cdr)或高變區的區段，所述三個區段均存在於輕鏈與重鏈可變域中。可變域的更高度保守部分稱為構架(fr)。原生重鏈和輕鏈的可變域各包含四個基本上採用b薄片構型的fr區，所述fr區通過三個cdr連接，從而形成環，所述環連接b薄片結構且在一些情況下形成b薄片結構的一部分。每條鏈中的cdr通過fr區緊鄰在一起且與來自另一鏈的cdr促成抗體中的抗原結合位點的形成(參見卡巴特(kabat)等人，《免疫學感興趣的蛋白質序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》第五版，美國國立衛生研究院(nationalinstituteofhealth)，馬裡蘭州貝塞斯達(bethesda，md.)(1991))。恆定域不直接涉及抗體結合到抗原，但展現各種效應子功能，如抗體參與抗體依賴性細胞毒性。抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「fab」片段，其各具有單一抗原結合位點；以及殘餘「fc」片段，其名稱反映了其容易結晶的能力。胃蛋白酶處理產生了f(ab′)2片段，所述f(ab′)2片段具有兩個抗原結合位點且仍然能夠與抗原發生交聯。「fv」是含有完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段.在雙鏈fv物質中，這種區域是由一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域經由非共價緊密結合而成的二聚體組成。在單鏈fv物質(scfv)中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可以通過柔性肽連接子共價連接，使得輕鏈和重鏈可以類似於雙鏈fv物質的「二聚」結構結合。在這種構型中，每個可變域的三個cdr發生相互作用以界定vh-vl二聚體表面上的抗原結合位點。總之，六個cdr將抗原結合特異性賦予抗體。然而，即使單個可變域(或包含僅三個對抗原具有特異性的cdr的fv的一半)也具有識別和結合抗原的能力，雖然親和力低於完整結合位點。關於sfv的評述，參見普魯克通(pluckthun)，《單克隆抗體的藥理學(thepharmacologyofmonoclonalantibodies)》，第113卷，羅森堡(rosenburg)和穆爾(moore)編，施普林格出版社(springer-verlag)，紐約(newyork)，第269-315頁(1994)。fab片段也含有輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域(chl)。fab′片段與fab片段不同之處在於，重鏈chl域的羧基末端增添了幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區的半胱氨酸。fab′-sh是本文中關於fab′的名稱，其中恆定域的半胱氨酸殘基具有游離硫醇基。f(ab′)2抗體片段最初是作為其間具有鉸鏈半胱氨酸的fab′片段對產生。抗體片段的其它化學偶聯也已為人所知。免疫球蛋白存在五種主要類別：iga、igd、ige、igg及igm，且其中若干類可以進一步分成亞類(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為a、d、e、g以及m。不同類別的免疫球蛋白的亞單元結構和三維構型已眾所周知。這個術語還涵蓋免疫球蛋白亞類的工程化變異體，包括增加或降低免疫效應功能、半衰期或血清穩定性的那些變異體。除非有相反的具體說明，否則如本文中所述以及所要求的術語「結合物」定義為通過一或多個抗體片段共價連接到一或多個聚合物分子而形成的異質分子，其中所述異質分子具有水溶性，即可溶於生理體液(如血液)中，且其中所述異質分子不含任何結構化聚集物。所關注的結合物是peg。在前述定義的背景下，術語「結構化聚集物」是指(1)存在於水溶液中的任何分子聚集物，其具有球形或球形外殼結構，使得異質分子不存在於膠束或其它乳化結構中，且不錨定於脂質雙層、微脂粒或脂質體；以及(2)呈固體或不溶解形式的任何分子聚集物，如色譜珠粒基質，其與水相接觸後，不會將異質分子釋放到溶液中。相應地，如本文所定義，術語「結合物」涵蓋存在於沉澱物、沉降物、生物溶蝕性基質或其它固體中的前述異質分子，其在固體發生水合作用後，能夠將異質分子釋放到水溶液中。如在本發明中所使用，術語「抗原決定基」意指抗體互補位所結合的抗原上的任何抗原決定子。表位決定子通常由根據表面化學活性分類的分子(例如胺基酸或糖側鏈)組成，並且通常具有特定的三維結構特徵，以及特定的電荷特徵。組合物提供了高親和力pd-1模擬多肽和其類似物，其一般可以稱為高親和力pd-1試劑。高親和力pd-1模擬多肽是野生型人類pd-1蛋白質的變異體。在一些實施例中，本發明提供高親和力pd-1模擬多肽，其中多肽缺乏pd-1跨膜域(且可以是可溶性高親和力pd-1模擬多肽)且包括至少一個相對於野生型pd-1序列來說的胺基酸變化，且其中所述胺基酸變化增強了pd-1模擬多肽結合到pd-l1的親和力(例如使解離速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更大)。應了解，當本發明的高親和力pd-1模擬多肽缺乏pd-1跨膜域時，又可以存在來自跨膜域(例如pd-1跨膜域)的一些胺基酸(例如可以保留跨膜域的一些胺基酸，只要蛋白質保留所期望的功能)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽具有可溶性。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽缺乏pd-1跨膜域，但包括異源跨膜域(即，跨膜域形成除pd-1之外的蛋白質)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括跨膜域(例如異源跨膜域、pd-1跨膜域等)，且包括位於胞外域部分與跨膜域之間的可裂解連接子。多肽如本文中所用，「pd-1模擬多肽」是指具有pd-1蛋白質的一部分的多肽，所述部分足以按可識別的親和力結合pd-l(例如pd-l1和/或pd-l2)，但缺乏跨膜域(例如缺乏野生型pd-1蛋白質的天然存在的跨膜域)。因此，不同於天然存在的pd-1多肽，本發明的pd-1模擬多肽不會藉助於跨膜域永久性地系留於細胞膜上。在一些實施例中，本發明的pd-1模擬多肽具有可溶性。正常情況下系留於細胞的質膜上的蛋白質胞外域在所屬領域中有時稱為胞外域。因此，pd-1模擬多肽可以認為是(或來源於)pd-1胞外域，且可以認為包括pd-1多肽胞外域的至少一部分(或來源於其的一部分)。野生型pd-1蛋白質具有跨膜域，表達於細胞表面上，且特異性地結合到其pd-l配位體(pd-l1和pd-l2)，所述配位體也表達於細胞表面上。因此，表達於第一細胞表面上的野生型pd-1特異性結合到表達於第二細胞表面上的pd-l1和/或pd-l2。pd-1模擬多肽對應的pd-1蛋白質(例如pd-1模擬多肽所來源的pd-1蛋白質)可以是任何pd-1蛋白質(例如野生型pd-1蛋白質)。實例pd-1蛋白質包括來自任何物種的pd-1蛋白質，例如哺乳動物pd-1蛋白質、齧齒動物pd-1蛋白質、靈長類動物pd-1蛋白質、大鼠pd-1蛋白質、小鼠pd-1蛋白質、豬pd-1蛋白質、牛pd-1蛋白質、綿羊pd-1蛋白質、兔pd-1蛋白質、狗pd-1蛋白質、人類pd-1蛋白質等。所屬領域的技術人員可容易發現且容易獲得針對各種野生型pd-1多肽序列(例如犬科動物、牛科動物、綿羊、馬科動物、豬科動物、齧齒動物、小鼠、大鼠、貓科動物、靈長類動物、猴、猿、黑猩猩及其類似物)的序列。舉例來說，人類pd-1蛋白質(如seqidno：1所述)是：野生型人類pd-1(亦稱為「程序性細胞死亡1」、pdcd1、cd279、pd1、sleb2、hpd-1、hpd-1以及hsle1)粗體：跨膜域-胺基酸168-191加下劃線：示例性原生pd-1模擬多肽-胺基酸26-147pd-l蛋白質是針對pd-1的膜結合配位體。存在兩種人類pd-l蛋白質，在所屬領域中稱為pd-l1和pd-l2。實例pd-l蛋白質包括來自任何物種的pd-l蛋白質，例如哺乳動物pd-l蛋白質、齧齒動物pd-l蛋白質、靈長類動物pd-l蛋白質、大鼠pd-l蛋白質、小鼠pd-l蛋白質、豬pd-l蛋白質、牛pd-l蛋白質、綿羊pd-l蛋白質、兔pd-l蛋白質、狗pd-l蛋白質、人類pd-l蛋白質等。所屬領域的技術人員可容易發現且容易獲得針對各種野生型pd-l多肽序列(例如犬科動物、牛科動物、綿羊、馬科動物、豬科動物、齧齒動物、小鼠、大鼠、貓科動物、靈長類動物、猴、猿、黑猩猩及其類似物)的序列。舉例來說，人類pd-l1以及pd-l2蛋白質(如seqidno：36-38分別所述)是：野生型人類pd-l1(亦稱為「程序性細胞死亡1配位體1」、pdcd1lg1、cd274、b7-h、b7h1、pdl1、pd-l1、pdcd1l1)(同功異型物a)(同功異型物b)野生型人類pd-l2(亦稱為「程序性細胞死亡1配位體2」、pdcd1lg2、cd273、b7dc、btdc、pdl2、pdcd1l2、ba574f11.2)野生型pd-1的跨膜域可容易鑑別。作為說明性實例，對seqidno：1中所述的野生型人類pd-1蛋白質進行三種不同的域預測程序，且為了定義跨膜域，測定以下重疊胺基酸區域：168-191、167-189以及169-191。因此，跨膜域存在於seqidno：1所述的野生型人類pd-1蛋白質的胺基酸167-191(例如168-191、167-189和/或169-191)。因此，在一些情況下，pd-1模擬多肽缺乏seqidno：1所述的野生型人類pd-1蛋白質的胺基酸167-191、168-191、167-189和/或169-191，或另一種野生型pd-1蛋白質的相應區域。所屬領域的技術人員可容易發現且容易獲得針對各種額外野生型pd-1多肽序列(例如犬科動物、牛科動物、綿羊、馬科動物、豬科動物、齧齒動物、小鼠、大鼠、貓科動物、靈長類動物、猴、猿、黑猩猩及其類似物)的序列。適合的pd-1模擬多肽特異性結合到pd-l(例如靶細胞(例如癌細胞)上的pd-l1和/或pd-l2)且藉此減少(例如阻斷、阻止等)pd-l與pd-1(例如免疫細胞(例如t細胞)上的pd-1)之間的相互作用。因此，本發明的pd-1模擬多肽可以認為是pd-l(例如pd-l1和/或pd-l2)的工程化誘餌受體。通過減少pd-l與pd-1之間的相互作用，本發明的pd-1模擬多肽可以減少pd-l/pd-1相互作用所產生的免疫抑制信號，並且因此可以增強免疫反應(例如通過增強t細胞活化)。適合的pd-1模擬多肽包含pd-1的一部分，其足以按可識別的親和力(例如高親和力)結合pd-l1，其在正常情況下位於信號序列與跨膜域之間；或其保持結合活性的片段。因此，本發明的pd-1模擬多肽可以包含免疫球蛋白域，或其足以利用可識別親和力結合pd-l1的一部分(如下文所述)。本發明的pd-1模擬多肽(例如高親和力pd-1模擬多肽)可以包含除免疫球蛋白域之外的野生型pd-1蛋白質的一部分，包括例如seqidno：2以及27-34中所述的任何序列的鄰接胺基酸(或任何其它pd-1蛋白質(例如任何其它哺乳動物pd-1蛋白質)的相應序列)。在一些情況下，足以結合pd-l1和/或pd-l2的pd-1的一部分包括野生型pd-1多肽的免疫球蛋白域的全部或一部分，其容易由所屬領域的技術人員鑑別。舉例來說，seqidno：1所述的野生型人類pd-1序列的掃描揭示了胺基酸35-146的區域含有免疫球蛋白域(表1)。pd-1模擬多肽(例如高親和力pd-1模擬多肽)可以包括pd-1免疫球蛋白域的全部或一部分；且可以進一步包含位於免疫球蛋白域外部的來自pd-1的一或多個胺基酸；且可以包含除pd-1之外的胺基酸序列，包括(不限於)免疫球蛋白fc區序列。表1根據各種序列分析軟體鑑別出的野生型人類pd-1的免疫球蛋白域胺基酸結構域資料庫35-145免疫球蛋白樣域prosite38-128免疫球蛋白v集合域pfam39-145免疫球蛋白亞型smart39-146免疫球蛋白樣摺疊gene3d49-125v型免疫球蛋白(igv)；免疫球蛋白v集合，亞群smart42-136igv；免疫球蛋白可變域(igv)ncbi39-125ig_樣；免疫球蛋白樣ncbi在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與野生型pd-1多肽(例如野生型pd-1多肽的相應區域)(例如哺乳動物野生型pd-1多肽；seqidno：1中所述的人類野生型pd-1蛋白質，及其類似物)具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與野生型pd-1多肽的免疫球蛋白域(例如免疫球蛋白v-set域或免疫球蛋白v型域(igv域)；免疫球蛋白樣摺疊；免疫球蛋白可變域；免疫球蛋白樣域，及其類似物)具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。所屬領域的技術人員可容易發現且容易獲得針對各種額外野生型pd-1多肽序列(例如犬科動物、牛科動物、綿羊、馬科動物、豬科動物、齧齒動物、小鼠、大鼠、貓科動物、靈長類動物、猴、猿、黑猩猩及其類似物)的序列。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與seqidno：1中所述的人類pd-1胺基酸序列的含有免疫球蛋白域的區域或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與seqidno：1中所述的野生型人類pd-1多肽胺基酸序列的胺基酸35-145(seqidno：27)、38-128(seqidno：28)、39-145(seqidno：29)、39-146(seqidno：30)、49-125(seqidno：31)、42-136(seqidno：32)、39-125(seqidno：33)、35-146(seqidno：34)、1-166(seqidno：35)和/或26-147(seqidno：2)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括seqidno：1中所述的野生型人類pd-1蛋白質序列(胺基酸序列)的胺基酸35-145、38-128、39-145、39-146、49-125、42-136、39-125、35-146、1-166和/或26-147(seqidno：2)；或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與seqidno：2中所述的原生pd-1模擬多肽胺基酸序列(即，seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。seqidno：2中所述的多肽是野生型人類pd-1蛋白質(seqidno：1)的蛋白質片段(胺基酸26-147)。seqidno：2中所述的胺基酸序列包括野生型人類pd-1多肽的免疫球蛋白域。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括seqidno：2中所述的胺基酸序列(即，seqidno：1中所述的人類pd-1蛋白質序列的胺基酸26-147)(即，在一些情況下，pd-1模擬多肽包括seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段)；或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括與seqidno：2-25中的任一個所述的胺基酸序列具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列(例如與seqidno：3-25、seqidno：2-23、seqidno：3-23、seqidno：24-25等中的任一個具有85％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)。在一些情況下，pd-1模擬多肽包括seqidno：2-25(例如seqidno：3-25、seqidno：2-23、seqidno：3-23、seqidno：24-25等)中的任一個所述的胺基酸序列。相對於野生型pd-1蛋白質的相應區域不具有突變的pd-1模擬多肽(即，其中pd-1模擬多肽是野生型蛋白質的片段)在本文中稱為「原生pd-1模擬多肽」。原生pd-1模擬多肽可以在各種情形下用作對照，例如在確定pd-1模擬多肽是否為「高親和力pd-1模擬多肽」的一些情況下。高親和力pd-1模擬多肽。「高親和力pd-1模擬多肽」是相對於野生型pd-1蛋白質來說(例如相對於野生型pd-1蛋白質的相應區域、相對於野生型pd-1蛋白質的胞外域、相對於野生型pd-1蛋白質的免疫球蛋白域、相對於原生pd-1模擬多肽等)具有胺基酸突變(即，胺基酸變化)的pd-1模擬多肽(如上文所定義，且因此缺乏野生型pd-1蛋白質的跨膜域)，其中所述胺基酸突變增強了pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力，使得高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力大於野生型pd-1蛋白質(和/或相應原生pd-1模擬多肽)對pd-l1的親和力。舉例來說，胺基酸突變可以通過使解離速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更大來增強親和力。根據本發明，胺基酸突變(即，變化)包括所述領域中已知或後來發現的任何天然存在的或人為胺基酸修飾。在一些實施例中，胺基酸變化包括例如一或多個胺基酸的取代、缺失、添加、插入等。在一些實施例中，胺基酸變化包括用另一胺基酸置換現存胺基酸。在相關實施例中，胺基酸變化包括用非天然胺基酸置換一或多個現存胺基酸，或插入一或多個非天然胺基酸。相對於野生型序列，可以在1或更多個(例如2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個、20或更多個等)胺基酸殘基中產生胺基酸變化。一或多個胺基酸變化可以向高親和力pd-1模擬多肽賦予各種特性，例如影響穩定性、結合活性和/或特異性等。在一些情況下，相對於野生型pd-1多肽(例如相對於野生型pd-1多肽的相應區域)(例如哺乳動物野生型pd-1多肽；seqidno：1中所述的人類野生型pd-1蛋白質，及其類似物)，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)。在一些情況下，相對於野生型pd-1多肽的免疫球蛋白域(例如seqidno：1中所述的野生型人類pd-1多肽胺基酸序列的胺基酸35-145、38-128、39-145、39-146、49-125、42-136、39-125、35-146、1-166和/或26-147(seqidno：2)；或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域)，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)。在一些情況下，相對於野生型pd-1多肽的胞外域，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的胺基酸序列(其是人類「原生pd-1模擬多肽」，如上文所定義)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)。在一些情況下，相對於seqidno：2-25中的任一者所述的胺基酸序列(例如相對於seqidno：3-25、seqidno：2-23、seqidno：3-23、seqidno：24-25等中的任一者)，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)。在一些情況下，相對於野生型pd-1多肽(例如野生型pd-1多肽的相應區域)(例如哺乳動物野生型pd-1多肽；seqidno：1中所述的人類野生型pd-1蛋白質，及其類似物)來說，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)，且包括與野生型pd-1多肽(例如野生型pd-1多肽的相應區域)(例如哺乳動物野生型pd-1多肽；seqidno：1中所述的人類野生型pd-1蛋白質，及其類似物)具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，相對於野生型pd-1多肽的免疫球蛋白域或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域來說，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)，且包括與野生型pd-1多肽的免疫球蛋白域(例如seqidno：1所述的野生型人類pd-1多肽胺基酸序列中的胺基酸35-145、38-128、39-145、39-146、49-125、42-136、39-125或35-146)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，相對於seqidno：1所述的野生型人類pd-1多肽胺基酸序列中的胺基酸35-145、38-128、39-145、39-146、49-125、42-136、39-125、35-146、1-166和/或26-147(seqidno：2)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)；且包括與seqidno：1所述的野生型人類pd-1多肽胺基酸序列中的胺基酸35-145、38-128、39-145、39-146、49-125、42-136、39-125、35-146、1-166和/或26-147(seqidno：2)或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的胺基酸序列或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)；且包括與seqidno：2中所述的胺基酸序列或另一種野生型pd-1蛋白質(例如另一種哺乳動物野生型pd-1蛋白質)的相應區域具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列。在一些情況下，相對於seqidno：2-25中的任一個所述的胺基酸序列(例如相對於seqidno：3-25、seqidno：2-23、seqidno：3-23、seqidno：24-25等中的任一個)，高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化(例如1或更多個、2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、19或更多個，或20個胺基酸變化)；且包括與seqidno：2-25中的任一個所述的胺基酸序列具有85％或更大序列一致性(例如90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)的胺基酸序列(例如與seqidno：3-25、seqidno：2-23、seqidno：3-23、seqidno：24-25等中的任一個具有85％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.2％或更大、99.5％或更大、99.8％或更大、99.9％或更大，或100％序列一致性)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括一或多個(例如2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、14或更多個、15個或更多個)位於接觸pd-l1的pd-1胺基酸位置的胺基酸變化。舉例來說，在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，一或多個(例如2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、14或更多個、15個或更多個)胺基酸變化位於選自以下的胺基酸位置：v39、n41、y43、m45、s48、n49、q50、t51、d52、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、p105、k106以及a107；或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置。舉例來說，參考圖3。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括一或多個(例如2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、14或更多個、15個或更多個)胺基酸變化，所述胺基酸變化位於選自以下的胺基酸位置：v39、l40、n41、y43、r44、m45、s48、n49、q50、t51、d52、k53、a56、q63、g65、q66、v72、h82、m83、r90、y96、l97、a100、s102、l103、a104、p105、k106以及a107；或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置。舉例來說，參考圖3。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括胺基酸變化，所述胺基酸變化位於選自以下的胺基酸位置：(a)v39、n41、y43、m45、s48、n49、q50、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、k106以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(b)v39、n41、y43、m45、s48、q50、t51、d52f、k53、a56、q63、g65、q66、l97、s102、l103、a104、k106以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(c)v39、l40、n41、y43、r44、m45、n49、k53、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(d)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、q66p、m83、l97以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(e)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、q66p、h82、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(f)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、m83、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；(g)v39、l40、n41、y43、r44、m45、n49、k53、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置；以及(h)v39、l40、n41、y43、m45、n49、k53、l97、a100以及a107，或相對於另一種野生型pd-1蛋白質的相應胺基酸位置。舉例來說，參考圖3。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括一或多個(例如2或更多個、3或更多個、4或更多個、5或更多個、6或更多個、7或更多個、8或更多個、9或更多個、10或更多個、11或更多個、12或更多個、13或更多個、14或更多個、15或更多個、16或更多個、17或更多個、18或更多個、14或更多個、15個或更多個)胺基酸變化，所述胺基酸變化選自：(1)v39h或v39r；(2)l40v或l40i；(3)n41i或n41v；(4)y43f或y43h；(5)r44y或r44l；(6)m45q、m45e、m45l或m45d；(7)s48d、s48l、s48n、s48g或s48v；(8)n49c、n49g、n49y或n49s；(9)q50k、q50e或q50h；(10)t51v、t51l或t51a；(11)d52f、d52r、d52y或d52v；(12)k53t或k53l；(13)a56s或a56l；(14)q63t、q63i、q63e、q63l或q63p；(15)g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v；(16)q66p；(17)v72i；(18)h82q；(19)m83l或m83f；(20)r90k；(21)y96f；(22)l97y、l97v或l97i；(23)a100i或a100v；(24)s102t或s102a；(25)l103i、l103y或l103f；(26)a104s、a104h或a104d；(27)p105a；(28)k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t；以及(29)a107p、a107i或a107v；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。舉例來說，參考圖3。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括選自以下的胺基酸變化：(a){v39h或v39r}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{s48d、s48l、s48n、s48g或s48v}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{q50k、q50e或q50h}、{k53t或k53l}、{a56s或a56l}、{q63t、q63i、q63e、q63l或q63p}、{g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v}、{q66p}、{l97y、l97v或l97i}、{s102t或s102a}、{l103i、l103y或l103f}、{a104s、a104h或a104d}、{k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t}，以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(b){v39h或v39r}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{s48d、s48l、s48n、s48g或s48v}、{q50k、q50e或q50h}、{t51v、t51l或t51a}、{d52f、d52r、d52y或d52v}、{k53t或k53l}、{a56s或a56l}、{q63t、q63i、q63e、q63l或q63p}、{g65n、g65r、g65i、g65l、g65f或g65v}、{q66p}、{l97y、l97v或l97i}、{s102t或s102a}、{l103i、l103y或l103f}、{a104s、a104h或a104d}、{k106g、k106e、k106i、k106v、k106r或k106t}，以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(c){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{r44y或r44l}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(d){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{q66p}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(e){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{q66p}、{h82q}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(f){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{m83l或m83f}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(g){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{r44y或r44l}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；以及(h){v39h或v39r}、{l40v或l40i}、{n41i或n41v}、{y43f或y43h}、{m45q、m45e、m45l或m45d}、{n49c、n49g、n49y或n49s}、{k53t或k53l}、{l97y、l97v或l97i}、{a100i或a100v}以及{a107p、a107i或a107v}；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。舉例來說，參考圖3。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的(人類野生型pd-1)蛋白質片段(其是人類野生型pd-1蛋白質的蛋白質片段)，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括選自以下的胺基酸變化：(a)v39r、n41v、y43h、m45e、s48g、n49y、q50e、k53t、a56s、q63t、g65l、q66p、l97v、s102a、l103f、a104h、k106v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(b)v39r、n41v、y43h、m45e、s48n、q50h、t51a、d52y、k53t、a56l、q63l、g65f、q66p、l97i、s102t、l103f、a104d、k106r以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(c)v39h、l40v、n41v、y43h、r44y、m45e、n49g、k53t、m83l、l97v、a100i以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(d)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49g、k53t、q66p、m83l、l97v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(e)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49s、k53t、q66p、h82q、m83l、l97v、a100v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(f)v39h、l40i、n41i、y43h、m45e、n49g、k53t、m83l、l97v、a100v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(g)v39h、l40v、n41i、y43h、r44l、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；(h)v39h、l40v、n41i、y43h、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化；以及(i)v39h、l40v、n41v、y43h、m45e、n49g、k53t、l97v、a100v以及a107i；或使得相應位置的胺基酸相對於另一種野生型pd-1蛋白質來說相同的變化。舉例來說，參考圖3。親和力相較於野生型pd-1蛋白質對pd-l1的親和力，且/或相較於pd-1模擬多肽(相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說，其不具有胺基酸變化)(例如原生pd-1模擬多肽，如上文所定義)對pd-l1的親和力，本發明的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1具有增強的親和力。在一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的kd為1×10-7m或更小(例如10-8m或更小、10-9m或更小、10-10m或更小、10-11m或更小、10-12m或更小、10-13m或更小、10-14m或更小、10-15m或更小，或10-16m或更小)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力在1fm到1μm範圍內(例如1fm到800nm、10fm到500nm、100fm到100nm、500fm到50nm、800fm到50nm、1pm到50nm、10pm到50nm、50pm到50nm、100pm到50nm、500fm到100nm、800fm到100nm、1pm到100nm、10pm到100nm、50pm到100nm，或100pm到100nm)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽結合到pd-l1的親和力為1μm或更大(例如800nm或更大、500nm或更大、200nm或更大、100nm或更大、50nm或更大、10nm或更大、1nm或更大、900pm或更大、750pm或更大、500pm或更大、200pm或更大、100pm或更大、10pm或更大、1pm或更大等)(其中親和力隨著數值降低而增強)。在一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力為野生型pd-1蛋白質對pd-l1的親和力的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)；且/或為pd-1模擬多肽(相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說，其不具有胺基酸變化)(例如原生pd-1模擬多肽，如上文所定義)對pd-l1的親和力的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)。在一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽針對pd-l1的解離半衰期為野生型pd-1蛋白質針對pd-l1的解離半衰期的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)；且/或為pd-1模擬多肽(相對於野生型pd-1多肽的相應序列來說，其不具有胺基酸變化)(例如原生模擬多肽，如上文所定義)針對pd-l1的解離半衰期的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)。舉例來說，在一些情況下，原生pd-1模擬多肽(如上文所定義)針對pd-l1的解離半衰期小於1秒，而本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以具有5秒或更長(例如30秒或更長、1分鐘或更長、5分鐘或更長、10分鐘或更長、20分鐘或更長、30分鐘或更長、40分鐘或更長等)的解離半衰期。舉例來說，本發明高親和力pd-1模擬多肽的胺基酸突變可以通過使解離速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更大來增強親和力。在一些情況下，相較於相應pd-1模擬多肽(相對於野生型pd-1多肽來說，其不具有胺基酸變化)對pd-l2的親和力，本發明的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力降低(例如相較於如上文所定義的相應原生pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力，對pd-l2的親和力降低)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力大於對pd-l2的親和力。舉例來說，在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽特異性結合到pd-l1，而非pd-l2。在一些情況下，表徵本發明高親和力pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力的kd(解離常數)是表徵高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力的kd的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)。換句話說，在一些情況下，本發明高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力可以是本發明高親和力pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力的2倍或更大(例如5倍或更大、10倍或更大、100倍或更大、500倍或更大、1000倍或更大、5000倍或更大、104倍或更大、105倍或更大、106倍或更大、107倍或更大、108倍或更大等)。結合到pd-l1和/或pd-l2的親和力可以例如根據高親和力pd-1模擬多肽在溶液中結合到分析板上所塗、呈現於微生物細胞表面上的pd-l1和/或pd-l2的能力等來測定。本發明的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1和/或pd-l2的結合活性可以通過使配位體(例如pd-l1和/或pd-l2)或高親和力pd-1模擬多肽固定於珠粒、底物、細胞等來分析。藥劑可以在適當緩衝液中添加且結合搭配物在指定溫度下培育一段時間。洗滌以除去未結合的材料後，可以使用例如sds釋放所結合的蛋白質，在高ph及其類似條件下緩衝且分析。舉例來說，參見圖4，其描繪了表面等離子體共振(spr)圖(即，測試高親和力pd-1模擬多肽結合到pd-l1的能力的spr實驗的結果)。結合也可以如下測定：例如測量未標記的高親和力pd-1模擬多肽與經標記的pd-1多肽(例如經標記的原生pd-1模擬多肽，如上文所定義)競爭結合到pd-l1的能力(參見例如圖5a-5c和圖6a-6b)。相應地，相對結合可以通過對使用未標記高親和力pd-1模擬多肽候選物所得的結果與使用未標記原生pd-1模擬多肽(如上文所定義，相對於野生型pd-1的相應序列來說不具有胺基酸變化的pd-1模擬多肽)所得的結果進行比較來評估。可以利用任何適宜的方法產生本發明的高親和力pd-1模擬多肽。作為一個實例(非限制性實例)，可以進行突變誘發(從原生pd-1模擬多肽開始，或從高親和力pd-1模擬多肽開始，用於產生親和力甚至更大的多肽)以產生一組突變型pd-1模擬多肽。可以靶向突變誘發以在特定胺基酸處產生變化，或突變誘發可以是隨機的。然後可以根據結合pd-l蛋白質(例如pd-l1和/或pd-l2)的能力來篩選突變型pd-1模擬多肽。舉例來說，pd-l蛋白質(或pd-l蛋白質的變異體，例如缺乏跨膜域的形式)可以經標記(例如直接標記，如放射性同位素、螢光部分等；間接標記，如抗原、親和標籤、生物素等)，並且然後可以用於接觸候選高親和力pd-1模擬多肽(例如其中候選高親和力pd-1模擬多肽可以附接到固體表面或呈現於細胞(例如酵母細胞)的膜上)。通過改變所用pd-l的濃度，可以從候選物中(即，從一組突變型pd-1模擬多肽中)鑑別出高親和力pd-1模擬多肽。關於如何可以鑑別本發明的高親和力pd-1模擬多肽的非限制性實例，參見圖2a-2b。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽是融合蛋白，例如與第二多肽(融合搭配物)同框融合。在一些實施例中，第二多肽能夠增加融合蛋白的尺寸，例如使得融合蛋白不能快速地從循環系統中清除。由於組織滲透(即，能夠滲透組織)可以是使用本發明高親和力pd-1模擬多肽的獨特優勢(因為其尺寸相對較小(例如相較於大得多的蛋白質，如抗體，例如抗pd-1或抗pd-l抗體))，因此在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽不與第二多肽融合，或與足夠小的第二多肽融合以便限制高親和力pd-1模擬多肽的組織滲透直到不可接受的水平(這取決於特定方法的背景和/或所期望的結果)。因此，在一些情況下，第二多肽(即，與本發明的高親和力pd-1模擬多肽融合的多肽)是200個胺基酸或更小(例如190個胺基酸或更小、180個胺基酸或更小、170個胺基酸或更小、160個胺基酸或更小、150個胺基酸或更小、140個胺基酸或更小、130個胺基酸或更小、120個胺基酸或更小、110個胺基酸或更小、100個胺基酸或更小、90個胺基酸或更小、80個胺基酸或更小、70個胺基酸或更小、60個胺基酸或更小、50個胺基酸或更小、40個胺基酸或更小，或30個胺基酸或更小)。在一些情況下，融合蛋白具有200kd或更小、150kd或更小、100kd或更小、90kd或更小、80kd或更小、70kd或更小、60kd或更小、50kd或更小、40kd或更小或30kd或更小的分子量平均值。在一些實施例中，第二多肽是免疫球蛋白fc區(例如人類免疫球蛋白fc區)(例如抗體fc序列、ch3域及其類似物)的一部分或全部。在其它實施例中，第二多肽是基本上類似於fc的任何適合多肽，例如提供增加的尺寸、多聚域和/或與ig分子的額外結合或相互作用。這些融合蛋白可以促進提純、多聚化且展示了延長的活體內半衰期。具有二硫鍵連接的多聚結構的融合蛋白還可以比單體高親和力pd-1模擬多肽更高的效率結合以及中和其它分子。與異源多肽融合時，對應於高親和力pd-1模擬多肽的部分可以稱為「高親和力pd-1模擬多肽部分」。高親和力pd-1多肽(例如高親和力pd-1模擬多肽部分)的長度可以是70個胺基酸或更長(例如75個胺基酸或更長、80個胺基酸或更長、85個胺基酸或更長、90個胺基酸或更長、95個胺基酸或更長、100個胺基酸或更長、105個胺基酸或更長、110個胺基酸或更長、115個胺基酸或更長、120個胺基酸或更長、125個胺基酸或更長，或130個胺基酸或更長)，直到野生型蛋白質的n末端到跨膜域的部分的全長(例如人類pd-1蛋白質為165-170個胺基酸)，且可以進一步與異源多肽(例如免疫球蛋白fc)融合。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽(例如高親和力pd-1模擬多肽部分)的長度在70個胺基酸到170個胺基酸(例如70個胺基酸到166個胺基酸、75個胺基酸到170個胺基酸、80個胺基酸到170個胺基酸等)範圍內。在一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽與免疫球蛋白序列融合或以其它方式連接而形成嵌合蛋白。免疫球蛋白序列可以是免疫球蛋白恆定域。此類嵌合體中的免疫球蛋白部分可以獲自任何物種，通常為人類，且包括igg1、igg2、igg3或igg4亞型、iga、ige、igd或igm。免疫球蛋白部分可以包含一或多個域，例如ch1、ch2、ch3等。利用連接到適當免疫球蛋白恆定域序列的序列建構而成的嵌合體在所屬領域中已為人所知。在此類融合物中，所編碼的嵌合多肽可以保留至少在功能上具有活性的鉸鏈、免疫球蛋白重鏈恆定區ch2以及ch3域。融合也發生於恆定域fc部分的c末端，或n末端直接與重鏈的ch1或輕鏈的相應區域融合。融合發生的確切位點並非關鍵；特定位點是眾所周知的且可以選擇以便優化高親和力pd-1模擬多肽：免疫球蛋白嵌合體的生物活性、分泌或結合特徵。在一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽：免疫球蛋白嵌合體組裝成單體或異質或同質多聚體，且在一些情況下組裝成二聚體或四聚體。雖然免疫球蛋白輕鏈不需要存在，但可以包括與高親和力pd-1模擬多肽：免疫球蛋白重鏈融合多肽共價結合或與多肽直接融合的免疫球蛋白輕鏈。可以利用單鏈構築體提供重鏈與輕鏈恆定區。在其它融合蛋白構築體中，第二多肽是標記物序列，如促進融合多肽提純的肽。舉例來說，標記物胺基酸序列可以是六聚組氨酸肽，其中如pqe載體(凱傑公司(qiagen，inc.)，加利福尼亞州，查特斯沃思，伊頓大道9259(9259etonavenue，chatsworth，calif.)，91311)中所提供的標籤，其中多種可購得。如傑恩斯(gentz)等人，《美國國家科學院院刊》86：821-824，1989中所述，例如六聚組氨酸使融合蛋白的提純變得方便。適用於提純的另一種肽標籤「ha」標籤對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白的抗原決定基。威爾遜(wilson)等人，《細胞(cell)》37：767，1984。為了促進多肽的處置而添加肽部分在本領域中是熟悉的常規技術。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽是多價的(例如四價)。高親和力pd-1模擬多肽可以是單體或多聚體，即二聚體、三聚體、四聚體等。舉例來說，一或多個pd-l1(和/或pd-l2)結合域可以按共價或非共價方式連接，例如作為融合蛋白；二硫鍵鍵結；通過生物素結合到抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素等。此類單體或多聚體高親和力pd-1模擬多肽作為單一藥劑用於刺激免疫反應(例如刺激一般免疫反應和/或刺激針對表達pd-l1的細胞(例如癌細胞)的反應)；或與其它結合劑(例如單克隆抗體)組合。舉例來說，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以具有融合搭配物，其中所述融合搭配物提供多聚域(即，促進多聚化的結構域，例如促進二聚化的結構域)。舉例來說，融合搭配物可以是任何適宜的蛋白質-蛋白質相互作用域(例如亮氨酸拉鏈基序、合成拉鏈多肽(多肽對)、ch3域及其類似物)。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以加以修飾，例如連接到多種多樣的其它寡肽或蛋白質用於多種目的。舉例來說，進行轉譯後修飾，例如通過異戊烯化、乙醯化、醯胺化、羧基化、糖基化、聚乙二醇化(共價連接聚乙二醇(peg)聚合物鏈)等。此類修飾還可以包括糖基化修飾，例如通過在其合成和處理期間或在進一步處理步驟中修改多肽糖基化模式所得到的糖基化修飾；例如通過將多肽暴露於影響糖基化的酶，如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽具有一或多個磷酸化胺基酸殘基，例如磷酸化酪氨酸、磷酸化絲氨酸或磷酸化蘇氨酸。在一些其它實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括進一步修飾的試劑，以改善其對蛋白水解性降解的抗性或優化溶解性特性或使其更適用作治療劑。舉例來說，本發明的變異體進一步包括類似物，所述類似物含有除天然存在的l-胺基酸之外的殘基，例如d-胺基酸或非天然存在的合成胺基酸。d-胺基酸可以取代胺基酸殘基中的一些或全部。除用於治療各種病症以及疾病之外，高親和力pd-1模擬多肽還適用作例如增強免疫功能的佐劑(例如與特定結合劑(例如抗體，在一些情況下為如本文所定義的腫瘤細胞特異性抗體)組合時)(例如通過刺激大量免疫細胞(如巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜中性白細胞、粒細胞、抗原呈遞細胞、t細胞及其類似細胞)，或減少其抑制)。高親和力pd-1模擬多肽還適用作成像劑，例如與可檢測標記結合時，這可以用於各種目的，例如用作診斷試劑。舉例來說，在一些情況下，本發明方法是一種診斷或預後個體癌症(例如其中可檢測pd-l1的存在、含量和/或位置能夠診斷和/或預後的癌症)的方法。在本發明的一些實施例中，高親和力pd-1模擬多肽是與一或多個成像部分(即可檢測標記)偶聯或結合。如本文所用，「細胞毒性部分」是指在接近細胞或被細胞吸收時抑制細胞生長或促進細胞死亡的部分。就此而言，適合的細胞毒性部分包括放射性同位素(放射性核素)、化學毒性劑(如分化誘導劑以及小化學毒性藥物)、毒素蛋白質和其衍生物。如本文所用，「成像部分」或可檢測標記是指在可視化技術(例如放射照相術、正電子發射斷層掃描(pet)、磁共振成像(mri)、直接或間接目視檢查)中可以用於增強腫瘤與周圍健康組織之間對比度的部分。因此，適合的成像部分包括放射照相術部分，例如重金屬以及輻射發射部分、正電子發射部分、磁共振造影部分以及光學可見部分(例如螢光或可見光譜染料、可見顆粒等。所述領域的技術人員應了解，什麼是治療部分與什麼是成像部分之間存在一些重疊。一般來說，治療劑或成像劑可以通過任何適合技術與高親和力pd-1模擬多肽部分結合，需要適當考慮的是藥物動力學穩定性以及降低對患者的總體毒性。當各自具有能夠彼此反應的官能團時，藥劑與pd-l1之間可能發生直接反應。舉例來說，親核基團(如氨基或硫氫基)能夠與含羰基的基團(如酸酐或酸滷化物)或含有良好離去基(例如滷化物)的烷基發生反應。或者，可以使用適合的化學連接基團。連接基團可以充當間隔子以免幹擾結合能力。對於所屬領域的技術人員顯而易見的是，可以採用多種雙官能或多官能試劑(同官能和異官能試劑(如伊州羅克福德的皮爾斯化工有限公司(piercechemicalco.，rockford，ill.)的產品目錄中所述的那些試劑))作為連接基團。偶聯可以通過例如氨基、羧基、硫氫基或氧化的碳水化合物殘基實現。描述此類方法的參考文獻有許多。或者，通過使用非共價結合對(如抗生蛋白鏈菌素/生物素，或抗生物素蛋白/生物素)使高親和力pd-1模擬多肽與細胞毒性或成像部分連接。在這些實施例中，結合對中的一個成員與高親和力pd-1模擬多肽共價偶聯且結合對中的另一成員與細胞毒性或成像部分共價偶聯。可能期望與超過一個細胞毒性和/或成像部分偶聯。通過聚合衍生高親和力pd-1模擬多肽，可以同時實施若干種策略，可以使抗體作為造影劑用於幾種可視化技術，或可以對治療抗體進行標記以便通過可視化技術追蹤。載劑可以通過多種方式攜帶藥劑，包括直接或經由連接基團共價鍵結以及非共價結合。適合的共價鍵載劑包括蛋白質，如白蛋白、肽以及多醣，如氨基葡聚糖，其各自具有多個位點用於連接各部分。載劑還可以通過非共價結合(如非共價鍵結)或通過囊封來攜帶藥劑。載劑以及對放射性核素劑具有特異性的連接子包括放射性滷化小分子以及螯合化合物。放射性核素螯合劑可以由螯合化合物形成，所述螯合化合物包括含有氮和硫原子作為供體原子以便結合金屬或金屬氧化物、放射性核素的螯合化合物。在本發明中適用作成像部分的放射照相部分包括含有相對較大原子(如金、銥、鎝、鋇、鉈、碘以及其同位素)的化合物以及螯合劑。在一些情況下，本發明的組合物和方法中可以使用毒性較弱的放射照相成像部分，如碘或碘同位素。此類部分可以通過可接受的化學連接子或螯合載劑而與高親和力pd-1模擬多肽結合。用於本發明的正電子發射部分包括容易通過氟化反應與高親和力pd-1模擬多肽結合的18f。pet發射體實例包括64cu、68ga、89zr以及18f。pet成像可以包括使正電子發射體與蛋白質偶聯。pet發射體實例包括64cu、68ga、89zr以及18f。這些藥劑可以使用任何適宜方法與蛋白質偶聯，例如經由螯合基團，例如1，4，7，10-四氮雜環十二烷-1，4，7，10-四乙酸(dota)、1，4，7-三氮雜環壬烷-1，4，7-三乙酸(nota)以及去鐵胺(desferoxamine，dfo)。此類螯合劑可以使用任何適宜方法按共價方式以及位點特異性方式連接到蛋白質，例如利用順丁烯二醯亞胺化學性質連接於游離半胱氨酸殘基處，例如工程化游離半胱氨酸殘基，如半胱氨酸r87c、n91c和/或r122c(相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，對應於r87c、n91c和/或r122c的突變)。在本發明中適用作成像部分的單光子發射計算機斷層掃描(spect)部分。spect就使用放射性示蹤劑材料以及檢測γ射線來說，類似於正電子發射斷層掃描術(pet)。然而，與pet相反，spect中所用的示蹤劑發射的γ輻射直接測量，而pet示蹤劑發射的正電子在至多幾毫米遠與電子發生湮滅，導致在相反的方向上發射兩個γ光子。磁共振造影部分可以包括鉻(iii)、錳(ii)、鐵(ii)、鎳(ii)、銅(ii)、鐠(iii)、釹(iii)、釤(iii)以及鐿(iii)離子的螯合劑。釓(iii)、鋱(iii)、鏑(iii)、鈥(iii)、鉺(iii)以及鐵(iii)離子由於其磁矩極強而也視為造影部分。適用作成像部分的光學可見部分包括螢光染料，或可見光譜染料、可見顆粒以及其它可見標記部分。螢光染料(如螢光素、香豆素、若丹明(rhodamine)、氟硼德州紅(bodipytexasred)以及花青染料)當可以向目測檢驗的位點提供足夠的激發能量時是適用的。內窺鏡可視化程序可能與此類標記的使用更兼容。可接受的染料包括fda核准的食品級染料以及顏料，其是無毒的，但是已經核准用於內部投藥的醫藥學上可接受的染料是優選的。給與特定患者的成像結合物組合物的有效量可以取決於多種因素，其中若干因素因患者而異。勝任的臨床醫師能夠確定可促進例如腫瘤可視化的有效量。劑量取決於腫瘤療法、投藥路線、治療劑性質、腫瘤對治療劑的敏感性等。勝任的臨床醫師在常規臨床試驗過程中利用普通技能便能夠優化特定治療性或成像組合物的劑量。典型的劑量可以是每公斤受檢者體重0.001到100毫克結合物。每公斤患者體重0.1到10mg範圍內的相對大的劑量可以用於對相對無毒成像部分的結合物進行成像。用量取決於成像方法的靈敏度以及成像部分的相對毒性。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以通過所述領域已知或後來發現的任何適合方式產生，例如由真核或原核細胞產生、活體外合成等。在蛋白質是由原核細胞產生的情況下，可以通過去摺疊來進一步處理，例如熱變性、dtt還原等，且可以使用所屬領域中已知的方法進一步再摺疊。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括對應於r87c、n91c和/或r122c的一個或多個突變。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括seqidno：3-25以及39-46中的任一個所述的胺基酸序列。如上文所提及，在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽包括可檢測標記(例如正電子發射斷層掃描(pet)成像標記)。在一些情況下，相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，本發明的高親和力pd-1模擬多肽包括對應於r87c、n91c和/或r122c的一或多個突變，且還包括可檢測標記(例如正電子發射斷層掃描(pet)成像標記)。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽(例如相對於seqidno：2中所述的pd-1蛋白質片段，包括對應於r87c、n91c和/或r122c的一個或多個突變的本發明高親和力pd-1模擬多肽)包括用於正電子發射斷層掃描(pet)成像(例如pet發射體，如64cu、68ga、89zr以及18f)、spect(例如γ射線發射體)和/或螢光成像(例如螢光染料，如螢光素、香豆素、若丹明、氟硼德州紅、花青染料及其類似物)的成像部分。多肽可以通過無細胞轉譯系統或合成式活體外合成、使用所屬領域中已知的傳統方法製備。可利用各種商業合成設備，例如應用生物系統公司(appliedbiosystems，inc.)(加州福斯特市(fostercity，ca))、貝克曼(beckman)的自動化合成器等。通過使用合成器可以用非天然胺基酸取代天然存在的胺基酸。特定的序列和製備方式將根據便利性、經濟性、所需純度及其類似因素來確定。也可以根據傳統的重組合成方法分離和提純多肽。溶胞物可以由表達宿主製備且溶胞物使用hplc、排阻色譜法、凝膠電泳、親和色譜法或其它提純技術提純。所用組合物多半包含至少20重量％的所期望產物、更通常至少約75％重量、優選至少約95％重量的所期望產物且出於治療目的，通常包含至少約99.5％重量的所期望產物(相對於與產物製備和其提純方法有關的汙染物)。百分率通常按總蛋白質計。可以利用所屬領域的技術人員熟知的方法建構含有編碼序列和適當轉錄/轉譯控制信號的表達載體。這些方法包括例如活體外重組dna技術、合成技術以及活體內重組/基因重組。或者，可以用化學方式合成能夠編碼所關注多肽的rna。所屬領域的技術人員容易利用熟知的密碼子使用表和合成方法提供本發明的任一種多肽的適合編碼序列。可以分離出且獲得基本上純的核酸。通常，所得呈dna或rna形式的核酸基本上不含其它天然存在的核酸序列，一般是至少約50％、通常至少約90％純，且典型地是「重組的」，例如側接一或多個核苷酸，所述核苷酸在正常情況下與天然存在的染色體不相關。本發明的核酸可以作為線性分子提供或提供於環狀分子內部，且可以提供於自主複製的分子(載體)內或不含複製序列的分子內。核酸的表達可以獨立調控或通過所屬領域中已知的其它調控序列調控。可以使用所屬領域中可獲得的多種技術將本發明的核酸引入適合的宿主細胞中。根據本發明，高親和力pd-1模擬多肽可以用適於治療用途(例如用於人類治療)的醫藥組合物(醫藥配製物)提供。在一些實施例中，本發明的醫藥組合物包括一或多種本發明治療性實體或其醫藥學上可接受的鹽類、酯類或溶劑化物。在一些其它實施例中，本發明的醫藥組合物包括一或多種本發明治療性實體與另一種治療劑(例如另一種抗腫瘤藥劑)的組合。本發明的治療性實體往往作為包含活性治療劑和醫藥學上可接受的其它賦形劑的醫藥組合物(醫藥配製物)投與。優選形式取決於預期投藥模式和治療應用。視所期望的配方而定，組合物還可以包括醫藥學上可接受的無毒載劑或稀釋劑，其定義為配製用於投與動物或人類的醫藥組合物所常用的媒劑。對稀釋劑進行選擇以免影響所述組合的生物活性。此類稀釋劑的實例是蒸餾水、生理磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(ringer′ssolution)、右旋糖溶液和漢克氏溶液(hank′ssolution)。另外，醫藥組合物或配製物還可以包括其它載劑、佐劑或無毒性、非治療性、非免疫原性穩定劑及其類似物。又在一些其它實施例中，本發明的醫藥組合物還可以包括較大的緩慢代謝巨分子，如蛋白質、多醣(如聚葡萄胺糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(如乳膠官能化sepharosetm、瓊脂糖、纖維素及其類似物)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物以及脂質聚集體(如油滴或脂質體)。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽具有多特異性(例如雙特異性)。術語「多特異性」或「雙特異性」在所屬領域中常用於指識別兩種或超過兩種不同抗原的抗體，其憑藉具有至少一個對第一抗原具有特異性的區域(例如來源於第一抗體的可變區)和至少一個對第二抗原具有特異性的第二區域(例如來源於第二抗體的可變區)(這些抗體也稱為雙功能抗體或多功能抗體)。雙特異性抗體特異性結合到兩種靶抗原且因此是一種類型的多特異性抗體。多特異性抗體可以通過重組dna方法產生或包括(但不限於)化學上通過任何適宜方法產生的抗體。雙特異性抗體包括能夠識別兩種不同抗原的所有抗體或抗體結合物或聚合物形式的抗體。雙特異性抗體包括已經還原且再形成的抗體(以便保留其二價特徵)以及已經發生化學偶聯的抗體(以使得其可以具有若干個針對每種抗原的抗原識別位點)。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽具有多特異性(例如雙特異性)。舉例來說，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以具有多特異性(例如雙特異性)，使得多肽的第一區域對應於本發明的高親和力pd-1模擬多肽序列(特異性地結合pd-l1)，且第二區域(融合搭配物)(例如來源抗體的序列，例如抗體的結合區(包含抗體的那些cdr)；特異性結合多肽；配位體的結合部分；受體的結合部分等)特異性結合到另一標靶(例如抗原、受體、配位體等)。舉例來說，在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽與特異性結合到除pd-l1之外的靶序列的第二多肽(融合搭配物)融合。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽與特異性結合到除pd-l1之外的標靶的第二多肽(融合搭配物)融合(因此，此類多聚體高親和力pd-1模擬多肽可以具有雙特異性，且因此結合2種不同標靶/部分)。在一些情況下，本發明的多聚體高親和力pd-1模擬多肽因融合搭配物結合到其標靶而改變信號傳導。舉例來說，在一些情況下，融合搭配物包括配位體或配位體的結合區域(例如細胞激素、減弱的細胞激素等)作為融合搭配物，且當配位體結合到其標靶(例如受體)時，多聚體高親和力pd-1模擬多肽改變信號傳導。同樣，在一些情況下，融合搭配物包括受體或受體的結合區域作為融合搭配物，且當受體結合到其標靶(例如配位體)時，多聚體高親和力pd-1模擬多肽改變信號傳導。適合融合搭配物的實例包括(但不限於)針對癌細胞標記物(如cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd123、cd279(pd-1)、egfr、her2、cd117、c-met、pthr2、havcr2(tim3)等)的抗體的結合序列。具有向癌細胞標記物提供特異性結合的cdr的抗體實例包括(但不限於)：西妥昔單抗(結合egfr)、帕尼單抗(結合egfr)、利妥昔單抗(結合cd20)、曲妥珠單抗(結合her2)、帕妥珠單抗(結合her2)、阿侖單抗(結合cd52)、貝倫妥單抗(結合cd30)及其類似物。適合的融合搭配物實例包括細胞激素；減弱的細胞激素；41bb促效劑；cd40促效劑；btla和/或cd160抑制劑；以及tim3和/或ceacam1抑制劑。舉例來說，在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多特異性高親和力pd-1模擬多肽，且與一或多種選自以下的融合搭配物融合：細胞激素；減弱的細胞激素；41bb促效劑；cd40促效劑；btla和/或cd160抑制劑；以及tim3和/或ceacam1抑制劑。舉例來說，多特異性高親和力pd-1模擬多肽可以與作為經修飾的細胞激素的融合搭配物融合，所述經修飾的細胞激素對其配位體/受體的親和力降低(相對於相應野生型細胞激素來說減小)。此類經修飾的細胞激素在本文中稱為『減弱的細胞激素』。減弱的細胞激素實例(可能的融合搭配物的一個實例)是具有突變的il-2蛋白質，其對il-2受體亞單元中的兩個的親和力降低(例如使對cd25的結合減少的f42a和使對cd122的結合減少的d20t)(參見例如seqidno：39)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多特異性高親和力pd-1模擬多肽，且具有融合搭配物41bb促效劑(例如41bbl，參見例如seqidno：40)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多特異性高親和力pd-1模擬多肽，且具有融合搭配物cd40促效劑(例如cd40l，參見例如seqidno：41)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多特異性高親和力pd-1模擬多肽，且具有融合搭配物，所述融合搭配物是btla和/或cd160抑制劑(參見例如seqidno：42)。在一些情況下，高親和力pd-1模擬多肽是多特異性高親和力pd-1模擬多肽，且具有融合搭配物，所述融合搭配物是tim3和/或ceacam1抑制劑(參見例如seqidno：43)。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽與融合搭配物通過連接子(例如連接子多肽)分隔。連接子多肽可以具有多種胺基酸序列中的任一種。蛋白質可以通過連接子多肽連接，連接子多肽可以具有柔性性質(例如柔性連接子多肽)，然而不排除其它化學鍵聯。適合的連接子包括長度在約6個胺基酸與約40個胺基酸之間或長度在約6個胺基酸與約25個胺基酸之間的多肽。這些連接子可以通過使用合成的連接子編碼寡核苷酸使蛋白質偶聯來產生。可以使用具有柔性程度的肽連接子。連接肽可以具有幾乎任何胺基酸序列，應注意在某些情況下，連接子具有產生一般柔性肽的序列。小胺基酸(如甘氨酸和丙氨酸)的使用是用於產生柔性肽。此類序列的產生是所屬領域的技術人員的常規操作。可購得且考慮適用的多種不同連接子。連接子多肽的實例包括甘氨酸聚合物(g)n、甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括例如(gs)n、gsggsn(seqidno：47)、ggsggsn(seqidno：48)以及gggsn(seqidno：49)，其中n是一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或大於十的整數)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物。示例性連接子可以包含包括(但不限於)以下的胺基酸序列：ggsg(seqidno：50)、ggsgg(seqidno：51)、gsgsg(seqidno：52)、gsggg(seqidno：53)、gggsg(seqidno：54)、gsssg(seqidno：55)及其類似物。所屬領域的技術人員認識到，與上述任何元件結合的肽的設計可以包括具有全部或部分柔性的連接子，使得連接子可以包括柔性連接子以及賦予結構較弱柔性的一或多個部分。核酸。本發明還提供編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的經分離的核酸、包含所述核酸的載體和宿主細胞，以及用於產生高親和力pd-1模擬多肽的重組技術。為了重組產生高親和力pd-1模擬多肽，可以將編碼高親和力pd-1模擬多肽的核酸插入可複製的載體中用於進一步克隆(dna擴增)或用於表達。編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的dna容易使用傳統程序分離以及測序。可獲得多種載體。載體組件通常包括(但不限於)以下一或多種：信號序列、複製起點、一或多種標記物基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。本發明的高親和力pd-1模擬多肽不僅可以直接重組重組，而且可以作為融合多肽產生，所述融合多肽具有可以包括信號序列的異源或同源多肽，或具有位於成熟蛋白質或多肽n末端的特定裂解位點、免疫球蛋白恆定區序列及其類似物的其它多肽。優選的異源信號序列可以是被宿主細胞識別且處理(即，通過信號肽酶裂解)的異源信號序列。對於不識別以及處理原生抗體信號序列的原核宿主細胞來說，信號序列被所選原核信號序列取代。「分離」的核酸分子是一種經鑑別且與至少一種汙染物核酸分子分離的核酸分子，所述「分離」的核酸分子在分離之前通常與所述至少一種汙染物核酸分子結合。分離的核酸分子不同於其在自然界中可以被發現的形式或環境。因此，分離的核酸分子有別於存在於天然細胞中的核酸分子。適用於克隆或表達本發明核酸的宿主細胞實例包括(但不一定限於)原核生物、酵母或更高等真核生物細胞。適用的哺乳動物宿主細胞系實例是經sv40轉型的猴腎cv1株系(cos-7，atcccrl1651)；人胚腎株系(經亞克隆以便在懸浮培養物中生長的293或293細胞；格雷安(graham)等人，《普通病毒學雜誌(journalofgeneralvirology)》36：59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(bhk，atccccl10)；中國倉鼠卵巢細胞/-dhfr(cho，烏爾勞布(urlaub)等人，《美國國家科學院院刊》77：4216(1980))；小鼠支持細胞(tm4，馬瑟(mather)，《生殖生物學(biol.reprod.)》23：243-251(1980))；猴腎細胞(cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細胞(vero-76，atcccrl-1587)；人類宮頸癌細胞(hela，atccccl2)；犬科動物腎細胞(mdck，atccccl34)；布法羅大鼠(buffalorat)肝細胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺細胞(w138，atccccl75)；人肝細胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562，atccccl51)；tr1細胞(馬瑟等人，《紐約科學院年報(annalsn.y.acad.sci.)》383：44-68(1.982))；mrc5細胞；fs4細胞；以及人類肝腫瘤株系(hepg2)。宿主細胞用上述表達或克隆載體轉型以便產生高親和力pd-1模擬多肽，且在適當時經修改的傳統營養培養基中培養用於誘發啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所期望序列的基因。核酸的引入。在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽是通過將高親和力pd-1模擬多肽以編碼高親和力pd-1模擬多肽的核酸形式(例如rna，例如mrna；或dna，例如重組表達載體、線性dna、環狀dna、質體、病毒載體等)提供來投與個體。本發明提供了此類方法並且還提供了供此類方法用的核酸。舉例來說，可以將編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的mrna引入細胞中，且細胞然後可以分泌所轉譯的蛋白質。作為另一實例，可以將編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的dna(例如重組表達載體、線性dna、環狀dna、質體、病毒載體等)引入細胞中且細胞然後可以產生且分泌所編碼的蛋白質。因此，在一些情況下，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸包括編碼信號序列的核苷酸序列(例如位於編碼高親和力pd-1模擬多肽的核苷酸序列的上遊且與其同框)。正如所屬領域的技術人員容易認識到，在此提及的信號序列是位於新生蛋白質的胺基末端或其附近的胺基酸序列，所述新生蛋白質可以被真核細胞的信號識別顆粒識別，導致所述蛋白質輸送到細胞的分泌路徑中，從而促進細胞分泌蛋白質(例如信號序列可以從蛋白質中裂解)。可以使用任何適宜的信號序列。在一些情況下，將編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入細胞(例如活體內、離體、活體外)中且所述細胞然後可以產生且分泌經編碼的蛋白質。在一些情況下，細胞是活體外細胞。在一些情況下，細胞是離體細胞。在一些情況下，細胞是活體內細胞。舉例來說，在一些情況下，將編碼高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入活體內細胞中(例如在一些情況下，編碼高親和力pd-1模擬多肽的核酸是通過將所述核酸投與個體來引入活體內細胞中)。在一些情況下，將編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入細胞(例如離體、活體外)中且然後將所述細胞引入個體中。在一些情況下，細胞個體的自體細胞(例如細胞是從個體分離出來的或是從所述個體分離的細胞的後代)。在一些情況下(例如在任一種上述情形中，例如活體外、離體、活體內)，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入其中的細胞是免疫細胞(例如白細胞、t細胞、cd8t細胞、cd4t細胞、記憶/效應子t細胞、b細胞、抗原呈遞細胞(apc)、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞及其類似物)。在一些情況下(例如在任一種上述情形中，例如活體外、離體、活體內)，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入其中的細胞是幹細胞(例如造血幹細胞、多能幹細胞、多潛能幹細胞、組織限制性幹細胞等)。在一些情況下(例如在任一種上述情形中，例如活體外、離體、活體內)，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入其中的細胞是免疫細胞(例如白細胞、t細胞、cd8t細胞、cd4t細胞、記憶/效應子t細胞、b細胞、抗原呈遞細胞(apc)、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞及其類似物)或幹細胞(例如造血幹細胞、多能幹細胞、多潛能幹細胞、組織限制性幹細胞等)。在一些情況下(例如在任一種上述情形中，例如活體外、離體、活體內)，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸引入其中的細胞是含有工程化t細胞受體(tcr)的t細胞(此細胞在本文中也稱為「tcr工程化t細胞」)。如本文中所用，術語「tcr工程化t細胞」是指具有與t細胞異源的t細胞受體的任何t細胞。適合的實例包括(但不限於)(i)含有嵌合抗原受體(car)的t細胞(此細胞在本文中也稱為「car-t細胞」或「工程化car-t細胞」；和(ii)含有異源tcr的t細胞，所述異源tcr結合到抗原，如癌症抗原，例如mart1、ny-eso-1、p53及其類似物(例如此細胞可以含有編碼異源tcr(如結合到抗原(如癌症抗原，例如mart1、ny-eso-1、p53及其類似物)的tcr)的tcr-α和tcr-β多肽的核酸)。在一些情況下，適合的tcr工程化t細胞可以含有工程化tcr(例如結合到抗原的異源tcr、car等)，所述tcr結合到癌症標記物(例如cd19、cd20、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd123、cd279(pd-1)、egfr、her2、cd117、c-met、pthr2和/或havcr2(tim3))。在一些情況下，適合的tcr工程化t細胞可以含有工程化tcr(例如結合到抗原的異源tcr、car等)，所述tcr結合到選自pd-l1(例如來源於抗pd-l1抗體的car)和pd-1(例如來源於抗pd-1抗體的car)的靶抗原。在一些情況下，適合的tcr工程化t細胞可以含有工程化tcr(例如結合到抗原的異源tcr、car等)，所述tcr結合到pd-l1(例如來源於抗pd-l1抗體的car)。在一些情況下，適合的tcr工程化t細胞可以含有工程化tcr(例如結合到抗原的異源tcr、car等)，所述tcr結合到pd-1(例如來源於抗pd-1抗體的car)。在一些情況下，適合的tcr工程化t細胞可以含有工程化tcr(例如結合到抗原的異源tcr、car等)，所述tcr結合到cd19(例如1d3car)。在一些情況下，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸還包括編碼t細胞受體(tcr)的核苷酸序列。在一些此類情況下，核酸包括編碼tcr的tcrα多肽和tcrβ多肽的核苷酸序列。在一些情況下，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸還包括編碼異源tcr(如結合到抗原(如癌症抗原，例如mart1、ny-eso-1、p53及其類似物)的tcr)的tcr-α和tcr-β多肽和/或編碼car(例如第一代car、第二代car、第三代car及其類似物)的核苷酸序列。各種組件(包括編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的序列以及編碼tcr的tcr-α和tcr-β多肽的序列以及編碼car的序列)是模塊化組件。因此，各種序列可以各自可操作地連接到相同或不同啟動子。可操作地連接到相同啟動子的那些組件可以通過允許蛋白質最終以單獨多肽形式存在的序列(例如內部核糖體進入位點(ires)、2a肽序列等)分隔。各種可能排列的實例包括(但不限於)圖20a-20e以及圖21a-21d中所描繪之那些排列。因此，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸實例包括(但不限於)圖20a-20e以及圖21a-21d中所描繪之那些核酸。「載體」或「表達載體」是另一dna區段(即「插入」)可以附接的複製子，如質體、噬菌體、病毒或粘質體，以便使所附接的區段在細胞中複製。「表達盒」包含可操作地連接到啟動子的dna編碼序列。「可操作地連接」是指一種並接，其中如此描述的組件處於允許其按預定方式發揮作用的關係。舉例來說，若啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，則啟動子可操作地連接到編碼序列。術語「重組表達載體」或「dna構築體」或「表達載體」和所屬領域中的類似術語在本文中可互換地使用，以指包含載體和至少一個插入序列的dna分子。重組表達載體可以出於表達和/或擴增插入序列的目的或為了建構其它重組核苷酸序列而產生。插入序列(例如編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核苷酸序列)可以或不可以可操作地連接到啟動子序列且可以或不可以可操作地連接到dna調控序列。因此，在一些情況下，編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核酸可操作地連接到啟動子(例如在所期望的細胞類型中可操作的啟動子，所期望的細胞類型例如真核細胞、哺乳動物細胞、靈長類動物細胞、人類細胞、免疫細胞、白細胞、t細胞、cd8t細胞、cd4t細胞、記憶/效應子t細胞、b細胞、抗原呈遞細胞(apc)、樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、nk細胞、幹細胞、造血幹細胞、多能幹細胞、多潛能幹細胞、組織限制性幹細胞等)。啟動子可以是組成性活性啟動子(即，在組成上呈活性/「開啟」狀態的啟動子)，其可以是誘導型啟動子(即，其狀態(活性/「開啟」或無活性/「關閉」)受外部刺激物(例如特定溫度、化合物或蛋白質的存在)控制的啟動子)，其可以是空間限制型啟動子(即，轉錄控制元件、增強子等)(例如組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子等)，且其可以是臨時限制型啟動子(即，啟動子在胚胎發育的特定階段期間或在生物過程的特定階段期間(例如小鼠的毛囊周期)處於「開啟」或「關閉」狀態)。適合啟動子可以來源於病毒且因此可以稱為病毒啟動子，或其可以來源於任何生物體，包括原核或真核生物體。適合啟動子可以用於驅動任何rna聚合酶(例如poli、polii、poliii)表達。示例性啟動子包括(但不限於)sv40早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複(ltr)啟動子；腺病毒主要晚期啟動子(admlp)；單純性皰疹病毒(hsv)啟動子、細胞巨大病毒(cmv)啟動子(如cmv即刻早期啟動子區域(cmvie))、勞斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus，rsv)啟動子、人類u6小核啟動子(u6)(宮岸(miyagishi)等人，《自然·生物技術(naturebiotechnology)》20，497-500(2002))、增強型u6啟動子(例如夏(xia)等人，《核酸研究(nucleicacidsres.)》2003年9月1日；31(17))、人類h1啟動子(h1)，及其類似物。誘導型啟動子的實例包括(但不限於)t7rna聚合酶啟動子、t3rna聚合酶啟動子、異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)調控型啟動子、乳糖誘導性啟動子、熱休克啟動子、四環素調控型啟動子、類固醇調控型啟動子、金屬調控型啟動子、雌激素受體調控型啟動子等。誘導型啟動子因此可以通過包括(但不限於)以下的分子調控：多西環素(doxycycline)；rna聚合酶，例如t7rna聚合酶；雌激素受體；雌激素受體融合物等。在一些實施例中，啟動子是空間限制型啟動子(即，細胞類型特異性啟動子、組織特異性啟動子等)，以致在多細胞生物體中，啟動子在特定細胞的亞群中具有活性(即，「開啟」)。空間限制型啟動子也可以稱為增強子、轉錄控制元件、控制序列等。可以使用任何適宜的空間限制型啟動子且適合啟動子(例如腦特異性啟動子、驅動在神經元亞群表達中的啟動子、驅動在生殖系中表達的啟動子、驅動在肺中表達的啟動子、驅動在肌肉中表達的啟動子、驅動在胰臟的胰島細胞中表達的啟動子等)的選擇取決於生物體。舉例來說，植物、蒼蠅、蠕蟲、哺乳動物、小鼠等的各種空間限制型啟動子已為人所知。因此，空間限制型啟動子可以用於調控編碼本發明定點修飾多肽的核酸在多種多樣的不同組織和細胞類型中的表達，此視生物體而定。一些空間限制型啟動子還受到臨時限制，以便啟動子在胚胎發育的特定階段期間或在生物過程的特定階段期間(例如小鼠的毛囊周期)呈「開啟」狀態或「關閉」狀態。出於說明的目的，空間限制型啟動子的實例包括(但不限於)神經元特異性啟動子、脂肪細胞特異性啟動子、心肌細胞特異性啟動子、平滑肌特異性啟動子、感光體特異性啟動子等。神經元特異性空間限制型啟動子包括(但不限於)神經元特異性烯醇酶(nse)啟動子(參見例如emblhseno2，x51956)；芳香族胺基酸脫羧酶(aadc)啟動子；神經纖毛啟動子(參見例如基因庫humnfl，l04147)；突觸蛋白啟動子(參見例如基因庫humsynib，m55301)；thy-1啟動子(參見例如陳(chen)等人(1987)《細胞》51：7-19；和萊維寧(llewellyn)等人(2010)《自然醫學(nat.med.)》16(10)：1161-1166)；血清素受體啟動子(參見例如基因庫s62283)；酪氨酸羥化酶啟動子(th)(參見例如奧(oh)等人(2009)《基因療法(genether)》16：437；世岡(sasaoka)等人(1992)《腦分子研究(mol.brainres.)》16：274；班迪(boundy)等人(1998)《神經科學雜誌(j.neurosci.)》18：9989；和卡琳達(kaneda)等人(1991)《神經元(neuron)》6：583-594)；gnrh啟動子(參見例如拉多維克等人(1991)《美國國家科學院院刊》88：3402-3406)；l7啟動子(參見例如奧伯蒂克(oberdick)等人(1990)《科學》248：223-226)；dnmt啟動子(參見例如巴特吉(bartge)等人(1988)《美國國家科學院院刊》85：3648-3652)；腦啡肽啟動子(參見例如庫勃(comb)等人(1988)《歐洲分子生物學雜誌(emboj.)》17：3793-3805)；髓磷脂鹼性蛋白(mbp)啟動子；ca2+鈣調蛋白依賴性蛋白激酶ii-α(camkiiα)啟動子(參見例如梅福特(mayford)等人(1996)《美國國家科學院院刊》93：13250；和卡薩諾瓦(casanova)等人(2001)《起源(genesis)》31：37)；cmv增強子/血小板源生長因子-β啟動子(參見例如劉(liu)等人(2004)《基因療法(genetherapy)》11：52-60)；以及其類似物。脂肪細胞特異性空間限制型啟動子包括(但不限於)ap2基因啟動子/增強子，例如人類ap2基因的區域-5.4kb到+21bp(參見例如託左(tozzo)等人(1997)《內分泌學(endocrinol.)》138：1604；羅斯(ross)等人(1990)《美國國家科學院院刊》87：9590；和帕維佳尼(pavjani)等人(2005)《自然醫學》11：797)；葡萄糖轉運子-4(glut4)啟動子(參見例如奈特(knight)等人(2003)《美國國家科學院院刊》100：14725)；脂肪酸移位酶(fat/cd36)啟動子(參見例如慄城(kuriki)等人(2002)《生物學與藥學通報(biol.pharm.bull.)》25：1476；和佐藤(sato)等人(2002)《生物化學雜誌(j.biol.chem.)》277：15703)；硬脂醯基-coa脫飽和酶-1(scd1)啟動子(塔波(tabor)等人(1999)《生物化學雜誌》274：20603)；瘦素啟動子(參見例如梅森(mason)等人(1998)《內分泌學》139：1013；和陳(chen)等人(1999)《生物化學與生物物理學研究通訊(biochem.biophys.res.comm.)》262：187)；脂聯素啟動子(參見例如基塔(kita)(2005)《生物化學與生物物理學研究通訊》331：484；和查克拉巴蒂(chakrabarti)(2010)《內分泌學》151：2408)；降脂素啟動子(參見例如普拉特(platt)等人(1989)《美國國家科學院院刊》86：7490)；抵抗素啟動子(參見例如賽歐(seo)等人(2003)《分子內分泌學(molec.endocrinol.)》17：1522)；以及其類似物。心肌細胞特異性空間限制型啟動子包括(但不限於)來源於以下基因的控制序列：肌凝蛋白輕鏈-2、α-肌凝蛋白重鏈、ae3、心臟肌鈣蛋白c、心臟肌動蛋白及其類似物。弗朗茲(franz)等人(1997)《心血管研究(cardiovasc.res.)》35：560-566；羅賓斯(等人)(1995)《紐約科學院年鑑》752：492-505；麗恩(linn)等人(1995)《循環研究(circ.res.)》76：584-591；帕瑪克(parmacek)等人(1994)《分子與細胞生物學(mol.cell.biol.)》14：1870-1885；亨特(hunter)等人(1993)《高血壓(hypertension)》22：608-617；和薩託瑞尼(sartorelli)等人(1992)《美國國家科學院院刊》89：4047-4051。平滑肌特異性空間限制型啟動子包括(但不限於)sm22α啟動子(參見例如阿庫萊克(akyürek)等人(2000)《分子醫學(mol.med.)》6：983；和美國專利案第7，169,874號)；平滑肌特異性蛋白啟動子(參見例如wo2001/018048)；α-平滑肌肌動蛋白啟動子；以及其類似物。舉例來說，sm22α啟動子的0.4kb區域(其中有兩個carg元件)已經表明可介導血管平滑肌細胞特異性表達(參見例如金(kim)等人(1997)《分子與細胞生物學》17，2266-2278；李(li)等人，(1996)《細胞生物學雜誌》132，849-859；以及姆斯勒(moessler)等人(1996)《發育(development)》122，2415-2425)。感光體特異性空間限制型啟動子包括(但不限於)視紫質啟動子；視紫質激酶啟動子(楊(young)等人(2003)《眼科學與視力學(ophthalmol.vis.sci.)》44：4076)；β磷酸二酯酶基因啟動子(尼考(nicoud)等人(2007)《基因醫學雜誌(j.genemed.)》9：1015)；色素性視網膜炎基因啟動子(尼考等人(2007)，同上)；光受體間類視黃醇結合蛋白(irbp)基因增強子(尼考等人(2007)，同上)；irbp基因啟動子(橫山(yokoyama)等人(1992)《實驗眼科研究(expeyeres.)》55：225)；以及其類似物。在本文中可互換使用的術語「dna調控序列」、「控制元件」以及「調控元件」是指轉錄和轉譯控制序列，如啟動子、增強子、聚腺苷酸化信號、終止子、蛋白質降解信號及其類似物，其實現和/或調控非編碼序列(例如靶向dna的rna)或編碼序列(例如定點修飾的多肽，或cas9/csn1多肽)的轉錄且/或調控所編碼多肽的轉譯。適合的表達載體包括(但不限於)病毒載體(例如基於以下病毒的病毒載體：牛痘病毒；脊髓灰質炎病毒；腺病毒(參見例如李等人，《眼科研究與視力學(investopthalmolvissci)》35：25432549，1994；波納斯(borras)等人，《基因療法》6：515524，1999；李和戴維森(davidson)，《美國國家科學院院刊》92：77007704，1995；坂本(sakamoto)等人，《人類基因療法(hgenether)》5：10881097，1999；wo94/12649、wo93/03769；wo93/19191；wo94/28938；wo95/11984以及wo95/00655)；腺相關病毒(參見例如阿里(ali)等人，《人類基因療法(humgenether)》9：8186，1998；弗蘭納裡(flannery)等人，《美國國家科學院院刊》94：69166921，1997；班尼特(bennett)等人，《眼科研究與視力學》38：28572863，1997；久瑪麗(jomary)等人，《基因療法》4：683690，1997；羅玲(rolling)等人，《人類基因療法》10：641648，1999；阿里等人，《人類分子遺傳學(hummolgenet)》5：591594，1996；斯瑞瓦斯特娃(srivastava)，wo93/09239；薩姆斯基(samulski)等人，《病毒學雜誌(j.vir.)》(1989)63：3822-3828；蒙德爾森(mendelson)等人，《病毒學(virol.)》(1988)166：154-165；以及弗洛狄(flotte)等人，《美國國家科學院院刊》(1993)90：10613-10617)；sv40；單純性皰疹病毒；人類免疫缺陷病毒(參見例如三好(miyoshi)等人，《美國國家科學院院刊》94：1031923，1997；高橋(takahashi)等人，《病毒學雜誌(jvirol)》73：78127816，1999)；逆轉錄病毒載體(例如鼠類白血病病毒、脾壞死病毒，以及來源於逆轉錄病毒的載體，如勞斯氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)、哈維肉瘤病毒(harveysarcomavirus)、禽白血病病毒、慢病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒以及乳腺腫瘤病毒)；以及其類似物。許多適合的表達載體已為所屬領域的技術人員所知，且多者可購得。舉例而言，提供以下載體；對於真核宿主細胞來說：pxt1、psg5(斯塔津(stratagene))、psvk3、pbpv、pmsg以及psvlsv40(法瑪西亞(pharmacia))。然而，可以使用任何其它載體，只要其與宿主細胞兼容即可。視所用的宿主/載體系統而定，表達載體中可使用多種適合轉錄和轉譯控制元件(包括組成以及誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等)中的任一個(參見例如比特(bitter)等人(1987)《酶學方法(methodsinenzymology)》153：516-544)。本發明中還提供含有核酸(例如如上文所述)的細胞，所述核酸含有編碼本發明高親和力pd-1模擬多肽的核苷酸序列。此類細胞可以是來自任何生物體的細胞(例如細菌細胞、古細菌細胞、單細胞真核生物體的細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞(例如酵母細胞)、動物細胞、無脊椎動物的細胞(例如果蠅、腔腸動物、棘皮動物、線蟲等)、脊椎動物的細胞(例如魚、兩棲動物、爬行動物、鳥類、哺乳動物)、哺乳動物的細胞、齧齒動物的細胞、人類的細胞等)。使用方法提供的方法用於治療、減少和/或預防癌症；治療、減少且/或預防感染(例如慢性感染)；且/或用於治療、減少且/或預防免疫疾病或病症(例如發炎疾病、與免疫抑制相關的病狀等)(例如多發性硬化症、關節炎及其類似疾病)。舉例來說，在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以用作免疫刺激劑(例如用於免疫增強)。在一些情況下，本發明方法使得個體中的癌細胞數目減少。在一些情況下，本發明方法使得腫瘤尺寸減小。在一些情況下，本發明方法使得腫瘤尺寸減小。在一些情況下，本發明方法減少了第一細胞上的pd-1對第二細胞上的pd-l1的結合。在一些情況下，本發明方法是一種診斷和/或預後個體的方法(例如診斷和/或預後個體癌症)。舉例來說，高親和力pd-1模擬多肽適用作成像劑，例如與可檢測標記(如pet標記)和/或螢光標記(例如如本發明中別處所述)結合時，其可以用於各種目的，如診斷/預後試劑。舉例來說，在一些情況下，本發明方法是一種診斷或預後個體癌症(例如其中可檢測pd-l1的存在、含量和/或位置能夠診斷和/或預後的癌症)的方法。治療劑(例如本發明的高親和力pd-1模擬多肽)抑制pd-1介導的細胞信號傳導能夠活化免疫細胞(例如t細胞、b細胞、nk細胞等)，並且因此增強免疫細胞功能，如抑制癌細胞生長和/或病毒感染，且恢復免疫監視和免疫記憶功能以治療人類疾病。可以用本發明高親和力pd-1模擬多肽治療的症狀、病痛和/或疾病實例包括(但不限於)癌症(任何形式的癌症，包括(但不限於)：癌瘤、軟組織腫瘤、肉瘤、畸胎瘤、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、腦癌、實體腫瘤、間皮瘤(msto)等)；感染(例如慢性感染)；和/或免疫疾病或病症(例如發炎疾病)(例如多發性硬化症、關節炎及其類似疾病)。舉例來說，在一些情況下，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以用作免疫刺激劑(例如用於免疫增強)。涉及免疫抑制的任何疾病、病症或病痛(例如pd-1、pd-l1或pd-l2信號傳導所誘導的免疫抑制信號所導致)可以使用本發明的高親和力pd-1模擬多肽加以治療。任何癌症均是適於用本發明方法和組合物治療的癌症。在一些情況下，癌症中的癌細胞表達pd-l1(即對於pd-l1表達來說呈陽性)。在一些情況下，癌症中的癌細胞不表達pd-l1，然而此類癌症仍然能夠用本發明的高親和力pd-1模擬多肽治療(例如由於高親和力pd-1模擬多肽的免疫增強作用)。如本文中所用，「癌症」包括任何癌症形式，包括(但不限於)實體腫瘤癌症(例如肺、前列腺、乳房、膀胱、結腸、卵巢、胰臟、腎臟、肝臟、神經膠母細胞瘤、神經管胚細胞瘤、平滑肌肉瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、黑色素瘤、神經內分泌等)以及液體癌症(例如血液癌症)；癌瘤；軟組織腫瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑色素瘤；白血病；淋巴瘤；以及腦癌，包括微小殘留病，且包括原發性和轉移性腫瘤。任何癌症均是適於用本發明方法和組合物治療的癌症。在一些情況下，癌細胞表達pd-l1。在一些情況下，癌細胞不表達pd-l1(例如在此類情況下，所治療的個體的免疫系統細胞表達pd-l1)。癌瘤是源於上皮組織中的惡性病。上皮細胞覆蓋身體的外表面，形成內部空腔的內襯且形成腺組織的內襯。癌瘤實例包括(但不限於)：腺癌(始於腺(分泌性)細胞的癌症)，例如乳房、胰臟、肺、前列腺以及結腸的癌症可以是腺癌；腎上腺皮質癌；肝細胞癌；腎細胞癌；卵巢癌；原位癌；導管癌瘤；乳癌；基底細胞癌；鱗狀細胞癌；移行細胞癌；結腸癌；鼻咽癌；多室囊性腎細胞癌；燕麥細胞癌；大細胞肺癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；及其類似癌瘤。癌瘤可以發現於前列腺、胰臟、結腸、腦(通常為繼發性轉移)、肺、乳房、皮膚等。軟組織腫瘤是來源於結締組織的一組高度多樣化罕見腫瘤。軟組織腫瘤實例包括(但不限於)：腺泡狀軟組織肉瘤；血管瘤樣纖維組織細胞瘤；軟骨粘液樣纖維瘤；骨骼軟骨肉瘤；骨外粘液樣軟骨肉瘤；透明細胞肉瘤；促結締組織增生小圓形細胞腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤；子宮內膜間質瘤；尤文氏肉瘤；纖維瘤病(硬纖維瘤)；嬰兒纖維肉瘤；胃腸道間質瘤；骨巨細胞瘤；腱鞘巨細胞瘤；發炎肌纖維母細胞腫瘤；子宮平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂母細胞瘤；典型脂肪瘤；梭形細胞或多形性脂肪瘤；非典型脂肪瘤；軟骨狀脂肪瘤；高分化型脂肪肉瘤；粘液樣/圓形細胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；粘液樣惡性纖維組織細胞瘤；高分級惡性纖維組織細胞瘤；粘液纖維肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤；間皮瘤；神經母細胞瘤；骨軟骨瘤；骨肉瘤；原始神經外胚層瘤；腺泡狀橫紋肌肉瘤；胚胎橫紋肌肉瘤；良性或惡性神經鞘瘤；滑膜肉瘤；伊凡氏腫瘤；結節性筋膜炎；硬纖維瘤型纖維瘤病；孤立性纖維性腫瘤；隆凸性皮膚纖維肉瘤(dfsp)；血管肉瘤；上皮狀血管內皮瘤；腱鞘巨細胞瘤(tgct)；色素沉著絨毛結節性滑膜炎(pvns)；纖維性結構不良；粘液纖維肉瘤；纖維肉瘤；滑膜肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤；神經纖維瘤；以及軟組織多形性腺瘤；以及來源於纖維母細胞、肌纖維母細胞、組織細胞、血管細胞/內皮細胞以及神經鞘細胞的贅瘤。肉瘤是一種罕見的癌症類型，其產生於間葉起源的細胞，例如骨骼或身體軟組織，包括軟骨、脂肪、肌肉、血管、纖維性組織或其它結締組織或支持組織。肉瘤的不同類型是基於癌症形成之處。舉例來說，骨肉瘤形成於骨骼，脂肪肉瘤形成於脂肪，且橫紋肌肉瘤形成於肌肉。肉瘤實例包括(但不限於)：阿斯金氏腫瘤；葡萄狀肉瘤；軟骨肉瘤；尤文氏肉瘤；惡性血管內皮瘤；惡性神經鞘瘤；骨肉瘤；以及軟組織肉瘤(例如腺泡狀軟組織肉瘤；血管肉瘤；乳腺葉狀囊肉瘤性皮膚纖維肉瘤(dfsp)；硬纖維腫瘤；促結締組織增生小圓形細胞腫瘤；上皮狀肉瘤；骨外軟骨肉瘤；骨外骨肉瘤；纖維肉瘤；胃腸道間質瘤(gist)；血管外皮瘤；血管內皮瘤(通常被稱為「血管肉瘤」)；卡波西氏肉瘤；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；周邊神經鞘惡性腫瘤(mpnst)；神經纖維肉瘤；滑膜肉瘤；未分化多形性肉瘤及其類似肉瘤。畸胎瘤是一種類型的生殖細胞腫瘤，其可以含有若干不同類型的組織(例如可以包括來源於三種胚層：內胚層、中胚層以及外胚層中的任一種和/或全部的組織)，包括例如毛髮、肌肉以及骨骼。畸胎瘤大部分發生於女性卵巢、男性睪丸以及兒童尾骨中。黑色素瘤是始於黑色素細胞(產生色素黑色素的細胞)的癌症形式。其可以始於胎塊(皮膚黑色素瘤)，而且可以始於其它著色組織，如眼睛中或腸中。白血病是始於血液形成組織(如骨髓)的癌症，且導致大量的異常血細胞產生且進入血流中。舉例來說，白血病可以源於通常在血流中成熟的骨髓源細胞。白血病是根據疾病快速產生和進展的程度(例如急性相對於慢性)且根據所感染的白血球的類型(例如骨髓相對於淋巴)來命名。骨髓白血病也稱為骨髓性或骨髓母細胞性白血病。淋巴白血病也稱為淋巴母細胞性或淋巴細胞性白血病。淋巴白血病細胞可以聚集於淋巴結中，所述淋巴結可以變得腫脹。白血病實例包括(但不限於)：急性骨髓性白血病(aml)、急性淋巴母細胞白血病(all)、慢性骨髓性白血病(cml)以及慢性淋巴細胞性白血病(cll)。淋巴瘤是始於免疫系統細胞的癌症。舉例來說，淋巴瘤可以源於通常在淋巴系統中成熟的骨髓源細胞。淋巴瘤存在兩個基本類別。一種是霍奇金淋巴瘤，其標誌為存在一種稱為裡德-斯騰伯格細胞的細胞類型。當前認可的hl類型存在6種。霍奇金淋巴瘤實例包括：結節性硬化經典霍奇金淋巴瘤(chl)、混合細胞性chl、淋巴細胞耗乏型chl、淋巴細胞富集型chl以及結節性淋巴細胞主導性hl。另一類別的淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(nhl)，其包括一大組多種多樣的免疫系統細胞癌症。非霍奇金淋巴瘤可以進一步分成具有頑固性(緩慢生長)過程的癌症以及具有侵襲性(快速生長)過程的癌症。當前認可的nhl類型存在61種。非霍奇金淋巴瘤的實例包括(但不限於)：aids相關淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴瘤、母細胞性nk細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(burkitt′slymphoma)、伯基特樣淋巴瘤(小非裂解細胞淋巴瘤)、慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、皮膚t細胞淋巴瘤、瀰漫性大b細胞淋巴瘤、腸病型t細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、肝脾γ-δt細胞淋巴瘤、t細胞白血病、淋巴母細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、鼻t細胞淋巴瘤、兒科淋巴瘤、周邊t細胞淋巴瘤、初始中樞神經系統淋巴瘤、轉型淋巴瘤、治療相關t細胞淋巴瘤以及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症。腦癌包括腦組織的任何癌症。腦癌的實例包括(但不限於)：神經膠質瘤(例如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、寡突神經膠質細胞瘤、室管膜瘤及其類似癌症)、腦膜瘤、腦垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層腫瘤(神經管胚細胞瘤)等。如本文中所用，術語「感染」是指生物體(即，受檢者)的至少一個細胞處於被傳染媒介物(例如患有細胞內病原體感染(例如慢性細胞內病原體感染)的受檢者)感染的任何狀態。如本文中所用，術語「傳染媒介物」是指一種外來生物實體(即，病原體)，其誘導所感染生物體的至少一個細胞中的pd-l(pd-l1和/或pd-l2)表達(例如pd-l表達增強)。舉例來說，傳染媒介物包括(但不限於)細菌、病毒、原生動物和真菌。細胞內病原體備受關注。傳染病是由傳染媒介物引起的病症。一些傳染媒介物在某些條件下引起無法識別的症狀或疾病，但在改變的條件下潛在地引起症狀或疾病。本發明方法可以用於治療慢性病原體感染，包括(但不限於)例如病毒感染，例如逆轉錄病毒、慢病毒、嗜肝dna病毒(hepadnavirus)、皰疹病毒、痘病毒、人類乳頭瘤病毒等；細胞內細菌感染，例如分枝桿菌屬(mycobacterium)、嗜衣體屬(chlamydophila)、艾利希體屬(ehrlichia)、立克次體屬(rickettsia)、布氏桿菌屬(brucella)、軍團菌屬(legionella)、弗朗西斯氏菌屬(francisella)、李斯特菌屬(listeria)、考克斯氏體屬(coxiella)、奈瑟氏菌屬(neisseria)、沙門氏菌屬(salmonella)、耶爾森氏菌種(yersiniasp)、幽門螺旋桿菌(helicobacterpylori)等；以及細胞內原蟲病原體，瘧原蟲種(plasmodiumsp)、錐蟲種(trypanosomasp.)、梨形鞭毛蟲種(giardiasp.)、弓蟲種(toxoplasmasp.)、利什曼原蟲種(leishmaniasp.)等。可以使用本發明高親和力pd-1模擬多肽加以治療的傳染病包括(但不限於)：hiv、流感、皰疹、梨形鞭毛蟲屬、瘧疾、利什曼原蟲屬、肝炎病毒(a、b及c)引起的病原性感染、皰疹病毒(例如vzv、hsv-i、hav-6、hsv-ii以及cmv、埃-巴二氏病毒(epsteinbarrvirus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackievirus)、冠狀病毒、呼吸合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革病毒(denguevirus)、乳突狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病病毒、jc病毒和蟲媒病毒腦炎病毒、細菌衣原體引起的病原性感染、立克次體細菌、分枝桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、肺炎球菌屬、腦膜炎球菌屬和淋球菌屬、克雷伯氏菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、假單胞菌屬、大腸桿菌、軍團菌屬、白喉、沙門氏菌屬、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌中毒、炭疽病、瘟疫、鉤端螺旋體病，以及萊姆氏病細菌、真菌念珠菌屬(白色念珠菌(albicans)、克柔氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)引起的病原性感染、新型隱球菌(cryptococcusneoformans)、麴黴屬(煙麴黴、黑麴黴等)、毛黴屬(毛黴、犁頭黴、如根黴)、申克氏孢子絲菌(sporothrixschenkii)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)和莢膜組織胞漿菌(histoplasmacapsulatum)，以及寄生蟲溶組織內阿米巴(entamoebahistolytica)引起的病原性感染、結腸小袋纖毛蟲(balantidiumcoli)、福氏耐格裡變形蟲(naegleriafowleri)、棘阿米巴種(acanthamoebasp.)、蘭伯氏梨形鞭毛蟲(giardialambia)、隱孢子蟲種(cryptosporidiumsp.)、肺炎肺囊蟲(pneumocystiscarinii)、間日瘧原蟲(plasmodiumvivax)、田鼠巴倍蟲(babesiamicroti)、布氏錐蟲(trypanosomabrucei)、克氏錐蟲(trypanosomacruzi)、杜氏利什曼原蟲(leishmaniadonovani)、剛地弓蟲(toxoplasmagondi)和/或巴西日圓線蟲(nippostrongylusbrasiliensis)。在一些實施例中，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以阻斷pd-l(例如pd-l1和/或pd-l2)誘導的抑制信號，且藉此使免疫細胞活化。因此，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以促進和/或刺激免疫細胞(尤其是細胞表面上表達pd-1的免疫細胞)產生細胞激素和/或趨化激素。舉例來說，與免疫細胞相互作用的免疫複合物(即，抗原-抗體複合物)的存在使免疫細胞活化且誘導免疫細胞產生細胞激素，但這種活化(刺激)可以被第二細胞表面上的pd-l抑制。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以用於改變免疫細胞的免疫反應性且由此可以適用於治療或預防免疫疾病或病症(例如與免疫抑制相關的病症)。換句話說，本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以作為刺激免疫系統的藥劑用於免疫增強(刺激免疫系統)。上述方法包括向需要治療的個體投與治療有效量或有效劑量的本發明高親和力pd-1模擬多肽，包括(但不限於)高親和力pd-1模擬多肽與藥物(例如化學治療藥物、腫瘤特異性抗體、消炎藥、治療感染的藥物、免疫刺激劑(即，免疫增強劑)、刺激免疫系統的藥劑等)的組合。本發明的治療實體的有效劑量(例如用於治療癌症的有效劑量)根據許多不同因素而變，包括投藥方式、靶點、患者的生理狀態、患者的生理狀態、患者是人類還是動物、所投與的其它藥物以及治療是預防性還是治療性的。通常，患者是人類，但也可以治療非人類哺乳動物，例如伴侶動物，如狗、貓、馬等，實驗室哺乳動物，如兔、小鼠、大鼠等，及其類似物。為了優化安全和功效，可以滴定治療劑量。在一些實施例中，治療性劑量可以在每公斤宿主體重約0.0001到100mg且更通常0.01到5mg範圍內。舉例來說，劑量可以是每公斤體重1mg或每公斤體重10mg或在1到10mg/kg範圍內。示例性治療方案需要每兩周投與一次或一個月一次或每3到6個月一次。本發明的治療性實體通常在多個時機投與。單次劑量之間的時間間隔可以按周、月或年算。時間間隔還可以是不定期的，如通過測量治療實體在患者中的血液含量來指定。或者，本發明的治療性實體可以作為持續釋放型配製物投與，在這種情況下，需要降低投藥頻率。劑量和頻率根據抗體在患者中的半衰期而變化。在預防性應用中，在較長的一段時間內，可以相對不頻繁的時間間隔投與相對較低的劑量。一些患者在其餘生繼續接受治療。在其它治療性應用中，有時需要以相對較短的時間間隔投與相對較高的劑量直到疾病進展減慢或終止為止，且優選地直到患者展示疾病症狀的部分或完全改善為止。隨後，可以按預防性方案投與患者。在又其它實施例中，本發明的方法包括治療、減少或預防任一種上述病狀、病痛和/或疾病(例如腫瘤生長、腫瘤轉移或癌症腫瘤侵入，包括淋巴瘤、白血病、癌瘤、黑色素瘤、膠質母細胞瘤、肉瘤、骨髓瘤等)。在預防性應用中，醫藥組合物或藥劑是按足以排除或降低疾病風險、減輕疾病嚴重度或延遲疾病發作的量投與易患疾病或另外處於疾病風險中的患者，所述疾病包括疾病的生物化學、組織學和/或行為症狀、其併發症以及在疾病發展期間呈現的中間病理學表型。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以活體外以及活體內用於監測疾病治療過程，舉例來說，通過測量表達pd-l(pd-l1和/或pd-l2)的細胞(具體地說，表達pd-l1的慢性感染細胞和/或癌細胞)數目的增加或減少，可以確定旨在改善疾病的特定治療方案是否有效。出於此類目的，高親和力pd-1模擬多肽可以進行可檢測標記。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以活體外用於結合分析中，其中其可以用於液相中或結合到固相載劑。另外，這些免疫分析中的多肽可以按不同方式進行可檢測標記。可以利用高親和力pd-1模擬多肽的分析類型實例是流式細胞術，例如facs、macs、組織化學、直接或間接形式的競爭性和非競爭性免疫分析；以及其類似分析。使用高親和力pd-1模擬多肽檢測pd-l可以利用按正向、逆向或同時模式運行的分析進行，包括針對生理學樣品的組織化學分析。本發明的高親和力pd-1模擬多肽可以結合到多種不同載劑且用於偵測表達pd-l(pd-l1和/或pd-l2)的細胞的存在。熟知載劑的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚葡萄糖、尼龍、澱粉酶、天然和改性的纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖以及磁鐵。載劑性質就本發明的目的而言可以是可溶性或不溶性的。所屬領域的技術人員已知適用於結合蛋白的其它載劑，或能夠使用常規實驗確定此類載劑。所屬領域的技術人員已知多種不同標記和標記方法。可以用於本發明中的標記類型實例包括(但不限於)酶、放射性同位素、螢光化合物、膠態金屬、納米粒子、化學發光化合物以及生物發光化合物。所屬領域的技術人員已知適用於本發明多肽的其它標記，或能夠使用常規實驗確定此類標記。另外，這些標記對本發明多肽的結合可以使用所屬領域的技術人員常見的標準技術進行。pd-l當存在於生物體液和組織中時可以通過本發明的高親和力pd-1模擬多肽進行偵測。可以使用含有可檢測量的pd-l的任何樣品。樣品可以是液體，如尿液、唾液、腦脊髓液、血液、血清及其類似物，或固體或半固體，如組織、糞便、活檢體及其類似物，或可替代地，固體組織，如組織學診斷中常用的那些組織。可以提高靈敏度的其它標記技術是由以下組成：使多肽與低分子量半抗原偶聯。這些半抗原然後可以特別藉助於第二反應來檢測。舉例來說，常見的是使用半抗原，如生物素，其與可以和特異性抗半抗原抗體反應的抗生物素蛋白或二硝基苯酚、吡哆醛或螢光素反應。高親和力pd-1模擬多肽的成像結合物可以利用一系列超過一次投藥來投與個體。成像結合物組合物可以在可視化技術之前的適當時間投與。舉例來說，在直接目視檢查之前的一小時內投藥可是適當的，或在pet或mri掃描之前的十二小時內投藥可是適當的。然而，應該注意投藥與可視化之間不允許耗時過多，因為成像化合物最終可以從患者的系統中清除。用於治療(例如治療癌症、慢性感染、免疫抑制、發炎等)的組合物可以通過不經腸、局部、靜脈內、瘤內、口服、皮下、動脈內、顱內、腹膜內、鼻內或肌肉內方式投與。典型的投藥路線是靜脈內或瘤內，但是其它路線可以同樣有效。組合物可以製備成呈液體溶液或懸浮液形式的注射劑；還可以製備適於在注射之前溶於或懸浮於液體媒劑中的固體形式。製劑還可以乳化或囊封於脂質體或微粒中，如聚乳酸交酯、聚乙交酯，或增強輔助效果的共聚物，如上文所論述。蘭格(langer)，科學(science)249：1527，1990和漢斯(hanes)，高級藥物遞送評論28：97-119，1997。本發明的藥劑可以儲槽式注射或植入式製劑形式投與，其可以允許活性成分持續或脈衝釋放的方式配製。藥物組合物通常配製為無菌、實質上等張的並且完全符合美國食品和藥物管理局的所有良好生產規範(goodmanufacturingpractice，gmp)規定。本文中所述的高親和力pd-1模擬多肽的毒性可以通過標準藥物程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如通過測定ld50(使50％的群體致死的劑量)或ld100(使100％的群體致死的劑量)。毒性作用與治療作用之間的劑量比是治療指數。從這些細胞培養物分析和動物研究獲得的數據可以用於配製在人類中使用的無毒劑量範圍。本文所述的蛋白質劑量優選地處於循環濃度的範圍內，包括毒性極小或無毒性的有效劑量。劑量可以根據所用劑型和所用投藥路線而在這個範圍內變化。個別醫師可以根據患者的病狀來選擇確切的配製物、投藥路線以及劑量。屬於本發明範圍內還有包含本發明組合物(例如高親和力pd-1模擬多肽和其配製物)以及使用說明書的試劑盒。所述試劑盒可以進一步含有至少一種額外試劑，例如化學治療藥物、抗腫瘤抗體以及抗感染藥物，例如抗病毒藥物等。試劑盒典型地包括指明試劑盒內容物的預定用途的標籤。術語標籤包括試劑盒上或隨試劑盒一起所提供、或以其它方式隨附於試劑盒的任何書面或記錄材料。序列表關鍵詞野生型人類pd-1蛋白質(也稱為pdcd1、cd279、pd1、sleb2、hpd-1、hpd-1以及hsle1)(粗體：跨膜域，胺基酸168-191；加下劃線：胺基酸26-147)野生型人類pd-1多肽的片段(r87、n91和r122加有下劃線)(本發明pd-1模擬多肽的實例；「野生型片段pd-1模擬多肽」)hac-ipd-1(位置41具有異亮氨酸的高親和力共同序列)hac-vpd-1(位置41具有纈氨酸的高親和力共同序列)g24-1(第2代，純系4-1)g24-2g24-3g24-5g24-12g14-12g14-2g14-5g14-1g14-4g14-10g24-10g24-14g24-4g24-22g24-6g24-7g24-18g24-23多聚化高親和力pd-1模擬多肽(例如針對改進的藥物動力學)(即，與多聚化域融合)hac-v『微體』(與含有鉸鏈區的人類igg1ch3域融合的hac-vpd-1)hac-vfc融合物(與人類iggfc(在此為效應功能降低(相較於其它fc區域)的人類igg4)融合的hac-vpd-1；且包括阻止fab臂交換的s228p突變；pd-1變異體與fc之間的aaa連接子)與「減弱」的細胞激素融合實例：hac-il2(f42a/d20t)與41bb促效劑融合實例：hac-41bbl與cd40促效劑融合實例：hac-cd40l與btla和/或cd160抑制劑融合實例：hac-btla誘餌：與tim3和/或ceacam1抑制劑融合實例：hac-tim3誘餌：半胱氨酸突變體(例如用於pet標記)hac-vn91chac-vr87chac-vr122c本發明現已充分描述，對於所屬領域的技術人員顯而易見的是，可以進行各種變化和修改而這些變化和修改不脫離本發明的精神或範圍。實驗以下實例的提出是為了向所屬領域的技術人員完整地揭露且描述如何製備和使用本發明，且不希望限制本發明人視為其發明的範圍，也不希望其表示下述實驗是所進行的全部或唯一實驗。已經努力確保關於所用數字(例如數量、溫度等)的準確度，但應該考慮到一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，否則份數是重量份，分子量是重量平均分子量，溫度是按攝氏度計並且壓力是大氣壓或接近大氣壓。本說明書中所引用的所有公開和專利申請均結合在此供參考，就如同各個別公開或專利申請特別地且個別地指出結合在此供參考一般。本發明已經按照特定實施例來描述，所述特定實施例由本發明人發現或提出以包含實施本發明的優選方式。所屬領域的技術人員應了解，根據本發明，可以對舉例說明的特定實施例進行多種修改和變化而這些修改和變化不脫離本發明的預定範圍。舉例來說，由於密碼子冗餘，因此可以對潛在的dna序列進行變化而不影響蛋白質序列。此外，由於生物學功能等效性考慮因素，因此可以對蛋白質結構進行變化而不影響生物學作用的種類或量。希望所有此類修改包括於所附權利要求書的範圍內。實例1以下實例表明產生有效拮抗pd-1與其配位體pd-l1之間相互作用的高親和力pd-1模擬多肽。高親和力pd-1模擬多肽可以作為治療劑用於與pd-1和pd-l1抗體(例如當前處於臨床試驗中的那些抗體)相同的適應症。圖1a描繪腫瘤細胞表面上的pd-l1特異性結合到t細胞表面上的pd-1以抑制t細胞活化，由此讓腫瘤細胞躲避免疫系統的摧毀。圖1b描繪(示意性圖解說明)本發明高親和力pd-1模擬多肽特異性結合到癌細胞表面上的pd-l1，藉此降低癌細胞抑制t細胞活化的能力，這又降低癌細胞躲避免疫反應的能力。圖2a描繪pd-1(右上方)與pd-l1(左下方)相互作用的結構圖示。位於與pd-l1接觸的位點的pd-1殘基用球形表示。誘導pd-1模擬多肽(包含野生型胺基酸殘基)在接觸pd-l1的殘基處發生突變以產生突變型多肽的第一代文庫(第1代)，其呈現於酵母細胞表面上。然後使用100nm生物素化人類pd-l1進行基於結合的選擇。為了篩選出對pd-l1親和力甚至更大的pd-1模擬多肽，產生突變型多肽的第二代文庫(第2代)，從而將突變誘發聚焦於匯聚位置。使用1nm生物素化人類pd-l1篩選第2代文庫。篩選結果參見圖2b。圖3中的表格反映了所產生的工程化變異體(本發明的高親和力pd-1模擬多肽)的序列。「g1」變異體來自第1代文庫，而「g2」變異體來自第2代文庫(參見圖2a-2b)。每一編號欄呈現了每個所示殘基相對於如seqidno：2所述的原生pd-1模擬多肽的胺基酸位置(seqidno：2的多肽是包括野生型pd-1序列、但缺乏跨膜域且缺乏野生型pd-1的前25個胺基酸的pd-1模擬多肽)。對於所回收的每種pd-1模擬多肽來說，相對於野生型胺基酸殘基的歧異是用單字母碼指示每種變異體所產生的突變。表面等離子體共振(spr)所測量的針對pd-l1的親和力是在右側指出(測量時)。基於所回收的序列，產生含有共同胺基酸突變的高親和力pd-1模擬多肽，且稱為「hac」(高親和力共同序列)。圖4描繪得自所進行的結合實驗(結合到pd-l1)的兩個代表性表面等離子體共振(spr)圖。原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)的解離半衰期小於一秒。相比之下，高親和力共同pd-1變異體hac-i(本發明的高親和力pd-1模擬多肽)的解離半衰期是42.4分鐘，由此表明所述高親和力pd-1模擬多肽結合到pd-l1的親和力比原生pd-1模擬多肽高得多。然後進行實驗以進一步測試所產生的一些高親和力pd-1模擬多肽的結合特徵(相較於原生pd-1模擬多肽)。圖5a-5c繪示了所產生的高親和力pd-1模擬多肽強有力地且特異性地結合到pd-l1。酵母呈現：(圖5a)人類pd-l1、(圖5b)人類pd-l2或(圖5c)小鼠pd-l1用經標記的原生pd-1模擬多肽抗生蛋白鏈菌素四聚體(具有野生型人類pd-1序列且與alexa647結合的對照pd-1模擬多肽)染色。經標記的原生pd-1模擬多肽與可變濃度的未標記高親和力pd-1模擬多肽(濃度指示於x軸上)競爭結合到pd-l1。未標記的原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)拮抗pd-1/pd-l1相互作用。高親和力pd-1模擬多肽(hac-vpd-1、g24-1以及g24-2)在濃度比原生pd-1模擬多肽低得多的情況下強有力地拮抗pd-1/pd-l1相互作用，由此表明其實際上是高親和力pd-1模擬多肽(圖1a)。高親和力pd-1模擬多肽對pd-1：pd-l2相互作用未顯示任何拮抗現象，而原生pd-1模擬多肽拮抗pd-1：pd-l2相互作用。因此，相較於原生pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力，這些特定的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l1的親和力增強，但相較於原生pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力，這些特定的高親和力pd-1模擬多肽對pd-l2的親和力降低(圖1b)。所產生的高親和力pd-1模擬多肽還能夠競爭結合到小鼠pd-l1(圖5c)。然後測試所產生的高親和力pd-1模擬多肽拮抗人類癌細胞上的pd-l1的能力。圖6a表明，通過2000u/ml人類幹擾素-γ(ifnγ)刺激24小時進行誘導後，pd-l1表達於人類黑色素瘤細胞系skmel28上(在誘導(外加ifnγ)相對於非誘導(減除ifnγ)條件下通過流式細胞術評估pd-l1染色)。ifnγ刺激的skmel28細胞用經標記的原生pd-1模擬多肽抗生蛋白鏈菌素四聚體(一種對照pd-1模擬多肽，其具有野生型人類pd-1序列且與alexa647結合)以及濃度可變的未標記高親和力pd-1模擬多肽(濃度指示於x軸上)染色(圖6b)。未標記的原生pd-1模擬多肽(具有野生型人類pd-1序列)不能有效地阻止(需要高濃度以便阻止)經標記的原生pd-1模擬多肽結合到skmel28細胞(ic50＝8.2μm)。相比之下，hac-v(一種高親和力pd-1模擬多肽)強有力地抑制經標記的原生pd-1模擬多肽結合(ic50為210pm)。hac-mbh(hac-v，一種高親和力pd-1模擬多肽，其與人類igg1的ch3域融合)以額外增強的效力(ic50為55pm)抑制經標記的原生pd-1模擬多肽結合。實例2：用於優化的免疫療法以及免疫pet成像的工程化高親和力pd-1變異體。(一些數據與實例1共享)通過免疫檢查點pd-1進行的信號傳導能夠通過抑制抗腫瘤免疫反應來實現腫瘤進展。單克隆抗體對pd-1與其配位體pd-l1之間的信號傳導軸的阻斷已經在癌症治療中展示了引人注目的臨床成功。然而，抗體具有可以使得其功效在這種背景下降低的固有局限性，包括不良的組織/腫瘤滲透率以及耗乏免疫細胞的有害fc效應子功能。為了確定針對pd-1/pd-l1的免疫療法是否可以使用較小的非抗體治療劑改進，在此使用通過酵母表面呈現進行的定向演化來將pd-1胞外域工程改造成pd-l1的高親和力(100pm)競爭性拮抗劑。與抗pd-l1單克隆抗體相比，高親和力pd-1顯示優良的腫瘤滲透而不誘導周邊效應子t細胞的耗乏。根據這些優勢，在同基因ct26腫瘤模型中，高親和力pd-1有效治療小腫瘤(約50mm3)與大腫瘤(＞150mm3)，而抗pd-l1抗體針對大腫瘤的活性完全消除。另外，高親和力pd-1經放射性標記且作為pet成像示蹤劑而應用於有效地區分活小鼠中的pd-l1陽性與pd-l1陰性腫瘤，從而提供替代侵入性活檢以及組織學分析的方式。這些結果突顯了小型非抗體治療劑用於增強癌症免疫療法以及免疫診斷學的有利藥理學。結果拮抗pd-l1的高親和力pd-1變異體的定向演化。如果其對pd-l1具有中等親和力(kd為8.2μm)18，那麼野生型pd-1胞外域是在治療性背景下競爭性拮抗pd-1：pd-l1相互作用的不良候選物。因此，使用通過酵母表面呈現進行的定向演化增強了pd-1對pd-l1的親和力。工程化策略是採用雙文庫方法。第一文庫用於鑑別使得親和力大大增加的突變「熱點」，且第二文庫用於確定源自第一文庫的有益突變的最佳組合。為了設計初始的「第一代」文庫，利用鼠類pd-1(mpd-1)與人類pd-l1(hpd-l1)19之間的複合物的晶體結構鑑別人類pd-1(hpd-1)的與pd-l1接觸的界面上的22個相應殘基以便進行隨機分組(圖7a；圖12a-12b)。將這個文庫呈現於酵母表面上且使用重組的生物素化hpd-l1胞外域作為選擇試劑進行四輪選擇(圖7b，「第1代」)。其餘克隆的生物物理學表徵展示對hpd-l1的親和力增加400到500倍，如通過表面等離子體共振所測量(圖7c)。然而，所述克隆展現不良的生物化學行為，其表達產量降低且傾向於聚集。對變異體序列(圖7c)的檢驗展示每種克隆平均16個突變，其中若干個隨機分布位置匯聚於一小組突變(例如v39、n41)，而其它位置似乎完全發散(例如s48、d52)，或反之具有原始野生型殘基的嚴謹偏好(例如p105、e111)。結果表明「第一代」變異體可能含有有益突變、非功能乘客突變和有害突變的混合物，如在文庫的理論多樣性極大(約1020個)的情況下(其經取樣而具有108種酵母轉型體)所預期。由此產生排除不必要且有害的取代的「第二代」文庫，同時優化使親和力增強的突變的組合(圖13a-13b)。文庫集中於似乎遠離野生型而匯聚且還在pd-1胞外域內的「核心」位置引入變異的那些位置(圖7a)。通過5輪選擇，獲得強烈結合pd-l1的變異體(圖7b，「第2代」)。相較於野生型hpd-1，所選變異體以15,000-40,000倍增強的親和力結合hpd-l1，且強烈傾向於匯聚到10個胺基酸取代的共同序列(包含八個接觸殘基和兩個核心殘基)上(圖7c)。產生這種「高親和力共同序列」(hac)pd-1的兩種形式，不同之處僅在於位置41的異亮氨酸或纈氨酸(分別稱為hac-i和hac-v)，且發現親和力或生物化學行為不可區別。兩種hac-pd-1變異體均容易表達，是單體，且以約100pm的kd值結合hpd-l1(圖7c)。如同其它高親和力變異體那樣，親和力的這種增強基本上受到解離速率顯著降低的驅動，從而產生約40分鐘的解離半衰期，相比之下，在野生型hpd-1：hpd-l1相互作用下，解離半衰期小於一秒(圖8a)。為了評估工程化pd-1變異體拮抗癌細胞上的pd-l1的能力，對人類和鼠類黑色素瘤細胞系進行競爭結合實驗。在人類sk-mel-28細胞上，hac-v阻斷野生型pd-1四聚體的結合，其中ic50為210pm，相較於野生型pd-1(ic50＝8.2μm)，效能增強40,000倍(圖8b)。雖然使用人類pd-l1進行選擇，但是相較於野生型hpd-1(ic50＝2.6μm)，hac-v還對鼠類b16-f10細胞上的pd-l1展示增強的阻斷作用(ic50＝69nm)，儘管效能相對於其對人類細胞的阻斷而降低(圖8b)。為了產生可以更高效地拮抗mpd-l1的hac-pd-1變異體用於活體內研究，使hac-v的序列與人類igg1的二聚ch3域融合以產生hac「微體」(hacmb；圖14)。憑藉其二聚結構所賦予的增強的親合力，hacmb分別強有力地阻斷skmel28以及b16-f10細胞上的hpd-l1(ic50＝55pm)以及mpd-l1(ic50＝1.2nm)(圖8b)。還表徵hac-pd-1對pd-1的第二配位體(pd-l2)的交叉反應性。在呈現hpd-l2胞外域的酵母上進行的競爭結合實驗中，相較於野生型pd-1(ic50＝2.5μm；圖8b)，hac-pd-1不可測量地抑制pd-1：pd-l2相互作用。綜合而言，這些結果表明hac-pd-1可以強有力地且特異性地拮抗pd-l1(且因此還可以充當模塊化支架供進一步工程化)。腫瘤滲透和t細胞耗乏研究。為了評估活體內hac-pd-1的pd-l1結合和腫瘤滲透，使用基因組編輯技術產生小鼠結腸癌株系ct26的亞株系，其對於mpd-l1表達呈確定的陰性，或對於mpd-l1呈陰性，但對於hpd-l1表達呈組成性陽性。這些pd-l1陽性和陰性細胞系容易通過螢光標記的抗hpd-l1抗體或螢光標記的hac-pd-1蛋白質的活體外染色區分(圖15a)。使用這些工程化株系，使得小鼠兩側移植有pd-l1陰性腫瘤和hpd-l1陽性腫瘤。一旦腫瘤直徑生長到約1cm，則通過腹膜內注射來全身性地遞送經螢光團標記的抗hpd-l1抗體和經螢光團標記的hac-pd-1的混合物。4小時後，解剖成對腫瘤且利用螢光顯微法與facs分析來評估每種藥劑的結合程度。在所有pd-l1陰性腫瘤中，組織學分析揭示了抗pd-l1抗體或hac-pd-1的結合檢測不到，這證實了兩種藥劑的特異性(圖9a)。相比之下，清楚地觀察到抗體與hpd-l1陽性腫瘤中的hac-pd-1的結合，但分布驚人的不同。雖然抗體相關的螢光信號局限於腫瘤的周邊區域以及緊鄰於血管的細胞，但hac-pd-1染色是廣泛的，其延伸到腫瘤內的深度區域(圖9a和圖15b)。對非酶促解離後的成對pd-l1陽性和陰性腫瘤的facs分析支持了這些定性的觀察結果。抗體和hacpd-1皆不能與pd-l1陰性腫瘤細胞發生明顯的相互作用(圖9b)。然而，在表達hpd-l1的腫瘤中，許多細胞對hac-pd-1染色呈陽性，且基本群體對於抗pd-l1抗體與hac-pd-1結合均呈陽性(圖9b)。相比之下，很少有(若有)細胞僅對於抗pd-l1抗體染色呈陽性(圖9b)。通過多次實驗量化這種信號揭示了hac-pd-1結合(p＜1x10-4)具有明顯的優勢，其中hac-pd-1所結合的細胞平均數超過抗pd-l1抗體的兩倍(圖9c)。綜合而言，這些數據說明了hac-pd-1能夠結合原本無法供抗體結合企及的腫瘤細胞上的pd-l1。hac-pd-1除其尺寸較小之外，還缺乏fc域，並且因此推測，與抗體相比，不會導致免疫介導的循環t細胞數目耗乏。為了檢驗這種假設，將來源於同基因結腸癌株系ct26的腫瘤移植到野生型balb/c小鼠中，且在移植後第14天開始，每天投與pbs、抗pd-l1抗體或hacmb療法(在這種情況下用於增強其與mpd-l1的結合)。治療開始後的72小時，注射抗pd-l1抗體的小鼠的循環周邊血液cd8+t細胞展現15％減幅(p＝0.011)(圖9d)。雖然絕大部分cd4+和cd8+細胞上的pd-l1表達是可檢測的(圖16)，但是耗乏效應對cd8+t細胞具有特異性，從而避開cd4+區室(圖9d)。與抗體相比，hacmb蛋白質的每日治療對循環t細胞含量具有檢測不到的影響(圖9d)，而其對淋巴結t細胞的影響稍微更複雜。如同在血液中，抗pd-l1抗體的治療引起cd8+t細胞出現明顯的耗乏(圖9e，約20％，p＜1x10-4)。然而，不同於在血液中(在血液中，其不具有作用)，hacmb治療確實引起淋巴結中的cd8+t細胞含量稍微減少，但是與抗pd-l1抗體相比，程度明顯更小(圖9e，約10％，p＝0.022)。這種觀察結果表明，定向pd-1/pd-l1的藥劑對於t細胞動力學可以具有多重效應，包括fc介導的耗乏以及刺激t細胞輸送到腫瘤中。hac-pd-1在同基因腫瘤模型中的治療功效。鑑於hacpd-1藥劑有效地拮抗人類pd-l1與小鼠pd-l1，因此測試這種阻斷作用是否可以放大再現抗pd-l1抗體的抗腫瘤作用。作為hac-pd-1活體內功效的初始測試，將同基因ct26腫瘤移植到具有免疫能力的野生型balb/c小鼠中，其先前已經展示對抗pd-l1抗體具有反應。移植後第7天，當腫瘤平均尺寸達到約50mm3時，將小鼠隨機分入治療組且開始每日注射pbs、抗pd-l1抗體或hacmb(圖10a)。正如所預期，經pbs治療的小鼠的腫瘤快速生長(圖10b)。然而，截至第14天，抗pd-l1或hacmb治療使腫瘤生長相對於對照來說明顯減緩(圖10b，分別為p＝2x10-4以及p＜1x10-4)。這兩種藥劑在這項小腫瘤研究中顯示幾乎相同的功效，其中兩個治療組的腫瘤生長之間無統計差異(圖10b，p＝0.99)。根據這些活體內治療結果，作出以下結論：在相對較小腫瘤的背景下，hacmb的功效與經充分驗證的抗pd-l1單克隆抗體療法無法區分。根據初始實驗的設計，小鼠癌症模型的許多報告依賴於腫瘤的極早期療法以便展現穩固的治療作用。然而，鑑於hacpd-1的組織滲透優良以及其阻斷pd-1：pd-l1相互作用的能力而不誘導適得其反的循環t細胞耗乏，因此假設當嘗試治療更大、更具有挑戰性的腫瘤時，其相較於抗體的優勢可能最明顯。為此目的，開始進行實驗，其中將ct26細胞移植到balb/c小鼠中，且每日監測其腫瘤體積；僅當個別腫瘤達到150mm3的最小體積時或之前實驗的平均開始尺寸的約三倍時，將宿主小鼠隨機分組且開始治療。實驗方案的這種簡單變化對這些藥劑的比較性功效產生了深刻的影響。雖然抗pd-l1抗體和hacmb等效地治療極小ct26腫瘤(圖10b)，但是在較大腫瘤的情況下，甚至每日注射抗pd-l1抗體也未能取得優於pbs療法的任何可測量功效(圖10d，左側，p＝0.464)。形成鮮明對比的是，相較於經pbs治療的小鼠(圖10d，右側，p＜1x10-4)或經抗體治療的小鼠(圖10d，左側，p＜1x10-4)，hacmb在持續研究期間明顯地減少了大腫瘤的腫瘤生長。接下來測試hacmb作為單一療法的優良功效在組合背景(例如與抗ctla4抗體組合)下是否繼續存在。抗ctla4抗體療法本身在這種大腫瘤模型中是有效的，相對於pbs療法可以減緩腫瘤生長(圖10d，左側和右側，p＜1x10-4)；然而，抗pd-l1抗體與抗ctla4抗體一起的共療法未能產生優於單獨抗ctla4的任何額外益處(圖10d，左側，p＝0.756)。相比之下，hacmb改善了抗ctla4療法，因為相較於hacmb(圖10d，p＝0.012)或單獨的抗ctla4(圖10d，p＝0.006)，經抗ctla4與hacmb組合治療的小鼠的腫瘤明顯減小。總之，這些活體內研究表明了hacpd-1有效治療同基因小鼠腫瘤。重要的是，結果說明腫瘤尺寸的增加不成比例地影響抗pd-l1抗體的功效(實際上，腫瘤一旦超過一定的尺寸閾值，則會導致所述抗體低效)，而hac-pd-1蛋白質在具有挑戰性且在臨床上更現實的腫瘤模型中仍然具有功效。這種觀察結果因此表明抗pd-1或抗pd-l1抗體可能未完全捕獲pd-1：pd-l1阻斷作用的最大治療益處，且在優化治療劑的情況下，進一步改善是有可能的。使用64cu放射性標記的hac-pd-1，通過正電子發射斷層掃描(pet)對pd-l1表達進行的活體內檢測。腫瘤pd-l1表達已表明是預測針對pd-1或pd-l1定向免疫療法的反應的潛在生物標記。目前，腫瘤上的pd-l1表達最常通過活檢、隨後通過免疫組織化學染色來評估。然而，除活檢程序的相關風險和禁忌之外，所產生的組織分析因腫瘤內的pd-l1的異質空間表達模式而複雜化。「免疫pet」可以提供藉以同時測量整個腫瘤中的pd-l1表達的無創方式，而無需切除任何組織。據推測，放射性標記的hac-pd1由於其對pd-l1的高親和力和特異性以及其增強的組織滲透，因此可以充當評估腫瘤pd-l1表達的有效pet探針。為了開發出基於hac-pd-1支架的pet示蹤劑，使突變型變異體hac-n91c與硫醇反應性雙官能螯合劑dota-順丁烯二醯亞胺結合20。雖然dota-hac的表觀hpd-l1親和力弱於其母序列hac-v，但是dota-hac仍然拮抗hpd-l1，比wtpd-1強1,200倍(圖17a)。隨後進行64cu放射性標記，產生hpd-l1特異性放射性蛋白質64cu-dota-hac，其具有每微克8-10μci比活性和大於98％的放射化學純度(圖17b)。這種pet示蹤劑用於使活小鼠的全身hpd-l1表達可視化。64cu-dota-hac在注射後1小時展示強的腫瘤/肌肉信號(6倍增強，p＜0.05)(圖11a、圖18a)，且腎臟吸收率高，表明游離藥物從血液中發生快速的腎清除，且在肝臟中的信號高，與肝臟表達的蛋白質的銅特異性結合相符(圖18b，圖18e)。pd-l1陰性腫瘤(圖11a，圖18c)或事先注射500μg冷hac-pd1所阻斷的hpd-l1陽性腫瘤(圖11a-11b)內的信號缺乏表明64cu-dota-hac-pd1對pd-l1結合的高度特異性。在2、4以及24小時時獲得額外掃描(圖18a、圖18d)，且評估24小時時的生物分布(圖19a-19b)。注射後一小時時觀察到最大腫瘤吸收率，但是hpd-l1(+)腫瘤內的強信號持續至少24小時。總之，64cu-dota-hac的快速且特定hpd-l1(+)腫瘤吸收率促進了其用作臨床成像應用中的試劑。論述癌症免疫療法是其顯著的治療潛力剛開始完全實現的治療範例。雖然使用靶向pd-1：pd-l1軸的抗體已經在癌症患者中獲得成功，但是在此提供的數據表明可以利用工程化pd-1受體誘餌hac-pd-1達到額外的功效。這種蛋白質不與抗體共享固有的局限性：不良的腫瘤滲透和非所需的效應子t細胞耗乏。相應地，相較於抗pd-l1抗體，其向越來越大且越來越多的腫瘤發揮增強的抗腫瘤活性。這些結果從而突顯了小蛋白質生物製劑作為治療劑用於患者的潛力以及其廣泛地用於調節免疫系統的適用性。除腫瘤遞送增強之外，小蛋白質(如hac-pd-1)的模塊化性質實現了與其它免疫治療劑的便利組合。根據尼沃單抗(nivolumab)(抗pd-1)與伊匹單抗(ipilimumab)(抗ctla4)的組合檢查點阻斷作用在黑色素瘤患者21中的功效，這是主要考慮因素，且許多臨床前研究已經證明靶向pd-1/pd-l1的抗體與額外的免疫調節路徑(如tim-322、lag-323、gitr24、ox-4025以及4-1bb26)之間存在協同作用。在hac-pd-1的情況下，靶向協同免疫調節路徑的多特異性藥劑可以容易通過簡單地融合多個小蛋白質模塊(包括其它工程化受體誘餌或單域抗體)來製造。這種設計是利用不同免疫檢查點配位體和/或受體在相同細胞上的共表達來向組合藥劑提供增強的親合力且從而提供增強的效能。另外，多特異性治療劑是通過減少分開投與的藥物種數來簡化治療方案且通過放大來降低與其單獨製造和研發相關的成本。雖然大體充分耐受(相較於一些其它癌症療法)，但是免疫調節藥物(如抗pd-1和抗pd-l1抗體)的毒性範圍是輕度腹瀉到危及生命的免疫相關有害事件，包括自身免疫性肝炎、肺炎以及結腸炎8，9。迫切需要可鑑別患者對治療有反應的生物標記和方法以避免原本不會受益於免疫療法的患者中出現不必要的毒性。通過免疫組織化學(ihc)獲得的腫瘤pd-l1迄今已經證實是抗pd-1/抗pd-l1反應27的不完全預測因子。然而，ihc可以是腫瘤pd-l1表達的不靈敏量度且可以想像這種方法可能會將pd-l1陽性腫瘤誤表徵為陰性。在此呈現的著作表明對腫瘤pd-l1表達進行的hac-pd-1免疫pet成像可以用作免疫組織化學的替代方式。這種無創方法允許同時對完整腫瘤與相關轉移進行成像，這可以不同於原發腫瘤的pd-l1表達狀況。另外，pet成像可以用於在不同時間點(例如在治療之前及之後)對相同腫瘤進行重複成像，由此產生一組較豐富的診斷信息，這種信息是傳統活檢/ihc方法難以或不可能獲得的。方法小鼠。依照史丹福大學實驗室動物護理管理小組(administrativepanelonlaboratoryanimalcareatstanforduniversity)的批准進行動物研究。直接從傑克遜實驗室(thejacksonlaboratory)獲得6-8周齡balb/c小鼠用於同基因腫瘤移植和評估響應於治療的t細胞含量。從內部繁殖群獲得nod.cg-prkdc.scid.il2rg.tm1wjl/szj(nsg)小鼠用於腫瘤滲透率的活體內評估和pet研究。細胞系。從atcc獲得人類黑色素瘤細胞系sk-mel-28、鼠類黑色素瘤細胞系b16.f10和鼠類結腸癌細胞系ct26。所有細胞系均在加溼的5％co2培育箱中、在37℃維持。sk-mel-28細胞在補充有10％胎牛血清(fbs；賽默飛世爾科技(thermofisherscientific))的emem培養基(atcc)中傳代培養。b16.f10細胞在補充有10％fbs和55μm2-巰基乙醇(西格馬(sigma))的dmem培養基(生命技術公司(lifetechnologies))中傳代培養。ct26細胞在補充有10％fbs的rpmi中生長。ct26的基因變異體是通過用表達cas9的慢病毒和編碼兩種靶向mpd-l1的sgrna[分別為序列ggctccaaaggacttgtacg(seqidno：56)和ggtccagctcccgttctaca(seqidno：57)]的混合物(利用genome-engineering.org的工具所設計)的慢病毒池同時轉導ct26細胞來產生28。感染後第6天，通過用100ng/ml小鼠ifnγ處理來誘導細胞高量表達pd-l1，且在感染後第7天，收集細胞且用經apc標記的10f9g2抗體染色。分選、培養陰性群體，且回收一定數目的細胞後的若干天，對這些細胞進行額外兩輪連續的分選。這種穩定的陰性群體定義為ct26-δ(mpd-l1)。產生針對hpd-l1的組成性、ef1a驅動性表達編碼的慢病毒且用於感染ct26-δ(mpd-l1)細胞，以便產生表達人類pd-l1的小鼠癌症株系。收集這些細胞，用pe-抗pd-l1(克隆mih1，電子生物科學(ebioscience))染色，且根據純度分選。這種分選總共重複三次以產生工程化亞株系ct26-tg(hpd-l1)-δ(mpd-l1)。蛋白質表達和提純。通過idt將hpd-1igv域(殘基26-147)、hpd-l1igv和igc域(殘基19-239)、高親和力pd-1變異體以及hacmb組裝成gblocks且利用杆狀病毒將其與羧基末端8x組胺酸標籤一起同框克隆到pacgp67a中以便從粉紋夜蛾(trichoplusiani)(highfive)中分泌。利用pcr介導的定點突變誘發將n91c突變引入hac-v中。通過鎳-氮基三乙酸(ni-nta)色譜從改良性培養基中提純所分泌的蛋白質且在磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)中脫鹽。另外使用tritonx-114對小鼠功能性或活體內研究中所用的蛋白質進行柱洗滌以除去內毒素。通過添加羧基末端生物素受體肽序列(glndifeaqkiewhe(seqidno：58))且使用bira連接酶進行酶促生物素化來獲得生物素化蛋白質。利用胺反應性和半胱氨酸反應性探針進行蛋白質標記。如上文所述表達且提純hac-vn91c且通過施加三(2-羧乙基)膦(tcep)直到1mm最終濃度來還原。然後將還原的蛋白質與20倍摩爾濃度過量的alexafluor594c5順丁烯二醯亞胺(生命技術公司)、alexafluor647c2順丁烯二醯亞胺(生命技術公司)或順丁烯二醯亞胺基-單醯胺-dota(巨環公司(macrocyclics))合併且在室溫下培育一小時，且然後在4℃另外培育12小時。通過使用vivaspin蛋白質濃縮器(賽多利斯公司(sartoriusstedim))使反應混合物在pbs中脫鹽來除去過量的游離探針。對於dota-hac來說，使反應過的蛋白質在hepes緩衝生理鹽水(hbs；10mmhepesph7.4，150mmnacl)中發生交換且濃縮到約5mg/ml。使用基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜(maldi-tof-ms)，通過比較未反應的hac-n91c和hac-dota來估算每個抗體偶聯的螯合劑數目(c/a)。在室溫下，低內毒素/無疊氮化物抗hpd-l1(克隆29e.2a3，生物聯想公司)用8倍摩爾濃度過量的alexafluor488nhs酯(生命技術公司)標記兩小時。游離染料通過添加trisph8.0到20mm最終濃度來淬滅且經標記的抗體使用vivaspin蛋白質濃縮器脫鹽。酵母呈現和定向演化。使用如前所述的pyal載體，將hpd-1(殘基26-147)的igv域、hpd-l1(殘基19-132)的igv和igc域以及hpd-l2(殘基20-123)呈現於與aga2n末端融合的釀酒酵母菌株eby100物的表面上。建構以及選擇第一代hpd-1文庫：因為與hpd-l1複合的hpd-1的晶體結構尚未報導，所以通過與hpd-l1(pdbid3sbw)結合的mpd-1的結構來推測22個可能接觸殘基。如圖12a-12b所述，使用表2中所列的引子、使用組裝pcr來產生這些殘基隨機分布的文庫。文庫具有約9.5x1019個獨特蛋白質序列的理論多樣性。使用與pyal載體同源的引子進一步擴增pcr產物且與線性化pyal一起共同電穿孔到eby100酵母中。所產生的文庫含有0.9×108個轉型體。回收經轉型的酵母且在液體sdcaa培養基中、在30℃擴增且通過在液體sgcaa培養基中1∶10稀釋來誘導且在20℃培養24小時。每一輪使用適當數目個經誘導的酵母來確保文庫的預期多樣性在每個步驟時的至少十倍覆蓋率，且不少於108個細胞。在4℃使用macs緩衝液(具有0.5％牛血清白蛋白和2mmedta的pbs)執行所有選擇步驟。每一輪之前，使用抗cy5/alexafluor647微珠(美天旎(miltenyi))以及ldmacs柱(美天旎)進行針對抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647(內部產生)的預清除。在第1-3輪中，如下進行正向選擇：經誘導的酵母在4℃用1μm生物素化hpd-l1標記，隨後用抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647進行二次染色，且使用抗cy5/alexafluor647微珠以及lsmacs柱(美天旎)進行磁性選擇。在第四輪中，通過用10nm生物素化hpd-l1染色且用抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647進行二次標記來進行正向選擇。通過用alexafluor488結合的抗cmyc(細胞信號傳導技術公司(cellsignalingtechnologies))染色來測定呈現水平且使用螢光活化細胞分選術(facs)聯合facsaria細胞分選器來分離出最高1％的呈現歸一化hpd-l1結合子。每一輪選擇後，將所回收的酵母在sdcaa培養基中、在30℃擴增整夜且隨後在20℃通過在sgcaa培養基中1∶10稀釋來誘導24小時。建構以及選擇第二代hpd-1文庫：設計第二代文庫，其中使來自第一文庫的十個接觸位置(其顯示匯聚遠離野生型殘基)以及七個額外核心位置隨機分布。圖13所說明的設計具有約9.1×109個獨特蛋白質序列的理論多樣性。就第一代文庫來說，通過使用表3中所列的引子進行組裝pcr來建構第二代文庫且與pyal一起共同電穿孔到eby100酵母中。所產生的文庫產生1.2×108個轉型體。類似於含有幾個修飾的第一代文庫來選擇第二代文庫。通過用1μm生物素化hpd-l1染色且進行如上文所述的磁珠選擇來進行第1-3輪。在第4輪和第5輪中，進行動力學選擇以選擇解離速率降低的變異體。簡言之，酵母在4℃用10nm生物素化hpd-l1染色一小時。用macs緩衝液洗滌後，然後將酵母與1μm非生物素化hpd-l1一起在室溫下、在攪拌下培育六小時。競爭後的酵母然後用抗生蛋白鏈菌素-alexafluor647和alexafluor488結合的抗cmyc染色且通過facs分選來分離出最高1％的呈現歸一化結合子。表面等離子體共振。使用biacoret100進行實驗且在25℃進行。使生物素化pd-l1固定到biacore抗生蛋白鏈菌素(sa)傳感器晶片(通用電氣醫療集團(gehealthcare))上以產生約100ru的rmax。使無關的生物素化蛋白質(人類cd47的igsf域)固定到具有匹配ru值的參考表面上以控制非特異性結合。在pd-1變異體於hbs-p+緩衝液(10mmhepesph7.4、150mmnacl、0.005％表面活性劑p20)中連續稀釋的情況下進行測量，如圖8a中所示(通用電氣醫療集團)。通過三次60秒注射50％v/v乙二醇、100mm甘氨酸ph9.5來使pd-l1表面再生。利用1∶1朗格繆爾結合模型(langmuirbindingmodel)，使用biacoret100評價軟體2.0版來分析所有數據。pd-1細胞競爭結合分析。通過按4∶1的摩爾比率將生物素化wtpd-1與alexafluor647結合的抗生蛋白鏈菌素一起培育來形成wtpd-1四聚體。通過用2000u/ml人類ifnγ刺激整夜來誘導gfp-螢光素酶+sk-mel-28細胞上的pd-l1表達。然後將100nmwtpd-1四聚體與滴定濃度的wtpd-1單體、hac-v或hacmb合併且同時添加到100,000個經誘導的sk-mel-28細胞中。將細胞與試劑混合物一起在冰上培育60分鐘，然後洗滌以除去未結合的四聚體。使用accuric6流式細胞儀(bdbiosciences)，通過流式細胞術來量化alexafluor647螢光強度。活體內腫瘤滲透研究。就各自注射來說，將經遺傳修飾的結腸癌株系ct26-δ(mpd-l1)的1x106個細胞於50μl75％rpmi懸浮液(生命技術公司)中皮下注射到6-8周齡nod.cg-prkdc.scid.il2rg.tm1wjl/szj(nsg)雌小鼠的左肩中，且將ct26-tg(hpd-l1)-δ(mpd-l1)的1x106個細胞於25％中密度基質膠(康寧(corning))中皮下注射到所述小鼠的右肩中。14天後，當腫瘤直徑生長到約1em時，將100μgalexafluor488結合的抗pd-l1抗體(克隆29e.2a3，生物聯想公司)和100μgalexafluor594結合的hacpd-1單體的混合物腹膜內注射到小鼠中。4小時後，將小鼠無痛處死且解剖其腫瘤。用冷pbs進行數輪洗滌以除去過量血液後，將每個腫瘤大致切成兩半。在4℃，在搖蕩下，將一半在1％pfa的pbs溶液中培育整夜，用pbs洗滌且包埋於冰凍組織切片包埋劑tissuetekoptimalcuttingtemperature(o.c.t.)(櫻花(sakura))中。將這些組織切成7微米冷凍切片且解凍30分鐘，在4℃用丙酮洗滌4分鐘，風乾10分鐘，用pbs洗滌(三次，各5分鐘)，且用hoechst33342(英傑公司(invitrogen))標記，隨後用fluoromountg(南方生物技術公司(southernbiotech))固定。在eclipsee800螢光顯微鏡(尼康(nikon))上，以10倍或20倍放大率目測載玻片。使用adobephotoshop(阿讀貝公司(adobe))進行基本光學處理，包括螢光通道假著色、通道匯合以及亮度和對比度調整。在facs分析中，用直剃刀將每個腫瘤的第二半切得細碎，且擠壓所切碎的組織通過100μm網狀細胞過濾器，用pbs衝洗且最後於液體懸浮液中通過40μm細胞過濾器。在所有處理步驟期間，樣品儘可能接近於4℃保存。最後，使所產生的單細胞懸浮液在1％pfa溶液中固定，且在lsrfortessafacs分析儀(碧迪生物科學公司(bdbiosciences))上分析來源於抗體和來源於hac的螢光信號。t細胞耗乏研究。將6-8周齡野生型balb/c雌小鼠的下背刮毛且皮下注射結腸癌株系ct26的1x106個細胞，所述細胞存在於含有75％rpmi(生命技術公司)和25％中密度基質膠(康寧)的50μl懸浮液中。在目視檢查7天內腫瘤移植失敗的小鼠從進一步研究中排除。使用random.org的工具將腫瘤可見、可觸知的小鼠隨機分入治療組，每組10隻小鼠。通過每日一次腹膜內注射100μlpbs、250μg抗pd-l1抗體(克隆10f.9g2，生物埃克思細胞公司(bioxcell))或250μg提純的hacmb蛋白質(各調節到2.5mg/ml濃度)而將小鼠治療3天。處理三天後，從每個小鼠收集周邊血液和淋巴結且用一組以下抗體(生物聯想公司(biolegend))染色：alexafluor488cd45(克隆30-f11)、percp-cy5-5cd8(克隆53-6.7)、alexafluor700nk1.1(克隆pk136)、apc-cy7b220(克隆ra3-6b2)、pe-dazzlecd11b(克隆m1/70)、pe-cy5f4/80(克隆bm8)、pe-cy7cd4(gk1.5)以及apcpd-l1(克隆10f.9g2)。dapi用作存活率染料。在lsrfortessafacs分析儀(碧迪生物科學公司)上分析樣品。ct26腫瘤模型。將6-8周齡野生型balb/c雌小鼠的下背刮毛且皮下注射結腸癌株系ct26的1x106個細胞，所述細胞存在於含有75％rpmi(生命技術公司)和25％中密度基質膠(康寧)的50μl懸浮液中。在目視檢查7天內腫瘤移植失敗的小鼠從進一步研究中排除。在小腫瘤治療研究中，使用random.org的清單隨機分組工具將小鼠隨機分組，且所有小鼠移植後第7天開始投與療法。在這些小腫瘤研究中，每隔兩天進行數字測徑規測量，且數值在圖上作為變化倍數(相對於第10天的測量值歸一化)顯示。在大腫瘤研究中，如上文所述對小鼠進行移植，且第8天開始每日測量腫瘤。將小鼠個別地分選到治療組中且僅當腫瘤達到150mm3閾值時開始治療(在所有情況下，大約在移植後10-14天)。在大腫瘤實驗中，在整個持續治療期間，每隻小鼠每天進行數字測徑規測量。為了減少測量值的日常隨機可變性，這個實驗中的腫瘤體積在圖上是作為平均值顯示(如滑動窗內所評價)，包括當日、前日以及次日的測量值。得自大腫瘤研究的數值在圖上是作為絕對腫瘤體積(mm3)顯示。在兩項實驗中，歷時14天每天給與小鼠治療，即腹膜內注射100μlpbs、250μg抗pd-l1抗體(克隆10f.9g2，埃克思生物細胞公司)或250μg提純的hacmb蛋白質(各調節到2.5mg/ml濃度)。腫瘤是作為具有兩個半徑x和y的橢球估計，其中x是腫瘤的最大可測量尺寸，且y是直接垂直於x的尺寸：體積＝((4/3)*(π)*(x/2)*(y/2)2。dota-hac的64cu標記。dota-hac用64cucl2(威斯康星大學，麥迪遜)(universityofwisconsin，madison)進行放射性標記：使含有500μgdota-hac的200μl0.1mm乙酸銨緩衝液(ph5.5)與含有約370mbq(約10mci)的中和64cucl2溶液在37℃反應1小時。培育後，在室溫下添加5mm乙二胺四乙酸(edta)ph7.0歷時15分鐘以清除反應混合物中未螯合的64cucl2。使用sec3000hplc，在1.0ml/min流速(0.1m磷酸鹽緩衝液，ph7.0)下提純64cu-dota-hac。通過放射性hplc評估放射化學純度。使最後劑量的放射性結合物通過0.2μm過濾器進入無菌小瓶中。放射性示蹤劑細胞結合分析使用hpdl1(+)細胞、經hac-v預阻斷的hpdl1(+)細胞和對照hpdl1(-)細胞進行活體外細胞結合分析，以評估免疫反應性。將0.1ml的2.5×105個細胞三重複等分試樣且用pbsa(補充有1％牛血清白蛋白的pbs)洗滌。將每個管與0.1ml5nmol/l64cu-dota-hac(5-6mbq/nmol)一起培育45分鐘。培育後，用1％pbsa洗滌細胞三次。使用γ計數器(1470wizard自動化γ計數器；珀金-埃爾默(perkin-elmer))對每個細胞團的活性進行量化。小動物微pet成像。將64cu-dota-hac(約230μci/25μg蛋白質/200μlpbs)靜脈內注射到具有皮下hpdl1陽性(n＝4)或hpdl1陰性(n＝4)ct26腫瘤的nsg小鼠中。一組在pet放射性示蹤劑注射前兩小時還接受阻斷劑量(n＝2)的500μg/200μl冷hac。將小鼠麻醉且在西門子inveon小動物多模pet/ct系統(臨床前解決方案；西門子醫療公司(siemenshealthcare))上、在注射後的1、2、4和24小時時間點進行成像。使用錐束微x射線源(50μm焦點尺寸)和2,048×3,072像素x射線檢測器，在80kvp/500μa的第二床位(220°旋轉的半掃描、每個床位120個投影)中擷取ct原始圖像。使用謝普-洛根過濾器(shepp-loganfilter)以及錐束過濾的反投影來重建ct數據集。根據ct掃描的衰減校正，利用3.4ns的默認重合時機窗和350到650kev的能量窗來擷取靜態pet圖像。基於注射後的時間來選擇3分鐘(1、2小時)、5分鐘(4小時)和10分鐘(24小時)的pet掃描擷取時間長度。使用二維有序子集期望最大化(osem2d)算法來重建pet數據集29。利用inveonresearchworkspace(irw)進行圖像分析。對於每次微pet掃描來說，在衰減校正的全身圖像上針對肝臟、脾、腎臟和腫瘤繪製三維的所關注區域(roi)。通過將所關注區域(roi；nci/cc)的平均像素值除以總注射劑量來獲得每個器官的每克組織的注射劑量百分比(％id/g)。不執行部分體積校正。通過雙向方差分析(graphpad)進行統計分析。生物分布研究。在注射時間點後的24小時完成微pet/ct成像後，將小鼠無痛處死且解剖以獲得生物分布。收集血液和器官(心臟、肺、肝臟、脾、胰臟、胃、小腸、大腸、腎臟、肌肉、骨骼、骨髓、皮膚、腦、腫瘤和尾巴)且稱重。將γ計數器測量所得的每個器官的cpm值換算為每克組織的注射劑量百分比。將數據相對於注射時間進行衰減校正。表格表格2.用於產生「第一代」pd-1文庫的引子表格3.用於產生「第二代」pd-1文庫的引子表格4.治療第14天時的大腫瘤研究組的統計分析序列表阿龍·m·林安德魯·c·克魯瑟阿施施·曼格裡克歐文·l·韋斯曼羅伊·l·莫特梅麗莎·n·麥克拉肯辛迪·戈登高親和力pd-1藥劑以及使用方法stan-1136wo2us62/035,3162014-08-08us62/150,7892015-04-21104patentinversion3.51288prt智人1metglnileproglnalaprotrpprovalvaltrpalavalleugln151015leuglytrpargproglytrppheleuaspserproaspargprotrp202530asnproprothrpheserproalaleuleuvalvalthrgluglyasp354045asnalathrphethrcysserpheserasnthrsergluserpheval505560leuasntrptyrargmetserproserasnglnthrasplysleuala65707580alapheprogluaspargserglnproglyglnaspcysargphearg859095valthrglnleuproasnglyargaspphehismetservalvalarg100105110alaargargasnaspserglythrtyrleucysglyalaileserleu115120125alaprolysalaglnilelysgluserleuargalagluleuargval130135140thrgluargargalagluvalprothralahisproserproserpro145150155160argproalaglyglnpheglnthrleuvalvalglyvalvalglygly165170175leuleuglyserleuvalleuleuvaltrpvalleualavalilecys180185190serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro195200205leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly210215220gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro225230235240cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly245250255metglythrserserproalaargargglyseralaaspglyproarg260265270seralaglnproleuargprogluaspglyhiscyssertrpproleu2752802852122prt人工序列合成胺基酸序列2aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphevalleuasntrptyrargmetserproser354045asnglnthrasplysleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyglnaspcysargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehismetservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095leucysglyalaileserleualaprolysalaglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151203122prt人工序列合成胺基酸序列3aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisvaliletrphisarggluserproser354045glyglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyglnaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehismetservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyvalileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151204122prt人工序列合成胺基酸序列4aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisvalvaltrphisarggluserproser354045glyglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyglnaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehismetservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyvalileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151205122prt人工序列合成胺基酸序列5aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisvalvaltrphisarggluserproser354045glyglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyproaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehisleuservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyalaileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151206122prt人工序列合成胺基酸序列6aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisileiletrphisarggluserproser354045glyglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyglnaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehisleuservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyvalileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151207122prt人工序列合成胺基酸序列7aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisvaliletrphisleugluserproser354045glyglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyglnaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580phehismetservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyvalileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151208122prt人工序列合成胺基酸序列8aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserpheser202530asnthrsergluserphehisvalvaltrphisarggluserproser354045serglnthraspthrleualaalapheprogluaspargserglnpro505560glyproaspalaargpheargvalthrglnleuproasnglyargasp65707580pheglnleuservalvalargalaargargasnaspserglythrtyr859095valcysglyvalileserleualaprolysileglnilelysgluser100105110leuargalagluleuargvalthrgluarg1151209122prt人工序列合成胺基酸序列9aspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproalaleu151015leuvalvalthrgluglyas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