從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法
2023-10-17 10:24:59
專利名稱：從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法。
背景技術：
殼聚糖及其衍生物可被廣泛用於醫藥、化妝品、食品、化工、農業、生物技術、高分子材料等許多領域。當前市場上出售的殼聚糖主要來自蝦、蟹等的外殼，製備工藝成熟，已經工業化生產，但該工藝存在著原料產地及分散性、季節性、品質的差異性等許多固有的缺點，這些給甲殼素的提取帶來了困難。在甲殼素和殼聚糖生產的原料來源上，人們忽視了另一重要途徑，即微生物中的甲殼素和殼聚糖，其實在子囊菌綱、擔子菌綱、藻類綱及半知菌綱等真菌細胞壁中的含量是十分可觀的(甲殼素含量為菌體乾重的20％～22％)。從菌絲體中提取的殼聚糖與用蝦殼生產的殼聚糖相比非常接近，但其對金屬離子(如Cu、Hg)的吸附能力遠大於蝦殼來源的殼聚糖，特別適用於含重金屬離子較多的廢水；且用菌絲殼聚糖製成的食品保鮮劑的抗菌(對乳酸菌、枯草菌等)能力比蝦殼來源的殼聚糖高1～2倍。
檸檬酸工廠是生產檸檬酸的專業廠家，在檸檬酸生產過程中，有大量的副產物廢菌體產生，這些廢菌體中含有較大比例的甲殼素，如果這些廢菌體被棄掉，不僅會造成資源的浪費，而且會帶來嚴重的環境汙染。從各種微生物的甲殼素和殼聚糖含量來看，黑麴黴的甲殼素含量較高，檸檬酸發酵所用的菌株為黑麴黴，在以薯幹為原料的發酵過程中，每生產1噸檸檬酸可產生500kg左右的幹濾渣，其中含160kg左右的幹菌體，即在發酵液中菌絲體的含量為20g/L左右，黑麴黴菌絲體中殼聚糖按20％計，其殼聚糖產率可達到4.0g/L。我國是一個大規模的檸檬酸生產國，且生產廠家也相對集中，每年可產生近百萬噸的廢菌體，這些菌體的排放不僅會帶來嚴重的環境汙染，而且會造成殼聚糖生產原料的巨大浪費。
在國外，有關從真菌中提取甲殼素和殼聚糖的報導越來越多，但未見利用發酵工廠廢菌體製備甲殼素和殼聚糖的文獻報導。在國內，婁永江採用膠體磨處理檸檬酸工廠廢渣，使菌絲體顆粒變細，水溶性物質最大限度地溶出，同時採用濃鹼分段處理提取甲殼素和殼聚糖，所得產品的分子量為7.89×104，脫乙醯度為96.82％，殼聚糖相對幹菌體的得率為3.35％；趙繼倫等採用酸鹼交替法脫檸檬酸發酵工廠廢菌體的蛋白，然後利用濃鹼液脫乙醯基製備殼聚糖；曹健等人研究採用電解法和間歇提取法提取檸檬酸發酵工廠廢菌體中的甲殼素和殼聚糖。但這些研究所得產品的分子量低，提取收率低，提取過程會帶來較多的環境汙染物。
發明內容
本發明提供了一種從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，該方法提取的殼聚糖分子量、提取收率較高，對環境帶來的汙染低。
產品的應用範圍廣，且該工藝與傳統的酸鹼水解提取法相比，提取過程產生較少的廢水。
本發明提供的技術方案是從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，將檸檬酸生產過程中的副產物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時，將用膠體磨處理過的菌絲體，按1克菌絲體2-5mL Na2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液中，加入枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶，於50～55℃連續攪拌2～3小時，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl緩衝溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl緩衝溶液中，加入甲殼素脫乙醯酶，於50～55℃連續攪拌6～8小時，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調pH7.5～8.0沉澱，離心分離得殼聚糖，沉澱物用去離子水及75～95％乙醇洗滌，離心分離乾燥後即得殼聚糖。
上述枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶的用量為廢菌絲體的0.05～0.30wt％。
上述甲殼素脫乙醯酶為藍色犁頭黴(Absidia coerulae)產生的甲殼素脫乙醯酶，甲殼素脫乙醯酶的用量為每百克廢菌絲體加入800～2000units。
本發明採用膠體磨破碎細胞及多種酶連續作用相結合來處理檸檬酸發酵工廠廢菌體，使細胞膜中的物質釋放出來、細胞壁中的蛋白質被降解去除、脫去細胞壁中甲殼素的N-乙醯基等，最後提取殼聚糖。該工藝所得產品的分子量、提取收率比傳統的酸鹼水解提取法高，且該工藝與傳統的酸鹼水解提取法相比，提取過程產生較少的廢水，環境汙染將大幅度的降低。
具體實施例方式
將新鮮的檸檬酸工廠廢菌體(原料來自湖南銀海石油化工有限公司。由於目前國內生產檸檬酸的廠家均採用黑麴黴為菌種，且工藝基本相似，因此不同廠家的廢菌體組成相似，結果基本沒有區別。)在膠體磨中反覆處理1～1.5小時，然後，按1∶3(g/ml)的比例加入到0.2MpH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4的緩衝溶液中，加入0.17％(g/g廢菌絲體)枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶脫蛋白，於12000轉20分鐘離心收集固形物，洗滌三次，按1∶3(g/ml)的比例加入到50mM pH6.0～8.5Tris-HCl的緩衝溶液中，加入1200units％(1unit/g廢菌絲體，1unit是指每毫克酶每分鐘催化六聚N-乙醯氨基葡萄糖產生1μmol乙醯基)的Absidia coerulae(藍色犁頭黴)產生的甲殼素脫乙醯酶進行脫乙醯基，於12000轉20分鐘離心收集固形物，水洗滌三次，用1～3％(g/ml)醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調pH7.5～8.0沉澱，離心分離得殼聚糖，沉澱物用去離子水及75～95％(ml/ml)乙醇各洗滌三次，離心分離乾燥後即得殼聚糖。
按照上述提取過程，原料中蛋白質的脫除率為58.9％，殼聚糖的提取率為50.0％，平均分子量為267.97kDa，產品中殼聚糖的含量為84.4％，脫乙醯度為73.6％，與化學提取法(蛋白質的脫除率為62.3％，殼聚糖的提取率為41.7％，平均分子量為84.04kDa，產品中殼聚糖的含量為82.7％，脫乙醯度為76.8％)相比，酶法提取所得產品的提取率、分子量、殼聚糖含量都比化學法提取高。
權利要求
1.從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，其特徵在於將檸檬酸生產過程中的副產物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時，將用膠體磨處理過的菌絲體，按1克菌絲體2-5mLNa2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液的比例，置入0.2M pH6.0～8.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩衝溶液中，加入枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶，於50～55℃連續攪拌2～3小時，收集固形物，按1克固形物2-5mLTris-HCl緩衝溶液的比例，置入50mM pH6.0～8.5的Tris-HCl緩衝溶液中，加入甲殼素脫乙醯酶，於50～55℃連續攪拌6～8小時，收集固形物，用10～30g/升醋酸溶液提取殼聚糖，用NaOH調pH7.5～8.0沉澱，離心分離得殼聚糖，沉澱物用去離子水及75～95％乙醇洗滌，離心分離乾燥後即得殼聚糖。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於枯草芽孢桿菌產生的中性蛋白酶的用量為廢菌絲體的0.05～0.30wt％。
3.根據權利要求1或2所述方法，其特徵在於甲殼素脫乙醯酶為藍色犁頭黴(Absidiacoerulae)產生的甲殼素脫乙醯酶，甲殼素脫乙醯酶的用量為每百克廢菌絲體加入800～2000units。
全文摘要
從檸檬酸廢菌絲體中提取分離殼聚糖的方法，將檸檬酸生產過程中的副產物廢菌絲體在膠體磨中處理1～1.5小時，將用膠體磨處理過的菌絲體，置入0.2M pH6.0～8.0的Na
文檔編號C08B37/08GK1629197SQ20041006098
公開日2005年6月22日 申請日期2004年10月19日 優先權日2004年10月19日
發明者杜予民, 蔡俊, 楊建紅, 邱雁臨 申請人:武漢大學